-
Es
existieren Sterolderivate mit folgender allgemeiner Struktur 1 Kation-Spacer 2-Y-Spacer 1-X-Sterol (1),wobei
das
Kation eine Stickstoffbase ist ausgewählt aus der Gruppe
enthaltend Piperazine, Imidazole, Morpholine, Purine, Pyrimidinen
und/oder Pyridine.
-
Die
Spacer 1 und 2 ausgewählt sind aus der Gruppe enthaltend
Niederalkylreste mit bis zu 8 C-Atomen mit linearer, verzweigter
oder ringförmiger Struktur und 0, 1 oder 2 ethylenisch
ungesättigten Bindungen,
die verbindenden Gruppen
X und/oder Y ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
-(C=O)-O-;
-(C=O)-NH-; -(C=O)-S-; -O-; -NH-; -S; -CH=N-; -O-(O=C)-; -S-(O=C)-;
-NH-(O=C)- und/oder N=CH-,.
das Sterol ausgewählt
ist aus der Gruppe bestehend aus Cholesterol, Sitosterol, Campesterol,
Desmosterol, Fucosterol, 22-Ketosterol, 20-Hydroxysterol, Stigmasterol,
22-Hydroxycholesterol, 25-Hydroxycholesterol, Lanosterol, 7-Dehydrocholesterol,
Dihydrocholesterol, 19-Hydroxycholesterol, 5☐-Cholest-7-en-3β-ol,
7-Hydroxycholesterol, Epicholesterol, Ergosterol und/oder Dehydroergosterol
und
das Gesamtmolekül einen pKa-Wert zwischen 3,5
und 8 aufweist.
-
Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin weitere, alternative
Sterolderivate der allgemeinen Struktur (1) zu finden.
-
Die
erfindungsgemäße Aufgabe wird dadurch gelöst,
dass mindestens eine der verbindenden Gruppen X und/oder Y unabhängig
voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus
-NH-(C=O)-O- und/oder -O-(C=O)-NH-.
-
Überraschenderweise
wurde gefunden, dass die Sterolderivate enthaltend die genannten
Gruppen für X und/oder Y eine verbesserte Stabilität
aufweisen, wodurch z. B. Liposomen, welche diese neuen Lipide enthalten über
einen längeren Zeitraum in Suspension gelagert werden können.
-
Die
erfindungsgemäßen Lipide besitzen die allgemeine
Struktur 1 Kation-Spacer 2-Y-Spacer
1-X-Sterol (1).
-
Das
Gesamtmolekül erhält seine pH-abhängige
Ladungscharakteristik durch ein oder mehrere organische Kationen
mit einem pKa-Wert zwischen 3,5 und 8. Typische Moleküle
oder Molekülfragmente mit dieser Eigenschaft sind Stickstoffbasen.
Diese Stickstoffbasen werden über Spacer und Kopplungsgruppen
mit der 3-Position des Sterolgerüsts verknüpft,
so dass eine Verbindung nach der erfindungsgemäßen
Formel entsteht. In vielen Fällen, etwa wenn die Stickstoffbasen
als Ringsysteme vorliegen, existieren Stellungsisomere, bei denen
der verbindende Spacer an verschiedenen Positionen des organischen
Kations substituiert ist. Solche Stellungsisomere fallen unter den
Offenbarungsgehalt dieser Erfindung. Durch die Stellungsisomerie
allein lassen sich in vielen Fällen bereits die pKa-Werte
der organischen Kationen beeinflussen. Die dem zugrunde liegenden
Regeln sind dem Fachmann geläufig. Alternativ können
diese Einflüsse aus Tabellenwerken abgeschätzt
werden (Handbook of Chemistry and Physics, 73. Band, S.
8–37 ff.).
-
In
einer bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung weist
das Sterolderivat einen pKa-Wert zwischen 4 und 7 auf. Dieser pKa-Wert
liegt vorteilhafter Weise in einem Bereich, der für die
Physiologie zahlreicher Organismen eine entscheidende Bedeutung
besitzt.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung
sind die Kationen Stickstoffbasen. Vorzugsweise sind die Kationen
aus Piperazinen, Imidazolen, Morpholinen, Purinen und/oder Pyrimidinen
herleitbar.
-
Durch
Ankopplungsreaktionen entstehen amphiphile organische Kationen,
die beispielsweise aus den folgenden Stoffklassen stammen:
o-,
m-, p-Aniline; 2-,3- oder 4-substituierte Anisidine, Toluidine oder
Phenetidine; 2-, 3-, 5-, 6-, 7- oder 8-substituierte Benzimidazole,
2-, 3, 4- oder 5-substituierte Imidazole, 1-, oder 5-substituierte
Isochinoline, 2-,3- oder 4- substituierte Morpholine, 2-,3- oder
4-substituierte Picoline, 1-,2-, oder 3-substitutierte Piperazine,
2-,5- oder 6-modifizierte Pterine, 3-,4-,5-, 6- oder 9-substituierte
Purine, 2- oder 3-substituierte Pyrazine, 3- oder 4-substituierte
Pyridazine, 2-,3- oder 4-modifizierte Pyridine, 2-,4-,5- oder 6-subsituierte
Pyrimidine, 1-, 2-,3-,4-,5-,6- oder 8-substituierte Chinoline, 2-,4-
oder 5-substituierte Thiazole, 2-,4- oder 6-substituierte Triazine,
oder auch Abkömmlinge des Tyrosins. Besonders bevorzugt
sind Piperazine, Imidazole, Morpholine, Purine und/oder Pyrimidine.
-
Ganz
besonders bevorzugt sind solche Molekülfragmente, wie sie
in biologischen Systemen vorkommen, also beispielsweise 4-Imidazole
(Histamine), 2-,6- oder 9-Purine (Adenine, Guanine, Adenosine oder
Guanosine), 1-,2- oder 4-Pyrimidine (Uracile, Thymine, Cytosine,
Uridine, Thymidine, Cytidine) oder auch Pyridin-3-carbonsäuren
(Nicotinsäureester oder -amide).
-
Die
hier genannten Strukturfragmente können weitere Substituenten
aufweisen. Das können beispielsweise Methyl-, Ethyl-, Propyl-
oder Isopropylreste sein, besonders bevorzugt in hydroxylierte Form
mit einer oder zwei Hydroxylgruppen. Das können aber auch
Hydroxyl- oder Ketofunktionen des Ringsystems sein. Daneben sind
weitere Strukturfragmente möglich, insofern sie im pH-Bereich
zwischen 3,5 und 8,5 keine anionisch dissoziierten Molekülteile
bilden, wie beispielsweise Carbonsäuren, Sulfonsäuren
oder manche aromatische Hydroxylgruppen oder Enole.
-
Stickstoffbasen
mit bevorzugten pKa-Werten entstehen auch durch einfache oder mehrfache
Substitution des Stickstoffatoms mit Niederalkanhydroxylen, etwa
Hydroxymethyl- oder Hydroxyethylgruppen. Geeignete organische Basen
aus dieser Gruppe sind beispielsweise Aminopropandiole, Triethanolamine, Tris-(hydroxymethyl)methylamine,
Bis-(hydroxymethyl)methylamine, Tris-(hydroxyethyl)methylamine,
Bis-(hydroxyethyl)methylamine oder die entsprechend substituierten
Ethylamine. Die Ankopplung dieser Fragmente an den hydrophoben Molekülteil
kann entweder über den Stickstoff der Base erfolgen oder über
ein der Hydroxylfunktionen.
-
Neben
den Sterolderivaten mit einem einzelnen organischen Kation werden
auch solche mit zwei oder drei gleichen oder verschiedenen dieser
Gruppen bevorzugt. Dabei müssen alle Gruppen einen pKa-Wert
im genannten Bereich besitzen. Eine geeignete komplexe Gruppe ist
das Amid aus Histamin und Histidin oder aus Histamin und Histindinylhistidin.
-
Anionische
Gruppen wie etwa Carbonsäuren, Sulfonsäuren, Enole
oder aromatische Hydroxyle dürfen nur dann Bestandteil
des Moleküls sein, wenn sie im beanspruchten pH-Bereich
zwischen 3,5 und 8,5 nicht dissoziiert vorliegen. Das ist im allgemeine
der Fall, wenn deren pKa-Wert oberhalb von 9,5 liegt.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsvariante hat die verbindende
Gruppe X die Struktur -NH-(C=O)-O- oder -O-(C=O)-NH- und die Gruppe
Y eine Struktur ausgewählt aus -(C=O)-NH-; -O-(C=O)-NH-; -NH-(C=O)-O-;
-(C=O)-S-; -O-; -NH-; -S-; -CH=N-.-O-(O=C)-; -(C=O)-O-; -S-(O=C)-;
-NH-(O=C)- oder N=CH-.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat die verbindende
Gruppe X eine Struktur ausgewählt aus -(C=O)-NH-; -O-(C=O)-NH-;
-NH-(C=O)-O-; -(C=O)-S-; -O-; -NH-; -S-; -CH=N-.-O-(O=C)-; -(C=O)-O-;
-S-(O=C)-; -NH-(O=C)- oder N=CH- und die Gruppe Y die Struktur -O-(C=O)-NH-
oder NH-(C=O)-O-.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung
ist Spacer 1 ist ein Niederalkylrest mit linearer, verzweigter oder
ringförmiger Struktur, der 1 bis 8 C-Atome besitzt und
0, 1 oder 2 ethylenische ungesättigte Bindungen enthält.
Spacer 1 kann zur Erhöhung der Polarität des Moleküls
Hydroxylgruppen besitzen. Spacer 1 kann insbesondere ein Zucker
sein. Spacer 2 ist ein Niederalkylrest mit linearer, verzweigter oder
ringförmiger Struktur, der 0 bis 8 C-Atome besitzt und
0, 1 oder 2 ethylenische ungesättigte Bindungen enthält.
Spacer 2 kann zur Erhöhung der Polarität des Moleküls
Hydroxylgruppen besitzen. Spacer 2 kann insbesondere ein Zucker
sein.
-
Methoden
zur Ausführung solcher Kopplungsreaktionen sind dem Fachmann
bekannt und werden je nach verwendetem Ausgangsstoff und Kopplungskomponente
variieren. Typische Reaktionen sind die Veresterung, die Amidierung,
die Addition von Aminen an Doppelbindungen, die Veretherung oder
auch die reduktive Aminierung.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung
sind die Sterole insbesondere das Cholesterol, das Sitosterol, das
Campesterol, das Desmosterol, das Fucosterol, das 22-Ketosterol,
das 20-Hydroxysterol, das Stigmasterol, das 22-Hydroxycholesterol,
das 25-Hydroxycholesterol, das Lanosterol, das 7-Dehydrocholesterol,
das Dihydrocholesterol, das 19-Hydroxycholesterol, das 5☐-Cholest-7-en-3β-ol,
das 7-Hydroxycholesterol, das Epicholesterol, das Ergosterol, das
Dehydroergosterol und andere verwandte Verbindungen.
-
Die
verwendeten Sterole können an ihrer 3-Position verschiedene
Gruppen tragen, die eine einfache und beständige Ankopplung
erlauben. Besonders geeignet für eine direkte Kopplung
sind die natürlicherweise vorhandene Hydroxylgruppe, aber
auch das Chlor der Sterolchloride, oder etwa die Aminogruppe der
Sterolamine oder die Thiolgruppe des Thiocholesterols.
-
In
einer Ausführungsvariante kann das erfindungsgemäße
Sterol eine der folgenden Strukturen umfassen, ohne darauf beschränkt
zu sein.
-
-
Die
Erfindung betrifft auch Liposomen, die die erfinderischen Substanzen
umfassen. Alle erfindungsgemäßen Substanzen oder
Verbindungen lassen sich in einem hohen Anteil in liposomale Membranen
einbauen.
-
In
einer besonderen Ausführungsvariante der Erfindung beträgt
der Anteil des Sterolderivats in der liposomalen Membran zwischen
3% und 100%, bevorzugt zwischen 5% und 80% und ganz bevorzugt zwischen 7%
und 70%.
-
Zweckmäßig
ist weiterhin eine Ausführungsvariante, bei der die Liposomen
insbesondere Phosphatidylcholin, Phophatidylethanolamin und/oder
Diacylglycerol umfassen. Da Cholesterole selbst keine Liposomen
ausbilden können, ist der Zusatz eines weiteren Lipids
notwendig. Dieses Lipid kann insbesondere ein Phospholipid sein.
In einer bevorzugten Ausführung, werden die Phosphatidylcholine
aus folgender Gruppe ausgewählt: POPC, natürliches
oder hydrogeniertes Soja-PC, natürliches oder hydrogeniertes
Ei-PC, DMPC, DPPC DSPC or DOPC. Die Phosphatidylethanolamine können
bevorzugt aus der Gruppe DOPE, DMPE und DPPE ausgewählt
werden. In einer weiteren Ausführung können die
Liposomen auch das neutrale Lipid Cholesterin umfassen.
-
Weitere
Modifikationen des Liposoms sind selbstverständlich möglich.
So ist insbesondere die Verwendung Polyethylenglykol-modifizierter
Phospholipide oder analoger Verbindungen vorteilhaft.
-
In
einer weiteren Ausführungsform sind die Liposomen, welche
die erfindungsgemäßen Verbindungen umfassen, amphotere
Liposomen. Amphotere Liposomen stellen eine kürzlich in
WO 02/066012 beschriebene neue
Klasse von Liposomen dar, welche bei einem pH-Wert von 7,5 anionisch
oder neutral geladen sind und bei einem pH-Wert von 4 eine kationische
Ladung besitzen. Diese Liposomen können aus Lipidmischungen hergestellt
werden, welche entweder ein amphoteres Lipid oder eine Mischung
von Lipiden mit amphoteren Eigenschaften und optional ein neutrales
Lipid umfassen.
-
In
einer weiteren Ausführungsvariante der Erfindung weisen
die Liposomen eine mittlere Größe zwischen 50
und 1000 nm, bevorzugt zwischen 50 und 300 nm und ganz besonders
bevorzugt zwischen 60 und 130 nm auf.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante umfassen
die Liposomen Wirkstoffe. Die erfindungsgemäßen
Liposomen sind beispielsweise für die parenterale Anwendung
geeignet. Sie können z. B. in der Krebstherapie und zur
Therapie schwerer Infektionen verwendet werden. Liposomendispersionen
können dazu injiziert, infundiert oder implantiert werden.
Sie verteilen sich danach im Blut oder in der Lymphe oder geben
als Depot ihren Wirkstoff kontrolliert ab. Letzteres kann durch
hochkonzentrierte Dispersionen erreicht werden, die als Gele vorliegen.
Die Liposomen können auch für topische Anwendung
auf der Haut eingesetzt werden. Sie können insbesondere
dazu beitragen, dass verschiedene Wirkstoffe besser in die Haut
eindringen können oder sogar durch die Haut in den Körper
gelangen können. Weiterhin ist es möglich die
Liposomen für den Gentransfer einzusetzen. Genetisches
Material kann wegen seiner Größe und Ladung meist
nicht ohne Hilfsmittel in Zellen gelangen. Dazu bedarf es geeigneter
Träger wie z. B. Liposomen oder Lipid-Komplexen. Diese
sollen zusammen mit der DNA effizient und möglichst gezielt
in die betroffenen Zellen aufgenommen werden. Dazu werden zelleigene
Transportmechanismen wie die Endozytose herangezogen. Die erfindungsgemäßen
Liposomen sind selbsverständlich auch als Modellmembranen
einsetzbar. Liposomen sind in ihrer prinzipiellen Struktur den Zellmembranen
sehr ähnlich. Sie können daher als Membranmodelle
eingesetzt werden, um die Permeationsgeschwindigkeit von Wirkstoffen
durch Membranen oder die Membranbindung von Wirkstoffen zu quantifizieren.
-
In
einer bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung umfassen
die Liposomen als Wirkstoff ein Protein, ein Peptid, Nukleinsäuren
wie z. B. eine DNA, eine RNA, ein antisense-Nukleotid, eine siRNA und/oder
ein Decoy-Nukleotid.
-
Nukleinsäuren
können eingeteilt werden in Nukleinsäuren, welche
ein oder mehrere spezifische Sequenzen für Proteine, Polypeptide
oder RNAs codieren und in Oligonukleotide, die sehr spezifisch die
Expression eines Proteins hemmen können.
-
In
einer Ausführung der Erfindung codieren die Nukleinsäuren
ein oder mehrere Sequenzen für Proteine, Polypeptide oder
RNAs und werden schließlich in die entsprechenden Proteine,
Polypeptide oder RNAs translatiert. Diese Nukleinsäuren
umfassen zirkuläre DNA-Plasmide, lineare DNA-Konstrukte,
wie MIDGE Vektoren (Minimalistic Immunogenically Defined Gene Expression),
offenbart in
WO 9821322
A1 und
DE
197 53 182 A1 und mRNAs zur direkten Translation (eg.
EP 1392341 B1 ).
-
In
einer weiteren Ausführung der Erfindung werden Oligonucleotide
eingesetzt, deren Ziel Nukleinsäuren sind, die für
spezifische Proteine codieren, so daß die Expression der
Proteine moduliert wird. Bei dieser Erfindung umfaßt der
Begriff "Ziel-Nukleinsäure" DNA, die für spezifische
Proteine codiert, sowie sämtliche von derartiger DNA abgeleiteten
RNAs, die pre-mRNA oder mRNA sind. Spezifische Hybridisierung zwischen
der Ziel-Nucleinsäure und einem oder mehreren Oligonucleotiden,
die gegen solche Sequenzen gerichtet sind, führt zur Hemmung
der Protein-Expression. Um ein solches spezifisches Targeting zu
erreichen, muß das Oligonucleotid einen kontinuierlichen
Strang aus Nukleotiden aufweisen, die zur Sequenz der Ziel-Nukleinsäure komplementär
sind.
-
Oligonucleotide,
die die vorstehend erwähnten Kriterien erfüllen,
lassen sich mit einer Reihe verschiedener chemischer Eigenschaften
und Topologien aufbauen. Die Oligonucleotide können einzelsträngig
oder doppelsträngig sein. Zu den einzelsträngigen
Oligonucleotiden gehören – ohne jedoch darauf
beschränkt zu sein – DNA-basierte Oligonucleotide,
geschlossene Nucleinsäuren, 2'-modifizierte Oligonucleotide
und andere, die allgemein als Antisense-Oligonucleotide geläufig
sind. Zu den Gerüst- oder Basenmodifikationen zählen – ohne
jedoch darauf beschränkt zu sein – Phosphothioat-DNA
(PTO), 2'O-Methyl-RNA (2'Ome), 2'O-Methoxyethyl-RNA (2'MOE), Peptid-Nucleinsäuren
(PNA), N3'-P5'-Phosphoamidate (NP), 2'-Fluorarabinonucleinsäuren
(FANA), geschlossene Nucleinsäuren (LNA), Morpholinphosphoamidat-(Morpholino),
Cyclohexennucleinsäuren (CeNA), Tricyclo-DNA (tcDNA) und
andere. Überdies sind auch gemischte chemische Gebilde
in der Fachwelt bekannt, wobei diese aus mehr als einer einzigen
Nucleotid-Spezies als Copolymere, Blockcopolymere oder Gapmere oder
in anderen Anordnungen aufgebaut sind.
-
Außer
mit den oben genannten Oligonucleotiden kann eine Proteinexpression
auch mit doppelsträngigen RNA-Molekülen gehemmt
werden, die die komplementären Sequenzmotive enthalten.
Derartige RNA-Moleküle sind in der Fachwelt als siRNA-Moleküle
bekannt (eg.
WO 9932619
A1 or
WO
02055693 A2 ). Wiederum wurden verschiedene chemische Eigenschaften
dieser Klasse von Oligonucleotiden angepaßt. Auch DNA/RNA-Hybridsysteme
sind in der Fachwelt bekannt.
-
Decoy
Oligonukleotide stellen eine weitere Klasse von Oligonukleotiden
dar. Diese doppelsträngigen DNA Moleküle zielen
nicht auf Nukleinsäuren sondern auf Transkriptionsfaktoren.
Das bedeutet, dass Decoy Oligonukleotide sequenz-spezifisch an die
Transkriptionsfaktoren (DNA-bindende Proteine) binden und dadurch
die Transkription inhibieren (eg. Cho-Chung et al. in Curr
Opin Mol Ther., 1999).
-
Alle
beschriebenen Oligonucleotide können in der Länge
variieren zwischen nur 10, vorzugsweise 15 und mehr bevorzugt 18
und 50, vorzugsweise 30 und besonders bevorzugt 25 Nucleotiden.
Vorzugsweise passen Oligonucleotid und Zielsequenz perfekt zusammen,
wobei jede Base des Oligonucleotids über einen ununterbrochenen
Strang aus der vorstehend erwähnten Anzahl von Nucleotiden
ein Basenpaar mit ihrer komplementären Base auf der Ziel-Nukleinsäure
bildet. Weniger bevorzugt ist es, wenn dieses Sequenzpaar eine Fehlpaarung
innerhalb des kontinuierlichen Strangs aus Basenpaaren enthält.
-
Liposomen,
die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen
hergestellt werden, zeigen vorteilhafter Weise nur eine geringe
unspezifische Bindung an Zelloberflächen. Diese geringe
unspezifische Bindung ist eine wesentliche Voraussetzung für
das Zustandekommen einer spezifischen Bindung an Zielzellen. Werden
die beschriebenen Liposomen mit weiteren Liganden versehen, so ist
eine Zielsteuerung der Vehikel gegeben. Der Wirkstoff kann dann
spezifisch an solchen Zellen oder Geweben angereichert werden, die pathologische
Zustände aufweisen.
-
Eine
wesentliche Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen
liegt daher bei der Konstruktion von Vektoren für den Wirkstofftransfer
in lebenden Organismen. Die Vektoren sind besonders geeignet für
den Transport von therapeutischen Makromolekülen wie etwa
Proteinen oder DNA, die von sich aus nicht die Zellmembran überwinden
können oder im Blutstrom schnell abgebaut werden.
-
Mit
Vorteil können Antikörper, Lektine, Hormone oder
andere Wirkstoffe unter schonenden Bedingungen in hoher Ausbeute
auf die Oberfläche von Liposomen gekoppelt werden.
-
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante befinden
sich mindestens 80% des Wirkstoffes im Innern des Liposoms.
-
Die
Erfindung betrifft auch Verwendung der Liposomen zur Herstellung
von Nanokapseln.
-
Die
Erfindung betrifft weiterhin Verwendung der Liposomen zur Herstellung
von Freisetzungssystemen in der Diagnostik.
-
Mit
Vorteil werden die Liposomen zum Transport und/oder zur Freisetzung
von Wirkstoffen verwendet.
-
Zweckmäßig
ist in einer weiteren Ausgestaltung Verwendung der Liposomen Depotformulierung und/oder
als zirkulierendes Depot.
-
Mit
Vorteil können die Liposomen insbesondere bei intravenöser
oder peritonealer Applikation verwendet werden.
-
Vorteilhaft
ist in einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung die Verwendung
der Liposomen als Vektor zur Transfektion von Zellen in vivo, in
vitro und ex vivo.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 02/066012 [0027]
- - WO 9821322 A1 [0032]
- - DE 19753182 A1 [0032]
- - EP 1392341 B1 [0032]
- - WO 9932619 A1 [0035]
- - WO 02055693 A2 [0035]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Handbook of
Chemistry and Physics, 73. Band, S. 8–37 ff. [0007]
- - Cho-Chung et al. in Curr Opin Mol Ther., 1999 [0036]
