DE10207177A1

DE10207177A1 - Fakultativ kationische Lipide

Info

Publication number: DE10207177A1
Application number: DE10207177A
Authority: DE
Inventors: Steffen Panzner
Original assignee: Novosom AG
Current assignee: Novosom AG
Priority date: 2002-02-19
Filing date: 2002-02-19
Publication date: 2003-09-04
Also published as: AU2003210303A1; US8192753B2; JP2005526727A; EP1480621A1; US20060002991A1; WO2003070220A1

Abstract

Es wird ein fakultativ kationisches Lipid mit einem pKa-Wert zwischen 3,5 und 8 nach der allgemeinen Formel Kation-Spacer-Y-Spacer-X-Lipid vorgeschlagen, wobei Y und X verbindende Gruppen darstellen. Es werden weiterhin Liposome beschrieben, die diese fakultativ kationischen Lipide enthalten.

Description

Die Erfindung betrifft polare Verbindungen auf Basis amphiphiler Moleküle, wobei an deren hydrophile Kopfgruppe ein oder mehrere organische Kationen mit einem pK-Wert zwischen 3,5 und 8 substituiert ist. Die Erfindung betrifft auch Liposomen, die diese Verbindungen enthalten.
Unter dem Begriff der Lipide werden drei Klassen von Naturstoffen zusammengefasst, die sich aus biologischen Membranen isolieren lassen: Phospholipide, Sphingolipide und Cholesterol mit seinen Derivaten. Technisch hergestellte Verbindungen mit ähnlichen Eigenschaften sind die Diacylglycerole oder N,N-Dialkylamine.
Von technischem Interesse sind diese Substanzen bei der Herstellung von Liposomen. Diese Liposomen lassen sich unter anderem als Container für Wirkstoffe bei pharmazeutischen Zubereitungen einsetzen. Wünschenswert ist dabei eine effiziente und stabile Verpackung des Cargos und eine kontrollierbare Freisetzung des Inhalts. Beide Ansprüche sind nicht ohne weiteres zu vereinen: Je stabiler und dichter die Verpackung ist, desto schwerer gibt sie den eingeschlossenen Wirkstoff wieder frei. Aus diesem Grund wurden Liposomen entwickelt, die ihre Eigenschaften als Reaktion auf einen äußeren Reiz verändern. Bekannt sind thermosensible und pH- sensitive Liposomen. Die pH-sensitiven Liposomen sind von besonderem Interesse, da dieser Parameter sich auch unter physiologischen Umständen, etwa bei der endozytotischen Aufnahme eines Liposoms in Zellen oder bei der Passage des Magen-Darm-Trakts, ändern kann.
Im weiteren sollen folgende Abkürzungen verwendet werden:
CHENS: Cholesterolhemisuccinat
PC: Phospatidylcholin
PE: Phosphatidylethanolamin
PS: Phosphatidylserin
Nach dem Stand der Technik umfassen pH-sensitive Liposomen insbesondere CHEMS. CHEMS in Mischung mit Phosphatidylethanolamin zur Herstellung pH-sensitiver Liposomen verwendet (Tachibana et al. (1998); BBRC 251: 538-544, US 4891208). Solche Liposomen können von Zellen endozytiert werden und vermögen auf diesem Weg Cargomoleküle in das Innere von Zellen zu transportieren, ohne die Integrität der zellulären Membran zu verletzen.
Ein wesentlicher Nachteil des CHEMS ist dessen anionischer Charakter. Die damit hergestellten Liposomen besitzen eine negative Gesamtladung und werden nachteiliger Weise nur mit geringer Effizienz von Zellen aufgenommen. Trotz des oben beschriebenen Transfermechanismus eignen sie sich daher kaum für den Eintransport von Makromolekülen in Zellen.
Für diesen Zweck werden fachgemäß kationische Liposomen verwendet, die über eine möglichst hohe und konstante Oberflächenladung verfügen. Die positive Gesamtladung solcher Partikel führt zu einer elektrostatischen Anheftung an Zellen und in der Folge zu einem effizienten Eintransport. Der Einsatz dieser Verbindungen und der damit hergestellten Liposomen bleibt aber auf Anwendungen in vitro oder ex vivo beschränkt, da solche positiv geladenen Liposomen mit Serumbestandteilen nachteilig unkontrollierte Aggregate bilden.
Es bestand daher die Aufgabe, neue Verbindungen herzustellen,

a) mit deren Hilfe Wirkstoffe in Liposomen eingeschlossen und bei einer Veränderung des pH-Wertes wieder freigesetzt werden können und
b) durch deren Anwesenheit die Herstellung von kationischen Liposomen gelingt, die ohne Bildung von größeren Aggregaten mit Serum gemischt werden können.

Weitere Aufgaben der Erfindung bestanden darin, dass die gesuchten Verbindungen sich einfach und preiswert herstellen lassen und in hohem Anteil in liposomale Membranen eingebaut werden können.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch amphipatische Verbindungen mit einem pKa-Wert zwischen 3,5 und 8 nach der allgemeinen Formel:

Kation-Spacer-Y-Spacer-X-Lipid,

wobei Y und X verbindende Gruppe darstellen. Je nach verwendetem Kation erhält man Verbindungen, die bei einem spezifischen pH-Wert ihre Ladung ändern und sich durch die Lipidkomponente zu einem hohen Anteil in liposomale Membranen einbauen lassen. Als Ausgangsverbindung können einfache und billige Diacylglycerole oder N,N-Dialkylamine oder deren Derivate, insbesondere Phosphoglycerole oder 3-Amino-1,2- proapandiole verwendet werden.
Zwischen dem Kation und dem Lipid liegen die Molekülfragmente: Spacer-Y-Spacer-X. Der Spacer ist ein Niederalkylrest mit linearer, verzweigter oder ringförmiger Struktur, der 0 bis 8 C-Atome besitzt und 0, 1 oder 2 ethylenische ungesättigte Bindungen enthält. Spacer kann zur Erhöhung der Polarität des Moleküls Hydroxylgruppen besitzen. Spacer kann insbesondere ein Zucker sein. Spacer kann vorteilhafterweise auch ein Polyethylenglykol sein, wobei dieser bis zu 20 Monomereinheiten umfassen kann.
Unter den membranbildenden oder membranständigen Gruppen einer Bilayermembran sind Amphiphile wie Diacylglycerole, Dialkylglycerole, Phosphoglycerole, acylierte oder alkylierte 3-Amino-1,2-Propandiole oder auch die N,N-Dialkylamine von besonderem Interesse, da diese Verbindungen insbesondere billig verfügbar sind, eine einfache Chemie aufweisen und in einem hohen Anteil in Membranen eingebaut werden können, ohne deren Permeabilität zu erhöhen oder gar den Membrancharakter völlig zu zerstören.
Das Gesamtmolekül erhält seine pH-abhängige Ladungscharakteristik durch ein oder mehrere organische Kationen mit einem pKa-Wert zwischen 3,5 und 8. Typische Moleküle oder Molekülfragmente mit dieser Eigenschaft sind Stickstoffbasen. Diese Stickstoffbasen werden über Spacer und Kopplungsgruppen mit dem Lipid verknüpft, so dass eine Verbindung nach der erfindungsgemäßen Formel entsteht. In vielen Fällen, etwa wenn die Stickstoffbasen als Ringsysteme vorliegen, existieren Stellungsisomere, bei denen der verbindende Spacer an verschiedenen Positionen des organischen Kations substituiert ist. Solche Stellungsisomere fallen unter den Offenbarungsgehalt dieser Erfindung. Durch die Stellungsisomerie allein lassen sich in vielen Fällen bereits die pKa-Werte der organischen Kationen beeinflussen. Die dem zugrunde liegenden Regeln sind dem Fachmann geläufig. Alternativ können diese Einflüsse aus Tabellenwerken abgeschätzt werden (Handbook of Chemistry and Physics, 73. Band, S. 8-37 ff.).
In einer bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung weist die Verbindung einen pKa-Wert zwischen 4 und 6,5 auf. Dieser pKa-Wert liegt vorteilhafter Weise in einem Bereich, der für die Physiologie zahlreicher Organismen eine entscheidende Bedeutung besitzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung sind die Kationen Stickstoffbasen. Vorzugsweise sind die Kationen aus Piperazinen, Imidazolen, Morpholinen, Purinen und/oder Pyrimidinen herleitbar.
Durch Ankopplungsreaktionen entstehen amphiphile organische Kationen, die beispielsweise aus den folgenden Stoffklassen stammen:
o-, m-, p-Aniline; 2-,3- oder 4-substituierte Anisidine, Toluidine oder Phenetidine; 2-,3-,5-,6-,7- oder 8- substituierte Benzimidazole, 2-,3,4- oder 5-substituierte Imidazole, 1-, oder 5-substituierte Isochinoline, 2-,3- oder 4-substituierte Morpholine, 2-,3- oder 4-substituierte Picoline, 1-,2-, oder 3-substitutierte Piperazine, 2-,5- oder 6-modifizierte Pterine, 3-,4-,5-,6- oder 9- substituierte Purine, 2- oder 3-substituierte Pyrazine, 3- oder 4- substituierte Pyridazine, 2-,3- oder 4-modifizierte Pyridine, 2-,4-,5- oder 6-subsituierte Pyrimidine, 1-,2-,3-, 4-,5-,6- oder 8-substituierte Chinoline, 2-,4- oder 5- substituierte Thiazole, 2-,4- oder 6-substituierte Triazine, oder auch Abkömmlinge des Tyrosins. Besonders bevorzugt sind Piperazine, Imidazole, Morpholine, Purine und/oder Pyrimidine.
Ganz besonders bevorzugt sind solche Molekülfragmente, wie sie in biologischen Systemen vorkommen, also beispielsweise 4- Imidazole (Histamine), 2-,6- oder 9-Purine (Adenine, Guanine, Adenosine oder Guanosine), 1-,2- oder 4-Pyrimidine (Uracile, Thymine, Cytosine, Uridine, Thymidine, Cytidine) oder auch Pyridin-3-carbonsäuren (Nicotinsäureester oder -amide).
Die hier genannten Strukturfragmente können weitere Substituenten aufweisen. Das können beispielsweise Methyl-, Ethyl-, Propyl- oder Isopropylreste sein, besonders bevorzugt in hydroxylierte Form mit einer oder zwei Hydroxylgruppen. Das können aber auch Hydroxyl- oder Ketofunktionen des Ringsystems sein. Daneben sind weitere Strukturfragmente möglich, insofern sie im pH-Bereich zwischen 3,5 und 8,5 keine anionisch dissoziierten Molekülteile bilden, wie beispielsweise Carbonsäuren, Sulfonsäuren oder manche aromatische Hydroxylgruppen oder Enole.
Stickstoffbasen mit bevorzugten pKa-Werten entstehen auch durch einfache oder mehrfache Substitution des Stickstoffatoms mit Niederalkanhydroxylen, etwa Hydroxymethyl- oder Hydroxyethylgruppen. Geeignete organische Basen aus dieser Gruppe sind beispielsweise Aminopropandiole, Triethanolamine, Tris-(hydroxymethyl)methylamine, Bis-(hydroxymethyl) methylamine, Tris-(hydroxyethyl)methylamine, Bis- (hydroxyethyl)methylamine oder die entsprechend substituierten Ethylamine. Die Ankopplung dieser Fragmente an den hydrophoben Molekülteil kann entweder über den Stickstoff der Base erfolgen oder über ein der Hydroxylfunktionen.
Neben den Derivaten mit einem einzelnen organischen Kation werden auch solche mit zwei oder drei gleichen oder verschiedenen dieser Gruppen bevorzugt. Dabei müssen alle Gruppen einen pKa-Wert im genannten Bereich besitzen. Eine geeignete komplexe Gruppe ist das Amid aus Histamin und Histidin oder aus Histamin und Histindinylhistidin.
Anionische Gruppen wie etwa Carbonsäuren, Sulfonsäuren, Enole oder aromatische Hydroxyle dürfen nur dann Bestandteil des Moleküls sein, wenn sie im beanspruchten pH-Bereich zwischen 3,5 und 8,5 nicht dissoziiert vorliegen. Das ist im allgemeine der Fall, wenn deren pKa-Wert oberhalb von 9,5 liegt.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung sind die amphipatischen Molekülteile (im folgenden als Amphiphil oder Lipid bezeichnet): Diacylglycerole, Dialkylglycerole, Phosphoglycerole, acylierte oder alkylierte 3-Amino-1,2- Propandiole oder auch die N,N-Dialkylamine. Die in diesen Fragmenten vorhandenen langkettigen Alkyle oder Acyle umfassen zwischen 8 und 30 C-Atome. Sie sind vorzugsweise geradkettig oder wenig verzweigt und können 0,1, oder 2 ethylenisch ungesättigte Bindungen aufweisen. Besonders bevorzugt sind solche Substituenten, die man in natürlichen Lipiden findet, also geradkettige Fettsäuren oder Alkohole mit 12 bis 20 C- Atomen und keiner, einer oder zwei ungesättigten Bindungen. Für die N,N-Dialkylamine gilt das sinngemäß für deren langkettige Alkylreste.
Die mit Vorteil als Ausgangsstoff verwendeten Amphiphile können an ihrer hydrophilen Kopfgruppe verschieden funktionalisiert sein, um zweckmäßigerweise eine einfache und beständige Ankopplung erlauben oder optional die Funktion eines räumlichen Spacers zu erfüllen. Besonders geeignet für eine direkte Kopplung sind die vorhandene Hydroxylgruppe oder eine Aminogruppe.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung umfasst die verbindende Gruppe X die Struktur -(C=O)-O-; -(C=O)-NH-; -NH-(C=O)-O-; -O-; -NH-; oder -CH=N-. Vorteilhafterweise entspricht die verbindende Gruppe Y in ihrer Struktur der Gruppe X, zusätzlich kann sie die Struktur -O-(O=C)-; -S-; (O=C)-; -NH-(O=C)-; -O-(O=C)-NH- oder -N=CH- umfassen. Die Gruppe Y kann beispielsweise entfallen, wenn sich das Amphoter direkt an das Amphiphil koppeln lässt, beispielsweise bei der Veresterung von Imidazolessigsäure mit Dipalmitoylglycerol.
Methoden zur Ausführung solcher Kopplungsreaktionen sind dem Fachmann bekannt und werden je nach verwendetem Ausgangsstoff und Kopplungskomponente variieren. Typische Reaktionen sind die Veresterung, die Amidierung, die Addition von Aminen an Doppelbindungen, die Veretherung oder auch die reduktive Aminierung.
Besonders bevorzugte Moleküle lassen sich herstellen durch

a) Veresterung von Diacylglycerolen
b) Veresterung oder Amidierung von Diacylglycerolhemisuccinat
c) Addition von Aminen an die Doppelbindung eines Diacylglycerolhemimaleats
d) Amidierung von Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidylserin
e) Amidierung oder Alkylierung von 3-Amino-1,2- propandioldiestern.

Zu den besonders bevorzugten amphoteren Komponenten gehören beispielsweise die folgenden Verbindungen, wobei R1 oder R2 das Amphiphil bedeuten und ( )n weitere Molekülteile im Sinne des oben definierten Spacers darstellen.
Die Erfindung betrifft auch Liposomen, die die erfinderischen Substanzen umfassen. Alle erfindungsgemäßen Substanzen oder Verbindungen lassen sich in einem hohen Anteil in liposomale Membranen einbauen und führen erst dann zu einer positiven Ladung des Gesamtpartikels, wenn der pH-Wert des Mediums kleiner als (pKa + 1) der erfindungsgemäßen Verbindungen ist.
In einer besonderen Ausführungsvariante der Erfindung beträgt der Anteil des fakultativ kationischen Lipids maximal 50 mol%. Besonders bevorzugt sind Zusammensetzungen, die mindestens 5 mol%, höchstens aber 40 mol% der Verbindung enthalten. Ganz besonders bevorzugt sind Zusammensetzungen, die mindestens 10 mol% und höchsten 30 mol% des fakultativ kationischen Lipids enthalten.
Zweckmäßig ist weiterhin eine Ausführungsvariante, bei der die Liposomen insbesondere Phosphatidylcholin, Phophatidylethanolamin und/oder Diacylglycerol umfassen. Da Cholesterole selbst keine Liposomen ausbilden können, ist der Zusatz eines weiteren Lipids notwendig. Dieses Lipid kann insbesondere ein Phospholipid sein. Weitere Modifikationen des Liposoms sind selbstverständlich möglich. So ist insbesondere die Verwendung Polyethylenglykol-modifizierter Phospholipide oder analoger Verbindungen vorteilhaft.
Für die Herstellung amphoterer Liposomen können anionische Lipide wie etwa Phosphatidylglycerol zugesetzt werden. Diese amphoteren Liposomen sind bei Applikationen in vivo besser verträglich, da sie keine Aggregate mit Serumkomponenten bilden.
In einer weiteren Ausführungsvariante der Erfindung weisen die Liposomen eine mittlere Größe zwischen 50 und 1000 nm, bevorzugt zwischen 50 und 300 nm und ganz besonders bevorzugt zwischen 60 und 130 nm auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsvariante umfassen die Liposomen Wirkstoffe. Die erfindungsgemäßen Liposomen sind beispielsweise für die parenterale Anwendung geeignet. Sie können z. B. in der Krebstherapie und zur Therapie schwerer Infektionen verwendet werden. Liposomendispersionen können dazu injiziert, infundiert oder implantiert werden. Sie verteilen sich danach im Blut oder in der Lymphe oder geben als Depot ihren Wirkstoff kontrolliert ab. Letzteres kann durch hochkonzentrierte Dispersionen erreicht werden, die als Gele vorliegen. Die Liposomen können auch für topische Anwendung auf der Haut eingesetzt werden. Sie können insbesondere dazu beitragen, dass verschiedene Wirkstoffe besser in die Haut eindringen können oder sogar durch die Haut in den Körper gelangen können. Weiterhin ist es möglich die Liposomen für den Gentransfer einzusetzen. Genetisches Material kann wegen seiner Größe und Ladung meist nicht ohne Hilfsmittel in Zellen gelangen. Dazu bedarf es geeigneter Träger wie z. B. Liposomen oder Lipid-Komplexen. Diese sollen zusammen mit der DNA effizient und möglichst gezielt in die betroffenen Zellen aufgenommen werden. Dazu werden zelleigene Transportmechanismen wie die Endozytose herangezogen. Die erfindungsgemäßen Liposomen sind selbsverständlich auch als Modellmembranen einsetzbar. Liposomen sind in ihrer prinzipiellen Struktur den Zellmembranen sehr ähnlich. Sie können daher als Membranmodelle eingesetzt werden, um die Permeationsgeschwindigkeit von Wirkstoffen durch Membranen oder die Membranbindung von Wirkstoffen zu quantifizieren.
Liposomen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen hergestellt werden, zeigen vorteilhafter Weise nur eine geringe unspezifische Bindung an Zelloberflächen. Das ist insbesondere dann der Fall, wenn weitere anionische Lipide zu Herstellung verwendet werden. Diese geringe unspezifische Bindung ist eine wesentliche Voraussetzung für das Zustandekommen einer spezifischen Bindung an Zielzellen. Werden die beschriebenen Liposomen mit weiteren Liganden versehen, so ist eine Zielsteuerung der Vehikel gegeben. Der Wirkstoff kann dann spezifisch an solchen Zellen oder Geweben angereichert werden, die pathologische Zustände aufweisen.
Eine wesentliche Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen liegt daher bei der Konstruktion von Vektoren für den Wirkstofftransfer in lebenden Organismen. Die Vektoren sind besonders geeignet für den Transport von therapeutischen Makromolekülen wie etwa Proteinen oder DNA, die von sich aus nicht die Zellmembran überwinden können oder im Blutstrom schnell abgebaut werden.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung umfassen die Liposomen als Wirkstoff ein Protein, ein Peptid, eine DNA, eine RNA, ein antisense-Nukleotid und/oder ein Decoy-Nukleotid.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante befinden sich mindestens 80% des Wirkstoffes im Innern des Liposoms.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Wirkstoffbeladung der Liposomen, wobei ein definierter pH-Wert zur Verkapselung benutzt wird und ein zweiter pH-Wert zur Abtrennung des nicht gebundenen Wirkstoffes eingestellt wird.
Die Erfindung betrifft auch Verwendung der Liopsomen zur Herstellung von Nanokapseln.
Die Erfindung betrifft weiterhin Verwendung der Liposomen zur Herstellung von Freisetzungssystemen in der Diagnostik.
Mit Vorteil werden die Liposomen zum Transport und/oder zur Freisetzung von Wirkstoffen verwendet.
Zweckmäßig ist in einer weiteren Ausgestaltung Verwendung der Liposomen Depotformulierung und/oder als zirkulierendes Depot.
Mit Vorteil können die Liposomen insbesondere bei intravenöser oder peritonealer Applikation verwendet werden.
Vorteilhaft ist in einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung die Verwendung der Liposomen als Vektor zur Transfektion von Zellen in vivo, in vitro und ex vivo.
Es wurde darüber hinaus überraschenderweise gefunden, das in Liposomen, deren Membran die hier beschriebenen Verbindungen enthält, überdurchschnittlich hohe Mengen an Proteinen oder DNA eingeschlossen werden können. Die Effizienz dieses Einbaus ist dabei abhängig vom pH-Wert der verwendeten Lösung. Ein Prozess für die effiziente Verkapselung von Proteinen oder DNA in die Liposomen kann daher so geführt werden, dass zunächst ein pH-Wert eingestellt wird, der zu einer guten Bindung der Cargomoleküle in die Liposomen führt. Für DNA als Polyanion werden hier niedrige pH-Werte von etwa 4 bis 5 verwendet. Bei Proteinen richtet sich der nutzbare pH-Wert nach dem isoelektrischen Punkt des Proteins. Dieser sollte unterhalb des pKa-Wertes der erfindungsgemäßen Substanz liegen. Eine Verkapselung ist dann besonders effektiv, wenn der pH-Wert des Mediums so gewählt wird, dass er zwischen dem isoelektrischen Punkt des Proteins und dem pKa-Wert des fakultativ kationischen Lipids liegt. Die Proteine sind dann negativ geladen, die Lipidschicht hat bereits eine positive Nettoladung.
Nicht eingebaute, außen anhaftende Cargomoleküle können wenn nötig durch einen einfache Erhöhung des pH-Wertes entfernt werden. Dieser Schritt ist immer dann notwendig, wenn nicht eingebaute Cargomoleküle zu einer Aggregation der Liposomen führen. Vorteilhaft bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Komponenten ist die Tatsache, dass die eingeschlossenen Wirkstoffe nur für den Zeitraum des eigentlichen Einschlusses unter Bedingungen gebracht werden müssen, die eine Interaktion mit der Lipidschicht erlauben. Sobald die Lipidschicht in sich geschlossen bleibt, kann zu anderen Bedingungen gewechselt werden. Eine denkbare Inaktivierung von Wirkstoffen, insbesondere von Proteinen kann dadurch minimiert werden.
Liposomen, die die erfindungsgemäßen Komponenten umfassen, können unter dem Fachmann bekannten Bedingungen mit Polymeren beschichtet werden. Dabei kann insbesondere eine einfache oder mehrfache Abscheidung solcher Substanzen auf der Oberfläche erfolgen. Bei einer mehrfachen Abscheidung, die gegebenenfalls unter Anwesenheit von Vernetzer durchgeführt wird, entstehen liposomale Nanoakapseln, wie sie in der WO 00/28972 oder in der WO 01/64330 beschrieben sind.
Vorteilhaft bei der Verwendung der hier beschriebenen Substanzen ist die Tatsache, dass die elektrostatische Interaktion mit dem Polyelektrolyten unterbrochen werden kann. Es ist bekannt, dass die Wechselwirkung eines Polyelektrolyten mit Ladungsträgern der liposomalen Membran zur Entmischung von Membranbestandteilen und zur Bildung von Lipidclustern führen kann. In vielen Fällen geht diese Entmischung mit einer Permeabilisierung des Liposoms einher. Die erfindungsgemäßen Substanzen ermöglichen eine Abschaltung dieser Wechselwirkung nach dem Beschichtungsprozess. Wird der pH-Wert zu diesem Zeitpunkt erhöht, so sind die Liposomen nur noch sterisch in der Nanokapseln eingeschlossen, eine Wechselwirkung der Membran mit den Polyelektrolyten besteht dann nicht mehr. Clusterbildung der Lipide und damit verbundene Permeabilisierung der Membran können so umgangen werden.
In einer Variante dieser erfindungsgemäßen Lehre werden die Permeabilitätsänderungen gezielt zur Beladung von Liposomen genutzt. Ein einzuschließender Wirkstoff kann dabei unter Bedingungen hoher Permeabilität ins Medium zugegeben werden. Anschließend werden Bedingungen geringer Permeabilität eingestellt. Damit verbleibt der Wirkstoff im Innern der Liposomen. Nicht eingeschlossener Wirkstoff kann dann gegebenenfalls abgetrennt werden. Eine solche Permeabilitätsänderung kann an Liposomen oder an liposomalen Nanokapseln herbeigeführt werden.
Weiterhin wurde überraschend gefunden, dass die erfindungsgemäßen Liposomen bei niedrigem pH-Wert leicht mit anderen Membranen fusionieren. Für gewöhnlich erfordert dieser Schritt die Anwesenheit eines größeren Anteils von PE in der Membran. Dieses hat durch seine Neigung zur Bildung von hexgonalen Phasen die Funktion eines Helferlipids. Nachteilig ist aber die geringere Stabilität solcher Membranen, hier wird oft eine schleichende Freisetzung von eingeschlossenen Wirkstoffen beobachtet.
Liposomen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen hergestellt werden, fusionieren aber effektiv auch in Abwesenheit eines solchen Helferlipids. Es sind also unter Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen solche Liposomen herstellbar, die einen Wirkstoff stabil verkapseln können, aber unter den Bedingungen eines niedrigen pH-Werts mit Zellmembranen fusionieren und dort den Wirkstoff freisetzen.
Diese Kombination zweier Eigenschaften stellt eine wichtige Voraussetzung für die Einbringung von Cargomolekülen in Zellen dar. Bei einer Fusion von Liposomen mit Zellhüllen oder -bestandteilen vereinigen sich die wäßrigen Lumen beider Partner, ohne das es zu einer Öffnung der Membranstrukturen gegenüber dem Medium kommt. Dadurch wird der unkontrollierte Ein- oder Ausstrom anderer Substanzen vermieden.
Eine wesentliche Voraussetzung für die Verwendung von Liposomen für experimentelle oder therapeutische Zwecke ist deren Verträglichkeit mit Zellen und Geweben. Eine Reihe bekannter Verbindungen, die für das Einbringen von DNA oder Proteinen in Zellen genutzt werden (beispielsweise das kationische Lipid DOTAP) sind zytotoxisch.
Es wurde weiterhin überraschenderweise gefunden, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen eine verringerte Zytotoxizität zeigen. Das ist insbesondere dann der Fall, wenn die Verbindungen physiologische Bausteine wie etwa Aminosäuren enthalten.
Eine weitere Voraussetzung für die Konstruktion von Vektoren zum Gen- oder Proteintransport in Zellen ist deren Kompatibilität mit Serum oder Blut. Wegen ihrer starken kationischen Ladung bilden die derzeit bekannten Vektoren mit Serum unkontrollierte grosse Aggregate, die im Organismus zur Bildung von Thromben führen. Ihre Verwendung ist damit in vivo praktisch ausgeschlossen und auf in vitro oder ex vivo Anwendungen beschränkt.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass Liposomen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Komponenten aufgebaut wurden, in Serum oder Blut keine Aggregate bilden.
Eine nächste Voraussetzung für die Konstruktion von Vektoren zum Protein- oder Gentransfer ist deren Stabilität unter physiologischen Bedingungen. Liposomen werden bei einer Applikation in den Blutkreislauf vom Bestandteilen des Complementsystems angegriffen und schnell lysiert. Diese Reaktion erfolgt binnen Minuten. Es koommt zur Porenbildung in der Membran, durch die selbst große Moleküle wie Proteine ausdiffundieren können. Eine Stabilisierung von Liposomen gegenüber diesen Mechanismen ist bisher nur durch Einbau von Cholesterol in die Lipidschicht möglich. Solche Liposomen sind dann sehr stabil, können aber nicht mehr mit Zellen wechselwirken oder ihren Wirkstoff leicht abgeben. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass Liposomen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Komponenten aufgebaut werden, in Serum oder Blut über mehrere Stunden stabil sind. Die Wirkstofffreisetzung ist auch unter diesen Bedingungen gering.
Eine liposomaler Vektor für den Transport von Wirkstoffen muss mindestens drei Voraussetzungen erfüllen: er muss eine geringe Toxizität besitzen, den Wirkstoff sicher und stabil einschließen und kompatibel mit Serum oder Blut sein.
Alle drei dieser Voraussetzungen werden von Liposomen, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Substanzen hergestellt sind, erfüllt. Die hier offenbarten Liposomen sind daher für eine Verwendung bei therapeutischen Zwecken gut geeignet. Weitere Eigenschaften, die diese Verwendung unterstützen sind die gute Beladbarkeit mit Wirkstoffen und die gezielte Freisetzung dieser Stoffe durch Permeabilisierung der Membran bei geeigneten pH-Werten.
Die Erfindung soll im folgenden anhand von Beispielen näher erläutert werden, ohne dass die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken ist.

Beispiel 1

Synthese von Histamin-Dipalmitoylglycerolsuccinat (His-DPGS)

1,7 g Dipalmitoylglycerolsuccinat werden bei Raumtemperatur in 20 ml DMF gelöst. Zur Lösung werden 400 mg Carbonyldiimidazol, gelöst in 20 ml DMF gegeben. Man läßt das Gemisch 1 Stunde rühren und gibt dann 300 mg Histamin zu. Nachdem das Gemisch über Nacht gerührt wurde, engt man im Vakuum vollständig ein. Der Rückstand wird säulenchromatografisch an Kieselgel 60 gereinigt, als Laufmittel wird Chloroform/Methanol 10 : 1 verwendet.

Beispiel 2

Herstellung von kationischen pH-sensitiven Liposomen

2 mg His-DPGS und 10 mg POPC werden in 4 ml Chloroform/Methanol (1 : 1, v/v) gelöst und im Rotationsverdampfer vollständig getrocknet. Der Lipidfilm wird mit 4 ml des entsprechenden Puffers (10 mM KAc, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5) in einer Lipidkonzentration von 5 mM durch kurzes Ultrabeschallen hydratisiert (5 min). Abschließend wird die Emulsion eingefroren und nach dem Tauen mehrfach extrudiert (Avestin LiposoFast, Polycarbonatfilter 200 nm Porenweite). Der Verlauf des Zetapotentials bei verschiedenen pH-Werten ist in der untenstehenden Tabelle dargestellt.

ph-Wert Zetapotential in mV

4,4 +40

6,2 +3

7,5 -15

Claims

1. Fakultativ kationisches Lipid mit einem pKa-Wert zwischen 3, 5 und 8 nach der allgemeinen Formel Kation-Spacer 2- Y-Spacer 1-X-Lipid, wobei Y und X verbindende Gruppen darstellen.

2. Fakultativ kationisches Lipid nach Anspruch 1 mit einem pKa-Wert zwischen 4 und 6,5.

3. Fakultativ kationisches Lipid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Kation eine Stickstoffbase ist.

4. Fakultativ kationisches Lipid nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Kation aus Piperazinen, Imidazolen, Morpholinen, Purinen und/oder Pyrimidinen hergeleitet ist.

5. Fakultativ kationisches Lipid nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Diacylglycerolen, Dialkylglycerolen, Phosphoglycerolen, acylierten oder alkylierten 3-Amino-1,2-Propandiole oder auch N,N-Dialkylaminen.

6. Fakultativ kationisches Lipid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die verbindenden Gruppen X und/oder Y ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus -(C=O)-O-; -(C=O)-NH-; -(C=O)-S-; -O-; -NH-; -S-; -CH=N-; -O-(O=C)-; -S-(O=C)-; -NH-(O=C)- und/oder -N=CH-, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die Spacer ausgewählt sind aus Niederalkylresten mit bis zu 8 C-Atomen mit linearer, verzweigter oder ringförmiger Struktur und 0,1, oder 2 ethylenisch ungsättigten Bindungen, wobei bevorzugte Spacer Hydroxylgruppen enthalten können oder besonders bevorzugt als Zucker aufzufassen oder weitere bevorzugte Spacer Polyethylenglykole mit bis zu 20 Monomeren sind.

7. Liposomen umfassend fakultativ kationische Lipide nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

8. Liposomen nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen zwischen 5 und 50 mol%, bevorzugt zwischen 5 mol% und 40 mol%, besonders bevorzugt zwischen 10 mol% und 30 mol% fakultativ kationische Lipide umfassen.

9. Liposomen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin, Ceramid, Sphingolipid, Tetraetherlipid, Cholesterol und/oder Diacylglycerol umfassen.

10. Liposomen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen eine mittlere Größe zwischen 50 und 1000 nm, bevorzugt 50 und 300 nm, besonders bevorzugt 60 und 130 nm aufweisen.

11. Liposomen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen einen Wirkstoff umfassen.

12. Liposomen nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ein Protein, ein Peptid, eine DNA, eine RNA, ein antisense-Nukleotid und/oder ein Decoy-Nukleotid ist.

13. Liposomen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sich mindestens 80% des Wirkstoffes im Innern des Liposoms befinden.

14. Verfahren zur Wirkstoffbeladung der Liposomen gemäß der Ansprüche 7 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein definierter pH-Wert zur Verkapselung benutzt wird und ein zweiter pH-Wert zur Abtrennung des nicht gebundenen Wirkstoffes eingestellt wird.

16. Verwendung der Liopsomen gemäß nach einem der Ansprüche 7 bis 13 zur Herstellung von Nanokapseln.

17. Verwendung der Liposomen gemäß nach einem der Ansprüche 7 bis 13 zur Herstellung von Freisetzungssystemen in der Diagnostik.

18. Verwendung der Liposomen gemäß nach einem der Ansprüche 7 bis 13 zum Transport und/oder zur Freisetzung von Wirkstoffen.

19. Verwendung der Liposomen gemäß nach einem der Ansprüche 7 bis 13 als Depotformulierung und/oder als zirkulierendes Depot.

20. Verwendung der Liposomen nach Anspruch 18 oder 19 bei intravenöser oder peritonealer Applikation.

21. Verwendung der Liposomen gemäß nach einem der Ansprüche 7 bis 13 als Vektor zur Transfektion von Zellen in vivo, in vitro und ex vivo.