DE19960924A1

DE19960924A1 - Amphiphile Polyamine, deren Anwendungen und Verfahren zu ihrer Synthese

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Publication number: DE19960924A1
Application number: DE19960924A
Authority: DE
Inventors: Oliver Keil
Original assignee: Individual
Current assignee: Got Therapeutics 13125 Berlin De GmbH
Priority date: 1999-12-17
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2001-07-05
Anticipated expiration: 2019-12-18
Also published as: US20030109699A1; WO2001044198A8; DE19960924C2; WO2001044198A1; JP2003516970A; EP1244630A1; AU2830401A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft amphiphile Polyamine und deren Salze, welche befähigt sind, Biopolymere wie DNA, RNA, Antisense-Oligonukleotide, Ribozyme, Proteine und Peptide zu komplexieren und in eukaryotische Zellen einzuschleusen. Hierbei erwiesen sich Polyaminochinolin-Derivate, welche mit lipophilen Gruppen modifiziert sind, als besonders geeignete Substanzklasse. Aufgrund ihrer Eigenschaft mit biologisch aktiven Molekülen, wie zum Beispiel DNA oder RNA, Aggregate zu bilden, eignen sich diese Verbindungen insbesondere für Anwendungen in der Gentherapie, aber auch für diagnostische Zwecke.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft amphiphile Polyamine und deren Salze, die in der Lage sind biologisch aktive Makromoleküle (insbesondere DNA und RNA) in eukaryotische Zellen einzuschleusen.

In den letzten 10 Jahren hat sich der Transfer von Biopolymeren, insbesondere von DNA, RNA und Oligonukleotiden, in eukaryotische Zellen zu einem fundamentalen Arbeitsgebiet in der Molekularbiologie und der molekularen Medizin entwickelt [P. A. Martin, S. M. Thomas; Human Gene Therapy 9 (1998) 87-114]. Hierbei sind vor allem gentherapeutische Ansätze, aber auch diagnostische Methoden von besonderem Interesse. Heute bereits teilweise etablierte Verfahren zur Einbringung von DNA in eukaryotische Zellen beruhen darauf, die betreffende DNA-Sequenz mit Hilfe von replikationsdefizienten, rekombinanten Retro-, Adeno- oder adenoassoziierten Viren einzuschleusen. Diese haben jedoch den Nachteil, daß sie bislang nahezu ausschließlich auf ex vivo Anwendungen beschränkt sind, da die viralen Proteine mitunter zu heftigen Immunreaktionen führen und replikationskompetente Viren nicht immer ausgeschlossen werden können. Retroviren weisen zudem den Nachteil auf, daß sie unspezifisch stabil in das Wirtsgenom integrieren und somit potentiell maligne Mutationen auslösen können. Aufgrund dieser Eigenschaften ist es verständlich, daß diese Verfahren extrem hohe Sicherheitsanforderungen stellen und sich nur mit großem finanziellen Aufwand ausführen lassen. Biophysikalische Methoden wie zum Beispiel der Beschuß von Zellen mit DNA-beladenen Goldpartikeln ("Biolistik") oder die Elektroporation sind aus offensichtlichen Gründen ebenfalls nur ex vivo anwendbar. Die seit langem bekannte Calciumphosphat-Copräzipitation und die DEAE-Dextran Methode erscheinen wegen ihrer geringen Effizienz als wenig geeignet.

Ein weiteres in den letzten Jahren entwickeltes Verfahren zur Einschleusung von biologisch aktiven Makromolekülen in eukaryotische Zellen verwendet kationische Polymere wie Poly- L-lysin, Polyethylenimin oder PAMAM-Dendrimere. Polyanionen wie DNA, RNA oder Oligonukleotide bilden mit diesen über elektrostatische Wechselwirkungen Aggregate und werden in dieser Form von den Zellen vermutlich über Endocytose aufgenommen.

Poly-L-lysin muß jedoch zuvor durch chemische Reaktion mit Rezeptorliganden (z. B. Transferrin, Glycoproteine) [E. Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 3410- 3414] oder endosomolytischen Peptiden [E. Wagner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 7934-7938] modifiziert werden, um eine hinreichende Effizienz aufzuweisen.

Deshalb und aufgrund ihres polymeren Charakters sind Verbindungen dieses Typs sehr heterogen zusammengesetzte Substanzgemische und lassen sich daher nur mit großem Aufwand in definierter Form produzieren.

Ein weiteres Verfahren, welches in den letzten Jahren stark an Bedeutung gewonnen hat, basiert auf den grundlegenden Arbeiten von Felgner et al.. Dabei werden aus kationischen, lipidischen Amphiphilen, pur oder in Mischung mit neutralen Phospholipiden wie Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), liposomale oder auch micellare Strukturen generiert. Diese bilden aufgrund elektrostatischer Wechselwirkungen mit anionischen Biopolymeren (wie DNA oder RNA) Aggregate, welche daraufhin effizient von eukaryotischen Zellen aufgenommen werden. DNA kann so in den Zellkern transportiert werden und führt dann zur Expression des entsprechenden Proteins. Obgleich der Mechanismus hierfür bislang noch nicht aufgeklärt ist, herrscht doch inzwischen Einigkeit darüber, daß die Aggregate durch endocytotische Prozesse über Endosomen in das Zellinnere gelangen. Auch ist bekannt, daß der pH-Wert innerhalb der Endosomen, bedingt durch sog. vacuoläre H+-ATPasen, im zeitlichen Verlauf auf ca. pH 5-6 absinkt. Es gibt Hinweise darauf, daß diese Erhöhung der Protonenkonzentration für die anschließende Verschmelzung der Endosomen mit Lysosomen verantwortlich ist [A. K. Fok et al., Eur. J. Cell Biol. 43 (3) (1987) 412-420]. Damit die internalisierten Biopolymere in andere Zellkompartimente (z. B. Cytoplasma oder Zellkern) gelangen können, müssen sie aus den Endosomen ausbrechen, da sie anderweitig in den Lysosomen enzymatisch abgebaut werden. Dieses wird in den meisten Fällen durch die Zumischung des Phospholipids DOPE erreicht, welches aufgrund seiner konischen Form in der Lage ist, invertierte hexagonale flüssigkristalline Phasen zu induzieren [J. O. Rädler et al., Science 281 (1998) 78-81]. Diese weisen eine hohe Tendenz zur Verschmelzung mit Doppelschichtstrukturen (z. B. biologische Membranen) auf. Aus den oben genannten Gründen ist es auch von entscheidender Bedeutung, die endosomale Acidifizierung zu verhindern, um ein Verschmelzen der Endosomen mit den Lysosomen hinauszuzögern. Dieser Sachverhalt wird auch dadurch bestätigt, daß ein 10-100 µM Zusatz von Chloroquin - einer schwachen Base - im Zellkulturmedium die Effizienz der kationischen Amphiphile signifikant steigert [P. L. Felgner et al., J. Biol. Chem. 269 (4) (1994) 2550-2561; A. K. Tanswell et al., Am. J. Physiol. 275 (3 Pt 1) (1998) L452-L460].

Die Zugabe von schwachen, puffernden Basen sorgt auch dafür, daß die Aktivität der lysosomalen, abbauenden Enzyme, welche ein pH-Optimum im sauren pH-Bereich aufweisen, stark herabgesetzt wird. Nachteiligerweise läßt sich dieser Effekt jedoch nicht in vivo anwenden.

Seit der erstmaligen Beschreibung durch Felgner ist eine Vielzahl, zumeist empirisch gefundener, kationischer Amphiphile für den Transfer von anionischen Makromolekülen wie z. B. DNA synthetisiert worden [A. D. Miller, Angew. Chem. 110 (1998) 1862-1880; L. Huang, X. Gao; Gene Therapy 2 (1995) 710-722]. Viele dieser kationischen Lipide, wie z. B. DOTMA oder DLRIE, haben den Nachteil, daß sie nur schwer metabolisierbar sind und daher deutliche zelltoxische Eigenschaften aufzeigen. Mit Ausnahme der Lipopolyaminderivate (Lipospermine u. a.) [Blagbrough et al., Chem. Commun. 13 (1998) 1403-1404] weisen die bislang bekannten kationischen Amphiphile keine Funktionalitäten auf, die bei einem physiologischen pH-Wert (ca. pH 7.4) eine hinreichende Pufferkapazität besitzen, um die Acidifizierung der endocytotischen Vesikel zu verhindern. Nachteilig bei der Herstellung der Lipopolyamin-Verbindungen ist, daß es sich um multifunktionelle Moleküle handelt, bei denen sich die Funktionalitäten kaum in ihrer chemischen Reaktivität unterscheiden. Sie müssen daher unter Verwendung orthogonaler Schutzgruppenstrategien aufwendig in vielstufigen Verfahren synthetisiert werden.

Außerdem wird die Aktivität vieler bislang bekannter kationischer Lipide durch die Anwesenheit schon geringer Anteile (< 5%) an Serum im umgebenden Medium inhibiert.

Der Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, neue amphiphile Polyamine für den Transfer von Biopolymeren (insbesondere von DNA und RNA) in eukaryotische Zellen zur Verfügung zu stellen, die

- leicht metabolisierbar sind und eine geringe Zelltoxizität aufweisen,
- die auch in Gegenwart hoher Serumanteile eine hohe Transfer-Effizienz zeigen,
- die leicht und kostengünstig in großen Mengen produziert werden können
- und die in einem Molekül sowohl Funktionalitäten für eine effiziente Komplexierung anionischer Makromoleküle als auch solche, die bei physiologischen pH-Werten eine sehr gute Pufferkapazität aufweisen, vereinen.

Ein im Hinblick auf die genannten Anforderungen überraschend effizienter Transfer von Biomolekülen, insbesondere von DNA und RNA, in eukaryotische Zellen (Transfektion) läßt sich erreichen, durch die erfindungsgemäßen amphiphilen Polyamine der allgemeinen Formel I,

wobei
R₁ bis R₆ unabhängig voneinander einen Rest Wasserstoff, Halogen, -C∼N, -NO₂, -SO₃H, -COOH, -N(Alkyl)₂, -NH(Alkyl), -NH₂, -Alkyl, -OH, -O-Alkyl, -O-Aryl, -O-Hetaryl, -O(C=O)Alkyl, -(C=O)Alkyl, -SH, -S-Alkyl bedeuten,
R₇ einen Rest Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen bedeutet,
m und k unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 1 bis 6 sind,
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist,
A eine Gruppe N⁺R₈R₉R₁₀Y^- bedeutet, wobei R₈ bis R₁₀ unabhängig voneinander einen Rest Wasserstoff, eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine Gruppe -(CH₂)_i-OH oder eine Gruppe -(CH₂)_i-NH₂ mit i = 2-6 bedeuten und Y^- ein phamazeutisch akzeptables Anion darstellt,
B eine Gruppe

bedeutet, in der R₁₁ die für R₇ angegebene Bedeutung hat und r eine ganze Zahl von 1 bis 6 sein kann,
Z ein über das C-Atom 3 (des Steran-Grundgerüstes) gebundenes Steroid, einen Rest R₁₂ oder eine Gruppe

bedeutet, wobei j eine ganze Zahl von 0 bis 4 sein kann, R₁₂ einen gesättigten oder ungesättigten Alkyl- oder Acylrest mit 8 bis 24 C-Atomen darstellt und E eine Gruppe O-R₁₃ oder CH₂-O-R₁₃ bedeutet, bei der R₁₃ die für R₁₂ angegebene Bedeutung hat und gleich oder von R₁₂ verschieden sein kann,
und wobei das Stickstoff-Atom des Chinolin-Gerüstes zusätzlich von einer Säure H⁺Y^- protoniert sein kann, wobei Y^- ein phamazeutisch akzeptables Anion darstellt.

Bevorzugt sind dabei solche Verbindungen, in denen R₁, R₂, R₄, R₆ und R₇ ein Wasserstoffatom darstellen, R₅ Wasserstoff oder ein Alkylrest ist und R₃ ein Halogenatom, insbesondere Chlor, bedeutet. Weiterhin sind solche Verbindungen von Vorteil, in denen m und k gleich 1 bis 3 sind, n gleich eins ist und A eine Dimethylammonium- oder Diethylammonium-Gruppe bedeutet. Darüber hinaus sind Verbindungen bevorzugt, bei denen B eine Gruppe
-CH₂- oder

repräsentiert und Z ein membranenassoziiertes Steroid oder einen 1,2-diglyceridartigen Rest darstellt. Ganz besonders bevorzugt sind solche Moleküle, bei denen Z einen Cholesterylrest oder einen 1,2-Dioleoyloxyethylrest bezeichnet und in denen das pharmazeutisch akzeptable Anion Y^- gleich Halogenid, Acetat oder Phosphat ist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Lipide in Mischung mit anderen, dem Fachmann schon bekannten Lipiden, wie Phospholipiden, insbesondere DOPE oder mit membranassoziierten Steroiden, insbesondere Cholesterol zur Einschleusung von biologisch aktiven Biomolekülen, insbesondere von DNA und RNA angewendet. Dabei können die Lipide in wäßriger (liposomaler) Dispersion oder als Lösung in mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln vorliegen, und die DNA (RNA) kann mit Polykationen, insbesondere mit Protaminsulfat vorkomplexiert sein.

Gegenüber den bislang bekannten Transfektionsreagenzien weisen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Reihe entscheidender Vorteile auf. Moleküle der beschriebenen Art besitzen in der hydrophilen Kopfgruppe gleichzeitig mindestens zwei basische Funktionalitäten mit deutlich unterschiedlichen pK_S-Werten, welche durch das nicht lipophil modifizierte, aliphatisch-gebundene Stickstoffatom und durch das aromatisch-gebundene Stickstoffatom (Chinolinring) gebildet werden. Die pK_S-Werte der entsprechenden Gruppierungen betragen etwa pK_S = 10.2 (für Diethylamino) bzw. pK_S = 8.06 (Chinolin). Erstere Funktionalität ist somit bei einem physiologischen pH-Wert von 7,4 nahezu vollständig protoniert und bildet daher starke elektrostatische Wechselwirkungen mit negativ geladenen Biomolekülen aus. In den Fällen, in denen die aliphatische Stickstoffgruppe quaternisiert ist, ist die positive Ladung nahezu unabhängig vom pH-Wert des Milieus. Die Chinolin-Base ist dagegen bei einem pH-Wert von 7,4 zu ca. 20% deprotoniert und daher sehr gut geeignet, den sinkenden pH-Wert nach Aufnahme in die Endosomen zu puffern. Ein weiterer wichtiger Vorteil ist, daß manche Chinolin-Basen in der Lage sind, vakuoläre (H⁺)- ATPasen zu inhibieren. Die der Erfindung zugrunde liegenden Verbindungen können zusätzlich auch hierdurch die Acidifizierung der Endosomen und somit den Transport der Aggregate in die Lysosomen und deren Abbau verhindern. Aufgrund des aromatischen Charakters des Chinolingerüstes sind außerdem π-Elektronen-Wechselwirkungen mit den Nucleotidbasen der DNA oder RNA möglich-ein zusätzlicher Vorteil gegenüber den bislang bekannten Reagenzien in Hinsicht auf die Komplexbildung.

Die bisher verwendeten Transfektionsreagenzien weisen keine starken Chromophore auf und sind daher bei HPLC-basierten Analysen- und Reinigungsverfahren mittels UV-Detektion nur sehr schwer detektierbar. Aufgrund der starken UV-Absorption des Chinolingerüstes im Wellenlängenbereich von 200-300 nm sind die erfindungsgemäßen Verbindungen leicht detektierbar und bieten somit auch bei der Analytik und der arzneimittelgerechten Präparation entscheidende Vorteile.

Die Herstellung der Verbindungen erfolgt in wenigen Stufen aus preiswerten Ausgangschemikalien unter Anwendung der dem Fachmann geläufigen Methoden [Methoden der organischen Chemie (Houben-Weyl) 4. Aufl. Thieme Verlag (Stuttgart) 1952; The Chemistry of Heterocyclic Compounds, John-Wiley & Sons, Inc. Vol. 32 part I (1977)]. Die entsprechenden Reaktionsschemata sind in den Abb. 1-4 dargestellt.

Die Transfektions- und zelltoxischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Lipide wurde auf verschiedenen Tumorzellinien getestet und mit denen bislang bekannter Reagenzien verglichen (Abb. 5 und 6). Als Reportersysteme dienten GFP bzw. β-Galactosidase codierende Plasmide. Bei den Untersuchungen wurden die Lipide #2, #7, #9 mit dem Phospholipid 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE) gemischt. Wäßrige liposomale Formulierungen wie auch ethanolische Lösungen der Lipide erwiesen sich dabei gleichermaßen für die Transfektionen als geeignet. Mit den Lipiden #2, #7 und #9 ist es möglich, alle untersuchten Zellinien mit höherer Effizienz zu transfizieren als mit den bekannten Lipiden Transfectam®, Lipofectamine^TM und DC-Chol. Überraschend günstig sind auch die zelltoxischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Lipide (Abb. 7) und die Unempfindlichkeit der Reagenzien gegenüber hohen Serumanteilen im Zellkulturmedium (Abb. 8). Selbst in Gegenwart von 50% fetalem Kälberserum verbleibt noch über 50% der Gentransfereffizienz, die sich unter Standardbedingungen (10% FCS) erzielen läßt.

Die Transfektionseffizienz der Lipide #2 und #7 (Mischung mit 70 mol% DOPE) in ethanolischer Lösung ist in Abb. 9 dargestellt. Auch mit diesen Reagenzien läßt sich beispielsweise die Mamma-Tumorzellinie MCF7 deutlich effizienter mit dem pEGFP-N1- Plasmid transfizieren als mit dem bekannten Reagenz Transfectam. Die Komplexierung der DNA mit dem polykationischen Protein Protaminsulfat führt zwar nicht zu einer signifikanten Steigerung des Anteils an transfizierten Zellen. Überraschenderweise wird jedoch eine deutliche stärkere Expression des Reportergens ermöglicht. Der Median der Fluoreszenzintensität der transfizierten Zellen liegt bei Verwendung der mit Protaminsulfat vorkomplexierten DNA um mehr als 50% höher als bei der Verwendung der nicht vorkomplexierten DNA (Abb. 9).

Die Erfindung soll exemplarisch anhand der nachfolgenden Beispiele erläutert sein. Obwohl die Beispiele bevorzugte Ausführungsformen repräsentieren, soll der Umfang der Erfindung durch sie nicht eingeschränkt werden.

Beispiel 1 Synthese von 7-Chlor-4-[N¹-(N⁴-H)-(N⁷-diethyl)-1,4,7-triaza-heptyl]-chinolin (#1)

In einem verschlossenen 25 ml Rundkolben werden 1.39 g (7 mmol) 4,7-Dichlorchinolin und 1.32 g (14 mmol) Phenol in einer Argonschutzgasatmosphäre unter Rühren für eine Stunde auf 120°C erhitzt. Die Schmelze wird daraufhin auf ca. 60°C abgekühlt, mit 1.115 g (7 mmol) Diethylaminoethylethylendiamin versetzt und für 24 Stunden unter Rühren auf 125°C erhitzt, wobei sie sich rötlich-dunkelbraun verfärbt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wird der Rückstand in 30 ml 2 N Essigsäure gelöst und mit konz. Essigsäure auf pH 4-5 angesäuert. Die Lösung wird 4 × mit je 25 ml CHCl₃ extrahiert und die wäßrige Phase anschließend mit konz. wäßrigem Ammoniak auf pH 8-9 eingestellt (ca. 7-8 ml). Die trübe Lösung wird daraufhin 4 × mit je 25 ml CHCl₃ extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden noch ein mal mit 10 ml ges. NaHCO₃-Lösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel dann am Rotationsverdampfer entfernt. Nach Trocknen im Hochvakuum erhält man 1.94 g (6.1 mmol) = 87% d. Th. eines bräunlichen, zähen Öls, welches über Nacht kristallin erstarrt. Die Verbindung kann ohne weitere Aufreinigung zur Darstellung von #2 verwendet werden. Analytisch reine Substanz wird durch präparative Säulenchromatographie auf Kieselgel 60 (70-230 mesh) erhalten (Eluent: Stufengradient aus CH₂Cl₂/MeOH 3 : 1 (0.1% Triethylamin) auf CH₂Cl₂/MeOH 1 : 3 (0.1% Triethylamin)).
DC (Kieselgel 60) [CHCl₃/MeOH 4 : 1]; R_f = 0.04; UV-Detektion.

Beispiel 2 Synthese von 7-Chlor-4-[N¹-(N⁴-carboxycholesteryl)-(N⁷-diethyl)-1,4,7-triaza-heptyl]- chinolin hydrochlorid (#2)

In einem 50 ml Rundkolben mit seitlichem Gaseinlaß werden unter einer Argonatmosphäre 614 mg (1.91 mmol) #1 in 15 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst. Daraufhin wird bei Raumtemperatur eine Lösung von 853 mg (1.90 mmol) Cholesterylchlorformiat in 20 ml wasserfreiem Dichlormethan innerhalb von 15 min unter Rühren zugetropft.

Nach einer Reaktionszeit von 2 h wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand für weitere 2 h im Vakuum getrocknet. Man erhält 1.45 g eines gelbbraunen amorphen Feststoffs. Weitere säulenchromatographische Aufreinigung auf Kieselgel 60 (70-230 mesh) (Eluent CH₂Cl₂/MeOH 7 : 1) liefert die reine Verbindung als einen farblosen, amorphen Feststoff.
DC (Kieselgel 60) [CH₂Cl₂/MeOH 4 : 1]; R_f = 0.24; UV-Detektion und Detektion mit Vanilin/konz. Schwefelsäure.

Beispiel 3 Synthese von 7-Chlor-4-[N¹-(N⁴-carboxycholesteryl)-(N⁷-diethyl-hydroxyethyl)-1,4,7-triaza- heptyl]-chinolin hydrobromid (#3)

In einem verschlossenen 10 ml Rundkolben werden unter einer Argonatmosphäre 40 mg (52 µmol) in 500 µl wasserfreiem Dimethylformamid gelöst und mit 30 mg trockenem Natriumcarbonat sowie mit 300 µl 2-Bromethanol versetzt. Die Mischung wird unter Rühren 16 Stunden bei 65°C erwärmt, danach mit 10 ml Dichlormethan versetzt und filtriert. Die flüchtigen Bestandteile werden daraufhin bei 60°C im. Hochvakuum entfernt. Nach säulenchromatographischer Aufreinigung auf Kieselgel 60 (70-230 mesh) mit Dichlormethan/Methanol 5 : 1 als Eluent erhält man 25 mg (29.1 µmol) = 56% d. Th. eines farblosen, glasartigen Feststoffs.
DC (Kieselgel 60) [CH₂Cl₂/MeOH 3 : 1]; R_f = 0.25; UV-Detektion und Detektion mit Vanilin/konz. Schwefelsäure.

Beispiel 4 Synthese von N,N-Dimethyl-N'-cyanoethyl-ethylendiamin (#4)

In einem 500 ml Rundkolben werden 10.9 ml (100 mmol) 2-Dimethylaminoethylamin, gelöst in 150 ml 2-Propanol, vorgelegt. Daraufhin werden unter Kühlung im Eisbad 6.91 ml (105 mmol) Acrylonitril zugefügt und die Mischung für 72 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach dieser Zeit wird das Lösungsmittel im Vakuum (7 mbar) bei 40-50°C entfernt und der Rückstand anschließend im Vakuum destilliert. Man erhält 9.80 g (69 mmol) = 69% d. Th. einer farblosen Flüssigkeit mit einem Sdp. von 135°C (7 mbar).
IR (Film, [cm^-1]):
= 3500-3150 (m, b) [ν N-H]; 2930 (s), 2840 (s), 2810 (s), 2750 (s) [ν_as,s CH₂, CH₃]; 2240 (s) [ν CN]; 1460 (m), 1440 (m, sh) [δ_as,s CH₂, δ_as CH₃],
¹H-NMR (400.132 MHz, CDCl₃ [ppm]):
δ = 1.35-1.6 (s(b), 1H, NH); 2.13 (s, 6 H, N(CH ₃)₂); 2.17, 2.42, 2.62, 2.85 (4 × t, 8H, 4 × CH ₂),
¹³C{¹H}-NMR (100.625 MHz, CDCl₃ [ppm]):
δ = 18.5, 45.1, 46.4, 58.7 (4 × CH₂); 45.25 (N(CH₃)₂); 118.5 (CN).

Beispiel 5 Synthese von N⁸-Dimethyl-1,5,8-triazaoctan (#5)

In einem 250 ml Dreihalskolben mit Rührfisch, Magnetrührer, Rückflußkühler, Septum und Argonzuleitung werden unter einer Argonatmosphäre 90 ml einer 1 M Lösung von Lithiumaluminiumhydrid in Diethylether vorgelegt. Über eine Einwegspritze werden dann 9.93 g (70 mmol) #4 vorsichtig zugetropft, so daß der Ether nur leicht siedet. Die Mischung wird daraufhin noch 5 h unter Rückfluß erhitzt.

Danach werden 15 ml einer 20%igen Natronlauge sehr vorsichtig zugetropft. Die entstehenden Hydroxide fallen dabei als sehr grober Niederschlag an, der sich leicht abdekantieren läßt. Die Hydroxidrückstände werden noch 5 × mit je 40 ml Diethylether aufgekocht. Die vereinigten Etherphasen werden filtriert und das Lösungsmittel daraufhin am Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wird in 150 ml Dichlormethan aufgenommen und einmal mit 5 ml 5 N NaOH-Lösung gewaschen. Nach Trocknen über Na₂SO₄ wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und die leicht ölige Flüssigkeit im Feinvakuum fraktionierend destilliert. Man erhält 3.96 g (27.3 mmol) = 39% d. Th. einer farblosen Flüssigkeit mit einem Sdp. von 65°C (0.1 mbar).
IR (Film, [cm^-1]):
= 3600-3100 (s, b) [ν N-H]; 2920 (s), 2800 (s), 2750 (s) [ν_as,s CH₂, CH₃]; 1445 (s) [δ_as,s CH₂, δ_as CH₃].

Beispiel 6 Synthese von 7-Chlor-4-[N¹-(N⁵-H)-(N⁸-dimethyl)-1,5,8-triaza-octyl]-chinolin (#6)

In einem verschlossenen 25 ml Rundkolben werden 812 mg (4.1 mmol) 4,7-Dichlorchinolin und 1.16 mg (12.3 mmol) Phenol in einer Argonschutzgasatmosphäre unter Rühren für eine Stunde auf 125-130°C erhitzt. Die Schmelze wird daraufhin auf ca. 60°C abgekühlt, mit 596 mg (4.1 mmol) N⁸-Dimethyl-1,5,8-triazaoctan (#5) versetzt und für 24 Stunden unter Rühren auf 130°C erhitzt. Nach dieser Zeit läßt man die Mischung erkalten und setzt 20 ml 5 N NaOH-Lösung hinzu. Die Lösung wird in einen Scheidetrichter überführt und 2 × mit je 60 ml Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit 10 ml 5 N NaOH-Lösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und das Lösungsmittel anschließend am Rotationsverdampfer entfernt. Man erhält 1.37 g eines gelbbraunen, zähen Öls. Die Verbindung kann ohne weitere Aufreinigung zur Darstellung von #7 verwendet werden. Analytisch reine Substanz wird durch präparative Säulenchromatographie auf Kieselgel 60 (70-230 mesh) erhalten (Eluent: Stufengradient aus CH₂Cl₂/MeOH 3 : 1 (0.1% Triethylamin) auf CH₂Cl₂/MeOH 1 : 3 (0.1% Triethylamin)).
DC (Kieselgel 60) [CH₂Cl₂/MeOH 3 : 1 (0.1% Triethylamin)]; R_f = 0.07; UV-Detektion [80% Ethanol (2% Triethylamin)]; R_f = 0.11; UV-Detektion.

Beispiel 7 Synthese von 7-Chlor-4-[N¹-(N⁵-carboxycholesteryl)-(N⁸-dimethyl)-1,5,8-triaza-octyl]- chinolin hydrochlorid (#7)

In einem 50 ml Rundkolben mit seitlichem Gaseinlaß werden unter einer Argonatmosphäre 580 mg (1.89 mmol) #6 in 40 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst. Daraufhin werden unter Kühlung im Eisbad 850 mg (1.89 mmol) Cholesterylchlorformiat zugesetzt. Die Mischung wird für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, woraufhin das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt wird. Anschließende säulenchromatographische Aufreinigung des Rohproduktes auf Kieselgel 60 (70-230 mesh) mit CH₂Cl₂/MeOH 7 : 1 als Eluent liefert die reine Verbindung als einen farblosen, amorphen Feststoff.
DC (Kieselgel 60) [CH₂Cl₂/MeOH 7 : 1]; R_f = 0.19; UV-Detektion und Detektion mit Vanilin/konz. Schwefelsäure.

Beispiel 8 Synthese von 7-Chlor-4-[N¹-(N⁵-(2(R),3-dihydroxy)propyl)-(N⁸-dimethyl)-1,5,8-triaza- octyl]-chinolin (#8)

In einem verschlossenen 10 ml Rundkolben werden 244 mg (795 µmol) #6 in 2 ml wasserfreiem Methanol gelöst. Die Lösung wird für 72 Stunden bei 0-4°C gerührt, wobei in gleichmäßigen Zeitabständen jeweils Portionen von 10 µl (S)-Glycidol (insgesamt 100 µl = 1.51 mmol) zugefügt werden. Daraufhin werden die flüchtigen Bestandteile am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand durch Säulenchromatographie auf 20 g Kieselgel 60 (70-230 mesh) gereinigt.

Als Eluent verwendet man dabei einen Stufengradienten aus CH₂Cl₂/MeOH 3 : 1 (0.1% Triethylamin) auf CH₂Cl₂/MeOH 1 : 1 (0.1% Triethylamin). Man erhält 24.5 mg (64 µmol) = 8.1% d. Th. eines farblosen, sehr zähen Öls.
DC (Kieselgel 60) [80% Ethanol (2% Triethylamin)]; R_f = 0.27; UV-Detektion.

Beispiel 9 Synthese von 7-Chlor-4-[N¹-(N⁵-(2(R),3-dioleoyloxy)propyl)-(N⁸-dimethyl)-1,5,8-triaza- octyl]-chinolin (#9)

In einem verschlossenen 10 ml Rundkolben werden 24.5 mg (64 µmol) #8 in 1.5 ml wasserfreiem Dichlormethan gelöst. Daraufhin werden 36 µl (256 µmol) Triethylamin, 41 µl (128 µmol) Ölsäure und 34 mg (131 µmol) N,N-Bis-[2-oxo-3-oxazolidinyl]- phosphorsäurediamidchlorid (BOP-Cl) zugefügt. Die Mischung wird für 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei der Umsatz mittels Dünnschichtchromatographie (Dichlormethan/Methanol 7 : 1) verfolgt wird. Nach dieser Zeit wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt und der Rückstand durch Säulenchromatographie auf 20 g Kieselgel 60 (70-230 mesh) gereinigt. Als Eluent dient dabei Dichlormethan/Methanol 7 : 1. Man erhält 24 mg (26 µmol) = 41% d. Th. eines farblosen, wachsartigen Feststoffs.
DC (Kieselgel 60) [Dichlormethan/Methanol 7 : 1]; R_f = 0.30; UV-Detektion und Detektion mit Vanilin/konz. Schwefelsäure.

Beispiel 10 Formulierung der erfindungsgemäßen amphiphilen Polyamine für die Transfektionsexperimente a) Liposomale Formulierung

Lösungen der Amphiphile #2, #3, #7, #9 in Chloroform werden mit einer Lösung von 1,2- Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE) in Chlorform in unterschiedlichen molprozentualen Verhältnissen gemischt und im Vakuum zu einem Lipidfilm eingetrocknet. Letzte Lösungsmittelreste werden dabei im Hochvakuum entfernt. Daraufhin werden die Lipidfilme in sterilem Wasser rehydratisiert und durch Ultraschallbehandlung die Liposomen generiert. Die Gesamt-Lipidkonzentration der resultierenden Dispersion beträgt dabei 1 mg/ml.

b) Ethanolische Formulierung

Die kationischen Lipide werden in unterschiedlichen molprozentualen Verhältnissen mit DOPE gemischt und in wasserfreiem Ethanol gelöst. Die Gesamt-Lipidkonzentration der resultierenden Lösung beträgt 1 mg/ml.

Beispiel 11 Transfektion von adhärenten Zellinien

Allgemeines: Verwendete Zellinien HeLa, Hec1a, SKOV3, MCF-7, Hey, SKBR3, T47D, 293 werden unter Standardbedingungen (gemäß ATCC-Angaben) kultiviert. Die kommerziellen Transfektionreagenzien Transfectam®, Lipofectamine^TM und Superfect wurden gemäß der Herstellerangaben verwendet. DC-Chol wurde entsprechend der Literaturvorschrift [L. Huang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 179 (1) (1991) 280- 285] synthetisiert, mit DOPE formuliert und zur Transfektion eingesetzt.

a) Transfektion mit pEGFP-N1-Plasmid a.1) Verwendung der Reagenzien als wäßrige Liposomen-Dispersion

Am Tag vor der Transfektion werden pro well einer 24-well-Zellkulturplatte 40- bis 50000 Zellen (ca. 70% Konfluenz) ausgesät. Zur Transfektion werden 2 µg des Plasmids (pEGFP-N1; Clontech Laboratories, Inc. Katalog-Nr. 6085-1) in 300 µl FCS-freiem Medium vorgelegt, mit 3 µl (SKBR3, MCF-7, Hey) bzw. 6 µl (HeLa, Hec1a, SKOV3) des wäßrigen Lipidreagenzes (30 mol% Lipid #2 bzw. #7 bzw. #9; 70 mol% DOPE) versetzt und die Mischung für 30 min bei RT inkubiert. Kurz vor der Transfektion wird das Medium entfernt und durch 700 µl frisches Medium (14,3% FCS) ersetzt. Nach Zugabe des Lipid-DNA-Komplexes wird für 48 Stunden inkubiert und daraufhin der Anteil der GFP-exprimierenden, fluoreszierenden Zellen durch FACS-Analyse bestimmt. Hierzu werden die Zellen mit PBS gewaschen und abtrypsinisiert. Die Zellen werden in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und abzentrifugiert. Daraufhin wird das Zellpellet in 500 µl PBS aufgenommen und der Anteil fluoreszenter Zellen an einem FACS-Gerät (Becton Dickinson, FACScan) bestimmt.

a.2) Verwendung der Lipide in ethanolischer Lösung

Am Tag vor der Transfektion werden pro well einer 24-well-Zellkulturplatte 40- bis 50000 Zellen (ca. 70% Konfluenz) ausgesät. Zur Transfektion werden 2 µg des Plasmids (pEGFP-N1; Clontech Laboratories, Inc. Katalog-Nr. 6085-1) in 300 µl FCS-freiem Medium vorgelegt, mit 4 µl des ethanolischen Lipidreagenzes (30 mol% Lipid #2 bzw. #7; 70 mol% DOPE) versetzt und die Mischung für 30 min bei RT inkubiert. Bei der Transfektion in Gegenwart von Protaminsulfat werden 2 µg des Plasmids in 300 µl FCS-freiem Medium vorgelegt und mit 2 µg Protaminsulfat komplexiert. Nach einer Inkubationszeit von 10 min werden 4 µl des Lipidreagenzes zugesetzt. Kurz vor der Transfektion wird das Medium entfernt und durch 700 µl frisches Medium (14,3% FCS) ersetzt. Nach Zugabe des Lipid-DNA-Komplexes wird für 48 Stunden inkubiert und daraufhin der Anteil der GFP-exprimierenden, fluoreszierenden Zellen durch FACS-Analyse, wie unter a.1 beschrieben, bestimmt.

b) Transfektion mit pRc/CMVlacZ-Plasmid

pRc/CMVlacZ-Plasmid: lacZ wurde unter Verwendung der Restriktionsenzyme HindIII und Xbal aus dem kommerziell verfügbaren Vektor pSVbetaGal (Promega; Kat.-Nr. E1081) herausgeschnitten und in das Expressionsplasmid pRc/CMV (Invitrogen; HindIII und Xba1 geschnitten) einkloniert.

Am Tag vor der Transfektion werden 12- bis 15000 Zellen pro well einer 96-well-Zellkulturplatte ausgesät. Kurz vor der Transfektion wird das Medium durch 80 µl/well frisches Medium (20% FCS) ersetzt. Zur Untersuchung der Inhibition der Transfektionseffizienz durch FCS (Abb. 8) wird Medium mit einem Anteil von 20-100% FCS vorgelegt.

Daraufhin werden 80 µl des Lipid-DNA-Komplexes, hergestellt aus 0,5-1 µg DNA in 40 µl FCS-freiem Medium und 0,5-2 µl der wäßrigen Lipiddispersion (20-60 mol% Lipid #2 oder #7; 80-40 mol% DOPE) in 40 µl FCS-freiem Medium, hinzupipettiert und die Zellen für 48 Stunden im CO₂-Inkubator inkubiert. DC-Chol wird entsprechend den in der Literatur (s. o.) beschriebenen Bedingungen verwendet.

Die gleichzeitige Bestimmung der Reportergen-Expression und der Zellvitalität erfolgt nach einem literaturbekannten Verfahren [D. Groth, O. Keil et al.; Anal. Biochem. 258 (1998) 141-143] und liefert die Gesamt-beta-Galactosidase Expression in mU/well und die Zellvitalität in Prozent relativ zu unbehandelten Zellen.

Claims

1. Verbindungen der allgemeinen Formel I
wobei
R₁ bis R₆ unabhängig voneinander einen Rest Wasserstoff, Halogen, -C∼N, -NO₂, -SO₃H, -COOH, -N(Alkyl)₂, -NH(Alkyl), -NH₂, -Alkyl, -OH, -O-Alkyl, -O-Aryl, -O-Hetaryl, -O(C=O)Alkyl, -(C=O)Alkyl, -SH, -S-Alkyl bedeuten,
R₇ einen Rest Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 C-Atomen bedeutet,
m und k unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 1 bis 6 sind,
n eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist,
A eine Gruppe N⁺R₈R₉R₁₀Y^- bedeutet, wobei R₈ bis R₁₀ unabhängig voneinander einen Rest Wasserstoff, eine Alkyl-Gruppe mit 1 bis 4 C-Atomen, eine Gruppe -(CH₂)_i-OH oder eine Gruppe -(CH₂)_i-NH₂ mit i = 2-6 bedeuten und Y^- ein phamazeutisch akzeptables Anion darstellt,
B eine Gruppe
bedeutet, in der R₁₁ die für R₇ angegebene Bedeutung hat und r eine ganze Zahl von 1 bis 6 sein kann,
Z ein über das C-Atom 3 (des Steran-Grundgerüstes) gebundenes Steroid, einen Rest R₁₂ oder eine Gruppe
bedeutet, wobei j eine ganze Zahl von 0 bis 4 sein kann, R₁₂ einen gesättigten oder ungesättigten Alkyl oder Acylrest mit 8 bis 24 C-Atomen darstellt und E eine Gruppe O-R₁₃ oder CH₂-O-R₁₃ bedeutet, bei der R₁₃ die für R₁₂ angegebene Bedeutung hat und gleich oder von R₁₂ verschieden sein kann,
und wobei das Stickstoff-Atom des Chinolin-Gerüstes zusätzlich von einer Säure H⁺Y^- protoniert sein kann, wobei Y^- ein phamazeutisch akzeptables Anion darstellt.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reste R₁, R₂, R₄, R₆ und R₇ ein Wasserstoffatom darstellen, R₅ ein Wasserstoffatom oder ein Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen ist und R₃ ein Halogenatom bedeutet.

3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß m und k gleich 1 bis 3 sind, n gleich 1 ist und A eine Dimethylammonium- oder Diethylammonium-Gruppe bedeutet.

4. Verbindungen nach Anspruch 1, 2 oder 3 dadurch gekennzeichnet, daß B eine Gruppe -CH₂- oder -C(O)O- repräsentiert und Z einen Cholesterylrest oder einen 1,2- Dioleoyloxyethylrest darstellt.

5. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß Y ein Halogenid-, Acetat- oder Phosphat-Anion darstellt.

6. Reagenz, bestehend aus mindestens einer Verbindung der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich andere lipidische Verbindungen in unterschiedlichen Anteilen beigemischt sein können und daß die Verbindung/en in wäßrigen Medien dispergiert, oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel gelöst vorliegen, wobei im Falle einer wäßrigen Dispersion gleichzeitig Kryo-Schutzmittel aus der Gruppe Lactose, Trehalose, Sucrose, Glucose, Fructose, Galactose, Maltose, Mannitol oder Polyethylenglykol gelöst sein können.

7. Reagenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzlich beigemischten lipidischen Verbindungen der Phospholipid- oder Steroidklasse angehören und es sich bei dem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel um Ethanol handelt.

8. Reagenz für pharmazeutische oder diagnostische Anwendungen, dadurch gekennzeichnet, daß aus biologisch aktiven, anionischen Makromolekülen und einem Reagenz nach Anspruch 6 oder Anspruch 7 ein Aggregat gebildet wird, welches in wäßriger Dispersion vorliegen kann oder in ein Lyophilisat überführt wird.

9. Reagenz für pharmazeutische oder diagnostische Anwendungen nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den biologisch aktiven, anionischen Makromolekülen um DNA, RNA, Antisense-DNA, Antisense-RNA, Ribozymen, Peptiden oder Proteinen handelt.

10. Reagenz für pharmazeutische oder diagnostische Anwendungen nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktiven, anionischen Makromoleküle vor der Zugabe der Lipide mit polykationischen Molekülen vorkomplexiert sein können.

11. Reagenz für pharmazeutische oder diagnostische Anwendungen nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den polykationischen Molekülen um eine Verbindung aus der Gruppe Spermin, Spermidin, Histon H1, Histon H2A, Histon H2B, Histon H3, Histon H4, Protaminsulfat oder HMG-1-Protein handelt.

12. Verfahren für den Transfer von biologisch aktiven, anionischen Makromolekülen in eukaryotische Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß ein Reagenz der Ansprüche 8 bis 11 in vivo oder in vitro mit den Zellen in Kontakt gebracht wird.