DE19610805A1 - Verfahren zum Einschleusen von Makromolekülen in Eukaryontenzellen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einschleusen von Makromolekülen in Eukaryontenzellen, insbesondere Lymphozyten, bestimmte danach modifizierte Eukaryontenzellen und ein Verfahren zur Herstellung einer therapeutisch wirksamen Zellpräparation unter Beteiligung des Verfahrens.

Die Transfektion von Eukaryontenzellen ist von zunehmender Wichtigkeit für die Entwicklung der Gentherapie. Die Fortschritte in der Gentherapie hängen zum Großteil von der Entwicklung geeigneter Systeme zur Einschleusung von Makromolekülen in Zielzellen ab. Es sind zahlreiche Verfahren zur Einschleusung exogener DNA in Zellen entwickelt worden. Darunter fallen Transduktionsverfahren unter Verwendung von Trägermolekülen oder Viren. Die meisten Ansätze zur Gentherapie beruhen auf der Transduktion mittels retroviraler Vektoren oder DNA-Virusvektoren. Diese Verfahren weisen jedoch den Nachteil auf, daß die Fremdgene unkontrolliert ins Genom der Zielzelle integrieren und essentielle Zellabläufe stören können. Es besteht überdies die Gefahr der unerwünschten Rekombination mit endogenen Viren. Bei wiederholter Verabreichung können virale Vektoren eine Immunantwort hervorrufen. Außerdem können Viren nur eine begrenzte Menge an DNA verpacken.

Daneben sind Verfahren bekannt, bei denen DNA oder andere Makromoleküle mittels Liposomen in Zielzellen eingeschleust werden. Diese Verfahren weisen jedoch den Nachteil auf, daß das Spektrum der damit transfizierbaren Zellen begrenzt ist. So gelingt es zum Beispiel nicht, Lymphozyten, deren Transfektion für eine zukünftige Anwendung bei der Gentherapie besonders interessant wäre, mittels dieser Verfahren in aus­ reichendem Maße zu transfizieren.

Die WO 95/07995 beschreibt ein Verfahren zur Genmanipulation mittels Liposomen und adenoassoziiertem viralem Material. Die Expressionskassette, welche die gewünschte Gensequenz enthält, wird hierbei an beiden Enden von adenoassoziierten viralen invertierten terminalen Sequenzwiederholungen flankiert. Nach diesem Verfahren sollen auch Lymphozyten modifiziert werden können. Die in der WO 95/07995 enthaltenen Beispiele zeigen jedoch, daß die Expression der eingeschleusten Fremdgene in einem nur knapp über der Nachweisgrenze liegenden Umfang erfolgt.

Ein Überblick über gängige Transfektionsverfahren findet sich in "Human cancer and gene therapy" in Ann Hematol (1994) 69, 273-279. Die dort geschilderten Verfahren zeigen entweder eine unzureichende Transfektionseffizienz oder weisen die vorstehend geschilderten Nachteile auf.

Demzufolge liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein nichtvirales Verfahren bereitzustellen, mit dem Makromoleküle, insbesondere exogene DNA, mit höherer Effizienz in ein breiteres Spektrum von Zielzellen eingeschleust werden können.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, bei dem die Zielzellen mit den einzuschleusenden Makromolekülen, Lipidaggregaten und einer endosomen­ beeinflussenden Substanz in Kontakt gebracht werden.

Der Begriff "Einschleusen" soll für die Zwecke der Erfindung bedeuten, daß ein Makromolekül in eine Zielzelle überführt wird, so daß das Makromolekül letztlich im Zytoplasma oder in Kompartimenten im Zytoplasma verfügbar ist.

Eine wichtige Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zur Transfektion von Eukaryontenzellen, bei dem DNA in Zielzellen eingeführt und exprimiert wird.

Das Spektrum der Eukaryontenzellen, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung modifiziert werden können, unterliegt keinen prinzipiellen Einschränkungen. Von besonderem Interesse ist hierbei das Modifizieren von Säugerzellen, insbesondere von menschlichen Zellen. Im Hinblick auf eine Anwendung zur Gentherapie ist vorzugsweise das Einschleusen von Makromolekülen in Lymphozyten, und hierbei insbesondere in T- und NK-Lymphozyten von Interesse. Die Einschleusung von Zytokingenen, insbesondere von Interleukin-, Interferon-, Tumornekrosefaktorgenen, in T- bzw. NK-Lymphozyten ist im Hinblick auf die Stimulierung dieser Zelltypen bei viralen Effekten und Krebserkrankungen von Interesse.

Eine besonders relevante Subpopulation der Lymphozyten, sind sogenannte Zytokin­ induzierte Killerzellen (CIK), deren Herstellung erstmals in J.Exp.Med., Vol. 174, Juli 1991, 139-149 beschrieben wird. Diese Zellen besitzen hohe lytische Aktivität gegenüber Tumorzellen. Die Modifizierung derartiger Zellen durch Einschleusen von Makromolekülen ist bislang nicht beschrieben worden. Wie durch die nachfolgenden Beispiele gezeigt wird, werden hierdurch modifizierte Zellen mit besonders wertvollen Eigenschaften erhalten. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch Zytokin-induzierte Killerzellen, die durch Einschleusen von exogener DNA modifiziert sind. So gelingt es beispielsweise, durch Transfektion dieser Zellen nach dem vorliegenden Verfahren, deren lytische Aktivität in überraschender Weise zu steigern. Dies kann durch das Einschleusen von Zytokingenen geschehen, die in der Zelle exprimiert werden.

Weitere geeignete Lymphozytenpopulationen sind Zellen, die eine hohe Affinität zu bestimmten Tumorarten aufweisen. Hierbei sind tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs), Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK), zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) und adhärente/aktivierte LAKs (ALAKs) zu nennen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden Makromoleküle in Eukaryontenzellen eingeschleust. Als Makromoleküle kommen vorzugsweise Nucleinsäuren, insbesondere DNA, in Betracht. Hierbei ist das Einschleusen von Nucleotidsequenzen, die ein oder mehrere Gene umfassen, von besonderem Interesse. Diese Nucleotidsequenzen können gegebenenfalls mit regulatorischen Elementen versehen sein. Als regulatorische Elemente sind insbesondere Promotoren, Polyadenylierungssignale und/oder Replikationsursprünge zu nennen. Vorzugsweise werden Gene in Form von Zytokingenen eingeschleust, worunter Interleukin-, Interferon-, Tumornekrosefaktor, GCSF-, GM-CSF-Gene und ähnliche zu zählen sind. Möglich ist auch das Einschleusen von Tumorsupressorgenen und Markergenen, sowie Genen für zytotoxische Expressionsprodukte.

Es wird aber auch die Möglichkeit in Betracht gezogen, Oligonucleotide in Zellen einzuschleusen, die dort nicht exprimiert werden sollen. Hierunter fallen beispielsweise sogenannte "Anti-Sense"-Oligonucleotide, die über homologe Sequenzen spezifisch an zelluläre DNA oder RNA binden und deren Transkription bzw. Translation behindern. Hierunter fallen auch Oligonucleotide, deren Rückgrat derart modifiziert ist, daß sie gegen einen Abbau durch Nucleasen beständiger sind. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft das Einschleusen katalytisch wirksamer RNA, sogenannter "Ribozyme", die bestimmte zelluläre Vorgänge beeinflussen können.

Unter dem Begriff "Lipidaggregate" sollen alle Arten von Liposomen, d. h. sowohl uni­ lamellare als auch multilamellare Liposomen, sowie Micellen und amorphe Lipidaggregate verstanden werden. Vorzugsweise werden Liposomen verwendet, die kationische Lipide enthalten. Besonders bevorzugte kationische Lipide sind 2,3-Dioleyl­ oxy-N-[2(spermincarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium-trif-luoracetat (DOSPA), N-[1-(2,3-dioleyloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylammonium-chlorid (DOTMA) 1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonia)-propan (DOTAP), die oft im Gemisch mit neutralen Lipiden, wie Dioleyl-phosphatidylethanolamin (DOPE) verwendet werden. Andere geeignete Lipide sind 5-Carboxyspermylglycindioctadecylamid (DOGS) und Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-5-carboxyspermylamid (DPPES). Ein besonders geeignetes Lipid ist ein 3 : 1-Gemisch (Gew./Gew.) von DOSPA und DOPE, das unter dem Handelsnamen Lipofectamine® von Gibco/BRL erhältlich ist. Polykationische Lipide, wie z. B. die in der WO 95/17373 offenbarten, sind ebenfalls mit Vorteil verwendbar. Hier nicht genannte Lipide, die zu den vorstehend genannten Lipiden strukturell oder funktionell ähnlich sind, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung ebenfalls geeignet.

Die genannten kationischen Lipide weisen lange fettähnliche Reste sowie basische bzw. positiv geladene Gruppen in Form von Ammonium-, Sulfonium- oder Phosphonium­ gruppen auf. Es wird angenommen, daß diese positiv geladenen Substanzen einen Komplex mit negativ geladenen Makromolekülen, z. B. in Form von Nucleinsäuren, bilden und die fettähnlichen Reste die Verschmelzung mit der Zellmembran erleichtern.

Zentrales Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, daß das Verfahren in Gegenwart einer endosomenbeeinflussenden Substanz durchgeführt wird. Unter endosomenbe­ einflussender Substanz wird eine Substanz verstanden, die zu Verschiebungen im intrazellulären pH-Milieu führt und dadurch eine negative Beeinflussung der Membranstabilität bewirkt. Ein geeignetes Verfahren zur Ermittlung der endosomenbeeinflussenden Aktivität einer Verbindung findet sich in dem Artikel: Endozytosis in cultured rat alevolar type I cells: effect of lysosomotropic weak basis on the processes (Kalina M., Socher, R.; 1991, Vol. 39, 1337-48, J. Histochem-Zy­ tochem). Durch ein basisches Agens wie Chloroquin wird die Endosomenmembran rupturiert, die lamellare Organisation geht verloren. Dies kann mittels Elektronen- und polarisierter Lichtmikroskopie nachgewiesen werden.

Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, daß die Funktionsweise der endosomenbeeinflussenden Substanz wie folgt erklärt werden kann: Erster Schritt der Einschleusung von Makromolekülen in Zellen ist eine Assoziierung mit der Zellmembran, worauf Endosomen gebildet werden, die von der Zellmembran ins Zellinnere abgeschnürt werden. Die endosomenbeeinflussende Substanz labilisiert die Endosomenmenbran bzw. lysiert diese teilweise. Dadurch kommt es zu einer Freisetzung der in den Endosomen eingeschlossenen, oft in komplexierter Form vorliegenden Makromoleküle.

Als endosomenbeeinflussende Substanz ist Chloroquin besonders bevorzugt. Die anzuwendende Chloroquinkonzentration hängt in starkem Maße von den zu modifizierenden Zielzellen ab. Geeignete Konzentrationen kann der Fachmann anhand einfacher Versuche ermitteln. Als grober Rahmen können folgende Konzentrationen angegeben werden: mindestens etwa 20 µmol/l bis etwa 500 µmol/l, vorzugsweise 50 bis 200 µmol/l.

Alternativ hierzu können Adenovirus-Capsidproteine als endosomenbeeinflussende Substanz verwendet werden. Eine Präparation, die Adenovirus-Capsidproteine enthält, wird vorzugsweise durch Inaktivierung eines Adenovirus erhalten. Die Inaktivierung besteht beispielsweise in einer Behandlung mit Psoralenderivaten (z. B. 8-Methoxy­ psoralen) oder β-Propiolacton und UV-Bestrahlung bei 365 nm (sh. M. Cotten et al., Psoralen treatment of adenovirus particles eliminates virus replication and transcription while maintaining the endosomolytic activity of the virus capsid, 1994, Virology, 205, 254-61).

Für das Verfahren gemäß der Erfindung ist die Reihenfolge der Zugabe der Reagenzien zu den zu modifizierenden Zielzellen nicht kritisch. Insbesondere wenn es sich bei den einzuschleusenden Makromolekülen um DNA handelt, wird jedoch ein Verfahren bevorzugt, bei dem zunächst ein Komplex aus einzuschleusenden Makromolekülen und Lipidaggregaten gebildet wird, dieser Komplex mit den Zielzellen in Kontakt gebracht wird und anschließend die endosomenbeeinflussende Substanz zugegeben wird.

Das vorliegende Verfahren eignet sich zur stabilen als auch zur vorübergehenden Transfektion von Zellen, insbesondere zur vorübergehenden Transfektion von Lymphozyten. Es konnte durch die Erfinder gezeigt werden, daß Interleukingene, die mit dem vorliegenden Verfahren in CIK-Zellen eingebracht wurden, mindestens drei bis vier Tage in signifikantem Umfange exprimiert wurden. Hierdurch wurde die Proliferation dieser Zellen stimuliert und deren zytotoxische Wirkung gegenüber Tumorzellen im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen erhöht. Hiermit ist ein vielversprechender Ansatzpunkt für den möglichen Einsatz in der Gentherapie gegeben.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer therapeutisch wirksamen Zellpräparation, bei dem eine Population von Lymphozyten eines Patienten gewonnen und nach einem hier beschriebenen Verfahren modifiziert wird.

Die Erfindung soll nun durch die folgenden Beispiele näher veranschaulicht werden.

Beispiel 1 Transfektion von CIK-Zellen

Aus Blut von gesunden Spendern wurden nach dem in J. Exp. Med., Vol. 174, Juli 1991, 139-149 beschriebenen Verfahren CIK-Zellen hergestellt. Nach 10 bis 14 Tagen in Kultur wurden sie für eine Transfektion verwendet. Im vorliegenden Beispiel wurden die CIK-Zellen alternativ mit IL-7 oder IL-2 transfiziert. Bei der bei diesem Versuch benutzten DNA handelte es sich um zwei Plasmide, die als pCEP-IL2 bzw. pCEP-IL7 bezeichnet wurden. pCEP-IL2 enthielt das humane Interleukin-2-Gen (IL-2) als IL-2-cDNA unter der Kontrolle eines Zytomegalievirus-Promotors (CMV-Promotor) und einer SV40-Polyadynelierungssequenz.

Zur Herstellung von pCEP-IL2 wurde IL2-cDNA in die multiple Klonierungsstelle des Plasmidvektors pCEP (von Invitrogene erworben) kloniert. Zur Selektion von Transformanden enthielt dieser Klonierungssektor das Ampicillinresistenzgen. Die IL-2-cDNA wurde von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) als cDNA, eingebaut in den Vektor pBRs22-IL-2, erhalten. Aus diesem Vektor wurde die cDNA mit Hilfe von PCR-Technik angereichert, in den Vektor pCR^TM (Invitrogene) eingefügt und aus diesem mit BamHI und NotI ausgeschnitten. Die Fragmente wurde durch Elektrophorese in einem 1%igen Agarose-Gel getrennt, das IL-2-Fragment mit etwa 700 bp wurde ausgeschnitten, gereinigt und in den pCEP-Vektor, der zuvor mit BamH1 und NotI geschnitten worden war, und ebenfalls aus einem Agarose-Gel eluiert worden war, über Nacht ligiert, wobei ein Verhältnis von linearisiertem Vektor zu DNA-Fragment von 1 : 3 eingesetzt wurde. Die ligierten Proben wurden zur Transformierung von E.coli mit Hilfe der CaCl₂-Methode verwendet. Die Transformanden wurden in ampicillin­ haltigem Medium selektiert.

Die Plasmide wurden durch Standardverfahren aus den Zellen isoliert und gereinigt (über Sephadex-Säulen, Qiagen, Hildesheim). Das Plasmid pCEP-IL7 wurde entsprechend erhalten, außer daß anstelle von IL-2-cDNA IL-7-cDNA eingesetzt wurde, die in dem Vektor pGEMBL-IL-7 von American Type Culture Collection enthalten war.

Die Zellen werden in serum- und antibiotikafreiem Wachstumsmedium gewaschen und in einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen in 800 µl Medium pro Ansatz in einer 24-Well-Platte ausgesät. In sterilen Eppendorfgefäßen mischte man pro Transfektion getrennt voneinander A) 3 µg DNA (pCEP-IL2 oder pCEP-IL7) in 100 µl serumfreiem Medium und B) 10 µl Lipofectamine® (3 : 1-Gemisch (Gew./Gew.) von DOSPA und DOPE) in 100 µl serumfreiem Medium. Beide Lösungen wurden sanft gemischt und bei Raumtemperatur 30 min inkubiert, damit sich DNA-Liposomenkomplexe ausbilden konnten. Diese Mischung gab man zur Zellsuspension, mischte sanft, setzte Chloroquin auf eine Endkonzentration von 100 µmol/l zu und inkubierte 4 h im Brutschrank bei 37°C. Am Ende der Inkubationszeit fügte man 1,5 ml komplettes Wachstumsmedium hinzu. 24 h nach der Transfektion wurden die Kulturüberstände auf die Anwesenheit des gewünschten Genproduktes getestet. Vor der Bestimmung wurde die Zellaliquot entnommen (ca. 100 µl) und nach Trypan-Blaufärbung in einer Neubauer-Zählkammer gezählt. Kulturüberstände wurden gesammelt und mittels eines käuflichen IL-2- bzw. IL-7-ELISA-Tests (R, über Hermann Biermann, Bad Nauheim, Deutschland) untersucht. Die IL-2- bzw. IL-7-Konzentrationen sind als pg/1 Mio. Zellen angegeben.

Die folgende Tabelle zeigt die Transfektionsergebnisse. Die CIK-Zellen wurden entsprechend ihrer Herstellung durchnumeriert und stellen jeweils unterschiedliche Chargen dar.

Die Ergebnisse in der vorstehenden Tabelle zeigen deutlich, daß in Abwesenheit von Chloroquin kein gesuchtes Expressionsprodukt bzw. nur unbedeutende Mengen hiervon nachgewiesen werden konnten. Durch Zugabe von Chloroquin zu den Transfektions­ ansätzen wurde die Transfektionseffizienz erheblich gesteigert.

Beispiel 2 Transfektion einer Colonkarzinom-Zellinie mit IL-2

24 h vor der Transfektion wurden 3 × 10⁵ Zellen einer Colonkarzinom-Zellinie (CR75, erhalten von Eric de Kant, Gaby Schulz, Rudolph-Virchow-Klinikum, Berlin, Deutschland) in 2 ml Medium in 6-Well-Platten ausgesät und im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Pro Transfektion wurden in sterilen Eppendorfgefäßen A) 2 µg DNA (sh. Beispiel 1) in 100 µl serumfreiem Medium und B) 15 µl Lipotectamine® in 100 µl serumfreiem Medium verdünnt. Beide Lösungen wurden sanft gemischt und bei Raumtemperatur 45 min inkubiert, damit sich DNA-Liposomenkomplexe bilden können. Die ausgesäten Zellen wurden dann mit 2 ml Opti-MEM (Transfektionsmedium, Gibco BRL) gewaschen. Danach gab man 800 µl dieses Mediums zu den Zellen und fügte die Transfektionskomplexe hinzu. Die Zellen wurden nun für 5 h im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Anschießend wird noch 1 ml komplettes Wachstumsmedium (L15, Seromed) hinzugefügt. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen vom Überstand abgetrennt und in 2 ml komplettem Wachstumsmedium aufgenommen. 24 h nach diesem Mediumwechsel wurden Proben vom Überstand entnommen und wie in Beispiel 1 beschrieben auf das Vorhandensein von Interleukin-2 untersucht. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten: Nach 24stündiger Inkubation wurden ohne Zugabe von Chloroquin 831 pg pro 10⁶ Zellen, unter Verwendung von Chloroquin 2067 pg pro 10⁶ Zellen gefunden.

Beispiel 3 Transfektion einer Colonkarzinom-Primärkultur mit IL-2

Die Transfektion erfolgte analog der unter Beispiel 2 beschriebenen Vorgehensweise, außer daß Zellen einer Colonkarzinom-Primärkultur (erhalten durch B. Trojaneck, hergestellt nach Weiser, M.M., Intestinal epithelial cell surface membrane glycoprotein synthesis, J. Biol. Chem. 248, 2536-41, 1973) verwendet wurden. Die Ergebnisse waren wie folgt: Nach 24stündiger Inkubation wurden ohne Zugabe von Chloroquin 579 pg pro 10⁶ Zellen, unter Verwendung von Chloroquin 3133 pg pro 10⁶ Zellen gefunden.

Claims (20)

1. Verfahren zum Einschleusen von Makromolekülen in Eukaryontenzellen, bei dem die Zielzellen mit den einzuschleusenden Makromolekülen, Lipidaggregaten und einer endosomenbeeinflussenden Substanz in Kontakt gebracht werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzellen Säugerzellen, insbesondere menschliche Zellen, sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzellen Lymphozyten sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzellen T-Zellen, natürliche Killerzellen oder Zytokin-induzierte Killerzellen sind.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die einzuschleusenden Makromoleküle Nucleinsäuren sind.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure DNA ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA ein oder mehrere Gene umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA zusätzlich regulatorische Elemente umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß es die Expression des Genproduktes beinhaltet.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die einzuschleusenden Makromoleküle "Anti-Sense"-Oligonucleotide bzw. modifizierte Formen hiervon sind.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die einzuschleusenden Makromoleküle RNA in Form von Ribozymen sind.

12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipidaggregate Liposomen sind.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Liposomen kationische Lipide enthalten.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipide DOSPA, DOPE, DOTMA, DOTAP, DOGS und/oder DPPES (wie in der Beschreibung definiert) sind.

15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die endosomenbeeinflussende Substanz Chloroquin ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die endosomenbeeinflussende Substanz Adenovirus-Capsidproteine sind.

17. Zytokin-induzierte Killerzellen, modifiziert durch Einschleusen von exogener DNA.

18. Zytokin-induzierte Killerzellen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die eingeschleuste exogene DNA Zytokingene und regulatorische Elemente umfaßt.

19. Zytokin-induzierte Killerzellen nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß in ihnen die eingeschleusten Fremdgene exprimiert werden.

20. Verfahren zur Herstellung einer therapeutisch wirksamen Zellpräparation, bei dem eine Population von Lymphozyten eines Säugers gewonnen und nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 16 modifiziert wird.