DE19610805A1 - Verfahren zum Einschleusen von Makromolekülen in Eukaryontenzellen - Google Patents
Verfahren zum Einschleusen von Makromolekülen in EukaryontenzellenInfo
- Publication number
- DE19610805A1 DE19610805A1 DE1996110805 DE19610805A DE19610805A1 DE 19610805 A1 DE19610805 A1 DE 19610805A1 DE 1996110805 DE1996110805 DE 1996110805 DE 19610805 A DE19610805 A DE 19610805A DE 19610805 A1 DE19610805 A1 DE 19610805A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- cells
- macromolecules
- dna
- cytokine
- endosome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 title description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 49
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims abstract description 23
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 14
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 13
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical group ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 claims description 11
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 claims description 11
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 5
- XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N DOSPA trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)CCNC(=O)C(CCCNCCCN)NCCCN)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC XULFJDKZVHTRLG-JDVCJPALSA-N 0.000 claims description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 4
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 claims description 3
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 2
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 claims description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 claims description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 2
- -1 DOPE Chemical compound 0.000 claims 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 12
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 4
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N psoralen Chemical compound C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OC=C2 ZCCUUQDIBDJBTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 4',5'-Dihydropsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C=CC2=CC2=C1OCC2 VXGRJERITKFWPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUNGCZLFHHXKBX-UHFFFAOYSA-N 8-methoxypsoralen Natural products C1=CC(=O)OC2=C1C=C1CCOC1=C2OC BUNGCZLFHHXKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100039619 Granulocyte colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- QXKHYNVANLEOEG-UHFFFAOYSA-N Methoxsalen Chemical compound C1=CC(=O)OC2=C1C=C1C=COC1=C2OC QXKHYNVANLEOEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000033077 cellular process Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000000021 endosomolytic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000002080 lysosomotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229960004469 methoxsalen Drugs 0.000 description 1
- SQBBOVROCFXYBN-UHFFFAOYSA-N methoxypsoralen Natural products C1=C2OC(=O)C(OC)=CC2=CC2=C1OC=C2 SQBBOVROCFXYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- HKUFIYBZNQSHQS-UHFFFAOYSA-N n-octadecyloctadecan-1-amine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCNCCCCCCCCCCCCCCCCCC HKUFIYBZNQSHQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 125000005496 phosphonium group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000001907 polarising light microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-O sulfonium Chemical compound [SH3+] RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einschleusen von Makromolekülen
in Eukaryontenzellen, insbesondere Lymphozyten, bestimmte danach modifizierte
Eukaryontenzellen und ein Verfahren zur Herstellung einer therapeutisch wirksamen
Zellpräparation unter Beteiligung des Verfahrens.
Die Transfektion von Eukaryontenzellen ist von zunehmender Wichtigkeit für die
Entwicklung der Gentherapie. Die Fortschritte in der Gentherapie hängen zum Großteil
von der Entwicklung geeigneter Systeme zur Einschleusung von Makromolekülen in
Zielzellen ab. Es sind zahlreiche Verfahren zur Einschleusung exogener DNA in Zellen
entwickelt worden. Darunter fallen Transduktionsverfahren unter Verwendung von
Trägermolekülen oder Viren. Die meisten Ansätze zur Gentherapie beruhen auf der
Transduktion mittels retroviraler Vektoren oder DNA-Virusvektoren. Diese Verfahren
weisen jedoch den Nachteil auf, daß die Fremdgene unkontrolliert ins Genom der
Zielzelle integrieren und essentielle Zellabläufe stören können. Es besteht überdies die
Gefahr der unerwünschten Rekombination mit endogenen Viren. Bei wiederholter
Verabreichung können virale Vektoren eine Immunantwort hervorrufen. Außerdem
können Viren nur eine begrenzte Menge an DNA verpacken.
Daneben sind Verfahren bekannt, bei denen DNA oder andere Makromoleküle mittels
Liposomen in Zielzellen eingeschleust werden. Diese Verfahren weisen jedoch den
Nachteil auf, daß das Spektrum der damit transfizierbaren Zellen begrenzt ist. So gelingt
es zum Beispiel nicht, Lymphozyten, deren Transfektion für eine zukünftige Anwendung
bei der Gentherapie besonders interessant wäre, mittels dieser Verfahren in aus
reichendem Maße zu transfizieren.
Die WO 95/07995 beschreibt ein Verfahren zur Genmanipulation mittels Liposomen und
adenoassoziiertem viralem Material. Die Expressionskassette, welche die gewünschte
Gensequenz enthält, wird hierbei an beiden Enden von adenoassoziierten viralen
invertierten terminalen Sequenzwiederholungen flankiert. Nach diesem Verfahren sollen
auch Lymphozyten modifiziert werden können. Die in der WO 95/07995 enthaltenen
Beispiele zeigen jedoch, daß die Expression der eingeschleusten Fremdgene in einem nur
knapp über der Nachweisgrenze liegenden Umfang erfolgt.
Ein Überblick über gängige Transfektionsverfahren findet sich in "Human cancer and
gene therapy" in Ann Hematol (1994) 69, 273-279. Die dort geschilderten Verfahren
zeigen entweder eine unzureichende Transfektionseffizienz oder weisen die vorstehend
geschilderten Nachteile auf.
Demzufolge liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein nichtvirales
Verfahren bereitzustellen, mit dem Makromoleküle, insbesondere exogene DNA, mit
höherer Effizienz in ein breiteres Spektrum von Zielzellen eingeschleust werden können.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, bei dem die Zielzellen
mit den einzuschleusenden Makromolekülen, Lipidaggregaten und einer endosomen
beeinflussenden Substanz in Kontakt gebracht werden.
Der Begriff "Einschleusen" soll für die Zwecke der Erfindung bedeuten, daß ein
Makromolekül in eine Zielzelle überführt wird, so daß das Makromolekül letztlich im
Zytoplasma oder in Kompartimenten im Zytoplasma verfügbar ist.
Eine wichtige Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zur
Transfektion von Eukaryontenzellen, bei dem DNA in Zielzellen eingeführt und
exprimiert wird.
Das Spektrum der Eukaryontenzellen, die nach dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung modifiziert werden können, unterliegt keinen prinzipiellen Einschränkungen.
Von besonderem Interesse ist hierbei das Modifizieren von Säugerzellen, insbesondere
von menschlichen Zellen. Im Hinblick auf eine Anwendung zur Gentherapie ist
vorzugsweise das Einschleusen von Makromolekülen in Lymphozyten, und hierbei
insbesondere in T- und NK-Lymphozyten von Interesse. Die Einschleusung von
Zytokingenen, insbesondere von Interleukin-, Interferon-, Tumornekrosefaktorgenen, in
T- bzw. NK-Lymphozyten ist im Hinblick auf die Stimulierung dieser Zelltypen bei
viralen Effekten und Krebserkrankungen von Interesse.
Eine besonders relevante Subpopulation der Lymphozyten, sind sogenannte Zytokin
induzierte Killerzellen (CIK), deren Herstellung erstmals in J.Exp.Med., Vol. 174, Juli
1991, 139-149 beschrieben wird. Diese Zellen besitzen hohe lytische Aktivität gegenüber
Tumorzellen. Die Modifizierung derartiger Zellen durch Einschleusen von
Makromolekülen ist bislang nicht beschrieben worden. Wie durch die nachfolgenden
Beispiele gezeigt wird, werden hierdurch modifizierte Zellen mit besonders wertvollen
Eigenschaften erhalten. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch Zytokin-induzierte
Killerzellen, die durch Einschleusen von exogener DNA modifiziert sind. So gelingt es
beispielsweise, durch Transfektion dieser Zellen nach dem vorliegenden Verfahren,
deren lytische Aktivität in überraschender Weise zu steigern. Dies kann durch das
Einschleusen von Zytokingenen geschehen, die in der Zelle exprimiert werden.
Weitere geeignete Lymphozytenpopulationen sind Zellen, die eine hohe Affinität zu
bestimmten Tumorarten aufweisen. Hierbei sind tumorinfiltrierende Lymphozyten
(TILs), Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK), zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs)
und adhärente/aktivierte LAKs (ALAKs) zu nennen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden Makromoleküle in Eukaryontenzellen
eingeschleust. Als Makromoleküle kommen vorzugsweise Nucleinsäuren, insbesondere
DNA, in Betracht. Hierbei ist das Einschleusen von Nucleotidsequenzen, die ein oder
mehrere Gene umfassen, von besonderem Interesse. Diese Nucleotidsequenzen können
gegebenenfalls mit regulatorischen Elementen versehen sein. Als regulatorische Elemente
sind insbesondere Promotoren, Polyadenylierungssignale und/oder Replikationsursprünge
zu nennen. Vorzugsweise werden Gene in Form von Zytokingenen eingeschleust,
worunter Interleukin-, Interferon-, Tumornekrosefaktor, GCSF-, GM-CSF-Gene und
ähnliche zu zählen sind. Möglich ist auch das Einschleusen von Tumorsupressorgenen
und Markergenen, sowie Genen für zytotoxische Expressionsprodukte.
Es wird aber auch die Möglichkeit in Betracht gezogen, Oligonucleotide in Zellen
einzuschleusen, die dort nicht exprimiert werden sollen. Hierunter fallen beispielsweise
sogenannte "Anti-Sense"-Oligonucleotide, die über homologe Sequenzen spezifisch an
zelluläre DNA oder RNA binden und deren Transkription bzw. Translation behindern.
Hierunter fallen auch Oligonucleotide, deren Rückgrat derart modifiziert ist, daß sie
gegen einen Abbau durch Nucleasen beständiger sind. Eine weitere Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung betrifft das Einschleusen katalytisch wirksamer RNA,
sogenannter "Ribozyme", die bestimmte zelluläre Vorgänge beeinflussen können.
Unter dem Begriff "Lipidaggregate" sollen alle Arten von Liposomen, d. h. sowohl uni
lamellare als auch multilamellare Liposomen, sowie Micellen und amorphe
Lipidaggregate verstanden werden. Vorzugsweise werden Liposomen verwendet, die
kationische Lipide enthalten. Besonders bevorzugte kationische Lipide sind 2,3-Dioleyl
oxy-N-[2(spermincarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminium-trif-luoracetat
(DOSPA), N-[1-(2,3-dioleyloxy)-propyl]-N,N,N-trimethylammonium-chlorid (DOTMA)
1,2-Bis(oleoyloxy)-3-(trimethylammonia)-propan (DOTAP), die oft im Gemisch mit
neutralen Lipiden, wie Dioleyl-phosphatidylethanolamin (DOPE) verwendet werden.
Andere geeignete Lipide sind 5-Carboxyspermylglycindioctadecylamid (DOGS) und
Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-5-carboxyspermylamid (DPPES). Ein besonders
geeignetes Lipid ist ein 3 : 1-Gemisch (Gew./Gew.) von DOSPA und DOPE, das unter
dem Handelsnamen Lipofectamine® von Gibco/BRL erhältlich ist. Polykationische
Lipide, wie z. B. die in der WO 95/17373 offenbarten, sind ebenfalls mit Vorteil
verwendbar. Hier nicht genannte Lipide, die zu den vorstehend genannten Lipiden
strukturell oder funktionell ähnlich sind, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung
ebenfalls geeignet.
Die genannten kationischen Lipide weisen lange fettähnliche Reste sowie basische bzw.
positiv geladene Gruppen in Form von Ammonium-, Sulfonium- oder Phosphonium
gruppen auf. Es wird angenommen, daß diese positiv geladenen Substanzen einen
Komplex mit negativ geladenen Makromolekülen, z. B. in Form von Nucleinsäuren,
bilden und die fettähnlichen Reste die Verschmelzung mit der Zellmembran erleichtern.
Zentrales Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, daß das Verfahren in Gegenwart
einer endosomenbeeinflussenden Substanz durchgeführt wird. Unter endosomenbe
einflussender Substanz wird eine Substanz verstanden, die zu Verschiebungen im
intrazellulären pH-Milieu führt und dadurch eine negative Beeinflussung der
Membranstabilität bewirkt. Ein geeignetes Verfahren zur Ermittlung der
endosomenbeeinflussenden Aktivität einer Verbindung findet sich in dem Artikel:
Endozytosis in cultured rat alevolar type I cells: effect of lysosomotropic weak basis on
the processes (Kalina M., Socher, R.; 1991, Vol. 39, 1337-48, J. Histochem-Zy
tochem). Durch ein basisches Agens wie Chloroquin wird die Endosomenmembran
rupturiert, die lamellare Organisation geht verloren. Dies kann mittels Elektronen- und
polarisierter Lichtmikroskopie nachgewiesen werden.
Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, daß die
Funktionsweise der endosomenbeeinflussenden Substanz wie folgt erklärt werden kann:
Erster Schritt der Einschleusung von Makromolekülen in Zellen ist eine Assoziierung mit
der Zellmembran, worauf Endosomen gebildet werden, die von der Zellmembran ins
Zellinnere abgeschnürt werden. Die endosomenbeeinflussende Substanz labilisiert die
Endosomenmenbran bzw. lysiert diese teilweise. Dadurch kommt es zu einer Freisetzung
der in den Endosomen eingeschlossenen, oft in komplexierter Form vorliegenden
Makromoleküle.
Als endosomenbeeinflussende Substanz ist Chloroquin besonders bevorzugt. Die
anzuwendende Chloroquinkonzentration hängt in starkem Maße von den zu
modifizierenden Zielzellen ab. Geeignete Konzentrationen kann der Fachmann anhand
einfacher Versuche ermitteln. Als grober Rahmen können folgende Konzentrationen
angegeben werden: mindestens etwa 20 µmol/l bis etwa 500 µmol/l, vorzugsweise 50 bis
200 µmol/l.
Alternativ hierzu können Adenovirus-Capsidproteine als endosomenbeeinflussende
Substanz verwendet werden. Eine Präparation, die Adenovirus-Capsidproteine enthält,
wird vorzugsweise durch Inaktivierung eines Adenovirus erhalten. Die Inaktivierung
besteht beispielsweise in einer Behandlung mit Psoralenderivaten (z. B. 8-Methoxy
psoralen) oder β-Propiolacton und UV-Bestrahlung bei 365 nm (sh. M. Cotten et al.,
Psoralen treatment of adenovirus particles eliminates virus replication and transcription
while maintaining the endosomolytic activity of the virus capsid, 1994, Virology, 205,
254-61).
Für das Verfahren gemäß der Erfindung ist die Reihenfolge der Zugabe der Reagenzien
zu den zu modifizierenden Zielzellen nicht kritisch. Insbesondere wenn es sich bei den
einzuschleusenden Makromolekülen um DNA handelt, wird jedoch ein Verfahren
bevorzugt, bei dem zunächst ein Komplex aus einzuschleusenden Makromolekülen und
Lipidaggregaten gebildet wird, dieser Komplex mit den Zielzellen in Kontakt gebracht
wird und anschließend die endosomenbeeinflussende Substanz zugegeben wird.
Das vorliegende Verfahren eignet sich zur stabilen als auch zur vorübergehenden
Transfektion von Zellen, insbesondere zur vorübergehenden Transfektion von
Lymphozyten. Es konnte durch die Erfinder gezeigt werden, daß Interleukingene, die
mit dem vorliegenden Verfahren in CIK-Zellen eingebracht wurden, mindestens drei bis
vier Tage in signifikantem Umfange exprimiert wurden. Hierdurch wurde die
Proliferation dieser Zellen stimuliert und deren zytotoxische Wirkung gegenüber
Tumorzellen im Vergleich zu nicht transfizierten Zellen erhöht. Hiermit ist ein
vielversprechender Ansatzpunkt für den möglichen Einsatz in der Gentherapie gegeben.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer therapeutisch wirksamen
Zellpräparation, bei dem eine Population von Lymphozyten eines Patienten gewonnen
und nach einem hier beschriebenen Verfahren modifiziert wird.
Die Erfindung soll nun durch die folgenden Beispiele näher veranschaulicht werden.
Aus Blut von gesunden Spendern wurden nach dem in J. Exp. Med., Vol. 174, Juli 1991,
139-149 beschriebenen Verfahren CIK-Zellen hergestellt. Nach 10 bis 14 Tagen in
Kultur wurden sie für eine Transfektion verwendet. Im vorliegenden Beispiel wurden die
CIK-Zellen alternativ mit IL-7 oder IL-2 transfiziert. Bei der bei diesem Versuch
benutzten DNA handelte es sich um zwei Plasmide, die als pCEP-IL2 bzw. pCEP-IL7
bezeichnet wurden. pCEP-IL2 enthielt das humane Interleukin-2-Gen (IL-2) als
IL-2-cDNA unter der Kontrolle eines Zytomegalievirus-Promotors (CMV-Promotor) und
einer SV40-Polyadynelierungssequenz.
Zur Herstellung von pCEP-IL2 wurde IL2-cDNA in die multiple Klonierungsstelle des
Plasmidvektors pCEP (von Invitrogene erworben) kloniert. Zur Selektion von
Transformanden enthielt dieser Klonierungssektor das Ampicillinresistenzgen. Die
IL-2-cDNA wurde von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) als cDNA,
eingebaut in den Vektor pBRs22-IL-2, erhalten. Aus diesem Vektor wurde die cDNA
mit Hilfe von PCR-Technik angereichert, in den Vektor pCRTM (Invitrogene) eingefügt
und aus diesem mit BamHI und NotI ausgeschnitten. Die Fragmente wurde durch
Elektrophorese in einem 1%igen Agarose-Gel getrennt, das IL-2-Fragment mit etwa 700
bp wurde ausgeschnitten, gereinigt und in den pCEP-Vektor, der zuvor mit BamH1 und
NotI geschnitten worden war, und ebenfalls aus einem Agarose-Gel eluiert worden war,
über Nacht ligiert, wobei ein Verhältnis von linearisiertem Vektor zu DNA-Fragment
von 1 : 3 eingesetzt wurde. Die ligierten Proben wurden zur Transformierung von E.coli
mit Hilfe der CaCl₂-Methode verwendet. Die Transformanden wurden in ampicillin
haltigem Medium selektiert.
Die Plasmide wurden durch Standardverfahren aus den Zellen isoliert und gereinigt (über
Sephadex-Säulen, Qiagen, Hildesheim). Das Plasmid pCEP-IL7 wurde entsprechend
erhalten, außer daß anstelle von IL-2-cDNA IL-7-cDNA eingesetzt wurde, die in dem
Vektor pGEMBL-IL-7 von American Type Culture Collection enthalten war.
Die Zellen werden in serum- und antibiotikafreiem Wachstumsmedium gewaschen und in
einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen in 800 µl Medium pro Ansatz in einer 24-Well-Platte
ausgesät. In sterilen Eppendorfgefäßen mischte man pro Transfektion getrennt
voneinander A) 3 µg DNA (pCEP-IL2 oder pCEP-IL7) in 100 µl serumfreiem Medium
und B) 10 µl Lipofectamine® (3 : 1-Gemisch (Gew./Gew.) von DOSPA und DOPE) in
100 µl serumfreiem Medium. Beide Lösungen wurden sanft gemischt und bei
Raumtemperatur 30 min inkubiert, damit sich DNA-Liposomenkomplexe ausbilden
konnten. Diese Mischung gab man zur Zellsuspension, mischte sanft, setzte Chloroquin
auf eine Endkonzentration von 100 µmol/l zu und inkubierte 4 h im Brutschrank bei
37°C. Am Ende der Inkubationszeit fügte man 1,5 ml komplettes Wachstumsmedium
hinzu. 24 h nach der Transfektion wurden die Kulturüberstände auf die Anwesenheit des
gewünschten Genproduktes getestet. Vor der Bestimmung wurde die Zellaliquot
entnommen (ca. 100 µl) und nach Trypan-Blaufärbung in einer Neubauer-Zählkammer
gezählt. Kulturüberstände wurden gesammelt und mittels eines käuflichen IL-2- bzw.
IL-7-ELISA-Tests (R, über Hermann Biermann, Bad Nauheim, Deutschland)
untersucht. Die IL-2- bzw. IL-7-Konzentrationen sind als pg/1 Mio. Zellen angegeben.
Die folgende Tabelle zeigt die Transfektionsergebnisse. Die CIK-Zellen wurden
entsprechend ihrer Herstellung durchnumeriert und stellen jeweils unterschiedliche
Chargen dar.
Die Ergebnisse in der vorstehenden Tabelle zeigen deutlich, daß in Abwesenheit von
Chloroquin kein gesuchtes Expressionsprodukt bzw. nur unbedeutende Mengen hiervon
nachgewiesen werden konnten. Durch Zugabe von Chloroquin zu den Transfektions
ansätzen wurde die Transfektionseffizienz erheblich gesteigert.
24 h vor der Transfektion wurden 3 × 10⁵ Zellen einer Colonkarzinom-Zellinie (CR75,
erhalten von Eric de Kant, Gaby Schulz, Rudolph-Virchow-Klinikum, Berlin,
Deutschland) in 2 ml Medium in 6-Well-Platten ausgesät und im Brutschrank bei 37°C
inkubiert. Pro Transfektion wurden in sterilen Eppendorfgefäßen A) 2 µg DNA (sh.
Beispiel 1) in 100 µl serumfreiem Medium und B) 15 µl Lipotectamine® in 100 µl
serumfreiem Medium verdünnt. Beide Lösungen wurden sanft gemischt und bei
Raumtemperatur 45 min inkubiert, damit sich DNA-Liposomenkomplexe bilden können.
Die ausgesäten Zellen wurden dann mit 2 ml Opti-MEM (Transfektionsmedium, Gibco
BRL) gewaschen. Danach gab man 800 µl dieses Mediums zu den Zellen und fügte die
Transfektionskomplexe hinzu. Die Zellen wurden nun für 5 h im Brutschrank bei 37°C
inkubiert. Anschießend wird noch 1 ml komplettes Wachstumsmedium (L15, Seromed)
hinzugefügt. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen vom Überstand abgetrennt
und in 2 ml komplettem Wachstumsmedium aufgenommen. 24 h nach diesem
Mediumwechsel wurden Proben vom Überstand entnommen und wie in Beispiel 1
beschrieben auf das Vorhandensein von Interleukin-2 untersucht. Es wurden folgende
Ergebnisse erhalten: Nach 24stündiger Inkubation wurden ohne Zugabe von Chloroquin
831 pg pro 10⁶ Zellen, unter Verwendung von Chloroquin 2067 pg pro 10⁶ Zellen
gefunden.
Die Transfektion erfolgte analog der unter Beispiel 2 beschriebenen Vorgehensweise,
außer daß Zellen einer Colonkarzinom-Primärkultur (erhalten durch B. Trojaneck,
hergestellt nach Weiser, M.M., Intestinal epithelial cell surface membrane glycoprotein
synthesis, J. Biol. Chem. 248, 2536-41, 1973) verwendet wurden. Die Ergebnisse waren
wie folgt: Nach 24stündiger Inkubation wurden ohne Zugabe von Chloroquin 579 pg pro
10⁶ Zellen, unter Verwendung von Chloroquin 3133 pg pro 10⁶ Zellen gefunden.
Claims (20)
1. Verfahren zum Einschleusen von Makromolekülen in Eukaryontenzellen, bei dem die
Zielzellen mit den einzuschleusenden Makromolekülen, Lipidaggregaten und einer
endosomenbeeinflussenden Substanz in Kontakt gebracht werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzellen Säugerzellen,
insbesondere menschliche Zellen, sind.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzellen Lymphozyten
sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzellen T-Zellen,
natürliche Killerzellen oder Zytokin-induzierte Killerzellen sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die
einzuschleusenden Makromoleküle Nucleinsäuren sind.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleinsäure DNA ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA ein oder mehrere
Gene umfaßt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA zusätzlich
regulatorische Elemente umfaßt.
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß es die Expression
des Genproduktes beinhaltet.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die
einzuschleusenden Makromoleküle "Anti-Sense"-Oligonucleotide bzw. modifizierte
Formen hiervon sind.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die
einzuschleusenden Makromoleküle RNA in Form von Ribozymen sind.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die
Lipidaggregate Liposomen sind.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Liposomen
kationische Lipide enthalten.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipide DOSPA,
DOPE, DOTMA, DOTAP, DOGS und/oder DPPES (wie in der Beschreibung definiert)
sind.
15. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die
endosomenbeeinflussende Substanz Chloroquin ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die
endosomenbeeinflussende Substanz Adenovirus-Capsidproteine sind.
17. Zytokin-induzierte Killerzellen, modifiziert durch Einschleusen von exogener DNA.
18. Zytokin-induzierte Killerzellen nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die
eingeschleuste exogene DNA Zytokingene und regulatorische Elemente umfaßt.
19. Zytokin-induzierte Killerzellen nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß in
ihnen die eingeschleusten Fremdgene exprimiert werden.
20. Verfahren zur Herstellung einer therapeutisch wirksamen Zellpräparation, bei dem
eine Population von Lymphozyten eines Säugers gewonnen und nach einem Verfahren
nach einem der Ansprüche 3 bis 16 modifiziert wird.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1996110805 DE19610805A1 (de) | 1996-03-19 | 1996-03-19 | Verfahren zum Einschleusen von Makromolekülen in Eukaryontenzellen |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1996110805 DE19610805A1 (de) | 1996-03-19 | 1996-03-19 | Verfahren zum Einschleusen von Makromolekülen in Eukaryontenzellen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19610805A1 true DE19610805A1 (de) | 1997-09-25 |
Family
ID=7788772
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1996110805 Withdrawn DE19610805A1 (de) | 1996-03-19 | 1996-03-19 | Verfahren zum Einschleusen von Makromolekülen in Eukaryontenzellen |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19610805A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001044198A1 (de) * | 1999-12-17 | 2001-06-21 | G.O.T. Gesellschaft Für Therapieoptimierung Und Targeting Entwicklungs Mbh | Amphiphile chinolylpolyamine als transfermittel für biologisch aktive makromoleküle |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996022379A2 (en) * | 1995-01-20 | 1996-07-25 | Nexia Biotechnologies, Inc. | Direct gene transfer into the ruminant mammary gland |
-
1996
- 1996-03-19 DE DE1996110805 patent/DE19610805A1/de not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996022379A2 (en) * | 1995-01-20 | 1996-07-25 | Nexia Biotechnologies, Inc. | Direct gene transfer into the ruminant mammary gland |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
AN 96023082 * |
Datenbank MEDLINE bei STN * |
Moshe Baru et.al.: Gene 161(1995), 143-150 * |
Zhon, H. et.al.: Chinese Medical Journal 108, (Mai 1995), 332-37 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001044198A1 (de) * | 1999-12-17 | 2001-06-21 | G.O.T. Gesellschaft Für Therapieoptimierung Und Targeting Entwicklungs Mbh | Amphiphile chinolylpolyamine als transfermittel für biologisch aktive makromoleküle |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69535540T2 (de) | Zusammensetzung enthaltend nukleinsäuren und kationische polymere, zubereitung und verwendung | |
DE69433462T2 (de) | Adeno-assoziierte virale (avv) liposomen und damit zusammenhängende verfahren | |
DE69534669T2 (de) | Nukleinsaeure enthaltende zusammensetzungen, herstellung und verwendung | |
DE69633669T2 (de) | Verfahren zur zelltransfektion mit liposomal-verkapselten nukleinsäuren | |
EP1776460B2 (de) | Verfahren zur modulation der genexpression durch änderung des cpg gehalts | |
DE69633725T2 (de) | Kationische lipide/dns komplexe zum zielen von genen | |
EP0905254B1 (de) | Verfahren zur Herstellung eines niedermolekularen Polyethylenimins | |
EP0778349A2 (de) | Genkonstrukt und dessen Verwendung | |
DE69804463T2 (de) | Kationische polymere, diese kationische polymere enthaltende komplexe und wenigstens eine negative ladung enthaltende therapeutisch wirksame mittel, insbesondere nukleinsäuren und ihre verwendung in gentherapie | |
EP2036980A1 (de) | Herabregulation der Genexpression mittels Nukleinsäure-beladener virusähnlicher Partikel | |
DE10202419A1 (de) | Verfahren zur Hemmung der Expression eines durch eine Chromosomen-Aberration entstandenen Zielgens | |
DE69101634T2 (de) | Rekombinant hergestellte blutfaktoren, verfahren zur exprimierung besagter blutfaktoren sowie in besagtem prozess verwendeter rekombinanter vaccina-virus. | |
DE69432500T2 (de) | Rekombinante Foamy-Virus-Vektoren zur medizinischen und diagnostischen Verwendung und Verfahren zur Herstellung rekombinanter Foamy-Virus-Vektoren | |
DE10131145B4 (de) | Zusammensetzung zum zellspezifischen Transfer von Wirkstoffen | |
DE19610805A1 (de) | Verfahren zum Einschleusen von Makromolekülen in Eukaryontenzellen | |
DE69709891T2 (de) | Chitosan enthaltende zusammensetzung | |
EP1294919B1 (de) | Verfahren in vitro zum einbringen von nukleinsäure in eine zelle (transfektion) mittels calciumphosphat | |
DE69426303T2 (de) | Verfahren zur unterdrückung der immunantwort durch gentherapie | |
EP2625275A1 (de) | Verfahren zur semi-synthetischen herstellung hochreiner "minicircle" dna-vektoren aus plasmiden | |
DE69810925T2 (de) | Verwendung eines kationischen Polymer zur Herstellung von Nukleinsäure-Komplexe und verwandte Zusammensetzungen | |
DE3640550C2 (de) | ||
DE69834938T2 (de) | Granulozyten-kolonie-stimulierender faktor aus der katze | |
EP1000167B1 (de) | Herstellung humaner mutierter proteine in humanen zellen mittels homologer rekombination | |
DE60013586T2 (de) | Genexpressions-basensequenzen zur therapeutischen anwendung und heilmittel zur gentherapie | |
DE10057014B4 (de) | Verfahren zur Herstellung von zielzellspezifischen Arzneimitteln |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OP8 | Request for examination as to paragraph 44 patent law | ||
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: NIEMITZ, GEB. RAU, SIGRUN, 12163 BERLIN, DE SCHMID |
|
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |