DE69534669T2

DE69534669T2 - Nukleinsaeure enthaltende zusammensetzungen, herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE69534669T2
Application number: DE69534669T
Authority: DE
Inventors: Jean-Paul Behr; Barbara Demeneix; Jean-Serge Remy; Daniel Scherman; Bertrand Schwartz
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1994-01-10
Filing date: 1995-01-09
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2015-01-10
Also published as: ATE312190T1; JPH09508100A; US6172048B1; NO962791D0; AU1458395A; ZA95137B; WO1995018863A1; CA2180872A1; NO962791L; FR2714830B1; AU707571B2; NO318180B1; EP0738328B1; CA2180872C; DE69534669D1; FI962799A0; KR100377889B1; MX9602561A; JP4380796B2; EP0738328A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen auf der Basis von Nucleinsäuren, ihre Herstellung und ihre Verwendung. Insbesondere betrifft sie Zusammensetzungen, die wenigstens eine Nucleinsäure und ein Lipopolyamin umfassen, und ihre Verwendung in der Gentherapie, insbesondere für die Übertragung von Nucleinsäuren.
Die Gentherapie besteht darin, einen Mangel oder eine Anomalie (Mutation, aberrante Expression usw.) zu korrigieren oder die Expression eines Proteins von therapeutischem Interesse durch Einführung einer genetischen Information in die betroffene Zelle oder das betroffene Organ zu gewährleisten. Diese genetische Information kann entweder in vitro in eine aus dem Organ entnommene Zelle eingeführt werden, wobei die modifizierte Zelle dann wieder in den Organismus eingeführt wird, oder direkt in vivo in das geeignete Gewebe eingeführt werden. Für die Übertragung dieser genetischen Information wurden verschiedene Techniken beschrieben, von denen verschiedene Transfektionstechniken Komplexe aus DNA und DEAE-Dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), aus DNA und Kernproteinen (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), aus DNA und Lipiden (Peigner et al., PNAS 84 (1987) 7413), aus DNA und Polylysin, den Einsatz von Liposomen (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), usw. beinhalten. Etwas später ist der Einsatz von Viren als Vektoren für die Übertragung von Genen als vielversprechende Alternative zu diesen physikalischchemischen Transfektionstechniken hinzugekommen. In dieser Hinsicht wurden verschiedene Viren auf ihre Fähigkeit, bestimmte Zellpopulationen zu infizieren, getestet, insbesondere Retroviren (RSV, HMS, MMS usw.), das Virus HSV, Adeno-assoziierte Viren und Adenoviren.
Die bisher entwickelten Techniken erlauben es jedoch nicht, die mit der Übertragung von Genen in Zellen und/oder den Organismus verbundenen Probleme in befriedigender Weise zu lösen. Insbesondere sind die mit dem Eindringen von Nucleinsäure in Zellen verbundenen Probleme noch nicht völlig gelöst. Tatsächlich verhindert die polyanionische Natur der Nucleinsäuren ihren Durchtritt durch die Zellmembranen. Es wurde zwar gezeigt, dass nackte Nucleinsäuren die Plasmamembran bestimmter Zelltypen in vivo durchqueren können (siehe insbesondere die Anmeldung Nr. WO 90/11092), doch bleibt die Transfektionseffizienz recht gering. Überdies haben nackte Nucleinsäuren aufgrund ihres Abbaus durch Enzyme und ihrer Beseitigung über die Harnwege im Plasma nur eine kurze Halbwertszeit. Außerdem ermöglichen es die rekombinanten Viren zwar, die Übertragungseffizienz von Nucleinsäuren zu verbessern, doch birgt ihr Einsatz gewisse Risiken, wie Pathogenität, Übertragung, Replikation, Rekombination, Transformation, Immunogenität usw.
Die vorliegende Erfindung liefert eine vorteilhafte Lösung für diese verschiedenen Probleme. Die Anmelderin hat in der Tat gezeigt, dass bestimmte Zusammensetzungen, die eine Nucleinsäure und ein Lipopolyamin, in dem es sich bei dem Polyaminbereich um Spermin handelt, umfassen, die in-vivo-Übertragung der Nucleinsäure in eine Zelle und/oder ein Organ mit großer Effizienz und ohne Toxizität ermöglichen können. Die Zusammensetzungen der Erfindung ermöglichen es auch, Nachteile, die mit dem Einsatz viraler Vektoren verbunden sind (potentielle Gefahren, beschränkte Größe des übertragenen Gens, hoher Preis usw.), zu vermeiden.
Die Verwendung bestimmter Lipopolyamine, um Zellkulturen in vitro zu transfizieren, wurde im Stand der Technik bereits beschrieben. So beschreibt die Anmeldung EP 394 111 die Verwendung bestimmter Lipopolyamine für die in-vitro-Transfektion von Zelllinien. Ebenso beschreibt der Artikel von Demeneix et al. (Int. J. Dev. Biol. 35 (1991) 481) die Verwendung eines Lipopolyamins (Dioctadecylaminoglycylspermin, DOGS) für die Transfektion von Nucleinsäuren in ovo. Gemäß diesen Dokumenten müssen die Lipopolyamine unter den Bedingungen verwendet werden, dass das Verhältnis von positiven Ladungen des Lipopolyamins zu negativen Ladungen der Nucleinsäure zwischen 2 und 5 liegt und vorzugsweise gleich 3 oder 4 ist. Wie die Beispiele 8 und 9 der vorliegenden Anmeldung jedoch überraschend zeigen, ermöglicht keine der in diesen Dokumenten beschriebenen Bedingungen die in-vivo-Transfektion von Nucleinsäuren. Aufgrund einer Wechselwirkung mit anionischen Makromolekülen oder mit der extrazellulären Matrix der Gewebe sind die unter diesen Bedingungen gebildeten Teilchen tatsächlich unfähig, aus der Applikationsstelle herauszudiffundieren, und damit, eine Nucleinsäure in vivo zu übertragen. Außerdem lassen sich die in diesen Dokumenten beschriebenen Herstellungsbedingungen nicht auf die Realisierung von pharmazeutischen Zusammensetzungen anwenden, die große Mengen an Nucleinsäuren enthalten. Die Anmelderin hat nun gezeigt, dass Lipopolyamine unter bestimmten Bedingungen für die in-vivo-Transfektion von Nucleinsäuren verwendet werden können. Insbesondere hat die Anmelderin herausgefunden, dass Zusammensetzungen, die eine Nucleinsäure und ein Lipopolyamin umfassen, unter solchen Bedingungen, dass das Verhältnis von positiven Ladungen des Lipopolyamins zu negativen Ladungen der Nucleinsäure kleiner oder gleich 2 ist, überraschenderweise die in-vivo-Transfektion der Nucleinsäure mit großer Effizienz ermöglichen.
Außerdem hat die Anmelderin bestimmte Bedingungen entwickelt, die die Herstellung dieser pharmazeutischen Zusammensetzungen, die hohe Mengen an Nucleinsäure umfassen, erlauben. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung stellen somit besonders vorteilhafte Werkzeuge für die in-vivo-Verabreichung und -Übertragung von Nucleinsäuren dar.
Die Artikel von Behr J.P. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, Vol. 86, 1989, S. 6982–6986, und Loeffler J.P. et al., Methods in Enzymology, Vol. 217, 1993, 5. 599–618, offenbaren Zusammensetzungen zur in-vitro-Transfektion, die eine Nucleinsäure und ein Lipopolyamin des Typs DOGS oder DPPES umfassen. Diese Zusammensetzungen werden jedoch nicht als Medikament verwendet und umfassen kein neutrales DOPE-Lipid.
Der Artikel von Xiang Gao et al., Journal of Liposome Research, Vol. 3, Nr. 1, 1993, S. 17–30, beschreibt Zusammensetzungen zur Transfektion einer Nucleinsäure, von denen einige ein Lipopolyamin (Polylysin) und das neutrale Lipid DOPE umfassen. Die Bedeutung der Werte des Ladungsverhältnisses wird jedoch nicht angegeben. Außerdem sind die in den Zusammensetzungen gemäß der Erfindung verwendeten Lipopolyamine keine Polylysine, sondern Lipopolyamine mit Sperminkopf.
Ein erster Gegenstand der Erfindung besteht also in einer Zusammensetzung, die wenigstens eine Nucleinsäure und ein Lipopolyamin umfasst, in dem es sich bei dem Polyaminbereich um Spermin handelt und dessen Verhältnis von positiven Ladungen des Lipopolyamins zu negativen Ladungen der Nucleinsäure kleiner oder gleich 2 ist, zur Verwendung als Medikament.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck "Lipopolyamin" jedes amphiphile Molekül, das wenigstens einen hydrophilen Polyaminbereich und einen lipophilen Bereich umfasst. Der kationisch geladene Polyaminbereich von Lipopolyaminen kann sich reversibel mit der negativ geladenen Nucleinsäure assoziieren. Durch diese Wechselwirkung wird die Nucleinsäure stark kompaktiert. Der lipophile Bereich macht diese ionische Wechselwirkung unempfindlich gegenüber dem äußeren Medium, indem er das gebildete Nucleolipidteilchen mit einem Lipidhäutchen bedeckt.
Vorteilhafterweise entspricht der Polyaminbereich der im Rahmen der Erfindung verwendeten Lipopolyamine der allgemeinen Formel

– wobei n und m ganze Zahlen sind, die so gewählt sind, dass eine Spermingruppe entsteht;
– R Folgendes darstellt: ein Wasserstoffatom oder einen Rest der allgemeinen Formel
wobei R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und jeweils einen gesättigten aliphatischen C_pH_2p+2-Rest oder ungesättigten aliphatischen C_pH_2p- oder C_pH_2p-2-Rest darstellen, wobei p eine ganze Zahl zwischen 12 und 22 einschließlich ist, und R' ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls mit einem Phenylrest substituiert ist, darstellt; oder einen Rest der allgemeinen Formel
wobei X eine Methylengruppe (-CH₂-) oder eine Carbonylgruppe (-CO-) darstellt und R₃ und R₄ gleich oder verschieden sind und jeweils einen gesättigten aliphatischen C_p'H_2p'+2-Rest oder ungesättigten aliphatischen C_p'H_2p'- oder C_p'H_2p'-2-Rest darstellen, wobei p' eine ganze Zahl zwischen 11 und 21 einschließlich ist, mit der Maßgabe, dass:
– unabhängig von den Werten von m und n nur ein einziges der Symbole R einen Rest der allgemeinen Formel (II) oder (III) darstellt.

Der lipophile Bereich kann eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette, Cholesterin, ein natürliches Lipid oder ein synthetisches Lipid, die lamellare oder hexagonale Phasen bilden können, sein.
Vorteilhafterweise verwendet man im Rahmen der vorliegenden Erfindung Lipopolyamine, wie sie in der Patentanmeldung EP 394 111 definiert sind. Diese Anmeldung beschreibt auch ein Verfahren, das für die Herstellung dieser Lipopolyamine verwendet werden kann.
In besonders vorteilhafter Weise verwendet man im Rahmen der vorliegenden Erfindung Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS) oder das 5-Carboxyspermylamid von Palmitoylphosphatidylethanolamin (DPPES).
Um eine optimale Wirkung der Zusammensetzungen der Erfindung zu erhalten werden die jeweiligen Anteile des Polyamins und der Nucleinsäure vorzugsweise so bestimmt, dass das Verhältnis R von positiven Ladungen des Lipopolyamins zu negativen Ladungen der Nucleinsäure zwischen 0,1 und 1,9 und besonders bevorzugt zwischen 0,5 und 1,5 liegt.
In den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung kann die Nucleinsäure entweder eine Desoxyribonucleinsäure oder eine Ribonucleinsäure sein. Es kann sich um Sequenzen natürlichen oder künstlichen Ursprungs und insbesondere um genomische DNA, cDNA, mRNA, tRNA, rRNA, Hybridsequenzen oder synthetische oder halbsynthetische Sequenzen handeln. Diese Nucleinsäuren können menschlichen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen, viralen usw. Ursprungs sein. Sie können mit jeder dem Fachmann bekannten Technik erhalten werden, insbesondere durch Screening von Banken, chemische Synthese oder auch durch gemischte Methoden, die die chemische oder enzymatische Modifikation von Sequenzen beinhalten, die durch Screening von Banken erhalten wurden. Sie können außerdem in Vektoren, wie Plasmidvektoren, eingebaut sein.
Was insbesondere die Desoxyribonucleinsäuren betrifft, so können sie einzel- oder doppelsträngig sein. Diese Desoxyribonucleinsäuren können therapeutische Gene, regulatorische Sequenzen für die Transcription oder Replikation, Antisense-Sequenzen, Bereiche für die Verbindung mit anderen Zellbestandteilen usw. tragen.
Im Sinne der Erfindung versteht man unter "therapeutisches Gen" insbesondere jedes Gen, das für ein Proteinprodukt mit einer therapeutischen Wirkung codiert. Das so codierte Proteinprodukt kann ein Protein, ein Peptid usw. sein. Dieses Proteinprodukt kann in Bezug auf die Zielzelle homolog sein (d.h. ein Produkt, das normalerweise in der Zielzelle exprimiert wird, wenn diese keinerlei Pathologie aufweist). In diesem Fall erlaubt es die Expression eines Proteins zum Beispiel, eine unzureichende Expression in der Zelle oder die Expression eines aufgrund einer Modifikation inaktiven oder nur geringfügig aktiven Proteins auszugleichen oder auch das Protein überzuexprimieren. Das therapeutische Gen kann auch für eine Mutante eines zellulären Proteins mit einer höheren Stabilität, einer modifizierten Aktivität usw. codieren. Das Proteinprodukt kann auch in Bezug auf die Zielzelle heterolog sein. In diesem Fall kann ein exprimiertes Protein zum Beispiel eine in der Zelle mangelhafte Aktivität ergänzen oder hinzufügen, was es der Zelle erlaubt, gegen eine Pathologie zu kämpfen, oder eine Immunantwort stimulieren.
Unter den therapeutischen Produkten im Sinne der vorliegenden Erfindung genannt seien insbesondere Enzyme, Blutderivate, Hormone, Lymphokine, wie Interleukine, Interferone, TNF usw. (FR 9203120), Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter oder deren Vorläufer oder Syntheseenzyme, trophische Faktoren, wie BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/Pleiotrophin usw., Apolipoproteine, wie ApoAI, ApoAIV, ApoE usw. (FR 9305125), Dystrophin oder ein Minidystrophin (FR 9111947), das mit Mukoviszidose zusammenhängende CFTR-Protein, die Tumorsuppressor-Gene, wie p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev usw. (FR 93 04745), die Gene, die für Faktoren codieren, welche an der Gerinnung beteiligt sind, wie Faktor VII, VIII, IX, die Gene, die bei der DNA-Reparatur eingreifen, die Suizid-Gene (Thymidin-Kinase, Cytosin-Deaminase) usw.
Das therapeutische Gen kann auch ein Antisense-Gen oder eine Antisense-Sequenz sein, dessen bzw. deren Expression in der Zielzelle es ermöglicht, die Expression von Genen oder die Transcription von zellulärer mRNA zu reduzieren. Solche Sequenzen können zum Beispiel in der Zielzelle in RNA, die zu zellulären mRNA komplementär sind, transcribiert werden und so deren Translation in ein Protein blockieren, gemäß der Technik, die im Patent EP 140 308 beschrieben ist. Die Antisense-Sequenzen umfassen auch Sequenzen, die für Ribozyme codieren, welche Ziel-RNA selektiv zerstören können ( EP 321 201 ).
Wie oben angegeben, kann die Nucleinsäure auch ein oder mehrere Gene umfassen, die für ein antigenes Peptid codieren, das bei Mensch oder Tier eine Immunantwort hervorrufen kann. In dieser besonderen Ausführungsform ermöglicht die Erfindung also entweder die Realisierung von Impfstoffen oder von immuntherapeutischen Behandlungen, die auf Mensch oder Tier angewendet werden, insbesondere gegen Mikroorganismen, Viren oder Krebserkrankungen. Es kann sich insbesondere um antigene Peptide handeln, die spezifisch für das Epstein-Barr-Virus, das Virus HIV, das Hepatitis-B-Virus ( EP 185 573 ), das Pseudorabiesvirus oder auch spezifisch für Tumoren ( EP 259 212 ) sind.
Vorzugsweise umfasst die Nucleinsäure auch Sequenzen, die die Expression des therapeutischen Gens und/oder des Gens, das für das antigene Peptid codiert, in der gewünschten Zelle oder dem gewünschten Organ erlauben. Es kann sich um Sequenzen, die natürlicherweise für die Expression des betreffenden Gens verantwortlich sind, handeln, wenn diese Sequenzen in der infizierten Zelle funktionieren können. Es kann sich auch um Sequenzen anderen Ursprungs handeln (die für die Expression anderer Proteine verantwortlich sind, oder auch synthetische). Insbesondere kann es sich um Promotorsequenzen von eukaryontischen oder viralen Genen handeln. Zum Beispiel kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom der Zelle stammen, die man infizieren möchte. Ebenso kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom eines Virus stammen. In dieser Hinsicht seien zum Beispiel die Promotoren der Gene E1A, MLP, CMV, RSV usw. genannt. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Hinzufügen von Aktivierungssequenzen, Regulierungssequenzen usw. modifiziert sein.
Außerdem kann die Nucleinsäure auch insbesondere stromaufwärts des therapeutischen Gens eine Signalsequenz umfassen, die das synthetisierte therapeutische Produkt zur Sekretion durch die Zielzelle lenkt. Diese Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz des therapeutischen Produkts sein, aber es kann sich auch um jede andere funktionelle Signalsequenz oder um eine künstliche Signalsequenz handeln.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen, die eine Nucleinsäure, ein Lipopolyamin, wobei es sich bei dem Lipopolyaminbereich um Spermin handelt, und ein Adjuvans, das mit dem Lipopolyamin/Nucleinsäure-Komplex assoziieren und das Transfektionsvermögen verbessern kann, umfassen, wobei das Verhältnis von positiven Ladungen des Lipopolyamins zu negativen Ladungen der Nucleinsäure kleiner oder gleich 2 ist. Die Anmelderin hat tatsächlich gezeigt, dass das Transfektionsvermögen der Lipopolyamine unerwarteterweise in Gegenwart von bestimmten Adjuvantien (zum Beispiel Lipiden oder Proteinen), die mit dem Lipopolyamin/Nucleinsäure-Komplex assoziieren können, erhöht sein kann. Wie die Beispiele 4 bis 7 der vorliegenden Anmeldung zeigen, manifestiert sich diese Verbesserung in vitro ebenso wie in vivo.
Besonders bevorzugt umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung als Adjuvans ein oder mehrere neutrale Lipide. Solche Zusammensetzungen sind besonders vorteilhaft, insbesondere wenn das Verhältnis R gering ist. Die Anmelderin hat tatsächlich gezeigt, dass die Zugabe eines neutralen Lipids es erlaubt, die Bildung von Nucleolipidteilchen zu verbessern und überraschenderweise das Eindringen des Teilchens in die Zelle zu begünstigen, indem es deren Membran destabilisiert.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten neutralen Lipide sind besonders bevorzugt Lipide mit 2 Fettketten.
In besonders vorteilhafter Weise verwendet man natürliche oder synthetische Lipide, die unter physiologischen Bedingungen zwitterionisch sind oder keine Ionenladung tragen. Sie können insbesondere ausgewählt sein aus Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE), Oleylpalmitoylphosphatidylethanolamin (POPE), Distearoyl-, -palmitoyl-, -myristoylphosphatidylethanolamin sowie ihre ein- bis dreifach N-methylierten Derivate, Phosphatidylglycerine, Diacylglycerine, Glycosyldiacylglycerine, Cerebroside (wie insbesondere Galactocerebroside), Sphingolipide (wie insbesondere Sphingomyeline) oder auch Asialoganglioside (wie insbesondere Asialo-GM1 und -GM2).
Diese unterschiedlichen Lipide können durch dem Fachmann wohlbekannte klassische Techniken entweder durch Synthese oder durch Extraktion aus Organen (zum Beispiel Hirn) oder Eiern erhalten werden. Insbesondere kann die Extraktion der natürlichen Lipide mittels organischer Lösungsmittel realisiert werden (siehe auch Lehninger Biochemistry).
Vorzugsweise umfassen die Zusammensetzungen der Erfindung 0,1 bis 20 Äquivalente Adjuvans auf 1 Äquivalent Lipopolyamin und besonders bevorzugt 1 bis 5.
Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können für die topische, perkutane, orale, rektale, vaginale, parenterale, intranasale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intraokulare, transdermale usw. Verabreichung zubereitet werden. Vorzugsweise enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung einen pharmazeutisch annehmbaren Träger für eine injizierbare Zubereitung, insbesondere für eine direkte Injektion in das gewünschte Organ, oder für eine topische Verabreichung (auf die Haut und/oder Schleimhaut). Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Lösungen oder trockene, insbesondere lyophilisierte, Zusammensetzungen handeln, die je nachdem durch Zugabe von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum die Herstellung von injizierbaren Lösungen erlauben. Die für die Injektion verwendeten Nucleinsäuredosen sowie die Zahl der Verabreichungen können in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern und insbesondere in Abhängigkeit von der verwendeten Verabreichungsart, der betroffenen Pathologie, des zu exprimierenden Gens oder auch der gewünschten Dauer der Behandlung angepasst werden.
Die vorliegende Erfindung liefert also Zusammensetzungen, die als Medikament verwendet werden können, besonders vorteilhaft für die Behandlung von Krankheiten, die die in-vivo-Verabreichung einer Nucleinsäure, die die Krankheit heilen kann, assoziiert an ein Lipopolyamin unter den vorstehend definierten Bedingungen umfasst. Insbesondere sind die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung auf die Behandlung von Krankheiten anwendbar, die sich aus einem Unterschuss an einem verabreichten Protein- oder Nucleinsäureprodukt ergeben, und die verabreichte Nucleinsäure codiert für das Proteinprodukt oder enthält das Nucleinsäureprodukt.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele, die als beispielhaft und nicht als einschränkend anzusehen sind, vollständiger beschrieben.
Beispiel 1 – Plasmide, die für die in-vivo-Übertragung von Genen verwendet werden
Drei Arten von Konstrukten wurden verwendet, um die Aktivität der Zusammensetzungen der Erfindung nachzuweisen: Plasmide, die das für Luciferase (Luc) codierende Gen umfassen, Plasmide, die das für β-Galactosidase codierende Gen (LacZ-Gen) umfassen, und Plasmide, die das für Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) codierende Gen umfassen.
1.1. Plasmide, die das Luc-Gen umfassen
Das Plasmid pCMV-luc umfasst den Promotor des Cytomegalievirus (CMV), der durch Herausschneiden mit den Restriktionsenzymen MluI und HindIII aus dem Plasmidvektor pcDNA3 (Invitrogen) gewonnen wurde, sich stromaufwärts des für Luciferase codierenden Gens befindet und in die MluI- und HindIII-Stellen des Vektors pGL Basic Vector (Promega) eingesetzt wurde.
1.2. Plasmide, die das LacZ-Gen umfassen
Das Plasmid pCMV-βGal (Clontech) umfasst den CMV-Promotor, der sich stromaufwärts des für die β-Galactosidase von Escherichia coli codierenden Gens befindet. Der Vektor pSV-nls LacZ (pAOnlsLacZ) umfasst denselben Promotor, eine Zellkern-Lokalisierungssequenz (die vom Virus SV40 stammt), die sich in Phase mit und stromaufwärts des LacZ-Gens befindet. Dieses Konstrukt erlaubt die Expression des Fusionsproteins nls-β-Galactosidase im Zellkern (siehe de Luze et al., PNAS 90 (1993) 7322).
1.3. Plasmide, die das CAT-Gen umfassen
Die Plasmide, die das für die Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) codierende Gen unter der Kontrolle des RSV- (pRSV-CAT) bzw. des SV40-Promotors (pSV40-CAT) als Reporter-Gen umfassen, wurden veröffentlicht (Boutiller et al., Prog. Neuro-Psycho Pharmacol. et Biol. Psychiat. 16 (1992) 959; de Luze et al., PNAS 90 (1993) 7322).
Beispiel 2 – In-vivo-Nucleinsäureübertragung in das Hirn von neugeborenen Mäusen unter Verwendung eines Lipopolyamins im Verhältnis R = 0,8
Dieses Beispiel beschreibt die in-vivo-Übertragung des Plasmids pCMV-luc in das Hirn von neugeborenen Mäusen.
30 μg des Plasmids pCMV-luc (Beispiel 1.1.) wurden in 30 μl sterilem 150 mM NaCl verdünnt (Konzentration 1 μg/μl). Anschließend wurden 0,6 μl 40 mM Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS), das in 100%igem Ethanol zubereitet wurde, hinzugefügt.
Das Gemisch wurde schnell mit dem Wirbelmischer gemischt und für intracerebrale Injektionen bei neugeborenen Mäusen verwendet. Dazu wurden die Mäuse durch Kälte anästhetisiert (auf Aluminiumfolie gesetzt, die in Kontakt mit Eis war), und dann wurden 2 μl Gemisch (2 μg Nucleinsäure) pro Maus injiziert.
Die Injektionen wurden im Cortex mit Hilfe eines Mikromanipulators und einer Mikrospritze, die mit einer Mikroelektrode verbunden waren, realisiert.
Die Hirne wurden 48 Stunden später entnommen, homogenisiert, zentrifugiert, und der Überstand wurde für die Bestimmung der Luciferase verwendet. Dazu wurde der Überstand in Gegenwart eines Puffers, der Luciferin, Coenzym A und ATP umfasste, inkubiert, und das emittierte Licht (im Allgemeinen während 10 Sekunden) wurde mit einem Luminometer (Wood K. (1990) Promega Notes, 28) gemessen.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine normalisierte Aktivität in relativen Lichteinheiten von 425 RLE/Hirn (Mittelwert von 10 Tieren) (RLE = "relative Lichteinheit"), wenn die Übertragung mittels der Zusammensetzung der Erfindung mit R = 0,8 realisiert wird, gegenüber einer normalisierten Aktivität von 100 RLE/Hirn, wenn die Übertragung mittels des Plasmids allein realisiert wird (Mittelwert von 10 Tieren).
Beispiel 3 – Vergleich der in-vivo-Nucleinsäureübertragung in das Hirn von neugeborenen Mäusen unter Verwendung eines Lipopolyamins im Verhältnis R = 1,5 und 0,8
3.1. Übertragung des Plasmids pCMV-luc
Für das Verhältnis R = 0,8 sind die Bedingungen diejenigen von Beispiel 2. Für das Verhältnis R = 1,5 wurden 30 μg des Plasmids pCMV-luc (Beispiel 1.1.) in 30 μl sterilem 150 mM NaCl verdünnt (Konzentration 1 μg/μl). Anschließend wurden 1,13 μl 40 mM Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS), das in 100%-igem Ethanol zubereitet wurde, hinzugefügt.
Das Gemisch wurde schnell mit dem Wirbelmischer gemischt und für intracerebrale Injektionen bei neugeborenen Mäusen verwendet. Dazu wurden die Mäuse durch Kälte anästhetisiert (auf Aluminiumfolie gesetzt, die in Kontakt mit Eis war), und dann wurden 2 μl Gemisch (2 μg Nucleinsäure) pro Maus injiziert.
Die Injektionen wurden im Cortex mit Hilfe eines Mikromanipulators und einer Mikrospritze, die mit einer Mikroelektrode verbunden waren, realisiert.
Die Hirne wurden 48 Stunden später entnommen, homogenisiert, zentrifugiert, und der Überstand wurde für die Bestimmung der Luciferase gemäß der Vorschrift in Beispiel 2 verwendet. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine normalisierte Aktivität von 89 RLE/Hirn (Mittelwert von 12 Tieren), wenn die Übertragung mittels der Zusammensetzung der Erfindung mit einem Verhältnis R = 1,5 realisiert wird, gegenüber einer normalisierten Aktivität von 100 RLE/Hirn, wenn die Übertragung mittels der Zusammensetzung der Erfindung mit einem Verhältnis R = 0,8 realisiert wird (Mittelwert von 11 Tieren).
3.2. Übertragung des Plasmids pSV-nls LacZ
Dasselbe Verfahren wie oben in Beispiel 3.1. wurde verwendet, um eine Transfektion mit dem Plasmid pSV-nls LacZ vorzunehmen, das das LacZ-Gen, welches für β-Galactosidase codiert, unter der Kontrolle eines Promotors von SV40 (Affenvirus 40) umfasst. Dieses Konstrukt (Beispiel 1.2.) codiert auch für ein Signalpeptid für die Lenkung in den Zellkern. So wird das Enzym β-Galactosidase zum Zellkern transportiert, und die durch die Nucleinsäure erzeugte enzymatische Reaktion ist auf diesen subzellulären Bereich beschränkt. Die Injektionen erfolgen in derselben Weise wie bei dem Plasmid pCMV-luc, und die Hirne wurden ebenfalls 48 Stunden nach der Transfektion entnommen, 24 Stunden lang in Paraformaldehyd (2%) fixiert und dann im Hinblick auf die β-Galactosidase-Reaktion behandelt. Die Hirne werden anschließend auf die Expressionsstellen untersucht, die positiven Zonen werden im Kryostat geschnitten (15 μm), auf Objektträger montiert und photographiert. In zwei unabhängigen Versuchsreihen zeigen drei Tiere von 10 in den Bereichen um die Injektionszone herum Zellgruppen, deren Zellkern eine sehr ausgeprägte Blaufärbung aufweist, die charakteristische für β-Galactosidase-Aktivität ist.
Beispiel 4 – In-vitro-Nucleinsäureübertragung: Optimierung des Lipopolyamin/Adjuvans-Verhältnisses
Dieses Beispiel beschreibt die In-vitro-Nucleinsäureübertragung (auf Zellkulturen) mittels einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung, die die Nucleinsäure, ein Lipopolyamin und ein Adjuvans (neutrales Lipid) unter unterschiedlichen Bedingungen umfasst.
10⁵ Zellen der Fibroblastenlinie 3T3 und der humanen Hepatomlinie HepG2 wurden unter unterschiedlichen Bedingungen jeweils in Gegenwart von 1 bzw. 2 μg der Plasmide pCMV-βGal oder pCMV-Luc inkubiert:

– in Gegenwart von DOGS mit Ladungsverhältnissen von R = 1 und 1,5
– in Abwesenheit oder Anwesenheit von 1, 2, 5 oder 10 Äquivalenten eines Adjuvans (DOPE).

Das Transfektionsvermögen wurde anschließend unter den in Beispiel 2 beschriebenen Bedingungen für Luciferase oder durch Messung der Prozentwerte der Zellen, die eine ausgeprägte Blaufärbung aufweisen, für LacZ-Aktivität bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen aufgeführt. Tabelle 1: Luciferase-Aktivität (in RLE/10 s/mg Prot.)
Tabelle 2: LacZ-Aktivität
Beispiel 5 – In-vivo-Nucleinsäureübertragung in das Hirn von neugeborenen Mäusen unter Verwendung eines Lipopolyamins im Verhältnis R = 1 und eines neutralen Lipids
In diesem Beispiel wurde eine 40 mM ethanolische Lösung von DOGS mit dem gleichen Volumen einer 80 mM Lösung von Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE), die in einem Chloroform/Ethanol-Gemisch (1/5) hergestellt wurde, gemischt. So enthält die Zusammensetzung auf ein Äquivalent DOGS zwei Äquivalente DOPE.
30 μg des Plasmids pCMV-luc (Beispiel 1.1.) wurden in 30 μl sterilem 150 mM NaCl verdünnt (Konzentration 1 μg/μl). Anschließend wurden 1,5 μl des oben hergestellten DOGS/DOPE-Gemischs hinzugefügt.
Die weitere Vorschrift (Injektionen, Probenahmen, Bestimmungen) ist mit der in Beispiel 3.1. beschriebenen identisch. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine normalisierte Aktivität von 241 RLE/Hirn (Mittelwert von 13 Tieren), wenn die Übertragung in Gegenwart des Adjuvans (neutrales Lipid) realisiert wird, gegenüber einer normalisierten Aktivität von 100 RLE/Hirn, wenn die Übertragung in Gegenwart nur von DOGS bei demselben Ladungsverhältnis R = 1 realisiert wird (Mittelwert von 13 Tieren).
Beispiel 6 – In-vivo-Nucleinsäureübertragung in das Hirn von neugeborenen Mäusen unter Verwendung eines Lipopolyamins im Verhältnis R = 1,25 und eines neutralen Lipids
In diesem Beispiel wurde eine 40 mM ethanolische Lösung von DOGS mit dem gleichen Volumen einer 80 mM Lösung von Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE), die in einem Chloroform/Ethanol-Gemisch (1/5) hergestellt wurde, gemischt. So enthält die Zusammensetzung auf ein Äquivalent DOGS zwei Äquivalente DOPE.
30 μg des Plasmids pCMV-luc (Beispiel 1.1.) wurden in 30 μl sterilem 150 mM NaCl verdünnt (Konzentration 1 μg/μl). Anschließend wurden 1,87 μl des oben hergestellten DOGS/DOPE-Gemischs hinzugefügt.
Die weitere Vorschrift (Injektionen, Probenahmen, Bestimmungen) ist mit der in Beispiel 3.1. beschriebenen identisch. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine normalisierte Aktivität von 405 RLE/Hirn (Mittelwert von 8 Tieren), wenn die Übertragung in Gegenwart des Adjuvans realisiert wird, gegenüber einer normalisierten Aktivität von 100 RLE/Hirn (Mittelwert von 8 Tieren), wenn die Übertragung in Gegenwart nur von DOGS bei demselben Ladungsverhältnis R = 1,25 realisiert wird.
Beispiel 7 – In-vivo-Nucleinsäureübertragung in das Hirn von neugeborenen Mäusen unter Verwendung eines Lipopolyamins im Verhältnis R = 1,5 und eines neutralen Lipids
In diesem Beispiel wurde eine 40 mM ethanolische Lösung von DOGS mit dem gleichen Volumen einer 80 mM Lösung von Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE), die in einem Chloroform/Ethanol-Gemisch (1/5) hergestellt wurde, gemischt. So enthält die Zusammensetzung auf ein Äquivalent DOGS zwei Äquivalente DOPE.
30 μg des Plasmids pCMV-luc (Beispiel 1.1.) wurden in 30 μl sterilem 150 mM NaCl verdünnt (Konzentration 1 μg/μl). Anschließend wurden 2,26 μl des oben hergestellten DOGS/DOPE-Gemischs hinzugefügt.
Die weitere Vorschrift (Injektionen, Probenahmen, Bestimmungen) ist mit der in Beispiel 4.1. beschriebenen identisch. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen eine normalisierte Aktivität von 165 RLE/Hirn (Mittelwert von 10 Tieren), wenn die Übertragung mittels einer Zusammensetzung der Erfindung, die ein Adjuvans (neutrales Lipid) enthält, realisiert wird, gegenüber einer normalisierten Aktivität von 100 RLE/Hirn (Mittelwert von 11 Tieren), wenn die Übertragung mittels DOGS allein bei demselben Ladungsverhältnis (R = 1,5) realisiert wird.
Beispiel 8 – In-vivo-Nucleinsäureübertragung bei der Maus unter Verwendung eines Lipopolyamins im Verhältnis R = 3
Dieses Beispiel beschreibt die in-vivo-Übertragung des Plasmids pCMV-luc auf erwachsene Mäuse. Die Experimente wurden mit erwachsenen Mäusen durchgeführt, die mit Pentobarbital anästhetisiert worden waren.
8.1. Intravenöse Übertragung
Für jede Maus wurden 100 μg des Plasmids pCMV-luc in 100 μl 150 mM NaCl verdünnt. Dann wurden 7,5 μl 40 mM DOGS zu der Lösung gegeben. Anschließend wurde die Drosselvene der Mäuse durch Sektion freigelegt, und die obige Lösung wurde in Richtung des Herzens in die Drosselvene injiziert. Dann wurde die Haut mit Klammern wieder verschlossen. 48 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse durch cervikale Dislokation getötet, und die Leber, die Lungen, die Milz, das Hirn, die Nieren und eine Probe der Skelettmuskulatur wurden entnommen. Nach der Homogenisierung und Zentrifugation wurden die Überstände verwendet, um die Luciferase zu bestimmen. Dieses Experiment wird mit 4 Mäusen durchgeführt. In den verschiedenen getesteten Geweben wurde keinerlei Expression von Luciferase nachgewiesen.
8.2. Intramuskuläre Übertragung
60 μg des Plasmids pCMV-luc wurden in 300 μl 150 mM NaCl verdünnt. Dann wurden 4,5 μl 40 mM DOGS zu der Lösung gegeben. Anschließend wurden jeder Maus 50 μl des vorstehend hergestellten Gemischs (10 μg DNA) durch die Haut hindurch in den Musculus tibialis anterior injiziert. 48 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse durch cervikale Dislokation getötet, und die Muskeln, in die injiziert wurde, wurden entnommen. Nach der Homogenisierung und Zentrifugation wurden die Überstände verwendet, um die Luciferase zu bestimmen. Dieses Experiment wird mit 6 Mäusen durchgeführt. Keinerlei Expression von Luciferase wurde nachgewiesen.
Beispiel 9 – In-vivo-Nucleinsäureübertragung bei der Maus unter Verwendung eines Lipopolyamins im Verhältnis R = 4
Dieses Beispiel beschreibt die in-vivo-Übertragung des Plasmids pCMV-luc auf erwachsene Mäuse. Die Experimente wurden mit erwachsenen Mäusen durchgeführt, die mit Pentobarbital anästhetisiert worden waren.
9.1. Intravenöse Übertragung
Für jede Maus wurden 100 μg des Plasmids pCMV-luc in 100 μl 150 mM NaCl verdünnt. Dann wurden 10 μl 40 mM DOGS zu der Lösung gegeben. Anschließend wurde die Drosselvene der Mäuse durch Sektion freigelegt, und die obige Lösung wurde in Richtung des Herzens in die Drosselvene injiziert. Dann wurde die Haut mit Klammern wieder verschlossen. 48 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse durch cervikale Dislokation getötet, und die Leber, die Lungen, die Milz, das Hirn, die Nieren und eine Probe der Skelettmuskulatur wurden entnommen. Nach der Homogenisierung und Zentrifugation wurden die Überstände verwendet, um die Luciferase zu bestimmen. Dieses Experiment wird mit 4 Mäusen durchgeführt. In den verschiedenen getesteten Geweben wurde keinerlei Expression von Luciferase nachgewiesen.
9.2. Intramuskuläre Übertragung
60 μg des Plasmids pCMV-luc wurden in 300 μl 150 mM NaCl verdünnt. Dann wurden 6 μl 40 mM DOGS zu der Lösung gegeben. Anschließend wurden jeder Maus 50 μl des vorstehend hergestellten Gemischs (10 μg DNA) durch die Haut hindurch in den Musculus tibialis anterior injiziert. 48 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse durch cervikale Dislokation getötet, und die Muskeln, in die injiziert wurde, wurden entnommen. Nach der Homogenisierung und Zentrifugation wurden die Überstände verwendet, um die Luciferase zu bestimmen. Dieses Experiment wird mit 6 Mäusen durchgeführt. Keinerlei Expression von Luciferase wurde nachgewiesen.

Claims

Zusammensetzung, die eine Nucleinsäure und ein Lipopolyamin umfasst, wobei es sich bei dem Polyaminbereich um Spermin handelt, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von positiven Ladungen des Lipopolyamins zu negativen Ladungen der Nucleinsäure kleiner oder gleich 2 ist, zur Verwendung als Medikament.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipopolyamin der allgemeinen Formel
entspricht, wobei – n und m ganze Zahlen sind, die so gewählt sind, dass eine Spermingruppe entsteht; – R Folgendes darstellt: ein Wasserstoffatom oder einen Rest der allgemeinen Formel
wobei R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und jeweils einen gesättigten aliphatischen C_pH_2p+2-Rest oder ungesättigten aliphatischen C_pH_2p- oder C_pH_2p-2-Rest darstellen, wobei p eine ganze Zahl zwischen 12 und 22 einschließlich ist, und R' ein Wasserstoffatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls mit einem Phenylrest substituiert ist, darstellt; oder einen Rest der allgemeinen Formel
wobei X eine Methylengruppe (-CH₂-) oder eine Carbonylgruppe (-CO-) darstellt und R₃ und R₄ gleich oder verschieden sind und jeweils einen gesättigten aliphatischen C_p'H_2p'+2-Rest oder ungesättigten aliphatischen C_p'H_2p'- oder C_p'H_2p'-2-Rest darstellen, wobei p' eine ganze Zahl zwischen 11 und 21 einschließlich ist, mit der Maßgabe, dass: – unabhängig von den Werten von m und n nur ein einziges der Symbole R einen Rest der allgemeinen Formel (II) oder (III) darstellt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipopolyamin aus DOGS und DPPES ausgewählt ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet; dass die Nucleinsäure eine Desoxyribo- (DNA) oder Ribonucleinsäure (RNA) ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure eine Antisense-Nucleinsäure ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure ein therapeutisches Gen umfasst.
Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von positiven Ladungen des Lipopolyamins zu negativen Ladungen der Nucleinsäure zwischen 0,1 und 1,9 liegt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von positiven Ladungen des Lipopolyamins zu negativen Ladungen der Nucleinsäure zwischen 0,5 und 1,5 liegt.
Zusammensetzung, die eine Nucleinsäure und ein Lipopolyamin, bei dessen Polyaminbereich es sich um Spermin handelt, umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass sie außerdem ein neutrales Dioleylphosphatidylethanolamin-Lipid (DOPE) umfasst und dass das Verhältnis von positiven Ladungen des Lipopolyamins zu negativen Ladungen der Nucleinsäure kleiner oder gleich 2 ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Lipopolyamin gemäß einem der Ansprüche 2 bis 3 definiert ist.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie 0,1 bis 20 und vorzugsweise 1 bis 5 Äquivalente neutrale Lipide auf 1 Äquivalent Lipopolyamin umfasst.
Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11 zur Verwendung als Medikament.
Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger für eine injizierbare Zubereitung umfasst.
Zusammensetzung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger für eine Applikation auf die Haut und/oder die Schleimhäute umfasst.