DE69735382T2 - Kationische reagenzien zür transfektion - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft kationische Reagenzien zur Transfektion, die zur Abgabe von exogenen Verbindungen in Zellen in vitro und in vivo von Nutzen sind.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Gegenwärtig werden vier Hauptverfahren zur Einführung von Nucleinsäuren in eukaryontische Zellen verwendet: (1) Elektroporation, (2) Transfektion auf Calciumphosphat-Basis, (3) Transfektion auf DEAE-Dextran-Basis; und (4) Liposomen-vermittelte Transfektion.
  • Im Vergleich zu anderen Verfahren ist die Liposomen-vermittelte Transfektion durch eine hohe Reproduzierbarkeit, eine geringe Zytotoxität und einfache Verfahrensschritte gekennzeichnet. Viele kationische Verbindungen, die für die Liposomen-vermittelte Transfektion von Nutzen sind, weisen jedoch Esterbindungen auf und werden schnell durch Hydrolyse abgebaut. Im Vergleich zu infektiösen Mitteln weisen kationische Liposomen oft geringe Gesamteffizienzen auf. Darüber hinaus können die im Handel erhältlichen kationischen Liposomen weder in vitro noch in vivo für die Transfektion von bestimmten Zell-Unterpopulationen verwendet oder angepasst werden.
  • Die Veröffentlichung von Sykora et al. (Folia Microbiol. 36, 240–245 (1991)) und ein entsprechendes Patent ( CS266103 ) beschreiben N,N'-Bis(alkyldimethyl)-1,6-hexandiammoniumdibromide und ihre Verwendung bei der Entfernung von Plasmiden aus Bakterienzellen. Horniak et al. (Stud. Biophys. 124, 61–68 (1988)) berichten von der Stöchiometrie der Wechselwirkung von N,N'-Bis(alkyldimethyl)-1,6-hexandiammoniumdibromiden mit DNA.
  • Vorteile der Erfindung gegenüber bekannten Technologien
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können leicht aus preiswerten Reagenzien hergestellt werden, weshalb sie für die Herstellung von Liposomen zur Verwendung in großem Maßstab sehr gut geeignet sind. Die Verbindungen der Formel (I) weisen keine Esterbindungen auf, weshalb sie nicht durch Hydrolyse abgebaut werden. Die Transfektion unter Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung ergibt eine hohe Gesamteffizienz der Transfektion. Die Anpassung zur Transfektion von besonderen Zellen ist durch strukturelle Veränderungen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung und durch Wahl des begleitenden Gegenions leicht möglich. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung stellen ein einfaches und reproduzierbares Verfahren für die Herstellung von Liposomen, vorzugsweise ohne die Notwendigkeit der Ultraschallbehandlung, bereit.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verwendungen von Verbindungen der Formel (I), die zur Abgabe von exogenen Verbindungen in Zellen in vitro und in vivo von Nutzen sind.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verwendungen von Liposomen, die (a) ein neutrales Lipid wie z. B. Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) oder ähnliche lipidartige Verbindungen wie z. B. 1,2-Dioleoyloxyphosphatidylethanolamin oder andere lipidartige Strukturen und (b) eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I) enthalten, bereit. Ferner werden hier Verfahren zum Abgeben von exogenen Verbindungen, beispielsweise von Makromolekülen oder Arzneimittels, in Zellen in vitro und in vivo unter Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
  • Ferner werden hier Kits zur Transfektion, umfassend die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, beschrieben.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Abgeben der gewünschten exogenen Verbindungen in Zielzellen durch Variieren von, unter anderem, folgendem moduliert werden: (1) der Struktur der Verbindungen der Formel (I), (2) dem Mengenverhältnis der neutralen Lipide zu den Verbindungen der Formel (I), (3) dem Verfahren zur Herstellung von Liposomen, und (4) dem mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung hergestellten Gegenion.
  • Ausführliche Beschreibung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verwendungen von Verbindungen der Formel (I):
    Figure 00030001
    wobei
    A ein Anion bedeutet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chlorid, Bromid, Iodid, Hydrogenphosphat (HPO4 2–), Dihydrogenphosphat (H2PO4 –), Sulphat, Thiosulphat, Hydroxy und/oder Oxalat;
    k eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4 oder 5 bedeutet;
    B eine Alkandiylbrücke (CH2)n bedeutet, wobei
    n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 bedeutet;
    R1, R3 und R4, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkenyl, C1-C6-Alkinyl bedeuten;
    R2 geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet;
    R5 wenn k = 1,
    geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet;
    wenn k > 1,
    Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkenyl, C1-C6-Alkinyl bedeutet;
    R6 wenn k = 1,
    Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkenyl, C1-C6-Alkinyl bedeutet;
    wenn k > 1,
    ein geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet;
    und die wiederkehrende Einheit -B-NR4R6 jeweils gleich oder verschieden sein kann;
    zur in vitro-Transfektion und zur Herstellung eines Arzneimittels zur in vivo-Transfektion bereit.
  • Bevorzugt sind Verwendungen von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), wobei
    A ein Anion bedeutet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Chlorid, Bromid, Iodid, Hydrogenphosphat (HPO4 2–), Dihydrogenphosphat (H2PO4 –), Sulphat, Thiosulphat, Hydroxy und/oder Oxalat;
    k eine ganze Zahl 1, 2 oder 3 bedeutet;
    B eine Alkandiylbrücke (-CH2)n- bedeutet, wobei
    n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bedeutet;
    R1, R3 und R4, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl bedeuten;
    R2 geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet;
    R5 wenn k = 1,
    geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet;
    wenn k > 1,
    Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl bedeutet;
    R6 wenn k = 1,
    Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkenyl, C1-C6-Alkinyl bedeutet;
    wenn k > 1,
    ein geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet;
    und die wiederkehrende Einheit -B-NR4R6 vorzugsweise jeweils gleich ist.
  • Besonders bevorzugt sind Verwendungen von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), wobei
    A ein Anion bedeutet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Bromid, Iodid, Dihydrogenphosphat (H2PO4 –) und/oder Thiosulphat;
    k eine ganze Zahl 1 oder 2 bedeutet;
    B wenn k = 1,
    eine Alkandiylbrücke -(CH2)n bedeutet, wobei
    n eine ganze Zahl 2, 3 oder 4 bedeutet;
    B wenn k = 2,
    eine Ethylenbrücke -(CH2-CH2)- bedeutet;
    R1, R3 und R4, die gleich sind, CH3 bedeuten;
    R2 geradkettiges C10-C20-Alkyl bedeutet;
    R5 wenn k = 1,
    geradkettiges C10-C20-Alkyl bedeutet und mit R2 identisch ist;
    wenn k = 2,
    CH3 bedeutet;
    R6 wenn k = 1,
    CH3 bedeutet;
    wenn k = 2,
    geradkettiges C10-C20-Alkyl bedeutet und mit R2 identisch ist.
  • Ein pharmazeutisch verträgliches Ion ist ein ein-, zwei- oder mehrwertiges, vorzugsweise nicht-zytotoxisches Ion. Die verschiedenen Salze können mit Verfahren, die als solche im Stand der Technik bekannt sind, synthetisiert werden, insbesondere mit Ionenaustauschverfahren.
  • C1-C6-Alkyl bezeichnet im Allgemeinen einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen – vorzugsweise Fluor –, die gleich oder voneinander verschieden sein können, substituiert sein kann. Folgende Reste können als Beispiele genannt werden: Methyl, Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl (Isopropyl), Butyl, 1-Methylpropyl, 2-Methylpropyl, 1,1-Dimethylethyl, n-Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 1,1-Dimethylpropyl, 1,2-Dimethylpropyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1,1-Dimethylbutyl, 1,2-Dimethylbutyl, 1,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1,1,2-Trimethylpropyl, 1,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methylpropyl und 1-Ethyl-2-methylpropyl.
  • Für Alkandiylreste, die, wie in der vorstehend genannten Hauptausführungsform definiert, ein bis zehn Kohlenstoffatome aufweisen, gilt die gleiche Definition entsprechend.
  • C8-C20-Alkyl bezeichnet im Speziellen einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen – beispielsweise Octyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Hexadecyl, Heptadecyl, Dodecadecyl, Nonadecyl and Eicosyl.
  • Wenn nicht anders angegeben, sind Alkylreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen wie z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl und Isopropyl bevorzugt. Die gleiche Definition gilt für Alkandiylreste.
  • Alkenyl bezeichnet im Allgemeinen einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und einer oder mehreren Doppelbindungen, vorzugsweise einer Doppelbindung, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen – vorzugsweise Fluor –, die gleich oder voneinander verschieden sein können, substituiert sein kann. C8-C20-Alkenyl bezeichnet im Speziellen einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen und einer oder mehreren Doppelbindungen.
  • Beispiele dafür umfassen: 2-Propenyl (Allyl), 2-Butenyl, 3-Butenyl, 1-Methyl-2-propenyl, 2-Methyl-2-propenyl, 2-Pentenyl, 3-Pentenyl, 4-Pentenyl, 1-Methyl-2-butenyl, 2-Methyl-2-butenyl, 3-Methyl-2-butenyl, 1-Methyl-3-butenyl, 2-Methyl-3-butenyl, 3-Methyl-3-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-propenyl, 1,2-Dimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-2-propenyl, 2-Hexenyl, 3-Hexenyl, 4-Hexenyl, 5-Hexenyl, 1-Methyl-2-pentenyl, 2-Methyl-2-pentenyl, 3-Methyl-2-pentenyl, 4-Methyl-2-pentenyl, 1-Methyl-3-pentenyl, 2-Methyl-3-pentenyl, 3-Methyl-3-pentenyl, 4-Methyl-3-pentenyl, 1-Methyl-4-pentenyl, 3-Methyl-4-pentenyl, 4-Methyl-4-pentenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Dimethyl-2-butenyl, 1,1-Dimethyl-3-butenyl, 1,2-Dimethyl-2-butenyl, 1,2-Dimethyl-3-butenyl, 1,3-Dimethyl-2-butenyl, 1,3-Dimethyl-3-butenyl, 2,2-Dimethyl-3-butenyl, 2,3-Dimethyl-2-butenyl, 2,3-Dimethyl-3-butenyl, 1-Ethyl-2-butenyl, 1-Ethyl-3-butenyl, 2-Ethyl-1-butenyl, 2-Ethyl-2-butenyl, 2-Ethyl-3-butenyl, 1,1,2-Trimethyl-2-propenyl, 1-Ethyl-1-methyl-2-propenyl und 1-Ethyl-2-methyl-2-propenyl.
  • Die Allylgruppe ist bevorzugt.
  • Alkinyl bezeichnet im Allgemeinen einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen und einer oder mehren Dreifachbindungen. C8-C20-Alkinyl bezeichnet im Speziellen einen geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffrest mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen und einer oder mehren Dreifachbindungen.
  • Beispiele dafür umfassen: 2-Propinyl (Propargyl), 2-Butinyl, 3-Butinyl, 2-Pentinyl, 3-Pentinyl, 4-Pentinyl, 3-Methyl-2-butinyl, 2-Hexinyl, 3-Hexinyl, 4-Hexenyl, 5-Hexinyl, 3-Methyl-2- pentinyl, 4-Methyl-2-pentinyl, 2-Methyl-3-pentinyl, 4-Methyl-3-pentinyl, 1-Methyl-4-pentinyl, 1,1-Dimethyl-2-butinyl, 1,1-Dimethyl-2-butinyl, 1,1-Dimethyl-3-butinyl, 1,2-Dimethyl-3-butinyl, 1,3-dimethyl-2-butinyl, 2,2-Dimethyl-3-butinyl, 1-Ethyl-2-butinyl, 1-Ethyl-3-butinyl, 2-Ethyl-3-butinyl und 1-Ethyl-1-methyl-2-propinyl.
  • Der Niederalkinylrest (Propargyl) mit 3 Kohlenstoffatomen und einer Dreifachbindung, der gegebenenfalls mit einem oder mehreren Halogenatomen – bevorzugt Fluor –, die gleich oder voneinander verschieden sein können, substituiert sein kann, ist bevorzugt.
  • Liposome, die zur Abgabe von exogenen Verbindungen in Zellen von Nutzen sind, sind Gegenstände dieser Erfindung. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Liposom" jede Struktur, die (a) ein neutrales Lipid oder ein lipidartiges Molekül und (b) eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I) umfasst. Die Strukturen umfassen Doppelschichten, Aggregate, Micellen und dergleichen. Ein neutrales Lipid oder ein lipidartiges Molekül, das bei der Herstellung von Liposomen gemäß dieser Erfindung von Nutzen ist, kann Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und/oder 1,2-Dioleoyloxyphosphatidylethanolamin und/oder Cholesterin und/oder Dioleylphosphatidylcholin (DOPC) sein.
  • Bei einer Verwendung dieser Erfindung können zwei oder mehrere Verbindungen der Formel (I), vorzugsweise mit verschiedenen Zellspezifitäten, mit Hilfslipiden oder lipidähnlichen Strukturen zur Herstellung von Liposomen kombiniert werden.
  • Bei einer weiteren Verwendung dieser Erfindung können lipidähnliche Moleküle, bei denen zum Zweck einer höheren Hydrolysestabilität die Esterbindung durch eine gegen Hydrolyse stabilere Bindung ersetzt ist, hergestellt und als Hilfslipide zur Herstellung von Liposomen verwendet werden.
  • Bei einer weiteren Verwendung dieser Erfindung werden asymmetrische, hydrophobe Seitenketten in Betracht gezogen.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung handelt es sich bei dem neutralen Lipid um DOPE. Ein Co-Lipid gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung, die fähig ist, allein oder in Kombination mit anderen Lipidkomponenten ein stabiles Liposom zu bilden, umfassend, aber nicht darauf beschränkt, Co-Lipide, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: Phospholipid-ähnliche Verbindungen wie z. B. Lecithin, Phosphatidylcholin, Dioleylphosphatidylcholin (DOPC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinosit, Sphingomyelin, Cephalin, Cardiolipin, Phosphatidsäure, Cerebrosid, Diacetylphosphat, Lysophosphatidylethanolamin, Dipalmitoylphosphatidylcholin, Dioleoylphosphatidylglycerin, Dipalmitoylphosphatidylglycerin, Palmitoyloleoylphosphatidylcholin, Palmitoyloleoylphosphatidylethanolamin, Diheptadecanoylphosphatidylethanolamin, Dilauroylphosphatidylethanolamin, Dimyristoylphosphatidylethanolamin, Distearoylphosphatidylethanolamin, β-Linoleoyl-γ-palmitoylphosphatidylethanolamin und β-Oleoyl-γ-palmitoylphosphatidylethanolamin und dergleichen, Lipide, die keinen Phosphor enthalten, umfassend, aber nicht darauf beschränkt, Steroide, Terpene, Stearylamin, Dodecylamin, Hexadecylamin, Acetylpalmitat, Glycerinricinoleat, Hexadecylstearat, Isopropylmyristat, Dioctadecylammoniumbromid, amphotere Polymere wie z. B. Triethanoleaminlaurylsulfat, Lysolecithin und ähnliche Verbindungen.
  • Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff „Verbindungen der vorliegenden Erfindung" Verbindungen der Formel (I) oder die vorstehend beschriebenen Liposomen, welche die Verbindungen der Formel (I) umfassen.
  • Bei einer Ausführungsform umfassen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung ein zelluläres oder subzelluläres Ansteuerungs-System zum Erzielen einer gewünschten intrazellulären Abgabe von bestimmten exogenen Verbindungen, im Folgenden als „Transfektion" bezeichnet. Die intrazelluläre Abgabe kann in das Zytoplasma und/oder den Nukleus und/oder andere Organellen erfolgen.
  • Der Begriff „Transfektion" bezeichnet im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung im Speziellen das Einführen einer exogenen Verbindung, beispielsweise von Makromolekülen, vorzugsweise von biologisch aktiven Verbindungen, in eine Zielzelle in vivo oder in vitro. Vorzugsweise können chemische Verbindungen, Proteine oder Peptide, die an Zelloberflächen oder subzelluläre Kompartimente binden, in Liposomen dieser Erfindung eingeschlossen werden. Bei einer Ausführungsform kann eine Komponente zum Ansteuern einer Zelle in einem Liposom ein Ligand oder eine Liganden-ähnliche Komponente für einen spezifischen Rezeptor an der Zelloberfläche oder einen Rezeptor im Kern sein. Vorzugsweise kann ein Ligand wie z. B. ein Hormon, ein Kohlenhydrat-Ligand, ein Wachstumsfaktor, ein Neurotransmitter oder ein Fragment davon oder ein Kernlokalisationssignal eingeschlossen werden, um die zelluläre oder subzelluläre Erkennung durch das Liposom zu erleichtern. Bei einer weiteren Ausführungsform sind die zellulären oder subzellulären Komponenten zum Ansteuern modifiziert. Vorzugsweise kann die zelluläre oder subzelluläre Komponente zum Ansteuern an die nachstehend beschriebenen Makromoleküle kovalent gebunden sein.
  • Zusätzliche Selektivität kann durch Einbau von spezifischen Molekülen wie z. B. Antikörpern, Lectinen, Peptiden oder Proteinen, Kohlenhydraten, Glycoproteinen und dergleichen auf der Oberfläche der Liposomvesikel erzielt werden, die dann dazu dienen, Arzneistoffe, die zusammen mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung formuliert werden, an gewünschte Gewebe, welche entsprechende Rezeptoren oder Bindungsstellen für den an der Vesikeloberfläche befestigten Liganden aufweisen, hinzusteuern. Eine weitere Selektivität kann auch durch Überziehen der Liposomvesikel mit einem neutralen oder negativ geladenen wählbaren Co-Lipid (zum Ausschalten von nicht-spezifischer Adsorption an Zellen) vor dem Zusetzen des wie vorstehend beschriebenen Liganden zum Ansteuern erzielt werden.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der exogenen Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung um eine natürliche oder synthetische Nucleinsäure oder ein Derivat davon – einzelsträngig oder doppelsträngig –, vorzugsweise Genom-DNA, cDNA, Plasmid-DNA, DNA-Vektoren (geeignete Vektoren sind beispielsweise in EP 773295 , veröffentlicht am 14. 05. 1997, das hier durch Bezugnahme vollständig eingeschlossen ist, beschrieben), Oligonucleotide oder Nucleoside oder RNA, beispielsweise mRNA (Sense oder Antisense) oder Ribozyme oder DNA/RNA-Hybride. Selbstverständlich können solche DNA-Oligonucleotide zu dem Codierungsbereich, dem nichttranslatierten 3'-Bereich oder einer Transkriptions-Kontrollsequenz eines Gens komplementär sein. Bei einer Ausführungsform der Erfindung sind die DNA-Oligonucleotide modifiziert, um die biologische Abbaubarkeit des Oligonucleotids zu erhöhen oder zu erniedrigen. Bei einer Ausführungsform können die Phosphodiesterbindungen zwischen Nucleotiden durch andere Bindungen wie z. B. Phosphorothioatbindungen oder Phosphoroamidatbindungen ersetzt werden.
  • Somit können Formulierungen, die (1) Verbindungen der vorliegenden Erfindung und (2) DNA oder komplementäre DNA (cDNA) – in geeigneten Plasmiden, die Promoteren, Enhancer und dergleichen unerwünscht erhalten – umfassen, zum Erzielen der Transfektion von Zellen und zum Erhalten von stabilen Transfektanten als Teil des Vorgangs der Clonierung (mit der Technologie der rekombinanten DNA, die dem Fachmann gut bekannt ist) von verschiedenen gewünschten Sequenzen zum Erhalten der entsprechenden exprimierten Produkte (beispielsweise Proteine und Peptide) eingesetzt werden.
  • Die Technologie, eine Verbindung der vorliegenden Erfindung zum Erzielen einer effizienten Transfektion und zum Erhalt von stabilen Transfektanten mit der gewünschten DNA-Sequenz einzusetzen, kann die Fähigkeit, das gewünschten Endergebnis des Clonierungsvorgangs zu erhalten, wesentlich verbessern. Diese Technologie stellt einen weniger toxischen und effizienteren Weg zur Abgabe von Polynucleotiden an Zellen im Vergleich zu anderen, gegenwärtig verwendeten Technologien wie z. B. der Calciumphosphat-Präzipitation bereit.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann es sich bei der exogenen Verbindung um ein natürliches oder synthetisches Peptid oder Protein oder ein Derivat davon handeln. Vorzugsweise weist das Peptid oder Protein oder das Derivat davon antigene Eigenschaften auf. Bei Derivaten von Peptiden oder Proteinen handelt es sich beispielsweise um cyclische Peptide oder Peptidomimetika, umfassend nicht-natürliche Aminosäuren und/oder nicht-natürliche Bindungen zwischen den einzelnen Aminosäuren. Andere exogene Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung sind physiologisch aktive Verbindungen, beispielsweise Hormone, d. h. Steroide und dergleichen, Kohlenhydrate oder pharmazeutische Verbindungen.
  • Von besonderem Interesse ist die Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei pharmazeutischen Formulierungen, insbesondere bei topischen Formulierungen, wie z. B. Salben, Gelen, Pasten, Cremen und dergleichen; besonders bei der Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen, die Liposomen enthalten. Die Konsistenz der Formulierung hängt von der Menge der bei der Herstellung der Formulierung verwendeten wässrigen Lösung ab. Bei solchen Formulierungen mit Verbindungen dieser Erfindung können Arzneistoffe, die in wässrigen Lösungen unlöslich oder nur schwach löslich sind, löslich gemacht werden, so dass dem Körper eine höhere Konzentration des Arzneistoffs zugeführt werden kann.
  • Die Verwendung von Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Arzneimittels ist in denjenigen Zusammenhängen vorgesehen, bei denen kationische Lipide für die Formulierung von Cremen, Pasten, Gelen, kolloidalen Dispersionen und dergleichen verträglich sind. Für weitere Informationen wird auf Remington's Pharmaceutical Society, 17. Auflage, Mark Publishing Company, Easton, Pa. (1985) oder auf jedes andere Standardwerk über pharmazeutische Formulierungen verwiesen.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei der Abgabe von biologisch aktiven Molekülen für die therapeutische und/oder prophylaktische Anwendung von Nutzen, vorzugsweise als ein prophylaktischer und/oder therapeutischer Impfstoff. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei der Gentherapie und der Antisense-Therapie, vorzugsweise bei der Prophylaxe und/oder Therapie bei Menschen oder nicht-menschlichen Tieren, von Nutzen. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können bei der Herstellung von pharmazeutischen Verbindungen verwendet werden. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung von Menschen und von nicht-menschlichen Tieren verwendet werden.
  • Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Oligonucleotide unmethylierte CpG-Dinucleotide, von denen gezeigt worden ist, dass sie das Immunsystem aktivieren (A. Krieg, et al., „CpG motifs in Bacterial DNA Trigger Directed B Cell Activation", Nature 374: 546–549 (1995)). Bestimmte CpG-Motive können in Abhängigkeit von den flankierenden Sequenzen für B-Zell- oder T-Zell-Antworten stärker immunstimulierend wirken und bestimmte Spezies bevorzugt stimulieren. Kopien von CpG-Motiven in DNA-Expressionsvektoren wirken als Hilfsstoffe, die das Hervorrufen einer Immunantwort gegen ein exprimiertes Protein erleichtern. Ein CpG-Motiv, also ein DNA-Abschnitt, der in einer bestimmten Sequenz CpG-Dinucleotide enthält, kann eine Länge von 5–40 Basenpaaren aufweisen. In dem nichtcodierenden Bereich des Expressionsvektors können mehrfache CpG-Motive eingefügt werden. Wenn eine humorale Antwort gewünscht wird, werden CpG-Motive bevorzugt solche sein, die bevorzugt eine B-Zell-Antwort stimulieren. Wenn eine zellvermittelte Immunität gewünscht wird, werden CpG-Motive bevorzugt solche sein, die eine Sekretion von Cytokinen, von denen bekannt ist, dass sie eine CD8+ T-Zell-Antwort erleichtern, stimulieren.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform werden die CpG-Motive in einen Plasmid-DNA-Vektor eingefügt, anschließend wird der Vektor in einer bakteriellen Zelle repliziert, wobei die CpG-Motive ihre unmethylierte Form beibehalten können. Der Vektor oder Teile davon wird bzw. werden dann geerntet und durch die Liposomen der vorliegenden Erfindung als ein immunstimulierender Stoff oder zusammen mit einem Impfstoff als ein Hilfsmittel in eine Zielzelle abgegeben.
  • Die intrazelluläre Abgabe unter Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung kann auch im gesamten Organismus erzielt werden und kann bei verschiedenen Anwendungen von Nutzen sein. Vorzugsweise kann durch direkte intrazelluläre Einführung der gewünschten Enzyme eine Enzymersatz-Therapie bewirkt werden, oder durch geeignete Transfektion von Zellen mit einer DNA-Sequenz, die das gewünschte Protein codiert, wobei die geeigneten Promoteren und dergleichen eingeschlossen sind, um eine ausreichende Genexpression zu erzielen. Wenn gewünscht, können induzierbare Promoter eingesetzt werden, um ein Regulieren des Einschaltens oder Abschaltens des Gens von Interesse zu ermöglichen. Andere Anwendungen der intrazellulären Abgabe, die durch Einsetzen der Verbindungen der vorliegenden Erfindung erzielt werden können, zur Transfektion von DNA umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Hormonersatz-Therapie (beispielsweise Insulin, Wachstumshormon usw.), Blutkoagulationsfaktorersatz-Therapie, Ersatztherapie bei anderen Blutstörungen wie z. B. β-Thalassämie oder andere Hämoglobinmangelzustände, Adenosindesaminase-Mangelzustand, Neurotransmitterersatz-Therapie und dergleichen. Eine weitere Anwendung unter Verwendung solcher Formulierungen zum Verbessern der intrazellulären Abgabe umfasst die Abgabe von „Antisense"-RNA-Oligomeren, um die Expression bestimmter Proteine kollektiv auszuschalten. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können auch zum Abgeben von biologisch aktiven Materialien durch die Blut/Hirn-Schranke verwendet werden.
  • Bevorzugte DNA/Liposomen-Verhältnisse zur Verwendung bei Systemen zur in vivo-Abgabe umfassen DNA/Liposomen-Verhältnisse im Bereich von (Gew./Gew.) 2:1 bis 1:3, 1 μg bis 100 mg pro kg Körpergewicht, d. h. für:
  • – Cystische Fibrose:
    • Maus: DNA/Lipid (Gew./Gew.) 2:1, 5 mg bis 100 mg, d. h. 10 mg bis 80 mg, DNA pro kg Körpergewicht;
    • Mensch: DNA/Lipid (Gew./Gew.) 1:5, 100 μg bis 8 mg, d. h. 125 μg bis 7,5 mg, DNA pro kg Körpergewicht;
  • – Koronararterienerkrankungen:
    • Schwein: DNA/Lipid (Gew./Gew.) 1:3, 1 μg bis 10 μg, d. h. 2 μg bis 8 μg, DNA pro kg Körpergewicht.
  • Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die transfizierten Zellen (Zielzellen) vorzugsweise eukaryontische Zellen oder Zelllinien, stärker bevorzugt Tierzellen, vorzugsweise Fischzellen, d. h. Teleostei, d. h. Lachs, Forelle, Aal und dergleichen; Nagetierzellen, d. h. Ratte, Maus, Hamster und dergleichen; Zellen von Paarhufern, d. h. Schwein, Rind und dergleichen; Zellen von Unpaarhufern, d. h. Pferde und dergleichen; Zellen von Affenartigen, d. h. Menschen, afrikanische grüne Meerkatze und dergleichen. Bevorzugte Zellarten sind Epithelzellen, d. h. Haut, Lunge, Arterie und dergleichen; Muskelzellen und dergleichen; Nervenzellen und dergleichen; und Keimbahnzellen.
  • Bevorzugte Liposomen zur in vivo-Anwendung, vorzugsweise zur Impfung von Fischen, umfassen die Verbindungen der Formel (I) und DOPE. Stark bevorzugt sind Q203, Q205, Q206, Q208 und Q817 (siehe Tabelle 1).
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können zunächst zum Bestimmen ihrer Transfektionsfähigkeit bei Transfektionsexperimenten mit DNA-Plasmiden in Zelllinien und Primärzellen geprüft werden, gefolgt von Transfektionen bei Tieren.
  • Hier wird auch die systemische, topische oder lokalisierte Verabreichung von exogenen Verbindungen mit den Verbindungen der vorliegenden Erfindung beschrieben. Die Wege der systemischen Verabreichung können intramuskuläre, intravenöse, intraperitoneale oder subkutane Verabreichung umfassen. Vorzugsweise können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung den Patienten injiziert werden. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst die Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung auf oralem Weg, auf transdermalem Weg oder durch orale Inhalation oder intranasale Inhalation.
  • Liposomen, die exogene Verbindungen umfassen, beispielsweise biologisch aktive Substanzen, können in Zusammensetzungen, die für die Verabreichung geeignet sind, formuliert werden. Beispielsweise kann eine Verbindung der vorliegenden Erfindung zur oralen Verabreichung in der Form einer Kapsel, einer Tablette oder eines Gels gegeben werden. Bei einer weiteren Ausführungsform kann eine Verbindung der vorliegenden Erfindung in der Form einer Salbe, von Heilsalben, eines Gels, einer Creme, eines Pflasters oder eines Zäpfchens gegeben werden.
  • Die Verbindungen der Formel (I) sind besonders bei der Herstellung von Liposomen von Nutzen, sie können jedoch bei jeder der vielen Verwendungen, bei denen kationische Lipide Anwendung finden, verwendet werden. Beispielsweise können sie bei industriellen Anwendungen, in pharmazeutischen Formulierungen oder auf anderen Gebieten, auf denen Lipide eingesetzt werden können, verwendet werden.
  • Bei einer Ausführungsform dieser Erfindung sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei der Abgabe von exogenen Verbindungen, beispielsweise von Makromolekülen, in vitro für die Laborverwendung von Nutzen. Formulierungen, welche die Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfassen, können bei der Transfektion und Transformation von Zellen in vitro zum Einführen eines gewünschten Merkmals vor der Implantation der transformierten Zellen in den Gesamtorganismus verwendet werden. Ein Beispiel dieser Anwendung ist die Transfektion von Knochenmarkzellen mit einem gewünschten Gen wie z. B. einem, das gewöhnliche adulte Hämoglobinsequenzen codiert, um bei Patienten mit Störungen wie β-Thalassämie, Adenosindesaminase-Mangelzustand und Sichelzellanämie, den Mangelzustand zu beseitigen. Die Knochenmarkzellen können in vitro transfiziert werden, anschließend können die auf geeignete Weise transfizierten Zellen in das Mark des Patienten übertragen werden. Bei einer anderen Ausführungsform können die Zellen, wie hier beschrieben, in vivo transfiziert werden. Verfahren wie die Calciumphosphat-Präzipitation sind bei der Durchführung solcher Transfektionen viel weniger effizient, weshalb sie für die praktische Anwendung ungeeignet sind. Andere Wege zum Erzielen einer Transfektion, die bereits in vitro durchgeführt worden sind, umfassen die Verwendung von viralen Vektoren (wie z. B. SV-40 und Retroviren). Diese Viren sind jedoch onkogen und können daher nicht zur sicheren Transfektion von Zellen in vivo oder in vitro verwendet werden. Die Übertragung von Formulierungen zur intrazellulären in vivo-Abgabe unter Verwendung von Formulierungen von Verbindungen der vorliegenden Erfindung ist auch zur Abgabe von antiviralen Verbindungen (wie z. B. Proteaseinhibitoren, Nucleosidderivate, Nucleotiden oder Polynucleotiden); und von Krebsverbindungen (umfassend, aber nicht darauf beschränkt, Nucleoside/Nucleotide wie z. B. 5-Fluoruracil, Adenosinanaloga, Cytosinanaloga und Purinanaloga), Antibiotika wie z. B. Anthracylinen (beispielsweise Adriamycin und Daunomycin) und Bleomycin; Proteinantibiotika wie z. B. Nuocarzinostatin, Marcomomycin und Auromomycin; Alkylierungsmitteln wie z. B. Chlorambucil, Cyclophosphamid, Nitrosoharnstoffe, Melphalan, Aziridine, Alkylalkansulfonate; Platin-Koordinationsverbindungen; Folat-Analoga wie z. B. Methotrexat; Strahlungssensibilisierungsmittel; Alkaloide wie z. B. Vincristin und Vinblastin; das Zytoskelett spaltenden Mitteln; differenzierenden Mitteln; und anderen Mitteln gegen Krebs von Nutzen. Diese Ausführungsform der Erfindung kann zum Überwinden von Arzneistoffresistenz, wie sie z. B. von Mechanismen zur verminderten Aufnahme des Arzneistoffs durch die Zellen verursacht sein kann, von besonderem Nutzen.
  • Bevorzugte DNA/Liposomen-Verhältnisse für die in vitro-Transfektion von Zellkulturen betragen 0,01 μg bis 10 μg DNA/μg Liposom. Stark bevorzugt sind 0,1 μg bis 1 μg DNA/μg Liposom.
  • Es werden hier ebenfalls Kits für die Transfektion, umfassend die Verbindungen der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise zusammen mit geeigneten Puffern beschrieben.
  • Um ein vollständigeres Verständnis dieser Erfindung zu ermöglichen, werden folgende Beispiele dargelegt. Die Beispiele haben jedoch lediglich den Zweck der Veranschaulichung und dürfen nicht als den Umfang der Erfindung auf irgendeine Weise beschränkend ausgelegt werden.
  • Beispiele
  • Beispiel 1 – Synthese von kationischen Cytofectinen
  • Alle nachstehend genannten Umsetzungen wurden in trockenem Acetonitril oder Ethanol unter Rückfluss mit Schutz durch Argon über einen Zeitraum von 40 Stunden bis 43 Stunden durchgeführt. Das feste Produkt wurde durch Filtration von dem Reaktionsgemisch abgetrennt, anschließend mit kaltem Diethylether gewaschen und aus Diethylether/Methanol und anderen Lösungsmittelgemischen rekristallisiert. Die Reinheit der Bis(quaternäres Ammonium)oberflächenaktiven Mittel wurde mittels DC auf Octadecylsilica-Platten mit der mobilen Phase Chloroform/Methanol/n-Propanol/Ethylester/0,25%-iges wässriges KCl 25/13/25/25/9 (Vol./Vol./Vol./Vol./Vol.) überprüft. In den Produkten wurden keine Ausgangsmaterialien gefunden.
  • A. Alkandiyl-α,ω-bis(dimethylalkylammoniumbromide)
  • Für die Herstellung von Alkandiyl-α,ω-bis(dimethylalkylammoniumbromiden) wurden zwei Verfahren verwendet. Die Verbindungen umfassen solche mit der folgenden Struktur:
    Figure 00160001
    wobei
    A = Bromid (Br–), k = 1; B eine Alkandiylbrücke (CH2)n bedeutet, wobei n = 2, 3 oder 4;
    R1, R3, R4 und R6 Methyl -(CH3) bedeuten;
    R2 und R5 geradzahliges geradkettiges C8-C20-Alkyl bedeuten.
  • Verfahren (a)
  • Umsetzung von α,ω-Dibrompropan oder -butan mit einem 10%-igen Überschuss von N,N,N-Decyldimethylamin oder N,N,N-Dodecyldimethylamin oder N,N,N-Octadecyldimethylamin.
  • Verfahren (b)
  • Umsetzung von Alkandiyl-α,ω-bis(dimethylamin) mit einem 10%-igen Überschuss von 1-Brom-n-octan, 1-Brom-n-decan, 1-Brom-n-dodecan, 1-Brom-n-tetradecan, 1-Brom-n-hexadecan oder Brom-n-octadecan.
  • B. N,N',N''-Trialkyl-N,N,N',N'',N''-pentamethyl-bis(2-ammonioethyl)ammoniumbromid
  • Umsetzung von N,N,N',N'',N''-Pentamethyldiethylentriamin mit einem 5%-igen Überschuss des geeigneten 1-Bromalkans, um N,N',N''-Trialkyl-N,N',N''-pentamethyl-bis(2-ammonioethyl)ammoniumbromid zu ergeben.
  • Auf diesem Weg wurden folgende kationische Cytofectine hergestellt:
    • a) N,N',N''-Trioctyl-N,N,N',N'',N''-pentamethyl-bis(2-ammonioethyl)ammoniumbromid
    • b) N,N',N''-Tridecyl-N,N,N',N'',N''-pentamethyl-bis(2-ammonioethyl)ammoniumbromid
    • c) N,N',N''-Tridodecyl-N,N,N',N'',N''-pentamethyl-bis(2-ammonioethyl)ammoniumbromid
    • d) N,N',N''-Tritetradecyl-N,N,N',N'',N''-pentamethyl-bis(2-ammonioethyl)ammoniumbromid
    • e) N,N',N''-Trihexadecyl-N,N,N',N'',N''-pentamethyl-bis(2-ammonioethyl)ammoniumbromid
    • f) N,N',N''-Trioctadecyl-N,N,N',N'',N''-pentamethyl-bis(2-ammonioethyl)ammoniumbromid
  • Beispiel 2 – Herstellung von kationischen Cytofectinen mit Dihydrogenphosphat (H2PO4 –) als Gegenion
  • 8 Gramm Dowex 1 × 8–400 Anionenaustauscherharz wurden mit 50%-igem wässrigen Methanol in einer Chromatographiesäule gründlich gewaschen. Die Säule wurde mit 20 Säulenvolumina 1 M Phosphorsäure, dann mit destilliertem Wasser bis zur Neutralität und schließlich mit zehn Säulenvolumina 50%-igem Methanol weiter gewaschen.
  • Nach diesen Waschschritten wurde eine Lösung eines kationischen Cytofectins in Bromidform in 50%-igem Methanol gelöst und auf die Säule aufgebracht. Anschließend wurde 50%-iges Methanol durch die Säule gepumpt, wobei 20 Säulenvolumina des Ausflusses gesammelt wurden. Der pH-Wert des Ausflusses wurde mit Phosphorsäure eingestellt, um Dihydrogenphosphate oder Hydrogenphosphate herzustellen. Anschließend wurde die Lösung mittels eines Rotationsverdampfers konzentriert und zu einem Pulver gefriergetrocknet.
  • Die Beispiele der Stoffe, die mit diesem Verfahren hergestellt wurden, umfassen die folgenden:
    • 1) Ethandiyl-1,2-bis(dimethyldecylammoniumchlorid)
    • 2) Ethandiyl-1,2-bis(dimethyldecylammoniumiodid)
    • 3) Ethandiyl-1,2-bis(dimethyldecylammoniumdihydrogenphosphat)
    • 4) Ethandiyl-1,2-bis(dimethyldecylammoniumthiosulfat)
    • 5) Ethandiyl-1,2-bis(dimethyldecylammoniumsulfat)
    • 6) Ethandiyl-1,2-bis(dimethyldecylammoniumoxalat)
  • Beispiel 3 – Herstellung von Liposomen
  • Liposomen können durch Kombination eines wie hier beschriebenen kationischen Cytofectins und eines neutralen Lipids, DOPE, durch das nachstehend beschriebene Verfahren hergestellt werden. Solche Liposomen umfassen Q203, Q205, Q206, Q208 und Q817 (siehe Tabelle 1).
  • Materialien:
  • Chloroform (Merck, p.a.), Endotoxin-freies entionisiertes Wasser, eine Lösung von DOPE in Chloroform und ein kationisches Cytofectin.
  • Verfahren:
  • Kurz gesagt wurden ein kationisches Cytofectin und ein neutrales Lipid in Chloroform auf eine Endkonzentration von 2 mM zusammengemischt, anschließend wurde das Gemisch in einem Rotationsverdampfer bei 60°C abgedampft. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei einem Unterdruck von 10 bis 15 mbar getrocknet. Dem Gemisch wurde Endotoxin-freies entionisiertes Wasser unter sterilen Bedingungen zugesetzt, anschließend wurde das Gemisch unter Rühren auf 60°C erhitzt.
  • Anschließend wurden einige Lösungen einmal 300 Sekunden bei 60°C ultraschallbehandelt (beispielsweise diejenigen mit Q203 und Q205 als Endprodukte). Andere Lösungen wurden nicht ultraschallbehandelt, wurden aber bei 60°C gerührt, bis die Lösungen durchsichtig oder leicht opaliszierend wurden (beispielsweise diejenigen mit Q206, Q208 und Q817 als Endprodukte). Die Gesamtkonzentration von DOPE + kationischem Cytofectin betrug bei allen Liposomen 2 mM. Die Konzentration von DOPE in jedem Liposom kann durch Multiplikation des Werts von X(DOPE) in Tabelle 1 mit 2 mM berechnet werden, so dass, beispielsweise, Q203-enthaltende Liposomen 1,7 mM DOPE und 0,3 mM Q203 aufweisen. Tabelle 1 (nachstehend) fasst die kationischen Cytofectin-Liposome, die bei den Verfahren der Erfindung verwendet werden, zusammen. Tabelle 1 gibt einen Überblick.
  • Tabelle 1
    Figure 00190001
  • Bei einem weiteren Beispiel wurde ein Liposom, bestehend aus Propandiyl-1,3-bis(decyldimethylammoniumbromid) (10-3-10) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE), hergestellt (mit X(DOPE) = 0,50).
  • Materialien:
  • Chloroform (Merck, p.a.), Endotoxin-freies entionisiertes Wasser, eine Lösung von DOPE in Chloroform und 10-3-10.
  • Verfahren:
  • Zunächst wurde eine Lösung, umfassend 1,17 ml einer 85,21 mg/ml DOPE-Lösung und 57,3 mg 10-3-10 in Chloroform, hergestellt. Das Lösungsmittel wurde mittels eines Rotationsverdampfers bei 60°C entfernt. Der Lipidfilm wurde 10 min bei einem Unterdruck von 10 bis 15 mbar getrocknet. Dem Kolben mit dem Lipidfilm wurden 100 ml Endotoxin-freies entionisiertes Wasser unter sterilen Bedingungen zugesetzt. Der Kolben wurde unter Rühren auf 60°C erhitzt, bis eine durchsichtige oder leicht opaliszierende Lösung erhalten war. Die End-Gesamtkonzentration von DOPE und 10-3-10 betrugen bei dieser Liposomenlösung 2 mM.
  • Bei der Herstellung von ultraschallbehandelten Proben wurde eine zusätzliche Ultraschallbehandlung der Lösung über einen Zeitraum 300 s mit einem im Handel erhältlichen Ultraschallgerät durchgeführt.
  • Beispiel 4 – Transfektionsexperimente
  • Liposomenherstellung mit und ohne Ultraschallbehandlung/Zellspezifität der Reagenzien
  • Bei 60°C wurden Liposomen durch Kombinieren von 10-3-10 (Propandiyl-1,3-bis(decyldimethylammoniumbromid) mit DOPE (wie in Beispiel 3 beschrieben) mit und ohne Ultraschallbehandlung hergestellt.
  • Die Liposomen wurden verwendet, um HeLaS3- und COS7-Zellen in vitro mit dem Reporterplasmid pCMVβ (Clontech) zu transfizieren. Die Transfektionseffizienzen, die durch Messung der optischen Dichte (OD) nach der Zelllyse und der Messung der β-Gal-Aktivität bestimmt wurden, wurden mit Effizienzen, die parallel dazu mit einem im Handel erhältlichen Liposomenpräparat (Lipofectamin, Gibco LTI) erhalten wurden, verglichen und als Prozentwert bezogen auf die Lipofectamin-Effizienz angegeben. Bei jeder Transfektion wurde 1 μg pCMVβ (mit EndoFree, QIAGEN, isoliert) pro Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen verwendet. Die DNA wurde mit DMEM-Medium (Gibco LTI) auf 50 μl verdünnt und anschließend mit 1, 2, 3 bzw. 4 μl der Liposomenpräparate, die dann mit DMEM-Medium auf 50 μl verdünnt wurden, kombiniert. Die DNA- und Liposomenlösungen wurden miteinander gemischt und den Zellen bei 37°C und 5% CO2 über einen Zeitraum von 6 Stunden zugeführt. Anschließend wurde das Medium zu DMEM mit 10% fetalem Kälberserum geändert. Die Zellen wurden nach 48 h Inkubation bei 37°C und 5% CO2 lysiert.
  • Es wurden jeweils zweifache Bestimmungen durchgeführt. Die Werte wurden gemittelt, dann wurde die höchste Effizienz (Optimum) innerhalb einer Serie als Prozentwert bezogen auf die höchste mit Lipofectamin erhaltene Effizienz (Optimum) angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Tabelle 2
    Figure 00210001
  • Folgerungen:
    • a) Die Transfektionseffizienz für HeLaS3- und COS7-Zellen ist höher, wenn bei der Herstellung von Liposomen keine Ultraschallbehandlung verwendet wird.
    • b) Die mit 10-3-10 (Propandiyl-1,3-bis(decyldimethylammoniumbromid)) als kationische Komponente hergestellten Liposome sind stärker zellspezifisch als Lipofectamin.
  • Variationen der Kettenlänge der hydrophoben Seitenkette (R) und Effizienz/Spezifität der Transfektion
  • Bei 60°C wurden Liposomen ohne Ultraschallbehandlung durch Kombinieren von DOPE mit einem der folgenden hergestellt:
    • 1) 10-2-10 (Ethandiyl-1,2-bis(decyldimethylammoniumbromid))
    • 2) 12-2-12 (Ethandiyl-1,2-bis(dodecyldimethylammoniumbromid))
    • 3) 14-2-14 (Ethandiyl-1,2-bis(tetradecyldimethylammoniumbromid))
    • 4) 16-2-16 (Ethandiyl-1,2-bis(hexadecyldimethylammoniumbromid))
    • 5) 18-2-18 (Ethandiyl-1,2-bis(octadecyldimethylammoniumbromid)).
  • Die so erhaltenen Liposomen wurden zur Transfektion von Huh7-Zellen in vitro mit dem Reporterplasmid pCMVβ (Clontech) verwendet. Die Transfektionseffizienzen, die durch Messung der optischen Dichte (OD) nach der Zelllyse und der Messung der β-Gal-Aktivität bestimmt wurden, wurden mit Effizienzen, die parallel dazu mit einem im Handel erhältlichen Liposomenpräparat (Lipofectamin, Gibco LTI) erhalten wurden, verglichen und als Prozentwert bezogen auf die Lipofectamin-Effizienz angegeben. Bei jeder Transfektion wurden 0,5 μg pCMVβ (mit EndoFree, QIAGEN, isoliert) pro Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen verwendet. Die DNA wurde mit DMEM-Medium (Gibco LTI) auf 50 μl verdünnt und anschließend mit 1, 2, 3 bzw. 4 μl der Liposomenpräparate, die dann mit DMEM-Medium auf 50 μl verdünnt wurden, kombiniert. Die DNA- und Liposomenlösungen wurden miteinander gemischt und den Zellen bei 37°C und 5% CO2 über einen Zeitraum von 6 Stunden zugeführt. Anschließend wurde das Medium zu DMEM mit 10% fetalem Kälberserum geändert. Die Zellen wurden nach 48 h Inkubation bei 37°C und 5% CO2 lysiert. Es wurden jeweils zweifache Bestimmungen durchgeführt. Die Werte wurden gemittelt, dann wurde die höchste Effizienz (Optimum) innerhalb einer Serie als Prozentwert bezogen auf die höchste mit Lipofectamin erhaltene Effizienz (Optimum) angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
  • Tabelle 3
    Figure 00230001
  • Folgerungen:
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass bei der Transfektion mit Huh7-Zellen:
    • a) eine Zunahme der Länge der Seitenketten zu einer Verschiebung des optimalen X(DOPE)-Werts führt. Bei 10-2-10 beträgt der optimale X(DOPE)-Wert nicht mehr als 0,50. Bei 12-2-12 beträgt der optimale X(DOPE)-Wert 0,70. Bei 14-2-14, 16-2-16 und 18-2-18 beträgt der optimale X(DOPE)-Wert wenigstens 0,80.
    • b) Die optimale Länge der hydrophoben Seitenkette bei dieser Serie ist 16. (Für HeLaS3-Zellen ist die optimale Länge der hydrophoben Seitenkette 10. Für LMH-Zellen ist die optimale Länge der hydrophoben Seitenkette 16. Für COS7-Zellen ist die optimale Länge der hydrophoben Seitenkette 14 – diese Daten sind nicht gezeigt).
  • Variationen der Brückenlänge (k) und Effizienz/Spezifität der Transfektion
  • Bei 60°C wurden Liposomen ohne Ultraschallbehandlung durch Kombinieren von DOPE mit einem der folgenden hergestellt:
    • 1) 10-2-10 (Ethandiyl-1,2-bis(decyldimethylammoniumbromid))
    • 2) 10-3-10 (Propandiyl-1,3-bis(decyldimethylammoniumbromid))
    • 3) 10-4-10 (Butandiyl-1,4-bis(decyldimethylammoniumbromid))
  • Die so erhaltenen Liposomen wurden zur Transfektion von HeLaS3- und Huh7-Zellen in vitro mit dem Reporterplasmid pCMVβ (Clontech) verwendet. Die Werte der Transfektionseffizienz, die durch Messung der optischen Dichte (OD) nach der Zelllyse und der Messung der β-Gal-Aktivität bestimmt wurden, wurden mit Effizienzen, die parallel dazu mit einem im Handel erhältlichen Liposomenpräparat (Lipofectamine, Gibco LTI) erhalten wurden, verglichen und als Prozentwert bezogen auf die Lipofectamine-Effizienz angegeben. Bei jeder Transfektion wurden 0,5 μg pCMVβ (mit EndoFree, QIAGEN, isoliert) pro Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen verwendet. Die DNA wurde mit DMEM-Medium (Gibco LTI) auf 50 μl verdünnt und anschließend mit 1, 2, 3 bzw. 4 μl der Liposomenpräparate, die dann mit DMEM-Medium auf 50 μl verdünnt wurden, kombiniert. Die DNA- und Liposomenlösungen wurden miteinander gemischt und den Zellen bei 37°C und 5% CO2 über einen Zeitraum von 6 Stunden zugeführt. Anschließend wurde das Medium zu DMEM mit 10% fetalem Kälberserum geändert. Die Zellen wurden nach 48 h Inkubation bei 37°C und 5% CO2 lysiert.
  • Es wurden jeweils zweifache Bestimmungen durchgeführt. Die Werte wurden gemittelt, dann wurde die höchste Effizienz (Optimum) innerhalb einer Serie als Prozentwert bezogen auf die höchste mit Lipofectamin erhaltene Effizienz (Optimum) angegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
  • Tabelle 4
    Figure 00250001
  • Folgerungen:
  • Strukturelle Änderungen der Brückenlänge des kationischen Cytofectins können verwendet werden, um:
    • a) das Transfektionsreagens für eine gegebene Zelllinie effizienter zu machen (Huh7: die Abnahme der Brückenlänge führt zu einer Zunahme der Effizienz; dies ist bei HeLaS3 nicht der Fall);
    • b) das Transfektionsreagens für eine gegebene Zelllinie spezifischer zu machen (bei zunehmender Brückenlänge bleibt die Transfektionseffizienz bei HeLaS3 konstant, während die Transfektionseffizienz bei Huh7 abnimmt, wodurch das Transfektionsreagens spezifischer für HeLaS3 wird).
  • Andere Gegenionen als Bromid, die bei der Herstellung von Cytofectinen verwendet werden: Transfektionseffizienz
  • Gemäß der Erfindung können kationische Cytofectine mit anderen Gegenionen als Brom hergestellt werden, wie in Beispiel 2 beschrieben ist. Beispielsweise können Ethandiyl-1,2-bis(decyldimethylammonium)chlorid, -iodid, -phosphat, -sulfat, -thiosulfat und -oxalat hergestellt werden.
  • Bei 60°C wurden Liposomen ohne Ultraschallbehandlung durch Kombinieren von DOPE mit einem der folgenden Cytofectine hergestellt:
    • 1) 10-2-10 Ethandiyl-1,2-bis(decyldimethylammonium)oxalat
    • 2) 10-2-10 Ethandiyl-1,2-bis(decyldimethylammonium)thiosulfat
    • 3) 10-2-10 Ethandiyl-1,2-bis(decyldimethylammonium)iodid
    • 4) 10-2-10 Ethandiyl-1,2-bis(decyldimethylammonium)dihydrogenphosphat
  • Die Liposomen wurden zur Transfektion von HeLaS3-Zellen in vitro mit dem Reporterplasmid pCMVβ (Clontech) verwendet. Die Werte der Transfektionseffizienz, die durch Messung der optischen Dichte (OD) nach der Zelllyse und der Messung der β-Gal-Aktivität bestimmt wurden, wurden mit Werten der Transfektionseffizienz, die parallel dazu in Untersuchungen mit im Handel erhältlichen Liposomenpräparaten (Lipofectamin, Gibco LTI) erhalten wurden, verglichen und als Prozentwert bezogen auf die Lipofectamin-Effizienz angegeben. Bei jeder Transfektion wurden 0,5 μg pCMVβ (mit EndoFree, QIAGEN, isoliert) pro Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen verwendet. Die DNA wurde mit DMEM-Medium (Gibco LTI) auf 50 μl verdünnt und anschließend mit 1, 2, 3 bzw. 4 μl der Liposomenpräparate, die dann mit DMEM-Medium auf 50 μl verdünnt wurden, kombiniert. Die DNA- und Liposomenlösungen wurden miteinander gemischt und den Zellen bei 37°C und 5% CO2 über einen Zeitraum von 6 Stunden zugeführt. Anschließend wurde das Medium zu DMEM mit 10% fetalem Kälberserum geändert. Die Zellen wurden 48 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert und anschließend lysiert.
  • Die nachstehend gezeigten Ergebnisse (Tabelle 5) zeigen die optimale Transfektionseffizienz des Reporterplasmids pCMVβ unter Verwendung der vorstehend genannten Liposome als Prozentwert, der auf die höchste mit Lipofectamin erhaltene Transfektionseffizienz bezogen ist. Tabelle 5
    Figure 00270001
    • * Dieser Prozentwert entspricht der Obergrenze der β-Gal-Prüfung, die wahren Werte liegen höher.
  • Bei ähnlichen Untersuchungen von HeLaS3-Zellen wurde der gleiche Vektor mit Liposomen, umfassend Bromid-Gegenionen und das Cytofectin 10-2-10 Ethandiyl-1,2-bis(decyldimethylammonium), transfiziert. Die Ergebnisse waren wie folgt (Tabelle 6):
  • Tabelle 6
    Figure 00280001
  • Im Allgemeinen waren bei den vorstehend genannten Transfektionen Liposome, welche die mit den vorstehend genannten Gegenionen hergestellten kationischen Cytofectine umfassten, bei der Abgabe von DNA wirksamer als Lipofectamin. Beispielsweise wiesen Transfektionen mit Cytofectinen, die mit Sulfat-, Thiosulfat-, Iodid- und Dihydrogenphosphat-Gegenionen hergestellt waren, höhere Werte der Transfektionseffizienz als Transfektionen mit Lipofectamin auf. Die höchsten Transfektionseffizienzen wurden mit Liposomen, die mit Iodid- und Dihydrogensphosphat-Gegenionen hergestellte kationische Cytofectine umfassten, erzielt. Somit können Gegenionen bei der Modulation der Transfektionseffizienz von Nutzen sein.
  • Beispiel 5 – Transfektionsexperimente unter Verwendung von kationischen Cytofectinen mit drei Stickstoffatomen/Ammoniumgruppen
  • N,N',N''-Trialkyl-N,N,N',N'',N''-pentamethyl-bis(2-ammonioethyl)ammoniumbromid
  • Liposome, umfassend Verbindung (3) [Synthese gemäß Beispiel 1B] und DOPE, wurden bei 60°C hergestellt, wobei DOPE ohne Ultraschallbehandlung verwendet wurde.
  • Die so erhaltenen Liposome wurden zur Transfektion von HeLaS3-Zellen und COS7-Zellen in vitro mit dem Reporterplasmid pCMVβ (Clontech) verwendet. Die Werte der Transfektionseffizienz, die durch Messung der optischen Dichte (OD) nach der Zelllyse und der Messung der β-Gal-Aktivität bestimmt wurden, wurden mit Werten der Transfektionseffizienz, die parallel dazu in Untersuchungen mit im Handel erhältlichen Liposomenpräparaten (Lipofectamin, Gibco LTI) erhalten wurden, verglichen und als Prozentwert bezogen auf die Lipofectamin-Effizienz angegeben. Bei jeder Transfektion wurden 0,5 μg pCMVβ (mit EndoFree, QIAGEN, isoliert) pro Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen verwendet. Die DNA wurde mit DMEM-Medium (Gibco LTI) auf 50 μl verdünnt und anschließend mit 1, 2, 3 bzw. 4 μl der Liposomenpräparate, die dann mit DMEM-Medium auf 50 μl verdünnt wurden, kombiniert. Die DNA- und Liposomenlösungen wurden miteinander gemischt und den Zellen bei 37°C und 5% CO2 über einen Zeitraum von 6 Stunden zugeführt. Anschließend wurde das Medium zu DMEM mit 10% fetalem Kälberserum geändert. Die Zellen wurden 48 h bei 37°C und 5% CO2 inkubiert und anschließend lysiert.
  • Die nachstehend gezeigten Ergebnisse (Tabelle 7) zeigen die optimale Transfektionseffizienz des Reporterplasmids pCMVβ unter Verwendung der vorstehend genannten Liposome als Prozentwert, der auf die höchste mit Lipofectamin erhaltenen Transfektionseffizienz bezogen ist. R bezeichnet die Anzahl der Kohlenstoffatome in der Alkylkette. Die Konzentration von DOPE in jedem Liposom kann durch Multiplikation des Werts von X(DOPE) mit 2 M berechnet werden. Tabelle 7
    Figure 00300001
    • A) Kationische Cytofectine mit der chemischen Formel N,N',N''-Trialkyl-N,N',N''-pentamethyl-bis(2-ammonioethyl)ammoniumbromid können Zelllinien in vitro transfizieren.
    • B) Verschiedene Alkylreste an dem Stickstoffatom verändern die Spezifität für verschiedene Zelllinien. Während HeLaS3-Zellen am Besten unter Verwendung einer Kettenlänge von 10 transfiziert wurden, zeigten COS7-Zellen ihr Optimum bei einer Kettenlänge von 18.

Claims (16)

  1. Verwendung einer Verbindung gemäß Formel (I):
    Figure 00310001
    Formel (I) wobei A ein Anion bedeutet, ausgewählt aus der Gruppe aus Chlorid, Bromid, Iodid, Hydrogenphosphat (HPO4 2–), Dihydrogenphosphat (H2PO4 –), Sulphat, Thiosulphat, Hydroxy und/oder Oxalat; k eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4 oder 5 bedeutet; B eine Alkandiylbrücke (CH2)n bedeutet, wobei n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 bedeutet; R1, R3 und R4, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkenyl, C1-C6-Alkinyl bedeuten; R2 geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet; R5 wenn k = 1, geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet; wenn k > 1, Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkenyl, C1-C6-Alkinyl bedeutet; R6 wenn k = 1, Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkenyl, C1-C6-Alkinyl bedeutet; wenn k > 1, ein geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet; und die wiederkehrende Einheit -B-NR4R6 gleich oder verschieden sein kann; zur in vitro-Transfektion.
  2. Verwendung einer Verbindung gemäß Formel (I):
    Figure 00320001
    Formel (I) wobei A ein Anion bedeutet, ausgewählt aus der Gruppe aus Chlorid, Bromid, Iodid, Hydrogenphosphat (HPO4 2–), Dihydrogenphosphat (H2PO4 –), Sulphat, Thiosulphat, Hydroxy und/oder Oxalat; k eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4 oder 5 bedeutet; B eine Alkandiylbrücke (CH2)n bedeutet, wobei n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 bedeutet; R1, R3 und R4, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkenyl, C1-C6-Alkinyl bedeuten; R2 geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet; R5 wenn k = 1, geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet; wenn k > 1, Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkenyl, C1-C6-Alkinyl bedeutet; R6 wenn k = 1, Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkenyl, C1-C6-Alkinyl bedeutet; wenn k > 1, ein geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet; und die wiederkehrende Einheit -B-NR4R6 gleich oder verschieden sein kann; für die Herstellung eines Arzneimittels zur in vivo-Transfektion.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei A ein Anion bedeutet, ausgewählt aus der Gruppe aus Chlorid, Bromid, Iodid, Hydrogenphosphat (HPO4 2–), Dihydrogenphosphat (H2PO4 –), Sulphat, Thiosulphat, Hydroxy und/oder Oxalat; k eine ganze Zahl 1, 2 oder 3 bedeutet; B eine Alkandiylbrücke (CH2)n bedeutet; und n eine ganze Zahl 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 bedeutet; R1, R3 und R4, die gleich oder verschieden sein können, Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl bedeuten; R2 geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet; R5 wenn k = 1, geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet; wenn k > 1, Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl bedeutet; R6 wenn k = 1, Wasserstoff, geradkettiges oder verzweigtes C1-C6-Alkyl, C1-C6-Alkenyl, C1-C6-Alkinyl bedeutet; wenn k > 1, ein geradkettiges oder verzweigtes C8-C20-Alkyl, C8-C20-Alkenyl, C8-C20-Alkinyl bedeutet; und die wiederkehrende Einheit -B-NR4R6 vorzugsweise gleich ist.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei A ein Anion bedeutet, ausgewählt aus der Gruppe aus Bromid, Iodid, Dihydrogenphosphat (H2PO4 –) und/oder Thiosulfat; k eine ganze Zahl 1 oder 2 bedeutet; B wenn k = 1, eine Alkandiylbrücke -(CH2)n bedeutet, wobei n eine ganze Zahl 2, 3 oder 4 bedeutet; B wenn k = 2, eine Ethylenbrücke -(CH2-CH2)- bedeutet; R1, R3 und R4, die gleich sind, CH3 bedeuten; R2 geradkettiges C10-C20-Alkyl bedeutet; R5 wenn k = 1, geradkettiges C10-C20-Alkyl bedeutet und mit R2 identisch ist; wenn k = 2, CH3 bedeutet; R6 wenn k = 1, CH3 bedeutet; wenn k = 2, geradkettiges C10-C20-Alkyl bedeutet und mit R2 identisch ist.
  5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Verbindung Teil eines Liposoms ist, weiter umfassend ein neutrales Lipid oder eine neutrale lipidähnliche Verbindung.
  6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei das neutrale Lipid oder die lipidähnliche Verbindung Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und/oder 1,2-Dioleoyloxiphosphatidylethanolamin und/oder Cholesterol und/oder Dioleylphosphatidylcholin (DOPC) ist.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Verbindung eine auf die Zielzelle gerichtete Komponente umfasst.
  8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die auf die Zielzelle gerichtete Verbindung ein Ligand oder eine Liganden-ähnliche Komponente für einen spezifischen Zelloberflächenrezeptor oder -kernrezeptor ist.
  9. Verwendung zur in vitro-Transfektion nach einem der Ansprüche 1 oder 3 bis 8, wobei die Transfektion die Transfektion von Zellkulturen ist und wobei das DNA/Liposom-Verhältnis 0,01 μg bis 10 μg DNA/μg Liposom ist.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das DNA/Liposom-Verhältnis 0,1 μg bis 1 μg DNA/μg Liposom ist.
  11. Verwendung zur in vivo-Transfektion nach einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei das DNA/Liposom-Verhältnis im Bereich von DNA/Liposom (Gew./Gew.) 2:1 bis 1:3/1 μg bis 100 mg pro kg Körpergewicht liegt.
  12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Transfektion die Abgabe einer Nucleinsäure oder Derivats davon in eine Zielzelle einschließt.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleinsäure eine einzelsträngige und/oder doppelsträngige DNA und/oder RNA und/oder ein DNA/RNA-Hybrid oder Derivate davon ist.
  14. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA ausgewählt ist aus Plasmiden, Vektoren, cDNA, CpG-Motiven und/oder Oligonucleotiden und die RNA ausgewählt ist aus mRNA, Oligonucleotiden oder Ribozymen.
  15. Verwendung zur in vivo-Transfektion nach einem der Ansprüche 2 bis 8 oder 11, wobei die Transfektion die Abgabe eines Arzneimittels einschließt.
  16. Verwendung zur in vivo-Transfektion nach einem der Ansprüche 2 bis 8 oder 11, wobei die Transfektion die Abgabe eines prophylaktischen und/oder therapeutischen Impfstoffes einschließt.
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