DE69837819T2 - Kondensierte plasmid-liposome komplex zur transfektion - Google Patents

Kondensierte plasmid-liposome komplex zur transfektion Download PDF

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Description

  • Bereich der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbesserung in einem Verfahren zur Herstellung von Plasmid-Liposom-Komplexen für eine in vivo Transfektion eines Gens, und betrifft Zusammensetzungen, die durch das Verfahren hergestellt werden.
  • Druckschriften
    • Felgner J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417 (1987);
    • Felgner J. et al., J. Tiss. Cult. Meth. 15: 63-68 (1993);
    • Gao X. und Huang L., Biochemistry 35: 1027-1036 (1996);
    • Guo L. et al., Journal of Liposome Research 3(1): 51-70 (1993);
    • Li S. und Huang L., Journal of Liposome Research, 6(3): 589-608 (1996);
    • Mulligan R. S., Science 260: 926-932 (1993);
    • Morishita R. et al., J. Clin. Invest. 91: 2580-2585 (1993);
    • Rose J. K., US-Patent Nr. 5,279,833 (1994);
    • Trubetskoy V. S. et al., Biochimica et Biophysica Acta 1131: 311-313 (1992);
    • Wagner E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4255-4259 (1991).
  • Hintergrund der Erfindung
  • Eine Vielzahl von Verfahrensweisen wurde entwickelt, um die Übertragung von genetischem Material in spezielle Zellen zu erleichtern, z. B. eine Gen-Therapie. Diese Verfahrenweisen sind nützlich sowohl für einen Gen-Transfer in vivo als auch ex vivo. Im erstgenannten Verfahren wird ein Gen direkt in ein Subjekt eingeführt (intravenös, intraperitoneal, in Form eines Aerosols usw.). Bei einem ex vivo- (o der in vitro-)Gen-Transfer wird das Gen in Zellen eingeführt, und zwar nach Entfernung der Zellen aus einem speziellen Gewebe eines Individuums. Die transfektierten Zellen werden dann zurück in das Subjekt eingeführt.
  • Abgabe-Systeme zum Erreichen einer in vivo- und ex vivo-Gen-Therapie schließen ein: virale Vektoren wie beispielsweise einen retroviralen Vektor oder Adenovirus-Vektoren, eine Mikroinjektion, eine Elektroporation, eine Protoplasten-Fusion, Calciumphosphat und Liposome (Felgner et al., 1987; Mulligan, 1993; Morishita et al., 1993).
  • Eine liposomal vermittelte Gen-Therapie hat beispielsweise die Verwendung kationischer Liposomen eingeschlossen, die aus LIPOFECTIN gebildet wurden, einem Reagenz, das aus einem kationischen Lipid und einem neutralen Lipid besteht (Felgner et al., 1989, 1993). Andere liposomal vermittelte Verfahren einer Gen-Therapie wurden beschrieben (Trubetskoy et al., 1992; Morishita et al., 1993; Rose, 1994), worin elektrostatische Komplexe von kationischen Liposomen und DNS gebildet werden. Noch jüngere Ansätze für Liposomen-basierte Transfektions-Zusammensetzungen haben ein Polykation wie beispielsweise Protamin oder Polylysin eingeschlossen, um die DNS an die Lipid-Teilchen zu binden (Wagner et al., 1991) oder die DNS zu kondensieren (Gao und Huang, 1996; Li und Huang, 1996).
  • Jedoch haben die liposomal vermittelten Gen-Therapie-Verfahren und Zusammensetzungen, die bis heute beschrieben wurden, Beschränkungen erfahren, einschließlich beispielsweise die Toxizität von LIPOFECTIN, die große Größe von DNS-Liposom-Komplexen und ziemlich schlechte in vivo-Transfektions-Effizienz.
  • Es wäre daher wünschenswert, einen DNS-Plasmid-Liposom-Komplex herzustellen, der relativ nicht-toxisch ist, eine Größe für eine intravenöse Verabreichung aufweist und eine hohe Transfektions-Effizienz aufweist.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird bereitgestellt eine Zusammensetzung von Plasmid-Liposom-Komplexen zur Verwendung beim Transfektieren einer Wirts-Zelle mit einem Gen, das in einem Plasmid enthalten ist, umfassend
    • – kondensierte Plasmid-Moleküle, wobei die Moleküle kondensiert sind mit einem polykationischen kondensierenden Mittel und suspendiert sind in einem wässrigen Medium, das eine nicht als Elektrolyt vorliegende gelöste Substanz enthält, wobei das Medium eine Ionenstärke aufweist, die geringer ist als die Ionenstärke einer 10 mM Lösung, die ein einwertiges, ionisierbares Salz enthält, und
    • – kationische Liposomen, die ein eine Diacyl-Kette umfassendes, kationisches, Vesikel-bildendes Lipid, Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDAB), N-[1-(2,3-Ditetradecyloxy-)propyl-]N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium-bro-mid (DMRIE) N-[1-(2,3-Dioleyloxy-)propyl-]N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid (DORIE) oder N-[1-(2,3-Dioleyloxy-)propyl-]N,N,N-tri-methylammoniumchlorid (DOTMA) umfassen, worin die Komplexe ein Verhältnis von Liposom-Lipid zu Plasmid von größer als 5 nMol Liposom-Lipid/μg Plasmid und weniger als 25 nMol Liposom-Lipid/μg Plasmid aufweisen und eine homogene Größe von weniger als 200 nm aufweisen.
  • In einer Ausführungsform sind die kondensierten Plasmid-Moleküle DNS-Plasmid-Moleküle, die ein Gen enthalten, das gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Genen, die für den Regulator der Transmembran-Leitfähigkeit bei cystischer Fibrose, Faktor VIII, Interleukin-2 oder p53 kodieren.
  • In einer Ausführungsform ist das kondensierende Mittel ein Polykation, das gewählt ist aus Historien, Poly-1-glutamin, Protamin, Melittin und Polymyxin B. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das kondensierende Mittel ein Histon, das gewählt ist aus Gesamt-Histon, Histon-1 und Histon-4.
  • In einer weiteren Ausführungsform liegt das Verhältnis von Liposom-Lipid zu Plasmid zwischen 8 und 18 nMol Liposom-Lipid/μg Plasmid.
  • Vorzugsweise ist der nicht als Elektrolyt vorliegende osmotische gelöste Stoff Glucose, Sucrose oder Dextran.
  • Die kationischen Liposome können umfassen ein kationisches, Vesikel-bildendes Lipid, das gewählt ist aus Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDAB), 1,2-Dioleyloxy-3-(trimethylamino-)propan (DOTAP), N-[1-(2,3-Ditetradecyloxy-)propyl-]N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid (DMRIE), N-[1-(2,3-Dioleyloxy-)propyl-]N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid (DORIE), N-[1-(2,3-Dioleyloxy-)propyl-]N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA).
  • In einer weiteren Ausführungsform schließen die kationischen Liposome weiter ein neutrales, Vesikel-bildendes Lipid ein. In noch einer weiteren Ausführungsform schließen die kationischen Liposome weiter Cholesterin ein.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform haben die kationischen Liposome eine Oberflächen-Beschichtung aus hydrophilen Polymer-Ketten, indem sie ein Vesikel-bildendes Lipid einschließen, das mit einem derartigen hydrophilen Polymer derivatisiert ist. In einer Ausführungsform ist wenigstens ein Teil der hydrophilen Polymer-Ketten mit einem Vesikel-bildenden Lipid über eine lösbare Bindung verbunden, z. B. eine Bindung, die wirksam ist, die hydrophilen Polymer-Ketten in Response auf einen existierenden oder einen induzierten physiologischen Zustand freizusetzen. Die Plasmid-Liposom-Komplexe können weiter einen Liganden einschließen, der an distale Enden der hydrophilen Polymer-Ketten gebunden ist, und zwar für ein Liganden spezifisches Binden an ein Rezeptor-Molkül an einer Zielzell-Oberfläche. Beispielsweise und in einer bevorzugten Ausführungsform ist das hydrophile Polymer Polyethylenglycol.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung von Plasmid-Liposom-Komplexen bereit, das die Schritte umfasst, dass man
    als kondensierendes Mittel zum Kondensieren der Plasmid-Moleküle ein Polykation auswählt, das gewählt ist aus Histonen, Poly-1-Glutamin, Protamin, Melittin oder Polymyxin B;
    als Medium zum Suspendieren der kondensierten Plasmid-Moleküle, ein wässriges Medium wählt, das einen nicht als Elektrolyt vorliegenden gelösten Stoff enthält, wobei das Medium eine Ionenstärke aufweist, die geringer ist als die Ionenstärke einer 10 mM Lösung, die ein einwertiges ionisierbares Salz enthält;
    ein Verhältnis von Liposom-Lipid zu Plasmid größer als 5 nMol Liposom-Lipid/μg Plasmid und weniger als 25 nMol Lipo som-Lipid/μg Plasmid wählt, worin die Plasmid-Liposom-Komplexe eine homogene Größe von weniger 200 nm aufweisen;
    die Plasmid-Moleküle kondensiert; und
    die kondensierten Plasmide mit einer Suspension von kationischen Liposomen mischt, die ein kationisches, Vesikel-bildendes Lipid mit einer Diacyl-Kette, Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDAB), N-[1-(2,3-Ditetradecyloxy-)propyl-]N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid (DMRIE), N-[1-(2,3-Dioleyloxy-)propyl-]N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium-bromid (DORIE) oder N-[1-(2,3-Dioleyloxy-)propyl-]N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) umfasst, und so die Plasmid-Liposom-Komplexe bildet.
  • Die Plasmid-Liposom-Komplexe gemäß der Erfindung können verwendet werden zum Transfektieren einer Wirts-Zelle mit einem in einem DNS-Plasmid enthaltenen Gen, wobei das DNS-Plasmid ein Gen enthält, das gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Genen, die für Faktor VIII, Interleukin-2 oder p53 kodieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Plasmid-Liposom-Komplex zur Verwendung beim Transfektieren einer Wirts-Zelle in der Lunge eines Subjekts bzw. Patienten mit einem DNS-Plasmid, das den Regulator der Transmembran-Leitfähigkeit bei zystischer Fibrose enthält, oder für Lungen-Karzinome, Zytokine wie beispielsweise Interleukin-2 oder Tumor-Suppressor-Gene wie beispielsweise p53.
  • Diese und andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung werden noch vollständiger offenbar, wenn die folgende detaillierte Beschreibung der Erfindung im Zusammenhang mit den beigefügten Figuren gelesen wird.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 ist ein Computer-erzeugtes Bild einer Elektronen-Mikro-Photographie eines Plasmids, das mit dem polykationischen Polymer Gesamt-Histon kondensiert ist.
  • 2 ist ein Computer-erzeugtes Bild einer Elektronen-Mikro-Photographie eines Polykation-kondensierten Plasmids, das mit kationischen Liposomen in Übereinstimmung mit der Erfindung komplexiert ist.
  • 3A-3B sind Computer-erzeugte Bilder von kryogenen (3A) und Gefrier-Bruch- (3B) Transmissions-Elektronen-Mikrophotographien eines Polykation-kondensierten Plasmids, das mit kationischen Liposomen in Übereinstimmung mit der Erfindung komplexiert ist.
  • 4 ist ein Diagramm, das die Größe (in nm, gemessen durch dynamische Licht-Streuung) von Plasmid-Liposom-Komplexen zeigt, die in Übereinstimmung mit der Erfindung hergestellt wurden.
  • 5 ist ein Diagramm des Teilchendurchmessers (in nm, gemessen durch dynamische Licht-Streuung) als Funktion der Lagerzeit bei 4°C für Plasmid-Liposom-Komplexe gemäß der Erfindung.
  • 6 ist ein Diagramm von Prozentmenge an injizierter Dosis, als Funktion der Zeit nach intravenöser Injektion in Mäuse, von markierten Plasmid-Liposom-Komplexen gemäß der Erfindung.
  • 7A-7E zeigen eine Luciferase-Expression (in relativen Licht-Einheiten; relativ light units; RLU)/10 s/mg Protein in der Lunge (7A) in der Leber (7B), im Herzen (7C), in der Milz (7D) und in der Niere (7E) für Plasmid-Liposom-Komplexe, die mit Gesamt-Histon hergestellt wurden.
  • 8A-8E zeigen eine Luciferase-Expression (in relativen Licht-Einheiten, RLU)/10 s/mg Protein in der Lunge (8A), in der Leber (8B), im Herzen (8C), in der Milz (8D) und in der Niere (8E) für Plasmid-Liposom-Komplexe, die mit Histon H1 hergestellt wurden.
  • 9A-9E zeigen eine Luciferase-Expression (in relativen Licht-Einheiten, RLU)/10 s/mg Protein in der Lunge (9A), in der Leber (9B), im Herzen (9C), in der Milz (9D) und in der Niere (9E) für Plasmid-Liposom-Komplexe, die mit Histon H4 hergestellt wurden.
  • 10A-10E zeigen eine Luciferase-Expression (in pg Luciferase/mg Protein) in der Lunge (10A), in der Leber (10B), im Herzen (10C), in der Milz (10D) und in der Niere (10E) für Plasmid-Liposom-Komplexe, die mit Poly-1-glutamin, Melittin oder Polymyxin B als kationische Kondensierungsmittel hergestellt wurden.
  • 11A-11B zeigen eine Luciferase-Expression in der Lunge (11A) und in der Leber (11B) als Funktion der Zeit (in Tagen) für Plasmid-Liposom-Komplexe, die bei 4°C gelagert wurden.
  • 12 zeigt Luciferase in verschiedenen Geweben (in pg/mg Protein) zum Zeitpunkt von 24 h nach intravenöser Verabreichung in Mäusen) von Plasmid-Liposom-Komplexen als Funktion der Mikrogramme von Luciferase tragendem Plasmid.
  • 13 zeigt eine Luciferase-Aktivität (in RLU/mg Protein) in verschiedenen Geweben 24 Stunden nach intravenöser Verabreichung von Plasmid-Liposom-Komplexen.
  • 14A-14B zeigen die Prozentzahl an überlebenden Tieren als Funktion von Tagen nach Inokulieren mit Lewis-Lungen-Metastase bei Tieren, die mit Plasmid-Liposom-Komplexen behandelt wurden, einschließlich der Plasmide pHSVtk (14A), pCMVp53 (14B) und pCMVIL2 (14C).
  • 15 ist eine Graphik, die das Körpergewicht (in Gramm) von Mäusen im Anschluss an eine Verabreichung von Plasmid-Liposom-Komplexen zeigt, die mit einem pNSL-Plasmid hergestellt wurden, das für Luciferase kodiert als Funktion der Zeit (in Tagen). Die Mäuse wurden an den Tagen 1, 8, 15, 22 und 28 behandelt, wie durch die Zeile in der Graphik angezeigt ist, und zwar mit Kochsalzlösung (Plus-Symbole) und Plasmid-Liposom-Komplexen bei Dosierungen von 50 μg Plasmid (offene Kreise), 75 μg Plasmid (geschlossene Dreiecke) und 100 μg Plasmid (offene, umgekehrte Dreiecke).
  • 16 ist eine Graphik, die eine Luciferase-Expression (in ng/mg Protein) in verschiedenen Mäuse-Geweben 24 h nach Verabreichung von Plasmid-Liposom-Komplexen an Tumor tragenden Mäusen zeigt, die mit pNSL-Plasmid hergestellt wurden, das für Luciferase kodiert (Metastasen-Modell von Lewis-Lungen-Tumoren).
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • I. Plasmid-Liposom-Komplex
  • Die vorliegende Erfindung ist gerichtet auf einen Plasmid-Liposom-Komplex und auf eine Verbesserung eines Verfahrens zur Herstellung eines solchen Komplexes zur Verwendung bei einer in vivo Transfektion einer Wirts-Zelle. Die Zusammensetzung schließt Plasmid-Moleküle ein, die mit einem polykationischen kondensierenden Mittel kondensiert sind und dann in einem Medium mit niedriger Ionenstärke suspendiert sind. Die kondensierten Plasmid-Moleküle werden mit Lipid-Teilchen wie beispielsweise Liposomen gemischt und bilden so Plasmid-Liposom-Komplexe. Die Verbesserung in dem Herstellungsverfahren – wie beschrieben wird – bezieht sich auf eine Auswahl des kondensierenden Mittels, eine Auswahl des suspendierenden Mediums und eine Auswahl des Verhältnisses Liposom-Lipid zu Plasmid. Vor Beschreiben des verbesserten Herstellungsverfahrens im Einzelnen wird der Plasmid-Liposom-Komplex und seine Komponenten beschrieben.
  • A. Kationische Liposomen-Komponenten und deren Herstellung
  • Wie oben beschrieben, schließt der Plasmid-Liposom-Komplex kondensierte Plasmid-Moleküle und Liposome ein. Der Begriff „Liposome" wie er in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf Lipid-Vesikel mit einer äußeren Lipid-Schale, typischerweise gebildet aus einer oder mehreren Lipid-Doppelschichten, die ein wässriges Inneres einkapseln. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Liposome kationische Liposome, die aus zwischen etwa 20 und 80 Mol-% eines kationischen, Vesikel-bildenden Lipids aufgebaut sind, wobei der Rest neutrale Vesikel bildende Lipide oder andere Komponenten sind. Der Begriff „Vesikel-bildendes Lipid", wie er in der vor liegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen verwendet wird, bezieht sich auf irgendein amphipathisches Lipid, das hydrophobe und polare Kopf-Gruppen-Einheiten aufweist und das aus sich selbst heraus spontan Doppelschicht-Vesikel in Wasser bilden kann, wofür Phospholipide ein Beispiel sind. Ein bevorzugtes, Vesikel-bildendes Lipid ist ein Diacyl-Ketten-Lipid wie beispielsweise ein Phospholipid, dessen Acyl-Ketten typischerweise eine Länge zwischen etwa 14 bis 22 Kohlenstoff-Atomen aufweisen und die unterschiedliche Grade von Unsättigung haben.
  • Ein kationisches, Vesikel-bildendes Lipid ist eines, dessen polare Kopf-Gruppe mit einer netto positiven Ladung versehen ist, und zwar bei einem Arbeits-pH-Wert, z. B. bei einem pH-Wert von 4 bis 9. Typische Beispiele schließen ein: Phospholipide, wie beispielsweise Phosphatidylethanolamin, dessen polare Kopf-Gruppen mit einer positiven Einheit derivatisiert sind, z. B. Lysin, wie veranschaulicht beispielsweise für das Lipid DOPE, das mit L-Lysin derivatisiert ist (LYS-DOPE) (Guo et al., 1993). Auch eingeschlossen in diese Klasse sind Glycolipide wie beispielsweise Cerebroside und Ganglioside, die eine kationische polare Kopf-Gruppe aufweisen.
  • Ein anderes kationisches Vesikel-bildendes Lipid, das verwendet werden kann, ist Cholesterinamin und vergleichbare kationische Sterole. Beispielhafte kationische Lipide schließen ein: 1,2-Dioleyloxy-3-(trimethylamino-)propan (DOTAP); N-[1-(2,3,-Ditetradecyloxy-)propyl-]N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid (DMRIE); N-[1-(2,3,-Dioleyloxy-)propyl]N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid (DORIE); N-[1-(2,3-Dioleyloxy-) propyl-]N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) und Dimethyloctadecylammoniumbromid (DDAB).
  • Der Rest der Liposome ist gebildet aus neutralen, Vesikel-bildenden Lipiden, was Vesikel bedeutet, die Lipide bilden, die keine Netto-Ladung aufweisen oder die eine kleine Prozentmenge an Lipiden mit einer negativen Ladung in der polaren Kopf-Gruppe einschließen können. Eingeschlossen in diese Klasse von Lipiden sind Phospholipide wie beispielsweise von Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylinositol (PI) und Sphingomyelin (SM) sowie Cholesterin, Cholesterin-Derivate und andere ungeladene Sterole.
  • Die oben beschriebenen Lipide können im Handel erhalten werden oder können nach veröffentlichten Verfahrensweisen hergestellt werden. Andere Lipide, die in die Erfindung eingeschlossen werden können, sind Glycolipide, wie beispielsweise Cerebroside und Ganglioside.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung schließt der Plasmid-Liposom-Komplex Liposome ein, die eine Oberflächen-Beschichtung aus hydrophilen Polymer-Ketten aufweisen, die wirksam sind, um die Blut-Zirkulations-Zeit von Plasmid-Liposom-Komplexen auszudehnen. Geeignete hydrophile Polymere schließen ein: Polyethylenglycol (PEG), Polymilchsäure, Polyglycolsäure, Polyvinylpyrrolidon, Polymethyloxazolin, Polyethyl-oxazolin, Polyhydroxypropylmethacrylamid, Polymethacrylamid, Polydimethylacryl-amid und derivatisierte Cellulosen wie beispielsweise Hydroxymethylcellulose oder Hydroxyethylcellulose. Eine bevorzugte hydrophile Polymer-Kette ist Polyethylenglycol (PEG), vorzugsweise als PEG-Kette mit einem Molekulargewicht zwischen 500 bis 10.000 D (Dalton), noch mehr bevorzugt zwischen 1.000 bis 5.000 D. Das hydrophile Polymer kann eine Löslichkeit in Wasser und in einem nicht-wässrigen Lösungsmittel wie beispielsweise Chloroform aufweisen.
  • Der Überzug wird vorzugsweise hergestellt durch Einschließen von zwischen 1 und 20 Mol-% eines Vesikel-bildenden Lipids, vorzugsweise eines Phospholipids oder eines anderen Lipids mit einer Diacyl-Kette, das an seiner Kopf-Gruppe mit der Polymer-Kette derivatisiert ist, in die Vesikel-bildenden Lipide, die die Liposome bilden. Beispielhafte Verfahrensweisen zur Herstellung solcher Lipide und zum Bilden von Polymer-überzogenen Liposomen damit wurden beschrieben in den US-Patenten Nrn. 5,013,556 und 5,395,619 .
  • Es wird erkannt, dass das hydrophile Polymer stabil an das Lipid gebunden werden kann oder über eine instabile Bindung gebunden werden kann, die es ermöglicht, dass die Polymer-beschichteten Plasmid-Liposom-Komplexe den hydrophilen Polymer-Überzug abgeben oder „freisetzen", und zwar während des Umlaufens im Blutstrom oder nach Lokalisierung an einer Ziel-Stelle. Ein Binden hydrophiler Polymere, insbesondere Polyethylenglycol (PEG), an Vesikel-bildende Lipide über eine Bindung, die wirksam dahingehend ist, die Polymer-Ketten in Response auf einen Stimulus freizusetzen, wurden beispielsweise beschrieben in den Druckschriften WO 98/16202 und WO 98/16201 sowie durch D. Kirpotin et al. (FEBS-Letters 388: 115-118 (1996)).
  • Die lösbare Bindung ist in einer Ausführungsform eine chemisch lösbare Bindung, die durch Verabreichung eines geeigneten Freisetzungsmittels gespalten wird, oder die unter selektiven physiologischen Bedingungen gespalten wird, wie beispielsweise in Gegenwart von Enzymen oder reduzierenden Mitteln. Beispielsweise werden Ester- und Peptid-Bindungen gespalten durch Esterase- oder Peptidase-Enzyme. Disulfid-Bindungen werden gespalten durch Verabreichen eines reduzierenden Mittels wie beispielsweise Glutathion oder Ascorbat oder durch ein in vivo vorhandenes reduzierendes Mittel wie beispielsweise Cystein, das im Plasma und intrazellulär zugegen ist.
  • Andere lösbare Bindungen schließen pH-Wert-empfindliche Bindungen und Bindungen ein, die bei Kontakt mit Glucose, Licht oder Wärme gespalten werden. Beispielsweise können die hydrophilen Polymer-Ketten an das Liposom durch eine pH-Wert-empfindliche Bindung gebunden werden, und die Plasmid-Liposom-Komplexe werden zielmäßig gerichtet auf eine Stelle, die einen pH-Wert aufweist, der wirksam dahingehend ist, die Bindung zu spalten und die hydrophilen Ketten freizugeben, wie beispielsweise ein Tumor-Bereich. Beispielhafte, pH-Wert-empfindliche Bindungen schließen Acyloxyalkylether-, Acetal- und Ketal-Bindungen ein. Ein weiteres Beispiel ist eines, bei dem die spaltbare Bindung eine Disulfid-Bindung ist, an der es im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen breit beabsichtigt ist, dass sie sich bezieht auf Schwefel enthaltende Bindungen. Schwefel enthaltende Bindungen können synthetisiert werden, um einen gewählten Grad von Labilität zu erreichen, und schließen Disulfid-Bindungen, gemischte Sulfid-Sulfon-Bindungen und Sulfid-Sulfoxid-Bindungen ein. Von den drei Bindungen ist die Disulfid-Bindung am wenigsten empfänglich für eine Thiolyse, und die Sulfid-Sulfoxid-Bindung ist am meisten empfänglich.
  • Derartige trennbare Bindungen sind nützlich, um die Rate an Freisetzung des hydrophilen Polymer-Segments von den Plasmid-Liposom-Komplexen maßgeschneidert anzulegen. Beispielsweise kann eine sehr labile Disulfid-Bindung verwendet werden zum zielmäßigen Ausrichten auf Blut-Zellen oder Endothelial-Zellen, da diese Zellen leicht zugänglich sind und eine kürzere Blut-Kreislauf-Lebensdauer der Liposome ausreichend ist. Auf der extremen anderen Seite kann eine lange haltende oder stabile Disulfid-Bindung verwendet werden, wenn das Ziel Tumor-Gewebe oder andere Organe sind, bei denen eine längere Blutkreislauf-Lebensdauer der Liposome allgemein dafür benötigt wird, dass die Komplexe das gewünschte Target bzw. Ziel erreichen.
  • Die lösbare Bindung, die die hydrophilen Polymer-Ketten an dem Liposom bindet, wird in vivo typischerweise gespalten als Ergebnis einer Änderung der Umgebung, wie beispielsweise dann, wenn die Liposome eine spezielle Stelle mit einem leicht niedrigeren pH-Wert erreichen, wie beispielsweise einen Bereich von Tumor-Gewebe, oder eine Stelle mit reduzierenden Bedingungen erreichen, wie beispielsweise einen hypoxischen Tumor. Reduzierende Bedingungen in vivo können auch bewirkt werden durch Verabreichen eines reduzierenden Mittels wie beispielsweise Ascorbat, Cystein oder Glutathion. Die spaltbare Bindung kann auch gebrochen werden in Response auf externe Stimuli, wie beispielsweise Licht oder Wärme.
  • In einer anderen Ausführungsform schließen die Plasmid-Liposom-Komplexe eine Affinitäts-Einheit oder einen zielrichtenden Liganden ein, die/der wirksam ist, um spezifisch an Ziel-Zellen zu binden, auf die die Therapie angelegt ist. Solche Einheiten können an die Oberfläche des Liposoms oder an die distalen Enden von hydrophilen Polymer-Ketten gebunden werden. Beispielhafte Einheiten schließen ein: Antikörper, Liganden für ein spezifisches Binden an Zielzellen-Oberflächen-Rezeptoren und dergleichen, wie beispielsweise beschrieben in den PCT-Anmeldungen Nrn. WO US94/03103 , WO 98/16202 und WO 98/16201 . Die Einheit kann auch ein hydrophobes Segment sein, um eine Fusion des Komplexes mit einer Ziel-Zelle zu erleichtern.
  • B. Kondensiertes Plasmid
  • Dieser Abschnitt beschreibt die Herstellung des Plasmids in der kondensierten Phase, das in dem Plasmid-Liposomen-Komplex der Erfindung verwendet wird.
  • Polykationische kondensierende Mittel, die zum Kondensieren des Plasmids verwendet werden, sind vielfach geladene kationische Polymere, typischerweise Biopolymere wie beispielsweise Spermidin, Spermin, Polylysin, Protamin, Gesamt-Histon, spezielle Histon-Fraktionen wie beispielsweise H1, H2, H3, H4 und andere polykationische Polypeptide, können jedoch auch biokompatible Polymere einschließen, wie beispielsweise Polymyxin B. Es wird erkannt, dass diese polykationischen kondensierenden Mittel verwendet werden können in Form der freien Base oder in Form des Salzes, beispielsweise Protaminsulfat und Polylysinhydrobromid. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das polykationische kondensierende Mittel ein Histon, welches – wie in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen in Bezug genommen wird – Gesamt-Histon oder spezielle Histon-Fraktionen einschließt.
  • Plasmide, die zur Verwendung in dem Komplex geeignet sind, sind vorzugsweise zirkularisierte oder geschlossene, dop pelsträngige Moleküle, die Größen aufweisen, die vorzugsweise im Bereich von 5 bis 40 kbp (Kilo-Basenpaare) liegen. Die Plasmide werden konstruiert entsprechend wohlbekannten Verfahrensweisen und schließen ein therapeutisches Gen, d. h. das Gen, das in einer Gen-Therapie exprimiert werden soll, unter der Kontrolle geeigneter Promoter- und Terminator-Steuer-Elemente sowie andere Elemente ein, die notwendig sind für eine Replikation innerhalb der Wirts-Zelle und/oder eine Integration in das Wirts-Zellen-Genom. Verfahrensweisen zur Herstellung von Plasmiden, die nützlich für eine Gen-Therapie in Genen oder anderen Säugern sind, sind weithin bekannt und in der Literatur in Bezug genommen.
  • Die Gene, die für eine Gen-Therapie durch den Komplex gemäß der Erfindung eingeführt werden sollen, fallen allgemein in eine von drei Kategorien:
    In der ersten Kategorie sind diejenigen Gene, von denen beabsichtigt ist, dass sie einen Gen-Mangel oder Gen-Defekt in dem Subjekt bzw. in dem Patienten überwinden, d. h. in den Fällen, in denen das Subjekt bzw. der Patient ein aktives, endogenes Protein überhaupt nicht oder nicht innerhalb normaler Konzentrations-Werte produzieren kann, und es beabsichtigt ist, dass das Gen, das in das Plasmid eingeführt ist, diesen Mangel kompensiert. Beispiele dieser Klasse von Genen schließen Gene ein, die kodieren für Adenosindeaminase (ADA), für eine Gen-Expression in Stammzellen oder Lymphozyten; Gene, die für einen Purin-Nucleosid-Phosphorylase-Mangel, einen Mangel an Prostaglandin G/H-Synthase kodieren; Gene für eine Therapie des Lesch-Nyhan-Syndroms, das durch einen Mangel an Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase verursacht wird; Gene, die für eine Vielfalt zirkulierender Proteine kodieren, wie beispielsweise α1-Antitrypsin, Gerinnungsfaktoren (z. B. Faktor VIII, Faktor IX) und Globine (z. B. β-Globin, Hämoglobin), für die Behandlung von Hämophilie, Sichelzell-Anämie und andere mit Blut in Verbindung stehende Krankheiten, und Gene, die für Hormone und andere Peptid-Regulatoren kodieren.
  • In der zweiten Klasse sind Polypeptide, die dafür ausgerichtet sind, irgendeine existierende Pathologie zu behandeln, wie beispielsweise Krebs, oder einen pathogenen Zustand, wie beispielsweise eine virale Infektion. Beispiele schließen eine Gen-Therapie zum Liefern des p53-Gens für eine Krebs-Therapie, des Gens für das CD4-Peptid zum Inhibieren einer HIV-Infektion, des Gens für das Pseudomonas-Peptid zum Inhibieren eines Bindens von Pseudomonas an epitheliale Zellen und spezifischer Antikörper-Gene zum Inhibieren eines im Ziel genommenen Pathogens ein.
  • Die dritte Klasse schließt Gene ein, von denen beabsichtigt ist, dass sie ein mRNS-Iranskript produzieren, das als Antisense-Molekül zum Inhibieren einer unerwünschten Protein-Expression wirken kann, wie beispielsweise eine Überexpression von Proteinen, wie sie für das Tumor-Wachstum spezifisch ist, oder eine Expression viraler Proteine.
  • II. Herstellung und Charakterisierung des Komplexes
  • In Übereinstimmung mit der Erfindung wurde entdeckt, dass ein Plasmid-Liposom-Komplex, gebildet wird durch Mischen von Plasmid in kondensierter Phase und kationischen Liposomen in einem wässrigen Medium, das einen keinen Elektrolyten darstellenden gelösten Stoff enthält, wobei das Medium eine Ionenstärke hat, die geringer ist als die Ionenstärke einer 10 mM Lösung, die ein einwertiges ionisierbares Salz enthält, Komplexe produziert, die eine im wesentlichen homogene Größe von typischerweise weniger als 200 nm und vorzugsweise eine Größe im Bereich von 50 bis 200 nm aufweisen, noch mehr bevorzugt zwischen 100 und 200 und am meisten bevorzugt zwischen 120 und 180 nm. Die Komplexe sind weiter gekennzeichnet durch eine Beibehaltung der Aktivität der Expression des kodierten Gens, d. h. die Komplexe haben eine Transfektions-Stabilität. Dies wird belegt durch das Vermögen der Komplexe nach Lagerung für 30 Tage und vorzugsweise für 90 Tage bei 4°C, Zellen zu transfektieren und eine Expression des kodierten Gens zu erreichen, wie nachfolgend diskutiert wird.
  • Das Plasmid in kondensierter Phase wird gebildet durch Zugabe eines polykationischen polymeren kondensierenden Mittels des oben identifizierten Typs zu dem Plasmid in einem wässrigen Medium, das einen keinen Elektrolyt darstellenden gelösten Stoff enthält, wobei das Medium eine Ionenstärke aufweist, die geringer als die Ionenstärke einer 10 mM Lösung, die ein einwertiges ionisierbares Salz enthält. Das kationische Polymer wird der Plasmid-Lösung zu einer bevorzugten Konzentration zugesetzt, bei der eine Ladungs-Stoichiometrie erreicht wird, d. h. bei der die Gesamtzahl von Ladungen in dem kationischen Polymer (bestimmt von der bekannten Ladungsdichte des Polymers/Gewichts) wenigstens so groß ist wie die gesamte negative Ladung der DNS (bestimmt aus der Gewichtsmenge Plasmid und der bekannten Ladungsdichte DNS/Gewicht). Typischerweise liegt das Gewichts-Verhältnis von zugesetztem DNS-Plasmid zu zugesetztem Polymer zwischen etwa 0,1 und 5,0, noch mehr bevorzugt zwischen 0,3 und 2,0. Das kondensierende Mittel wird vor zugsweise der Plasmid-Suspension langsam unter Rühren zugesetzt, z. B. über einen Zeitraum von 10 min.
  • Das kondensierte Plasmid und die kationischen Liposome, die beide in dem wässrigen Medium enthalten sind, werden dann gemischt, z. B. durch langsame Zugabe der kondensierten Plasmid-Moleküle zu den Liposomen. Das Verhältnis von Liposom-Lipiden zu Plasmid ist ein wichtiger Parameter zum Erreichen einer maximalen Transfektion. Das Verhältnis (in nMol Liposom-Lipid/μg Plasmid) ist größer ist als 5, jedoch geringer als 25, vorzugsweise größer als 8, jedoch geringer als 18, noch mehr bevorzugt größer als 10, jedoch weniger als 15 und liegt am meisten bevorzugt zwischen 12 und 14.
  • Wie oben angegeben, ist ein kritisches Merkmal der Erfindung das Mischen von Liposomen und Plasmid in kondensierter Phase in dem wässrigen Medium. Die End-Konzentration des Mediums, einschließlich Ionen, die in der DNS zugegen sind, kondensierendes Mittel und Liposomen-Lipid-Spezies, ist geringer als die Ionenstärke eines in einer Konzentration von 10 mM vorliegenden einwertigen ionisierbaren Salzes wie beispielsweise NaCl und ist vorzugsweise weniger als 1 mM. Allgemein wird eine niedrige Ionenstärke einfach erhalten durch Verwenden eines Plasmids in Form der freien Base oder der freien Säure, Polykationen und Lipid-Spezies, Entfernen von Elektrolyt-Komponenten oder alternativ Verwenden ausreichend verdünnter Konzentrationen der Komponenten unter Aufrechterhaltung einer geringen Ionenstärke und/oder Entfernen von Elektrolyten, die aus den Komponenten gebildet werden, durch Dialyse oder dergleichen. Die Zusammensetzung wird hergestellt in Gegenwart eines gelösten Stoffes, der kein Elektrolyt ist, wie beispielsweise Glycose, unter Be reitstellen eines osmotischen Gleichgewichts als injizierbare Formulierung.
  • 1 ist ein durch einen Computer erzeugtes Bild einer Negativ-Farben-Transmissions-Elektronen-Mikrophotographie eines für Luciferase kodierenden pNSL-Plasmids, das mit Gesamt-Histon kondensiert ist, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben. Wie ersichtlich, wird das Plasmid in getrennte, einzelne Teilchen einer Größe von etwa 100 nm und weniger kondensiert.
  • 2 ist ein durch Computer erzeugtes Bild einer Negativ-Farben-Transmissions-Elektronen-Mikrophotographie eines mit einem Polykation kondensierten Plasmid-Liposom-Komplexes, der hergestellt wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben ist. Beim Vergleichen der isolierten, kondensierten Plasmid-Moleküle in 1 mit dem Komplex von 2 sind die opaken, kondensierten Plasmide leicht in 2 ersichtlich. Auch sichtbar in 2 ist eine transparente Membran, die jedes kondensierte Plasmid umgibt. Diese transparente Membran ist die Liposom-Lipid-Doppelschicht, die jedes kondensierte Plasmid überzugsmäßig überzieht.
  • Die 3A bis 3B sind durch Computer erzeugte Bilder von kryo-Elektronen- und Gefrierbruch-Transmissions-Elektronen-Mikrophotographien des Plasmid-Liposom-Komplexes, der so hergestellt wurde, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Mikrophotographie in 3A wird erhalten durch Einfrieren einer dünnen Schicht einer Plasmid-Liposom-Komplex-Suspension und Anschauen der Schicht unter einem kryo-Elektronen-Mikroskop. Die Mikrophotographie zeigt einzelne diskrete Plasmid-Liposom-Komplexe, wobei die kondensierte DNS sichtbar ist als dunklerer Zentralbereich in vielen der Teilchen. Die Gefrier-Bruch-Mikrophotographie von 3B zeigt ebenfalls diskrete Plasmid-Liposom-Komplexe ohne sichtliche Aggregation.
  • Dynamische Licht-Streuung wurde zum Bestimmen der mittleren Komplex-Größe und Größen-Verteilung verwendet. Die Ergebnisse sind 4 gezeigt, zeigt dass die Komplexe, wie sie in Beispiel 1 hergestellt wurden, eine homogene Population mit einer mittleren Größe von etwa 146 nm (Standard-Abweichung: 45 nm) bilden. Diese und andere Untersuchungen, die zur Stützung der Erfindung durchgeführt wurden, zeigen an, dass die Zusammensetzung, wenn sie gemäß dem beschriebenen Verfahren hergestellt wird, Komplexe erreicht, die eine homogene Population haben, wie belegt wird durch einen einzigen Peak, der eine Population von Komplexen anzeigt, die eine relativ schmale Größen-Verteilung aufweisen.
  • Die Komplexe haben eine Größe von weniger als 200 nm, mehr bevorzugt zwischen 50 und 200 nm, am meisten bevorzugt zwischen 100 und 200 nm und noch mehr bevorzugt zwischen 120 und 180 nm.
  • Wie kurz oben diskutiert wurde, sind die Plasmid-Liposom-Komplexe stabil, d. h. die Komplexe behalten ihre anfängliche Größe bei, z. B. gibt es wenig Aggregation der Komplexe, und die Komplexe behalten ihre therapeutische Aktivität bei, und zwar für wenigstens 30 Tage nach Lagerung bei 4°C. 5 liefert einen Beleg der Komplex-Größen-Stabilität und zeigt die Komplex-Größe, gemessen durch dynamische LichtStreuung, als Funktion der Zeit. Eine Suspension der Plasmid-Liposom-Komplexe in Wasser/Glucose wurde bei 4°C gelagert und nach 7, 14, 21, 28, 60 und 90 Tagen Lagerung analysiert. Anfangs nach der Komplexbildung betrug die mittlere Komplex-Größe etwa 150 nm und – wie ersichtlich – nach 90 Tagen Lagerung blieb die Komplex-Größe bei etwa 150 nm. Die Komplex-Stabilität in Bezug auf die Beibehaltung der therapeutischen Aktivität wird unten in den 11A bis 11B diskutiert.
  • III. In-vivo-Transfektion
  • Plasmid-Liposom-Komplexe, die in Übereinstimmung mit der Erfindung hergestellt wurden, wurden an Mäuse verabreicht, um die Transfektions-Effizienz verschiedener Plasmid-Liposom-Komplex-Formulierungen zu bestimmen und die Stabilität einer Transfektion, die Bio-Verteilung des Komplexes, pharmakokinetische Daten und eine Dosis-Response zu bestimmen. Die beispielhafte in vivo-Transfektion-Verfahrensweise ist in Beispiel 2 beschrieben.
  • Die pharmakokinetischen Daten von Plasmid-Liposom-Komplexen wurden durch Injizieren von Komplexen, die ein mit 35S markiertes DNS-Plasmid einschließen, an Mäuse bestimmt. 6 zeigt den Prozentwert einer injizierten Dosis als Funktion der Zeit nach intravenöser Injektion. Unmittelbar nach Injektion des Plasmid-Liposom-Komplexes ist etwa 7% der injizierten Dosis im Blutstrom. Andere Studien haben bestimmt, dass die verbleibende Prozentmenge der Komplexe unmittelbar nach einer Injektion in der Lunge lokalisiert wird. Nach einer bestimmten Zeitdauer werden die Komplexe durch Serum-Proteine in der Lunge neutralisiert und treten in den Blutstrom ein, wie belegt wird durch den Anstieg der Prozentmenge der injizierten Dosis auf etwa 22% zum Zeitpunkt 5 h nach Injektion (6). Die Komplexe werden aus dem Blutstrom ausgeschieden, wobei etwa 12% der injizierten Dosis zum Zeitpunkt 24 h zugegen sind.
  • Plasmid-Liposom-Komplexe wurden hergestellt für eine in vivo Verabreichung bei unterschiedlichen Verhältnissen Liposom-Lipid zu Plasmid. Die Komplexe wurden hergestellt gemäß der allgemeinen Verfahrensweise, die in Beispiel 1 beschrieben ist, durch Variieren der Menge an in Form eines Polykations vorliegendem kondensierendem Mittel und der Gesamtmenge an Liposom-Lipiden. Typischerweise schwankte die Menge an in Form eines Polykations vorliegendem kondensierendem Mittel zwischen 100 und 500 μg, und das Verhältnis Liposom-Lipid/Plasmid schwankte zwischen 8 und 18 nMol Lipid/μg Plasmid.
  • Die 7 bis 9 zeigen die Ergebnisse für Plasmid-Liposom-Komplexe, die mit Gesamt-Histon hergestellt wurden (7A bis 7E), mit Histon H1 hergestellt wurden (8A bis 8E) und mit Histon H4 hergestellt wurden (9A bis 9E), jeweils als polykationische kondensierende Mittel. Nach Verabreichung des Komplexes, der aus den Formulierungen hergestellt wurde, die in den nachfolgenden Tabellen angegeben sind, wurde eine Luciferase-Expression in der Lunge, in der Leber, im Herz, in der Milz und in der Niere gemessen.
  • Tabelle 1 fasst summarisch die Zusammensetzungen für die Plasmid-Liposom-Komplexe zusammen, die hergestellt wurden unter Verwendung von Gesamt-Histon als polykationisches kondensierendes Mittel. Die Menge an Gesamt-Histon wurde geändert zwischen 100 und 500 μg, um das Verhältnis Plasmid/Gesamt-Histon im Bereich von 0,2 bis 1,0 schwanken zu lassen. Das Verhältnis an Liposom-Lipiden/Plasmid wurde ebenfalls variiert, und Verhältnisse von 8, 14 und 18 nMol Liposom-Lipide/μg Plasmid wurden getestet. Tabelle 1
    Komponente Formulierungs-Nummer1
    1 2 3 4 5 6
    pNSL Plasmid, μg 100 100 100 100 100 100
    Gesamt-Histon, μg 200 100 200 350 500 200
    μMol Liposom-Lipide2 0,8 1,4 1,4 1,4 1,4 1,8
    μg Plasmid/μg Gesamt-Histon 0,5 1,0 0,5 0,3 0,2 0,5
    nMol Lipide/μg Plasmid 8 14 14 14 14 18
    • 1In vivo-Ergebnisse für jede Formulierungs-Zahl, wie sie in den 7A-7E gezeigt sind.
    • 2Liposome, die hergestellt wurden aus DDAB:Cholesterin im Mol-Verhältnis 1:1.
  • Die Ergebnisse einer in vivo Verabreichung der in Tabelle 1 zusammengefassten Formulierungen an Mäuse sind in den 7A bis 7E gezeigt, wo eine Luciferase-Expression (in relativen Licht-Einheiten (relativ light units); RLU/10 s/mg Protein) gezeigt ist in der Lunge (7A), in der Leber (7B), im Herz (7C), in der Milz (7D) und in der Niere (7E). Die Figuren zeigen, dass es ein Fenster gibt, in dem die Transfektion am größten ist. Speziell ist für Gesamt-Histon als kondensierendes Mittel die Transfektion am höchsten, wenn das Verhältnis Liposom-Lipid-Plasmid größer ist als 8 nMol Lipid/μg Plasmid und kleiner als 18 nMol Lipid/μg.
  • Tabelle 2 fasst summarisch die Plasmid-Liposom-Komplex-Zusammensetzungen zusammen, die hergestellt und in vivo getestet wurden unter Verwendung von Histon H1 als polykationisches Kondensierungsmittel. Das Verhältnis von Plasmid/Histon H1 betrug 0,3 oder 0,5, und das Verhältnis Lio posom-Lipid/Plasmid wurde variiert von 8, 14 und 18 nMol Lipid/μg Plasmid. Tabelle 2
    Komponente Formulierungs-Nummer1
    7 8 9 10 11
    pNSL Plasmid, μg 100 100 100 100 100
    Histon H1, μg 350 200 350 200 350
    μMol Liposom-Lipide2 0,8 1,4 1,4 1,4 1,4
    μg Plasmid/μg Histon H1 0,3 0,5 0,3 0,5 0,3
    nMol Lipide/μg Plasmid 8 14 14 18 18
    • 1In vivo-Ergebnisse für jede Formulierungs-Zahl, wie sie in den 8A-8E gezeigt sind.
    • 2Liposome, die hergestellt wurden aus DDAB:Cholesterin im Mol-Verhältnis 1:1.
  • Die Ergebnisse einer in vivo Verabreichung der in Tabelle 2 zusammengefassten Formulierungen an Mäuse sind in den 8A bis 8E gezeigt, wo eine Luciferase-Expression (in relativen Licht-Einheiten (relativ light units; RLU/10 s/mg Protein) gezeigt ist in der Lunge (8A), in der Leber (8B), im Herz (8C), in der Milz (8D) und in der Niere (8E). Die Figuren zeigen, dass die beste Transfektion erreicht wird, bei Verhältnissen Liposom-Lipid-Plasmid von 14 und 18.
  • Tabellen 3A und 3B fassen summarisch die Formulierungen von Plasmid-Liposom-Komplexen zusammen, die unter Verwendung von Histon H4 als polykationisches Kondensierungsmittel gebildet wurde. Das Verhältnis von Plasmid/Histon H4 schwankte von 0,2, 0,3 oder 0,5, und das Verhältnis Liposom- Lipid/Plasmid wurde variiert von 8, 14 und 18 nMol Lipid/μg Plasmid. Tabelle 3A
    Komponente Formulierungs-Nummer1
    12 13 14 15
    pNSL Plasmid, μg 100 100 100 100
    Histon H4, μg 200 350 500 200
    μMol Liposom-Lipide2 0,8 0,8 0,8 1,4
    μg Plasmid/μg Histon H4 0,2 0,3 0,2 0,5
    nMol Lipide/μg Plasmid 8 8 8 14
    • 1In vivo-Ergebnisse für jede Formulierungs-Zahl, wie sie in den 9A-9E gezeigt sind.
    • 2Liposome, die hergestellt wurden aus DDAB:Cholesterin im Mol-Verhältnis 1:1.
    Tabelle 3B
    Komponente Formulierungs-Nummer1
    16 17 18 19 20
    pNSL Plasmid, μg 100 100 100 100 100
    Histon H4, μg 350 500 200 350 500
    μMol Liposom-Lipide2 1,4 1,4 1,8 1,8 1,8
    μg Plasmid/μg Histon H4 0,3 0,2 0,5 0,3 0,2
    nMol Lipide/μg Plasmid 14 14 18 18 18
    • 1In vivo-Ergebnisse für jede Formulierungs-Zahl, wie sie in den 9A-9E gezeigt sind.
    • 2Liposome, die hergestellt wurden aus DDAB:Cholesterin im Mol-Verhältnis 1:1.
  • Die Ergebnisse einer in vivo Verabreichung der in Tabellen 3A und 3B zusammengefassten Formulierungen an Mäuse sind in den 9A bis 9E gezeigt, wo eine Luciferase-Expression (in relativen Licht-Einheiten (relativ light units) RLU/10 s/mg Protein) gezeigt ist in der Lunge (9A), in der Leber (9B), im Herz (9C), in der Milz (9D) und in der Niere (9E). Es gibt ein Fenster, in dem die Transfektion am höchsten ist, von größer als 8 nMol Liposom-Lipid-Plasmid und weniger als 18 nMol Liposom-Lipid/μg Plasmid.
  • In anderen Experimenten, die zur Stützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, wurden Plasmid-Liposom-Komplexe hergestellt unter Verwendung von Poly-1-glutamin, Melittin (ein Peptid mit niedrigem Molekulargewicht, das 26 Aminosäuren enthält) oder Polymyxin B-Sulfat als polykationische kondensierende Mittel. Jedes dieser kondensierenden Mittel ist im Handel erhältlich von der Firma Sigma Chemical Co.. Die Komplexe wurden in Mäuse injiziert, wie dies in Beispiel 2 beschrieben ist, und eine in vivo Transfektion wurde gemessen durch Bestimmen der Luciferase-Expression.
  • Tabelle 4 fasst summarisch die Zusammensetzungen der Plasmid-Liposom-Komplexe zusammen, die hergestellt wurden unter Verwendung von Poly-1-glutamin, Melittin oder Polymyxin B als polykationische kondensierende Mittel. Die Menge an kondensierendem Mittel wurde verändert im Bereich von 50 bis 200 μg.
    Figure 00290001
  • Die Ergebnisse einer in vivo Verabreichung der in Tabelle 4 zusammengefassten Formulierungen an Mäuse sind in den 10A bis 10E gezeigt, wo eine Luciferase-Expression (in pg-Luciferase/mg Protein) gezeigt ist in der Lunge (10A), in der Leber (10B), im Herz (10C), in der Milz (10D) und in der Niere (10E). Das Verhältnis Lipid/Plasmid für jede der Formulierungen war konstant bei 14 nMol Lipid/μg Plasmid und fällt damit in die Mittel des bevorzugten Bereichs von 5 bis 25 nMol Liposom-Lipid/μg Plasmid.
  • Diese Untersuchungen unter Verwendung einer Vielzahl von polykationischen kondensierenden Mitteln, z. B. Gesamt-Histon, Histon H1, Histon H4, Poly-1-glutamin, Melittin und Polymyxin B, zeigen an, dass eine Transfektion erreicht wird, wenn das Verhältnis Liposom-Lipid-Plasmid (in nMol Lipid/μg Plasmid) größer ist als 5 und kleiner ist als etwa 25. Noch mehr bevorzugt liegt das Verhältnis zwischen 8 und 18, sogar noch mehr bevorzugt zwischen 10 und 15 und am meisten bevorzugt zwischen 12 und 14 nMol Liposom-Lipid/μg Plasmid.
  • Wie oben diskutiert, ist der Plasmid-Liposom-Komplex gemäß der vorliegenden Erfindung stabil, wie belegt wird durch eine geringe Änderung der Teilchengröße (siehe 5), und zwar für einen Zeitpunkt, der so lang ist wie 90 Tage, bei 4°C. Die Expressions-Stabilität des Komplexes wurde bestimmt durch Verabreichen von Plasmid-Liposom-Komplexen, die bei 4°C gelagert wurden, an Mäuse. Speziell wurde die Suspension von Plasmid-Liposom-Komplexen intravenös an Mäuse unmittelbar nach der Herstellung des Komplexes (Tag 0) und nach 7, 14, 21, 28, 30 und 90 Tagen nach einer Lagerung bei 4°C verabreicht. Im Anschluss an die detailliert in Beispiel 2 beschriebene Verfahrensweise wurde eine Lucife rase-Expression in der Lunge und in der Leber bestimmt, und die Ergebnisse sind in den 11A bis 11B gezeigt.
  • Wie aus den 11A bis 11B ersichtlich ist, bleiben die Luciferase-Expression in der Lunge (11A) und die Luciferase-Expression in der Leber (11B) konstant als Funktion der Lagerzeit der Komplexe. Es ist klar, dass der Komplex das Vermögen beibehält, das kodierte Gen für die 90 Tage dauernde Test-Periode zu exprimieren. Dementsprechend ist eine Ausführungsform der Erfindung, dass der Komplex gekennzeichnet ist durch das Vermögen, mehr als 50% der Expressions-Aktivität beizubehalten gemessen am Tag 0, für wenigstens 30 Tage, mehr bevorzugt für 90 Tage.
  • Eine Dosis-Response-Studie wurde durchgeführt unter Verwendung von Plasmid-Liposom-Komplexen, die so hergestellt worden waren, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Der Plasmid-Liposom-Komplex wurde intravenös an Mäuse in 5 Dosierungs-Konzentrationen von Plasmid verabreicht, nämlich 25, 50, 100, 150 und 200 μg. 24 Stunden nach der Verabreichung wurde die Luciferase-Expression in der Lunge, im Herzen, in der Leber, in der Niere und in der Milz gemessen, und die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Die gemessene Luciferase-Expression war proportional zu der verabreichten Dosis, und die höchste Expression fand in der Lunge statt.
  • Die systemische Luciferase-Expression 24 h im Anschluss an eine Verabreichung des Plasmid-Liposom-Komplexes an Mäuse ist in 13 gezeigt. Der Plasmid-Liposom-Komplex verteilt sich in weitem Umfang, wie belegt wird durch eine Luciferase-Expression im Knochenmark, in Lymphknoten und im Gehirn.
  • In einer weiteren Untersuchung, die zur Stützung der Erfindung durchgeführt wurde und detailliert in Beispiel 3 beschrieben ist, wurden Mäuse, die metastatische Lewis-Lungen-Tumore trugen, mit Plasmid-Liposom-Komplexen behandelt. Nach einer Tumor-Inokulation wurden die Mäuse nach einem von 8 Behandlungs-Plänen behandelt, die in Tabelle 5 in Beispiel 3 angegeben sind. Die Behandlungen schlossen die Verabreichung von Plasmid-Liposom-Komplexen, die unter Verwendung von Plasmiden hergestellt wurden, die Gene tragen, die für p53 (pCMVp53) und Interleukin 2 (pCMVIL2) kodieren, und eine Kombinations-Behandlung von Ganciclovir und Plasmid-Liposom-Komplexen ein, die mit pHSVtk-Plasmid hergestellt worden waren (Herpes-Simplex-Virus-Thymidin-Kinase-Plasmid). Eine Kontroll-Gruppe von Tieren erhielt Kochsalzlösung, und Vergleichs-Gruppen von Tieren erhielten Komplexe, die mit pNSL-Plasmid, das für Luciferase kodiert (Beispiel 1) oder Ganciclovir allein.
  • Die 14A bis 14C zeigen die Prozentzahl an überlebenden Tieren als Funktion von Tagen nach einer Tumor-Zellen-Inokulation. In allen 14A bis 14C sind die mit Kochsalzlösung behandelten Tiere diejenigen, die durch die geschlossenen Quadrate wiedergegeben werden. Wie ersichtlich, starben alle mit Kochsalzlösung behandelten Tiere spätestens 24 Tage nach einer Tumor-Inokulation. In 14A sind die Tiere gezeigt, die mit Komplexen behandelt wurden, die 50 μg (ausgefüllte umgekehrte Dreiecke) und 75 μg (offene Quadrate) pHSVtk-Plasmid und mit Ganciclovir behandelt wurden. Alle mit Ganciclovir allein behandelten Tiere (offene Kreise) starben bis zum Tag 37. Im Gegensatz dazu hielten sich die mit der Kombinations-Therapie aus Liposom-Plasmid-Komplexen und Ganciclovir behandelten Tiere besser, und 70% von denjenigen, die mit der höheren Plasmid-Dosis behandelt worden waren, überlebten die Studie.
  • 14B zeigt die Prozentzahl des Überlebens von Tieren, die mit Plasmid-Liposom-Komplexen behandelt wurden, einschließlich pCMVp53 (ausgefüllte umgekehrte Dreiecke) und pNSL (kodierend für Luciferase) (offene Kreise). Wie ersichtlich, überlebten 20% der Tiere, die mit Komplexen behandelt worden waren, die das Plasmid einschlossen, das für das p53-Gen kodiert, die Dauer der Studie, während die mit Kochsalzlösung behandelten Tiere (geschlossene Quadrate) und die Tiere, die mit dem pNSL-Plasmid behandelt worden waren, das für das Luciferase-Reporter-Gen kodiert, starben.
  • 14C zeigt die Ergebnisse für Tiere, die mit Komplexen behandelt worden waren, die das pCMVIL2-Plasmid einschlossen, verabreicht in einer Menge von 50 μg Plasmid-DNS (umgekehrte ausgefüllte Dreiecke) und 75 μg Plasmid-DNS (offene Quadrate). Wie ersichtlich, überlebten zwischen etwa 15 und 20% der Tiere das Ende der Behandlungs-Periode, während ohne Behandlung (Kochsalzlösung zur Kontrolle, ausgefüllte Quadrate) alle Tiere bis zum Tag 24 der Untersuchung starben. In ähnlicher Weise starben Tiere, die mit Komplexen behandelt wurden, die das für Luciferase kodierende pNSL-Plasmid einschlossen (offene Kreise), bis zum Tag 31.
  • Formulierung Nr. 34 von Tabelle 5 in Beispiel 3, nämlich der Plasmid-Liposom-Komplex mit dem pNSL-Luciferase-Kodierungs-Gen, wurde an Mäuse in Dosierungen von 50 μg Plasmid/0,7 μMol Lipid, 75 μg Plasmid/1,05 μMol Lipid und 100 μg Plasmid/1,4 μMol Lipid verabreicht, und das Körpergewicht der Mäuse wurde überwacht als Zeichen von Toxizität der Formulierung. Wie in 15 ersichtlich ist, hatten Mäuse, die an den Tagen 1, 8, 15, 22 und 28 (wie durch die Pfeile in dem Plot angezeigt) mit den Komplexen behandelt wurden, einen geringen Gewichtsverlust nach der ersten Dosis, erholten sich jedoch in Bezug auf irgendeinen Gewichtsverlust innerhalb von wenigen Tagen. Die Symbole in der Figur sind wie folgt: Mäuse, die mit Kochsalzlösung behandelt wurden (Plus-Symbole) und Mäuse, die mit Plasmid-Liposom-Komplexen in Dosierungen von 50 μg Plasmid (offene Kreise), 75 μg Plasmid (ausgefüllte Dreiecke) und 100 μg Plasmid (offene, umgekehrte Dreiecke) behandelt wurden.
  • In einer weiteren Untersuchung unter Anwendung des Lewis-Lungen-Tumor-Modells wurde der pNSL-Luciferase-Liposom-Plasmid-Komplex an Mäuse verabreicht, und eine Luciferase-Expression in verschiedenen Geweben wurde 24 h nach Verabreichung der Plasmid-Liposom-Komplexe untersucht. Wie aus 16 ersichtlich, wurde die höchste Luciferase-Expression in der Lunge und in den Tumoren beobachtet.
  • Aus dem Vorangehenden kann erkannt werden, wie verschiedene Merkmale und Aufgaben der vorliegenden Erfindung erreicht werden. Plasmid-Liposom-Komplexe, die in Übereinstimmung mit den Verfahren gemäß der Erfindung hergestellt werden, bilden eine im Wesentlichen homogene Population mit Größen mit weniger als etwa 200 nm, wie belegt wurde durch dynamische Licht-Streuung. Die Komplexe sind stabil für 90 Tage, wobei keine Aggregation von Komplexen stattfindet, wie belegt wird durch dynamische Licht-Streuung.
  • Wichtigerweise ist die Transfektions-Aktivität der Komplexe ebenfalls stabil, wobei die Komplexe mehr als 50% der Transfektions-Effizienz nach Lagerung für wenigstens 30 Tage bei 4°C beibehalten.
  • IV. Beispiele
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen Verfahrensweisen zur Herstellung, Charakterisierung und Verwendung der Plasmid-Liposom-Komplexe gemäß der vorliegenden Erfindung. Es ist in keiner Weise beabsichtigt, dass die Beispiele den Umfang der Erfindung beschränken.
  • Materialien und Verfahrensweisen
  • A. Lipide
  • Dimethyldioctadecylammonium (DDAB) wurde gekauft von der Firma Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL). Cholesterin mit einer Reinheit von mehr als 99% wurde erhalten von der Firma Nu-Chek (Elysian, MN).
  • B. Polykationische kondensierende Mittel
  • Gesamt-Histon, das aus einer Mischung von Histonen bestand, die H1, H2, H3 und H4 einschlossen, sowie Histon H1 und Histon H4, wurden erhalten von der Firma Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN). Poly-1-glutamin, Melittin und Polymyxin B-Sulfat wurden erhalten von der Firma Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO).
  • C. Verfahrensweisen: Dynamische Licht-Streuung
  • Messungen der Teilchengröße-Verteilung wurden erhalten aus dynamischer Licht-Streuung (dynamic light scattering; DLS) unter Verwendung eines Coulter N4MD-Instruments, betrieben nach den Anweisungen des Herstellers. Die Ergebnisse wurden ausgedrückt als mittlere Durchmesser (in nm) und Standard-Abweichung einer Gauss'schen Verteilung von Teilchen nach relativem Volumen.
  • Beispiel 1
  • Herstellung eines Plasmid-Liposom-Komplexes
  • A. Herstellung von pNSL-Plasmid
  • Ein pNSL-Plasmid, das für Luciferase kodiert, wurde aus zwei im Handel erhältlichen Plasmiden konstruiert, und zwar pGFP-N1-Plasmid (Firma Clontech, Palo Alto, CA) und PGL3-C (Firma Promega Corporation, Madison, WI).
  • Das PGL3-C-Plasmid wurde mit XbaI geschnitten und mit stumpfem Ende unter Verwendung des Klenow-Fragments von E. coli DNS-Polymerase verknüpft. Es wurde danach mit HindIII geschnitten, und das 1689 bp große Fragment, das das Luciferase-Gen trägt, wurde Gel-gereinigt. Das pGFP-N1-Plasmid wurde mit SmaI und HindIII geschnitten, und das 4,7 kb große Fragment, das von einem Agarose-Gel isoliert wurde, wurde mit dem Luciferase-Fragment verknüpft. JM109-E. coli-Zellen wurden transformiert, und 20 Kolonien wurden selektiert. Etwa die Hälfte von ihnen zeigte das Vorhandensein von Inserts. 8 Klone mit Inserts wurden mit NamHI und XhoI geschnitten, um weiter das Vorhandensein des Luciferase-Gens zu bestätigen; 7 von ihnen waren positiv.
  • B. Herstellung von kationischen Liposomen
  • Kationische Liposome wurden hergestellt nach Standard-Verfahrensweisen durch Lösen von 10 μMol DDAB und 10 μMol Cholesterin in einem organischen Lösungsmittel, das hauptsächlich CHCl3 enthielt. Die Lipide wurden dann zu einem dünnen Film durch Rotation unter verringertem Druck getrocknet. Der Lipid-Film wurde unter Zusatz von destilliertem Wasser hydratisiert und so eine Suspension von Liposomen mit einer Konzentration von 20 μMol/ml gebildet. Die Liposome wurden durch Ultraschall-Behandlung oder durch sequentielle Extrusion durch Nucleopore-Polycarbonat- Membranen mit Porengrößen von 0,4 μm, 0,2, μm, 0,1, μm und 0,05 μm unter Erhalt von Liposomen von weniger als etwa 200 nm Größe klassiert (Firma Nucleopore, Pleasanton, CA).
  • C. Herstellung eines kondensierten Plasmids
  • Das für Luciferase kodierende DNS-Plasmid pNSL, das wie oben beschrieben hergestellt worden war, wurde gemäß der folgenden Verfahrensweise kondensiert: 400 μl des Plasmids (1 mg/ml in destilliertem Wasser) wurde mit 310 μl destilliertem Wasser verdünnt und danach mit 90 μl 50%iger Glucose gemischt. 100 μl eines polykationischen kondensierenden Mittels (Gesamt-Histon, Histon H1, Histon H4, Poly-1-glutamin, Melittin oder Polymyxin B) von einer Vorratslösung von 1 mg/ml in destilliertem Wasser wurde der Plasmid-Lösung langsam unter Rühren zugesetzt. Die Mischung wurde 10 min lang gerührt.
  • D. Herstellung eines Komplexes
  • Plasmid-Liposom-Komplexe mit einem Verhältnis Liposom-Lipid/Plasmid von 14 nMol Lipid/μg Plasmid wurden hergestellt durch Verdünnen von 280 μl der Liposom-Suspension mit 350 μl destilliertem Wasser und anschließendes Zusetzen von 70 μl 50%iger Glucose. Die Suspension von kondensierten Plasmiden wurde der verdünnten kationischen Liposom-Suspension unter kontinuierlichem Rühren von 10 min zugesetzt.
  • Beispiel 2
  • In vivo-Transfektions-Verfahren
  • Eine in vivo-Transfektion mit den Plasmid-Liposom-Komplexen wurde durchgeführt mit BALB/c-Mäusen, die erhalten wurden von der Firma Simonsen (Gilroy, CA). Jede Plasmid-Liposom-Komplex-Formulierung wurde drei Mäusen über die Schwanzvene injiziert. Die Mäuse wurden 24 h nach der Injektion geschlachtet, und Gewebe (Lunge, Leber, Milz, Niere, Herz) wurden gewonnen im Anschluss an eine Perfusion mit heparinisierter Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) (4°C) unter Anästhesie.
  • Bei einer Temperatur zwischen 0 und 4°C wurden 0,75 ml Zell-Lyse-Reagenz (Firma Promega, Madison, WI) jedem Gewebe zugesetzt, und das Gewebe wurde 1 min bei 20.000 Upm homogenisiert. Die Überstands-Flüssigkeit wurde in ein Mikrozentrifugen-Röhrchen abgezogen und bei 10.000 g 5 min lang zentrifugiert. Die Überstands-Flüssigkeit wurde für Luciferase- und Protein-Assays gewonnen. 20 μl jeder Probe wurden unmittelbar mit einem Luminometer (100 μl Luciferin und ATP enthaltender Assay-Puffer, 10 s Messung) gemessen. Die relativen Licht-Einheiten wurden normalisiert durch die Menge an Protein in den Extrakten.
  • Beispiel 3
  • In vivo-Transfektion von Tumor tragenden Mäusen
  • A. Herstellung von Plasmid-Liposom-Komplexen
  • Plasmid-Liposom-Komplexe wurden hergestellt nach der Verfahrensweise von Beispiel 1 unter Verwendung der vorliegenden Plasmide: pNSL, kodierend für Luciferase, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 1, und pCMVp53, pCMVIL2 und pHSVtk (alle im Handel erhältlich).
  • B. Tumor-Inokulation
  • 80 B6C3-F1-Mäuse (männlich) wurden erhalten von der Firma Taconic Farms (German Town, NY), und man ließ sie sich 3 Tage vor dem Beginn des Experiments akklimatisieren. Die Tiere wurden in passenden isolierten Käfigen mit ad libidum bereitgestelltem sterilem Nagerfutter und angesäuertem Was ser bei einem Licht-Dunkel-Zyklus (12:12) untergebracht. Die Tiere wurden nach dem Zufallsprinzip in Behandlungs-Gruppen vor einer Inokulation von Tumoren auf der Basis der Körpergewichte eingeteilt. Die Tiere wurden vor der Inokulation von Tumoren in Behandlungs-Gruppen nach dem Zufalls-Prinzip eingeteilt.
  • Alle Tiere wurden täglich hinsichtlich des allgemeinen Wohlbefindens beobachtet. Die Tiere wurden vor einer Inokulation von Tumorzellen und zwei Wochen danach gewogen. Tiere, bei denen beobachtet wurde, dass sie einen Gewichtsverlust von 15% oder mehr, auf der Basis ihres Start-Gewichts, hatten, oder irgendwelche Tiere mit Stress-Symptomen wurden euthanatisiert und auf das Vorhandensein und die Größe von metastatischen Foci in der Lunge, in der Leber und in der Milz untersucht.
  • Tumore wurden inokuliert, indem man wachsende Lewis-Lungen-Tumore von anderen B6C3-F1-Mäusen durch sterile chirurgische Abnahme nach Euthanasie gewann. Die Tumore wurden mechanisch so fein wie möglich zerkleinert und kurz in einem Enzym-Mix von Collagenase, Protease und DNSase bei 37°C verdaut. Nach Verdauen und Waschen im Medium (RPMI + 15% FCS) wurden die Zellen mit einem Hemozytometer gezählt. Die Zellen wurden zentrifugiert und erneut in einem Medium in einer Konzentration von 106 Zellen pro ml (105 Zellen pro 0,1 ml Injektion) suspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden in einzelne Spritzen aufgezogen (0,1 ml, bei kontinuierlichem Mischen), und zwar für eine intravenöse Injektion in die Schwanzvene jedes Tieres.
  • C. Behandlung
  • Die Tiere wurden behandelt, und zwar beginnend drei Tage nach Inokulation mit Tumor-Zellen, mit einem von acht Behandlungs-Plänen, wie sie in Tabelle 5 angegeben sind. Die 10 Tiere jeder Gruppe wurden 5 Mal in ein-Wochen-Intervallen behandelt, mit Ausnahme dort, wo es für die Ganciclovir-Behandlungs-Gruppe Nr. 30 und für die Tiere angezeigt ist, die Ganciclovir als Teil einer Kombinations-Therapie erhielten (Gruppen Nummern 32, 33). Tabelle 5
    Formulierungs-Nr. Zusammensetzung
    301,2,3,4 Kochsalzlösung, 0,1 ml IV
    311 Ganciclovir, 100 μg/kg, i. p. zweimal täglich für 6 Tage für 5 Wochen
    321 Liposom/pHSVtk-Komplex, 50 μg DNS/Maus + Ganciclovir 100 μg/kg zweimal täglich für 6 Tage nach jeder Verabreichung des Plasmid-Liposom-Komplexes
    331 Liposom/pHSVtk-Komplex, 75 μg DNS/Maus + Ganciclovir 100 μg/kg zweimal täglich für 6 Tage nach jeder Verabreichung des Plasmid-Liposom-Komplexes
    342,3,4,5 Liposom-/pNSL (kodierend für Luciferase)-Komplex; verschiedene Dosen von 50, 75, 100 μg Plasmid
    352 Liposom-/pCMVp53-Komplex, 75 μg DNS/Maus
    363 Liposom-/pCMVIL2-Komplex, 50 μg DNS/Maus
    373 Liposom-/pCMVIL2-Komplex, 75 μg DNS/Maus
    • 1Daten präsentiert in 14A
    • 2Daten präsentiert in 14B
    • 3Daten präsentiert in 14C
    • 4Daten präsentiert in 15
    • 5Daten präsentiert in 16
  • 24 Stunden nach der letzten Behandlung wurden die überlebenden Tiere euthanatisiert für eine Gewinnung und Untersuchung von Gewebe und Tumor. Die Prozentzahl überlebender Tiere für jede Behandlungs-Gruppe ist in den 14A bis 14C gezeigt. Die Toxizität der Formulierung Nr. 34 ist in 15 gezeigt, und die Luciferase-Expression der Formulierung Nr. 34 ist in 16 gezeigt.

Claims (18)

  1. Komposition von Plasmid-Liposom-Komplexen zur Benutzung beim Transfizieren einer Wirtszelle mit einem in einem Plasmid enthaltenen Gen, umfassend: kondensierte Plasmid-Moleküle, diese Moleküle kondensiert mit einer polykationischen kondensierenden Reagenz und suspendiert in einem wässrigen Medium umfassend eine nicht-elektrolytische Substanz, dieses Medium umfasst eine ionische Stärke geringer als die ionische Stärke einer 10 mM Lösung eines monovalenten ionisierbaren Salzes, und kationische Liposome umfassend eine Diacylkette, kationisch bläschenformendes Lipid, Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDAB), N[1-(2,3,-ditetradecyloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid (DMRIE), N[1-(2,3,-dioleyloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid (DORIE), oder N[1-(2,3,-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA), worin diese Komplexe ein Verhältnis von Liposom-Lipid zu Plasmid größer als 5 nmol Liposom-Lipid/μg Plasmid haben und weniger als 25 nmol Liposom-Lipid/μg Plasmid und eine homogene Größe von weniger als 200 nm haben.
  2. Eine Komposition nach Anspruch 1, worin die kondensierten Plasmid-Moleküle DNA-Plasmid-Moleküle sind umfassend ein Gen selektiert aus Genen, welche den Regulator für transmembrane Leitfähigkeit bei zystischer Fibrose, Factor VIII, Interleukin-2 oder p53 kodieren.
  3. Eine Komposition nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin die kondensierende Reagenz ein Polykation ist selek tiert aus Histonproteinen, Poly-1-Glutaminen, Protaminen, Melittin und Polymyxin B.
  4. Eine Komposition nach Anspruch 3, worin die kondensierende Reagenz ein Histonprotein ist selektiert aus Totalhiston, Histon 1 und Histon 4.
  5. Eine Komposition nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Verhältnis von Liposom-Lipid zu Plasmid zwischen 8 und 18 nmol Liposom-Lipid/μg Plasmid liegt.
  6. Eine Komposition nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin diese gelöste Substanz selektiert wird aus Glukose, Saccharose und Dextran.
  7. Eine Komposition nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Diacylkette kationisch bläschenformendes Lipid 1,2-dioleyloxy-3-(trimethylamino)Propan (DOTAP) ist.
  8. Eine Komposition nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die kationischen Liposome weiter ein neutrales bläschenformendes Lipid umfassen.
  9. Eine Komposition nach Anspruch 8, worin die kationischen Liposome des Weiteren Cholesterin umfassen.
  10. Eine Komposition nach Anspruch 9, worin die kationischen Liposome von DDAB und Cholesterin erstellt werden.
  11. Eine Komposition nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die kationischen Liposome eine Oberflächenummatelung aus hydrophilen Polymerketten haben, indem ein bläschenformendes Lipid-Derivat mit solch einem hydrophilen Polymer umfasst wird.
  12. Eine Komposition nach Anspruch 11, worin mindestens ein Teil des hydrophilen Polymers an dem bläschenbildenden Lipid angeschlossen ist durch eine Bindung effektif, um die hydrophile Polymerketten freizusetzen, als Antwort auf eine bestehende oder eine induzierte physiologische Bedingung.
  13. Eine Komposition nach entweder Anspruch 11 oder 12, worin die Plasmid-Liposom-Komplexe des Weiteren einen Ligand umfassen, welcher am Distalende der hydrophilen Polymerkette angebracht ist, für Ligand-spezifische Bindungen zu einem Rezeptormolekül auf einer Zell-Zieloberfläche.
  14. Eine Komposition nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin das hydrophile Polymer Polyethylenglycol ist.
  15. Eine Komposition aus Plamid-Liposom-Komplexen nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung beim Tranfizieren einer Wirtszelle in die Lunge eines Subjekts mit einem DNS-Plasmid umfassend ein Gen selektiert aus Genen, welche den Regulator für transmembrane Leitfähigkeit bei zystischer Fibrose, Interleukin-2 und p53 kodieren.
  16. Eine Komposition aus Plasmid-Liposom-Komplexen nach einem der vorherigen Ansprüche zur Benutzung zum Tranfizieren einer Wirtszelle in einen Tumor in einem Subjekt mit einem DNS-Plasmid umfassend ein Gen selektiert aus Genen, welche für Interleukin-2 und p53 kodieren.
  17. Eine Methode zur Vorbereitung von Plasmid-Liposom-Komplexen umfassend die Schritte: – Selektieren als kondensierende Reagenz zum Kondenzieren der Plasmid-Moleküle, ein Polykation selektiert aus Histonen, Poly-1-Glutamin, Protamin, Melittin oder Polymxin B; – Selektieren eines Mediums, um diese kondensierten Plasmid-Moleküle zu suspendieren, ein wässriges Medium umfassend eine nicht-elektrolytische gelöste Substanz, dieses Medium umfasst eine ionische Stärke geringer als die ionische Stärke von einem 10 mM Solutior eines monovalenten ionisierbaren Salzes; – Selektieren eines Verhältnisses von Liposom-Lipid zu Plasmid größer als 5 nmol Liposom-Lipid/μg Plasmid und weniger als 25 nmole Liposom-Lipid/μg Plasmid; worin die Plasmid-Liposom-Komplexe eine Homogene Größe von weniger als 200 nm haben; – Kondensieren dies Plasmid-Moleküls; und Mischen des kondensierten Plasmids mit einer Suspension aus kationischen Liposomen umfassend eine Diacylkette kationisch bläschenbildendes Lipid, Dimethyldioctadecylammoniumbromid (DDAB), N[1-(2,3,-ditetradecyloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid (DMRIE), N[1-(2,3,-dioleyloxy)propyl]-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammoniumbromid (DORIE), or N[1-(2,3,-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA), um diese Plamid-Liposom-Komplexe zu formen.
  18. Eine Methode nach Anspruch 17, um einen Plamid-Liposom Komplex vorzubereiten nach einem der Ansprüche 1 bis 16.
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