DE69630691T2 - Liposomal p-Ethoxy Oligonucleotides - Google Patents
Liposomal p-Ethoxy Oligonucleotides Download PDFInfo
- Publication number
- DE69630691T2 DE69630691T2 DE69630691T DE69630691T DE69630691T2 DE 69630691 T2 DE69630691 T2 DE 69630691T2 DE 69630691 T DE69630691 T DE 69630691T DE 69630691 T DE69630691 T DE 69630691T DE 69630691 T2 DE69630691 T2 DE 69630691T2
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- oligos
- oligonucleotides
- liposomal
- antisense
- oligonucleotide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/312—Phosphonates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
- C12N2310/315—Phosphorothioates
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft liposomale Zusammensetzungen von bestimmten Antisense-p-Ethoxyoligonukleotiden. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen und Verfahren zur Verwendung solcher Zusammensetzungen in der Heiltherapie.
- Antisense-Oligonukleotide (Oligos), die komplementär zu spezifischen Regionen der Ziel-mRNA sind, hat man zur Hemmung der Expression endogener Gene eingesetzt. Wenn die Antisense-Oligonukleotide an die Ziel-mRNA binden, entsteht ein DNA-RNA-Hybrid. Diese Hybridbildung hemmt die Translation der mRNA und, infolgedessen, die Genexpression des Proteins. Ist das Protein für das Überleben der Zelle essentiell, kann die Hemmung seiner Expression zum Zelltod führen. Daher können Antisense-Oligonukleotide bei Therapien zur Bekämpfung von Krebs und Viren nützliche Werkzeuge sein.
- Wesentliche Schwierigkeiten, Antisense-Oligonukleotide zur Hemmung der Genexpression zu verwenden, sind ihre zelluläre Instabilität, ihre schlechte Aufnahme in die Zelle und ihre dürftige intrazelluläre Verteilung. Natürliche Phosphodiester sind gegenüber Hydrolyse durch Nukleasen nicht resistent; daher sind hohe Konzentrationen an Antisense-Oligonukleotiden nötig, um einen hemmenden Effekt beobachten zu können. Modifizierte Phosphodiester-Analoge wie Phosphorothioate hat man hergestellt, um das Problem der Hydrolyse durch Nukleasen zu beheben, aber sie bieten keine vollständig zufrieden stellende Lösung des Problems.
- Die zelluläre Aufnahme von Antisense-Oligonukleotiden ist gering. Zur Lösung dieses Problems hat man physikalische Verfahren wie Kalziumphosphat-Fällung, DEAE-Dextran-vermittelte Aufnahme oder Elektroporation eingesetzt, um die zelluläre Aufnahme der Oligonukleotide zu verbessern. Diese Verfahren sind schwierig zu reproduzieren und in vivo nicht anwendbar.
- Weitere modifizierte Phosphodiester-(PD)-Analoge, die hergestellt wurden, sind p-Ethoxy-(pE)-Oligos. Die Modifizierungen von pE-Oligos werden in dem Phosphatrückgrat vorgenommen, damit durch die Modifizierung die Bindung dieser Oligos an die Ziel-mRNA nicht beeinträchtigt ist. pE-Oligos werden hergestellt, indem eine Ethylgruppe an das nicht-verbrückte Sauerstoffatom des Phosphatrückgrats gehängt wird, wodurch diese Oligos ungeladen werden. Trotz ihrer Resistenz gegenüber Nukleasen ist die zelluläre Aufnahme und die intrazelluläre Verteilung von pE-Oligos nach wie vor gering, da diese Oligos nach Internalisierung in die Zelle innerhalb der endosomalen/lysosomalen Vakuolen verbleiben und ihr Zugang zur Ziel-mRNA somit unterbunden ist.
-
DE 41 10 085 offenbart Verfahren zur Herstellung von 2'-O-Alkyl-Oligoribonukleotide und deren Verwendung als Antisense-Oligonukleotide. - WO 95/03788 offenbart liposomale Methylphosphonatoligonukleotid-Zusammensetzungen, die bei der Behandlung von chronischer myeloider Leukämie nützlich sind.
- Akhtar et al., Nucleic Acids Research (1991) 19: 5551–5559, beschreibt die Wechselwirkung bestimmter Oligonukleotide, andere als p-Ethoxy-Oligonukleotide, mit Phospholipidmembranen und die Eigenschaften bestimmter Oligonukleotid-Analoge, solche Membranen zu durchdringen.
- Stein und Cheng, Science (1993) 261: 1004–1012, beschreiben die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden als therapeutische Mittel, im Detail werden Phosphodiester, Phosphorothioat und Methylphosphonat-Oligonukleotide diskutiert.
- WO 97/04787 offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein gegen menschliches raf gerichtetes Oligonukleotid, welches in sterisch stabilisierten Liposomen, bei denen ein Teil des Lipids ein Glykolipid, ein mit einem hydrophilen Polymer derivatisiertes Lipid oder ein Lipidpolymerkonjugat ist, eingeschlossen ist.
- Es besteht Bedarf an verbesserten Antisense-Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten und Bedarf an Verfahren zur Herstellung solcher verbesserter Zusammensetzungen.
- Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine liposomale Zusammensetzung von Antisense-Oligonukleotiden. Die Zusammensetzung umfasst (a) ein Liposom, das im Wesentlichen aus ungeladenen Phospholipiden besteht und im Wesentlichen frei von Cholesterin ist und (b) ein Antisense-Oligonukleotid, das in dem Liposom eingeschlossen ist und ein p-Ethoxyoligonukleotid ist. Die Phospholipide sind bevorzugt Phosphatidylcholine. Ein besonders bevorzugtes Phospholipid ist Dioleoylphosphatidylcholin. Wenn das Antisense-Oligonukleotid ein p-Ethoxyoligonukleotid ist, liegt das bevorzugte molare Verhältnis von Phospholipid zu Oligo zwischen 5 : 1 und 100 : 1.
- Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer liposomalen Zusammensetzung von Antisense-Oligonukleotiden. Das Verfahren umfasst die Schritte (a) Hydratisieren einer lyophilisierten Zusammensetzung, die im Wesentlichen aus ungeladenen Phospholipiden besteht und im Wesentlichen frei von Cholesterin ist und ein Antisense-Oligonukleotid, das ein p-Ethoxyoligonukleotid ist, wodurch sich eine wässrige Suspension bildet, die freie Oligonukleotide und Oligonukleotide einschließende Liposomen enthält; und (b) Trennen der freien Oligonukleotide von den Liposomen mittels Dialyse. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die wässrige Suspension vor der Dialyse mit Ultraschall behandelt.
- Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung stellen ein verbessertes Transportsystem für Antisense-Oligos, zum Beispiel für solche, die in der Therapie gegen Krebs verwendet werden, dar. Verglichen mit Zusammensetzungen aus dem Stand der Technik bewirken die liposomalen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung neben einer verringerten Hydrolyse der Oligos durch Nukleasen eine erhöhte zelluläre Aufnahme und einen erhöhten intrazellulären Transport der Antisense-Oligos. Wenn solche Zusammensetzungen zum Transport von Oligos, welche die Expression eines in Krebszellen aber nicht in normalen Zellen vorhandenen Gens hemmen, verwendet werden, sind die therapeutischen Ergebnisse besser. Krebsformen gäbe es zahlreiche, wobei Leukämie ein bedeutendes Beispiel darstellt.
- Verglichen mit liposomalen Zusammensetzungen aus dem Stand der Technik verstärken die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auch den Einbau von Oligos in die Liposomen.
-
1A und1B sind Photographien, welche die Aufnahme von (A) freien und (B) lioposomalen pE-Oligos durch ALL-1-Zellen zeigen. -
2A zeigt das Maß an Wachstumshemmung nach Inkubation von ALL-1- und HL60-Zellen mit liposomalen pE-Antisense-Oligos, die gegen den B1/A2-Bruchpunkt der Bcr-Abl mRNA gerichtet sind. -
2B zeigt das Maß an Wachstumshemmung nach Inkubation von ALL-1-Zellen mit liposomalen B1/A2 pE-Antisense-Oligos und liposomalen B2/A2 pE-Kontrolloligos. -
3A zeigt das Maß an Wachstumshemmung nach Inkubation von BV173- und HL60-Zellen mit liposomalen pE-Antisense-Oligos, die gegen den B2/A2-Bruchpunkt der Bcr-Abl mRNA gerichtet sind. -
3B zeigt das Maß an Wachstumshemmung nach Inkubation von BV173-Zellen mit liposomalen pE-Antisense-Oligos, die gegen den B2/A2-Bruchpunkt und mit Kontrolloligos, die gegen den B1/A2-Bruchpunkt gerichtet sind. -
4A zeigt das Maß an Wachstumshemmung nach Inkubation von K562- und HL60-Zellen mit liposomalen pE-Antisense-Oligos, die gegen den B3/A2-Bruchpunkt der Bcr-Abl mRNA gerichtet sind. -
4B zeigt das Maß an Wachstumshemmung nach Inkubation von K562-Zellen mit liposomalen pE-Antisense-Oligos, die gegen den B3/A2-Bruchpunkt und mit Kontrolloligos, die gegen den B1/A2-Bruchpunkt gerichtet sind. -
5 zeigt das Maß an Wachstumshemmung, wenn BV173-Zellen mit Tween 20-enthaltenden liposomalen pE-Oligos inkubiert wurden. - „Liposomen" bedeutet innerhalb des vorliegenden Patents Lipid-enthaltende Vesikel mit einer Lipid-Doppelschicht, sowie andere Lipid-Transportpartikel, welche Antisense-Oligonukleotide einschließen können. Die Liposomen können sich aus einem oder mehreren Phospholipiden zusammensetzen, sofern das Lipid-Material im Wesentlichen ungeladen ist. Es ist wichtig, dass die Zusammensetzung im Wesentlichen frei von anionischen und kationischen Phospholipiden und Cholesterol ist. Geeignete Phospholipide schließen Phosphatidylcholine und andere, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, ein. Die Liposomen können beispielsweise unilamellar, multilamellar oder mit einer undefinierten Lamellenstruktur versehen sein. Eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend die Liposomen enthält üblicherweise einen sterilen, pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff oder Lösungsmittel, wie zum Beispiel Wasser oder eine Salzlösung.
- „Einschließen," „Einkapseln," und „Einbauen" bedeuten innerhalb des vorliegenden Patents, dass das Oligo innerhalb mindestens eines Teils des inneren wässrigen Raums (einschließlich der interlamellaren Regionen der Doppelschicht) des Liposoms eingeschlossen ist.
- Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung eignet sich bevorzugt zur parenteralen Verabreichung, zum Beispiel durch intravenöse, intraarterielle, intramuskuläre, intralymphatische, intraperitoneale, subkutane, intrapleurale oder intrathekale Injektion oder kann ex vivo für Knochenmarksspülungen verwendet werden. Bevorzugte Dosierungen zwischen 5–25 mg/kg können erwogen werden. Die Verabreichung würde bevorzugt innerhalb eines Zeitplans bis zum Verschwinden oder Rückgang des Tumors wiederholt werden und kann in Verbindung mit anderen Therapieformen erfolgen. Die Herstellung und die Verwendung der vorliegenden Erfindung werden anhand der folgenden Beispiele näher verdeutlicht.
- BEISPIEL 1 (vergleichendes Beispiel)
- Materialien
- Phosphodiester und Phosphorothioat-Oligonukleotide wurden von Genta Incorporated bezogen. Phospholipide wurden von Avanti Polar Lipids bezogen.
- Oligonukleotid-Markierung
- Phosphodiester wurden bei 37°C für 8 Stunden mit [32Pγ]ATP am 5'-Ende mittels T4-Kinase markiert. Das markierte Oligonukleotid wurde mit Ethanol bei –20°C über Nacht gefällt. Nach dreimaligem Waschen mit 70% Ethanol wurden die Phosphodiester-Oligonukleotide zweimal durch einen Microcon-3-Filter gefiltert, um die markierten Oligonukleotide von freiem [32Pγ]ATP zu trennen.
- Mit 35S markierte Phosphorothioate wurden von Genta Incorporated bezogen.
- Herstellung liposomaler Phosphodiester
- In destilliertem Wasser gelöste Phosphodiester-Oligonukleotide wurden mit Phospholipiden in Anwesenheit von überschüssigem t-Butanol gemischt, so dass das Endvolumen an t-Butanol in der Mischung zwischen 80 und 90% betrug. Geringe Mengen an [3H]-Cholestanyl-Ether und [32P]-Phosphodiester wurden zu der Mischung als Lipid- bzw. Oligonukleotid-Marker hinzugefügt. Die Mischung wurde mittels Vortex gemischt und anschließend in einem Aceton-/Trockeneisbad eingefroren. Die gefrorene Mischung wurde lyophilisiert und mit HEPES-gepufferter Salzlösung (1 mM HEPES und 10 mM NaCl) über Nacht hydriert. Die Liposomen wurden zweimal für 10 min. in einem Bad-Ultraschallgerät mit Ultraschall behandelt.
- Herstellung liposomaler Phosphorothioate
- Liposomale Phosphorothioate wurden in ähnlicher Weise hergestellt wie liposomale Phosphodiester, mit der Ausnahme, dass Phosphorothioate, anstatt Phosphodiester verwendet wurden. Außerdem wurden [35S] Phosphorothioate anstatt [32P] Phosphodiester als Oligonukleotidmarker verwendet.
- Trennung freier von in Liposomen eingebauten Oligonukleotiden
- Die Abtrennung freier von in Liposomen eingebauten Phosphodiester oder Phosphorothioat-Oligonukleotiden erfolgte durch Dialysieren der Mischung gegen ein überschüssiges 2500-faches Volumen an RPMI-Medium bei Raumtemperatur über Nacht. Vor und nach der Dialyse wurden Aliquots der Präparation zur flüssigen Szintillationszählung entnommen, um den Einbau von Phosphodiester- oder Phosphorothioat-Oligonukleotide in die Liposomen zu bestimmen.
- Entwicklung von liposomalen Phosphodiestern
- Dioleoylphosphatidylcholin-(DOPC)-Lipide wurden für den Phosphodiester-(PD)-Einbau ausgewählt, weil diese Lipide neutral sind, während PD negativ geladen ist. Die Verwendung dieses Lipids reduziert möglicherweise elektrostatische Abstoßung (welche den Einbau mindern kann). Positiv geladene Lipide wurden nicht verwendet, da sie nichtspezifische, zelluläre Toxizität hervorrufen. Der Einbau von PD-Oligonukleotiden in Liposomen erfolgte zunächst durch die Einfrier-/Auftau-Methode und die Dehydrierungs-Rehydrierungs-Methode.
- (A) Einfrier-/Auftau- (EA) Methode.
- Zur Bildung eines Lipidfilms wurde das organische Lösungsmittel von den [3H]-markierten DOPC-Lipiden unter Stickstoffgas verdunstet. Nach Vakuumtrocknung wurde der Lipidfilm mit HEPES-gepufferter Salzlösung (1 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 8,0) hydriert und in einem Bad-Ultraschallgerät mit Ultraschall behandelt. Diese vorgeformten Liposomen wurden anschließend mit [32P]-markierten PD-Oligonukleotiden in einem molaren Verhältnis von 100 oder 1000 zu 1 gemischt. Die ganze Mischung wurde in einem Aceton/Trockeneisbad für 5–10 min. eingefroren und bei Raumtemperatur für 25–30 min. aufgetaut. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt, bevor die Probe auf eine Biogel A 0,5 M-Säule zur Trennung freier von liposomalen PD-Oligonukleotiden geladen wurde. Vor und nach der Einfrier-/Auftauprozedur wurden Aliquots entnommen und zur flüssigen Szintillationszählung gebracht, um den Einbau der Phosphodiester in Liposomen zu bestimmen.
- Der Einbau wurde bestimmt durch
- Ein Einbau fand nicht statt (Tabelle 1).
- (B) Dehydrierungs-Rehydrierungs- (DR)-Methode
- Zur Bildung eines Lipidfilms wurde das organische Lösungsmittel von den [3H]-markierten DOPC-Lipiden unter Stickstoffgas verdunstet. Nach Vakuumtrocknung wurde der Lipidfilm mit HEPES-gepufferter Salzlösung hydriert und in einem Bad-Ultraschallgerät mit Ultraschall behandelt. Diese vorgeformten Liposomen wurden anschließend in einem Aceton/Trockeneisbad eingefroren und lyophilisiert. Die getrockneten Lipide wurden anschließend mit destilliertem Wasser, das [32P]-Phosphodiesteroligonukleotide enthielt, rehydriert. Das molare Verhältnis zwischen DOPC zu PD betrug entweder 100/1 oder 1000/1. Zur Trennung freier PD-Oligonukleotide von liposomalen PD wurde die Mischung auf eine BioGel A 0,5 M-Säule geladen. Vor und nach Säulenbeladung wurden Aliquots entnommen und zur flüssigen Szintillationszählung gebracht. Der Einbau lag bei < 5% (Tabelle 1).
- Mit molaren Verhältnissen von DOPC zu PD von 500/1 und 5000/1 wurde ein Einbau von 0 bzw. 5,2% erzielt.
- Es wurde gefunden, dass durch die Zugabe von t-Butanol zur Mischung vor dem Einfrieren und Lyophilisieren der Einbau auf 11,9% gesteigert werden konnte. Darüber hinaus wurde durch Reduzierung des Volumens an destilliertem Wasser während des Rehydrierungsprozesses von 200 auf 50 μl 11,9% gegenüber 1,8% Einbau bei einem molaren Verhältnis von 1000/1 erzielt. Mit diesen verbesserten Bedingungen wurde der Effekt des molaren Verhältnisses auf den Einbau erneut gemessen (Tabelle 2).
- Vor dem Einfrieren in einem Aceton/Trockeneisbad und dem Lyophilisieren wurde in destilliertem Wasser gelöstes PD mit DOPC in Anwesenheit von überschüssigem t-Butanol gemischt, so dass das Endvolumen an t-Butanol in der Mischung 80–90% betrug. Damit konnte der Schritt der Herstellung vorgeformter Liposomen weggelassen werden. Mit diesem Verfahren wurde ein ähnliches Maß an Einbau (16,2%) bei einem molaren Verhältnis von 2000/1 erzielt.
- Die Methode zur Trennung von freiem PD von liposomalem PD wurde geändert, weil die Ausbeute von Lipiden und PD < 50% betrug. Zwei andere Trennungsmethoden wurden verwendet: Microcon-10-Filter und Dialyse (Tabelle 3).
- Wenn die liposomale Mischung vor dem Trennungsverfahren mittels Dialyse für 10 min. mit Ultraschall behandelt wurde, wurde ein ähnliches Maß an Einbau erzielt. Für den PD-Einbau wurde ein weiteres Lipid, Dimyristoylphosphatidylcholin, eingesetzt. Der Einbau betrug > 85%.
- Entwicklung liposomaler Phosphorothioate
- Ein ähnliches Einbauprotokoll wurde mit Phosphorothioaten (PT) angewendet, da PT und PD Strukturanaloga sind. Verschiedene molare Verhältnisse von DOPC zu PT wurden eingesetzt (Tabelle 4). Der Effekt der Ultraschallbehandlung auf die liposomale Mischung (vor der Dialyse) wurde ebenfalls untersucht.
- BEISPIEL 2
- Einbau von p-Ethoxyoligos in Liposomen
- pE-Oligos wurden von Oligos Therapeutics (Willsonville, OR) bezogen. Phospholipide wurden von Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL) bezogen.
- (a) Oligo-Markierung
- pE-Oligos wurden bei 37°C für 24 Stunden mit [32Pγ]ATP am 5'-Ende mittels T4-Polynukleotidkinase markiert und anschließend mit Ethanol bei –20°C über Nacht präzipitiert. Anschließend wurden sie mit 70% Ethanol dreimal gewaschen, um die markierten Oligos von freiem [32Pγ]ATP zu trennen.
- (b) Herstellung von Liposomen
- In destilliertem H2O gelöste pE-Oligos wurden mit Phospholipiden zu verschiedenen molaren Verhältnissen in Anwesenheit von überschüssigem t-Butanol gemischt, so dass das Endvolumen an t-Butanol in der Mischung mindestens 95% betrug. Geringe Mengen an [3H]Cholestanylether und [32P]pE wurden ebenfalls als Lipid- bzw. Oligomarker zu der Mischung hinzugefügt. Die Mischung wurde mittels Vortex gemischt, in Aceton/Trockeneisbad gefroren und anschließend lyophilisiert. Der lyophilisierte Ansatz wurde mit HEPES-gepufferter Salzlösung (1 mM HEPES und 10 mM NaCl) auf eine Endkonzentration des Oligos von 10–100 μM hydriert. Die liposomalen p-Ethoxyoligos wurden für 10–20 min. in einem Bad-Ultraschallgerät mit Ultraschall behandelt.
- (c) Trennung freier von in Liposomen eingebauten pE-Oligos
- Die Trennung freier von in Liposomen eingebauten pE-Oligos erfolgte durch Dialyse (Molekulargewichtausschluss = 12–14000) gegen einen 1000-fachen Überschuss an HEPES-gepufferter Salzlösung bei Raumtemperatur über Nacht. Vor und nach der Dialyse wurden Aliquots der liposomalen pE-Oligos entnommen, um den Einbau an pE-Oligos in die Liposomen im Szintillationszähler zu bestimmen.
- (d) Einbaueffizienz
- Das Lipid Phosphatidylcholin (PC) wurde für den Einbau von pE-Oligos gewählt, da sowohl PC als auch pE-Oligos neutrale Moleküle sind, so dass sie miteinander kompatibel sein sollten. Aus den verschiedenen PCs wurde Dioleoyl-PC (DOPC) ausgewählt, weil seine kettenschmelzende Phasenübergangstemperatur zwischen –15 bis –20°C liegt.
- Infolgedessen liegt DOPC bei Raumtemperatur in der flüssig-kristallinen Phase vor, welche ideal zum Herstellen von Liposomen ist.
- Zum Einbau von pE-Oligos in Liposomen wurden verschiedene Verhältnisse von pE-Oligos in Anwesenheit von überschüssigem t-Butanol mit DOPC gemischt. Geringe Mengen an radioaktiv markierten pE-Oligos und DOPC wurden zu der Mischung hinzugefügt. Die DOPC/pE-Oligo-Mischungen wurden in einem Trockeneis/Acetonbad vor dem Lyophilisieren eingefroren. Das lyophilisierte DOPC/pE-Oligo-Pulver wurde anschließend mit einer HEPES-gepufferten Salzlösung hydriert, so dass die Endkonzentration an Oligo 10 μM betrug. Die pE-Oligos waren erfolgreich in DOPC-Liposomen mit einer Effizienz zwischen 28 und 83% eingebaut (Tabelle 5). Die Einbaueffizienz war von den molaren Verhältnissen zwischen DOPC und den pE-Oligos abhängig: 10 > 100 > 5 > 1000 : 1.
- Transport der pE-Oligos zu leukämischen Zellen
- Nachdem eine hohe Einbaueffizienz (> 80%) der pE-Oligos in Liposomen erzielt werden konnte, testeten wir weiterhin, ob diese liposomalen pE-Oligos das Cytoplasma, in welchem sich die mRNA befindet, erreichen konnten. Wir bezogen ein 16-mer pE-Oligo, das am 5'-Ende mit Rhodamin markiert war, so dass wir die Lokalisierung der pE-Oligos mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar machen konnten.
- (a) Inkubation von pE-Oligos mit leukämischen Zellen
- Es wurden ALL-1-Zellen, welche menschliche akute lymphozytische Leukämiezellen darstellen, verwendet. Fünfzigtausend ALL-1-Zellen pro Vertiefung wurden in eine 24- well-Platte in 0,3 mL Medium ausplattiert. 2 Stunden nach Ausplattieren wurden Endkonzentrationen von 16 μM von liposomalen oder freien pE-Oligos, die mit Rhodamin konjugiert waren, zu den ALL-1-Zellen hinzugefügt. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die Zellen vor Betrachtung unter einem konfokalen Laser-Rastermikroskop dreimal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen. Siehe
1 (Aufnahme von (A) freiem oder (B) liposomalen pE-Oligos durch ALL-1-Zellen). - Unsere Ergebnisse zeigen, dass größere Mengen an pE-Oligos von ALL-1-Zellen aufgenommen worden waren, wenn diese in Liposomen eingebaut waren. Die Liposomen waren in der Lage, die pE-Oligos zum Cytoplasma zu transportieren.
- Wachstumshemmung von liposomalen pE-Oligos auf leukämische Zellen
- Wir testeten anschließend weiterhin, ob liposomale pE-Oligos spezifisch das Wachstum leukämischer Zellen hemmen können. Wir haben drei verschiedene Arten menschlicher leukämischer Zelllinien verwendet: ALL-1 (akute lymphocytische Leukämie), BV173 und K562 (beide sind chronische myelogene Leukämiezellen). Alle drei Zelllinien enthalten das rearrangierte Philadelphia-(Ph)-Chromosom, welches durch eine reziproke Translokation der Chromosomen 9 und 22 entsteht. Die Translokation resultiert in der Relokation des c-Abl-Protoonkogens vom Chromosom 9 auf das 3'-Ende der sogenannten „Bruchpunkt Cluster Region" (Bcr) des Chromosoms 22, wodurch ein hybrides Bcr-Abl-Gen entsteht. Die Bruchpunkte, an denen die Bcr- und die Abl-Gene fusionieren, sind in allen drei Zelllinien unterschiedlich. In ALL-1-Zellen ist der Bruchpunkt Bcr exon 1/Abl exon 2. In BV173-Zellen ist der Bruchpunkt Bcr exon 2/Abl exon 2. In K562-Zellen ist der Bruchpunkt Bcr exon 3/Abl exon 2. Alle diese Hybridgene produzieren ein neuartiges Bcr-Abl-Fusionsprotein, welches eine erhöhte Tyrosinkinase-Aktivität aufweist, die mit der Pathogenese von Leukämien in Verbindung gebracht wird. Infolgedessen könnte die Hemmung der Produktion des Bcr-Abl-Proteins zur Hemmung des Wachstums leukämischer Zellen oder sogar zum Zelltod führen. Um die Produktion des Bcr-Abl-Proteins spezifisch zu hemmen, haben wir uns entschlossen, die Antisense-Sequenzen gegen die Bruchpunkte der Bcr-Abl-mRNA zu richten, welche nur in Ph-Chromosompositiven Leukämiezellen aber nicht in nomalen Zellen vorhanden ist. Wir hoffen, auf diesem Weg nur minimale nicht-spezifische toxische Nebeneffekte hervorzurufen, da nur das Wachstum leukämischer, aber nicht normaler Zellen betroffen ist.
- (a) Sequenzen der pE-Antisense-Oligos (geschrieben vom 5'- zum 3'-Ende)
- Antisense gegen Bcr exon 1/Abl exon 2 (B1/A2), vorhanden in ALL-1-Zellen
GAAGGGCTTCTGCGTC - Antisense gegen Bcr exon 2/Abl exon 2 (B2/A2), vorhanden in BV173-Zellen
CTGAAGGGCTTCTTCC - Antisense gegen Bcr exon 3/Abl exon 2 (B3/A2), vorhanden in K562-Zellen
GGGCTTTTGAACTCTGCT - (b) Transport liposomaler pE-Oligos zu leukämischen Zellen
- Zehntausend ALL-1- oder BV173-Zellen oder fünftausend K562-Zellen wurden in einer 96-well-Platte pro Vertiefung in 100 μL RPMI-Medium mit 10% fötalem Kälberserum ausplattiert. Zwei Stunden nach Ausplattieren wurden Endkonzentrationen von 0–10 μM liposomaler pE-Oligos zu den leukämischen Zellen hinzugefügt. Die Zellen wurden mit den liposomalen pE-Oligos für 5 Tage inkubiert. HL60-Zellen, eine menschliche promyelocytische Zelllinie, die das Philadelphia-Chromosom nicht besitzt, wurden als Kontrollzellen verwendet. Sie wurden unter den gleichen Bedingungen mit einer Konzentration von zehntausend Zellen pro Vertiefung ausplattiert.
- (c) Bestimmung der Lebensfähigkeit leukämischer Zellen
- Am Ende der Inkubation wurden 100 μL Medium zu jeder Vertiefung auf ein Endvolumen von 200 μL hinzugefügt. Anschließend wurden 50 μL Zellen aliquotiert und zu den 96-well-Platten, welche 130 μL Medium und 20 μL alamarBlue-Farbstoff enthielten, hinzugefügt. Die Zellen werden für weitere 4–8 Stunden bei 37°C inkubiert, bevor sie direkt in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät (Molecular Devices, Menlo Park, CA) bei 570 und 595 nm gemessen werden. Der alamarBlue-Farbstoff inkorporiert einen Oxidations-Reduktions-Indikator, der bei chemischer Reduktion des Wachstumsmediums aufgrund Zellwachstum seine Farbe ändert. Der Absorptionsunterschied zwischen 570 und 595 nm wird als allgemeiner Absorptionswert der leukämischen Zellen herangezogen. Die Lebensfähigkeit leukämischer Zellen, die mit liposomalen pE-Oligos behandelt worden waren, wird mit der Lebensfähigkeit unbehandelter Kontrollzellen verglichen.
- Nach Inkubation der ALL-1- und der HL60-Zellen mit liposomalen pE-Antisense-Oligos gegen den B1/A2-Bruchpunkt der Bcr-Abl-mRNA wurde eine dosisabhängige Wachstumshemmung der ALL-1-, aber nicht der HL60-Zellen beobachtet (
2A ). Eine ähnliche Wachstumshemmung wurde bei BV173- und K562-Zellen beobachtet, wenn diese mit liposomalen pE-Antisense-Oligos gegen B2/A2- bzw. B3/A2-Bruchpunkte der Bcr-Abl-mRNA inkubiert worden waren (3A ,4A ). HL60-Zellen waren bei identischen Bedingungen nicht im Wachstum gehemmt. - Um sicherzustellen, dass die wachstumshemmenden Effekte sequenzabhängig waren, wurden die Ph-Chromosom-positiven Zelllinien mit liposomalen Antisense- und Kontroll-pE-Oligos inkubiert. Die Inkubation von ALL-1-Zellen mit liposomalen B1/A2 pE-Antisense-Oligos und liposomalen B2/A2 pE-Kontroll-Oligos induzierte Wachstumshemmung (
2B ). Jedoch induzierten die B1/A2-Antisense-Oligos einen bedeutend höheren hemmenden Effekt. In ähnlicher Weise wurden höhere hemmende Effekte auf BV173- und K562-Zellen mit den entsprechenden liposomalen pE-Antisense-Oligos als mit den Kontrolloligos beobachtet (3B ,4B ). - Außerdem stellten wir fest, dass durch die Zugabe des Detergens Tween 20 zu der liposomalen pE-Oligomischung die Wirkung der hemmenden Effekte der liposomalen pE-Oligos erhöht war. Wir gaben Tween 20 zu 5% (Gew.-% der pE-Oligos) zu der liposomalen pE-Oligomischung dazu. Die Mischung wurde mittels Vortex gemischt, und vor dem Lyophilisieren in einem Aceton/Trockeneisbad eingefroren. Die getrocknete Mischung wurde anschließend hydriert und wie vorher angegeben mit Ultraschall behandelt. Wenn Tween 20-enthaltende liposomale pE-Oligos zu BV173-Zellen zugefügt wurden, konnte eine 100%-ige Wachstumshemmung bei 5 μM (
5 ) beobachtet werden, wohingegen unter den gleichen Bedingungen eine 100%ige Wachstumshemmung mit normalen liposomalen pE-Oligos (ohne Tween 20) stattdessen bei 10 μM beobachtet wurde.
Claims (9)
- Liposomale Zusammensetzung von Antisense-Oligonukleotiden, umfassend (a) ein Liposom, das sich aus einem oder mehreren im Wesentlichen ungeladenen Phospholipiden zusammensetzt und im Wesentlichen frei von Cholesterin ist und (b) ein Antisense-Oligonukleotid, das in dem Liposom eingeschlossen ist und ein p-Ethoxyoligonukleotid ist; wobei das molare Verhältnis von Phospholipid zu Oligo zwischen ungefähr 5 : 1 und ungefähr 100 : 1 beträgt.
- Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Phospholipide Phosphatidylcholine sind.
- Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Phospholipide Dioleoylphosphatidylcholine sind.
- Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonukleotid ein p-Ethoxyoligonukleotid ist, das im Wesentlichen aus einem Nukleinsäuremolekül mit der Sequenz GAAGGGCTTCTGCGTC besteht.
- Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonukleotid ein p-Ethoxyoligonukleotid ist, das im Wesentlichen aus einem Nukleinsäuremolekül mit der Sequenz CTGAAGGGCTTCTTCC besteht.
- Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonukleotid ein p-Ethoxyoligonukleotid ist, das im Wesentlichen aus einem Nukleinsäuremolekül mit der Sequenz GGGCTTTTGAACTCTGCT besteht.
- In vitro-Verfahren zum Hemmen des Wachstums von Tumorzellen, einschließend die Verabreichung einer zur Hemmung des Tumorzellwachstums wirksamen Menge einer Zusammensetzung, einschließend (a) ein Liposom, welches sich aus einem oder mehreren im Wesentlichen ungeladenen Phospholipiden zusammensetzt und im Wesentlichen frei von Cholesterin ist und (b) ein Antisense-Oligonukleotid, das in dem Liposom eingeschlossen ist und ein p-Ethoxyoligonukleotid ist.
- Verfahren zur Herstellung einer liposomalen Zusammensetzung von Antisense-Oligonukleotiden gemäß Anspruch 1, das die Schritte einschließt: (a) Hydratisieren einer lyophilisierten Zusammensetzung, die sich aus einem oder mehreren im Wesentlichen ungeladenen Phospholipiden zusammensetzt und die im Wesentlichen frei von Cholesterin ist und ein Antisense-Oligonukleotid, das ein p-Ethoxyoligonukleotid ist; wodurch sich eine wässerige Suspension bildet, die freie Oligonukleotide und Oligonukleotide einschließende Liposomen enthält; und (b) Trennen der freien Oligonukleotide von den Liposomen mittels Dialyse.
- Verfahren nach Anspruch 8, wobei die wässerige Suspension vor der Dialyse mit Ultraschall behandelt wird.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/520,385 US5855911A (en) | 1995-08-29 | 1995-08-29 | Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides |
US520385 | 1995-08-29 | ||
PCT/US1996/014146 WO1997007784A2 (en) | 1995-08-29 | 1996-08-26 | LIPOSOMAL PHOSPHODIESTER, PHOSPHOROTHIOATE, AND p-ETHOXY OLIGONUCLEOTIDES |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE69630691D1 DE69630691D1 (de) | 2003-12-18 |
DE69630691T2 true DE69630691T2 (de) | 2004-11-25 |
Family
ID=24072378
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE69630691T Expired - Lifetime DE69630691T2 (de) | 1995-08-29 | 1996-08-26 | Liposomal p-Ethoxy Oligonucleotides |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US5855911A (de) |
EP (1) | EP0847272B1 (de) |
JP (1) | JP4291412B2 (de) |
AT (1) | ATE253897T1 (de) |
AU (1) | AU6912996A (de) |
CA (1) | CA2228944C (de) |
DE (1) | DE69630691T2 (de) |
DK (1) | DK0847272T3 (de) |
ES (1) | ES2210385T3 (de) |
PT (1) | PT847272E (de) |
WO (1) | WO1997007784A2 (de) |
Families Citing this family (59)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5855911A (en) * | 1995-08-29 | 1999-01-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides |
US6977244B2 (en) | 1996-10-04 | 2005-12-20 | Board Of Regents, The University Of Texas Systems | Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides |
US6894031B1 (en) * | 1996-11-21 | 2005-05-17 | Cedars-Sinai Medical Center | Pituitary tumor transforming gene (PTTG) carboxy-terminal peptides and methods of use thereof to inhibit neoplastic cellular proliferation and/or transformation |
US6565889B2 (en) * | 1996-12-02 | 2003-05-20 | The Regents Of The University Of California | Bilayer structure which encapsulates multiple containment units and uses thereof |
US7262173B2 (en) | 1997-03-21 | 2007-08-28 | Georgetown University | Chemosensitizing with liposomes containing oligonucleotides |
US6126965A (en) * | 1997-03-21 | 2000-10-03 | Georgetown University School Of Medicine | Liposomes containing oligonucleotides |
CA2289702C (en) | 1997-05-14 | 2008-02-19 | Inex Pharmaceuticals Corp. | High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles |
US6835395B1 (en) | 1997-05-14 | 2004-12-28 | The University Of British Columbia | Composition containing small multilamellar oligodeoxynucleotide-containing lipid vesicles |
WO1998058630A1 (en) * | 1997-06-23 | 1998-12-30 | Sequus Pharmaceuticals, Inc. | Liposome-entrapped polynucleotide composition and method |
ATE321882T1 (de) * | 1997-07-01 | 2006-04-15 | Isis Pharmaceuticals Inc | Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre |
DE19740092A1 (de) * | 1997-09-12 | 1999-03-18 | Ulrich Dr Med Hengge | Liposomen und Verfahren zur Transfektion von Zellen |
US7285288B1 (en) * | 1997-10-03 | 2007-10-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides |
US7704962B1 (en) * | 1997-10-03 | 2010-04-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Small oligonucleotides with anti-tumor activity |
DE60037938T2 (de) | 1999-02-26 | 2009-01-29 | The University Of British Columbia, Vancouver | Antisense-therapie für trpm-2 |
US7112337B2 (en) | 1999-04-23 | 2006-09-26 | Alza Corporation | Liposome composition for delivery of nucleic acid |
WO2001026625A2 (en) | 1999-10-08 | 2001-04-19 | Alza Corp | Neutral-cationic lipid for nucleic acid and drug delivery |
FR2802422B1 (fr) * | 1999-12-21 | 2002-08-09 | Capsulis | Structures mixtes resultant de l'incorporation d'une macromolecule biologique, en particulier d'adn, dans une phase structuree d'amphiphiles et vesicules obtenues a partir de ces structures |
US7569551B2 (en) | 2000-02-25 | 2009-08-04 | The University Of British Columbia | Chemo- and radiation-sensitization of cancer by antisense TRPM-2 oligodeoxynucleotides |
EP1317470B1 (de) | 2000-09-14 | 2011-04-27 | The University Of British Columbia | Antisense insulin-ähnliches wachstumsfaktor bindendes protein (igfbp)-2-oligodeoxynukleotide zur behandlung von prostatakrebs |
EP1460898A4 (de) * | 2002-01-03 | 2006-05-24 | Univ Texas | Wt1-antisense-oligos für die hemmung von brustkrebs |
US20030158143A1 (en) * | 2002-01-17 | 2003-08-21 | Martin Gleave | Bispecific antisense olignucleotides that inhibit IGFBP-2 and IGFBP-5 and methods of using same |
DK1530636T3 (da) | 2002-08-21 | 2010-11-29 | Univ British Columbia | Behandling af melanomer ved reduktion af clusterinniveauet |
DE60332363D1 (de) | 2002-10-02 | 2010-06-10 | Univ British Columbia | Oligonucleotide zur behandlung von prostatakrebs und anderen krebserkrankungen |
EP1613285A2 (de) | 2003-03-31 | 2006-01-11 | Alza Corporation | Fettpartikel mit asymmetrischer lipid-beschichtung und herstellungsverfahren dafür |
AU2003259832A1 (en) | 2003-08-14 | 2005-03-10 | Boston Scientific Limited | Medical slings |
WO2005030260A1 (en) * | 2003-10-01 | 2005-04-07 | The University Of British Columbia | Bispecific oligonucleotide for the treatment of cns malignancies |
BRPI0416243A (pt) | 2003-11-05 | 2007-01-09 | Palingen Inc | método de tratamento de um paciente humano que sofre de uma condição que inclui uma hiper-proliferação de células b; formulação farmacêutica para injeção parenteral; kit para o tratamento de um paciente que sofre de uma condição que inclui uma hiper-proliferação de células b; e método para purgar a medula óssea de um paciente que sofre de cáncer linfóide de células b malignas antes do reimplante da medula óssea no paciente após a terapia mieloablativa |
CA2546616A1 (en) | 2003-11-21 | 2005-06-09 | Alza Corporation | Gene delivery mediated by liposome-dna complex with cleavable peg surface modification |
WO2005094899A1 (en) | 2004-04-02 | 2005-10-13 | The University Of British Columbia | Clusterin antisense therapy for treatment of cancer |
EP3087949B1 (de) * | 2004-06-14 | 2018-07-25 | Boston Scientific Limited | System im zusammenhang mit implantierbaren stützschlingen |
JP2008519030A (ja) | 2004-11-05 | 2008-06-05 | パリンゲン インコーポレーテッド | 抗体で誘導される細胞膜損傷 |
US20080014198A1 (en) * | 2004-11-23 | 2008-01-17 | The University Of British Columbia | Treatment of Cancer With a Combination of an Agent that Perturbs the EGF Signaling Pathway and an Oligonucleotide that Reduces Clusterin Levels |
WO2006113679A2 (en) | 2005-04-15 | 2006-10-26 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Delivery of sirna by neutral lipid compositions |
ES2536748T3 (es) * | 2005-04-06 | 2015-05-28 | Boston Scientific Limited | Sistemas y dispositivos para tratar trastornos del suelo pélvico |
US8043205B2 (en) | 2005-07-13 | 2011-10-25 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Snap fit sling anchor system |
EP1909691B1 (de) | 2005-07-25 | 2015-09-16 | Boston Scientific Limited | Beckenboden-reparatursystem |
US7981023B2 (en) * | 2005-07-25 | 2011-07-19 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Elastic sling system and related methods |
US8273429B2 (en) * | 2006-01-19 | 2012-09-25 | Federal-Mogul World Wide, Inc. | Fabric for end fray resistance and protective sleeves formed therewith and methods of construction |
FR2900576B1 (fr) | 2006-05-03 | 2008-09-19 | Centre Nat Rech Scient | Procede de concentration extemporanee et reversible de liposomes. |
WO2008106781A1 (en) * | 2007-03-05 | 2008-09-12 | The University Of British Columbia | Treatment of squamous cell carcinoma with hsp27 antisense oligonucleotides and radiotherapy |
EP2306978A2 (de) * | 2008-06-06 | 2011-04-13 | Mirna Therapeutics, Inc. | Zusammensetzungen zur abgabe von rnai-mitteln in vivo |
EP2652136B1 (de) | 2010-12-17 | 2018-11-07 | INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Auf tctp gerichtete nukleinsäuren zur behandlung von chemotherapie- oder hormonresistentem krebs |
CA2864394C (en) | 2011-03-02 | 2021-10-19 | Jack Roth | A method of predicting a response to a tusc2 therapy |
US9636201B2 (en) | 2011-05-12 | 2017-05-02 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Delivery members for delivering an implant into a body of a patient |
US9113991B2 (en) | 2011-05-12 | 2015-08-25 | Boston Scientific Scimed, Inc. | Anchors for bodily implants and methods for anchoring bodily implants into a patient's body |
CN104254544B (zh) | 2012-02-08 | 2017-04-26 | Igm生物科学有限公司 | Cdim结合蛋白及其用途 |
CN110464709A (zh) | 2012-08-10 | 2019-11-19 | 德克萨斯州大学系统董事会 | 用于治疗中风的神经保护性脂质体组合物和方法 |
WO2014195755A1 (en) | 2013-06-05 | 2014-12-11 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Hydrophobically modified antisense oligonucleotides comprising a ketal group |
WO2014195754A1 (en) | 2013-06-05 | 2014-12-11 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Hydrophobically modified antisense oligonucleotides comprising a triple alkyl chain |
WO2017066643A1 (en) * | 2015-10-14 | 2017-04-20 | Bio-Path Holding, Inc. | P-ethoxy nucleic acids for liposomal formulation |
CN108601765A (zh) | 2015-12-18 | 2018-09-28 | 德克萨斯州大学系统董事会 | 用于早产管理的治疗剂 |
US20190216735A1 (en) * | 2016-09-14 | 2019-07-18 | Nanyang Technological University | Liposomal formulations |
MX2019003070A (es) | 2016-09-16 | 2019-10-14 | Bio Path Holdings Inc | Terapia de combinacion con oligonucleotidos antisentido liposomales. |
JP7041136B2 (ja) | 2016-10-12 | 2022-03-23 | ボード オブ リージェンツ,ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム | Tusc2免疫療法のための方法および組成物 |
CA3058018A1 (en) * | 2017-04-19 | 2018-10-25 | Bio-Path Holdings, Inc. | P-ethoxy nucleic acids for stat3 inhibition |
WO2018195281A1 (en) * | 2017-04-19 | 2018-10-25 | Bio-Path Holdings, Inc. | P-ethoxy nucleic acids for igf-1r inhibition |
CA3057974A1 (en) * | 2017-04-19 | 2018-10-25 | Bio-Path Holdings, Inc. | P-ethoxy nucleic acids for igf-1r inhibition |
AU2021260578A1 (en) | 2020-04-20 | 2022-11-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Biologically active dry powder compositions and method of their manufacture and use |
WO2022040435A1 (en) | 2020-08-19 | 2022-02-24 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Nanodrugs for targeted drug delivery and use thereof |
Family Cites Families (82)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CH621479A5 (de) | 1977-08-05 | 1981-02-13 | Battelle Memorial Institute | |
US4394448A (en) | 1978-02-24 | 1983-07-19 | Szoka Jr Francis C | Method of inserting DNA into living cells |
US4469863A (en) | 1980-11-12 | 1984-09-04 | Ts O Paul O P | Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof |
US4480041A (en) * | 1982-07-09 | 1984-10-30 | Collaborative Research, Inc. | Use of phosphotriester intermediates for preparation of functionalized liposomes |
FR2540122B1 (fr) | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
US4721612A (en) * | 1984-04-12 | 1988-01-26 | The Liposome Company, Inc. | Steroidal liposomes |
US5202429A (en) | 1986-07-09 | 1993-04-13 | The Wistar Institute | DNA molecules having human BCL-2 gene sequences |
US5049388A (en) * | 1986-11-06 | 1991-09-17 | Research Development Foundation | Small particle aerosol liposome and liposome-drug combinations for medical use |
US5094785A (en) | 1986-12-10 | 1992-03-10 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Process for stabilizing liposomes |
US4837028A (en) | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US4920016A (en) | 1986-12-24 | 1990-04-24 | Linear Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
US5030442A (en) * | 1987-03-30 | 1991-07-09 | Liposome Technology, Inc. | Non-crystalline minoxidil composition |
US4904582A (en) | 1987-06-11 | 1990-02-27 | Synthetic Genetics | Novel amphiphilic nucleic acid conjugates |
US5178875A (en) * | 1991-01-14 | 1993-01-12 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Liposomal-polyene preliposomal powder and method for its preparation |
US4950432A (en) * | 1987-10-16 | 1990-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Polyene microlide pre-liposomal powders |
US5188897A (en) * | 1987-10-22 | 1993-02-23 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates |
US4924624A (en) * | 1987-10-22 | 1990-05-15 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof |
EP0397774A1 (de) * | 1988-02-04 | 1990-11-22 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Formulierung und anwendung von retinoiden für behandlung von krebs und anderen krankheiten |
US5098890A (en) * | 1988-11-07 | 1992-03-24 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Antisence oligonucleotides to c-myb proto-oncogene and uses thereof |
US5831066A (en) | 1988-12-22 | 1998-11-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Regulation of bcl-2 gene expression |
US5734033A (en) * | 1988-12-22 | 1998-03-31 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Antisense oligonucleotides inhibiting human bcl-2 gene expression |
US5248671A (en) * | 1989-02-15 | 1993-09-28 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides |
US5087617A (en) * | 1989-02-15 | 1992-02-11 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for treatment of cancer using oligonucleotides |
FR2644080A1 (fr) * | 1989-03-13 | 1990-09-14 | Trizac Jacques | Dispositif de filtration et d'evacuation de petites particules, dechets et detritus, de natures diverses |
WO1990012595A1 (en) | 1989-04-18 | 1990-11-01 | Vestar, Inc. | Liposomal targeting of ischemic tissue |
US5112962A (en) * | 1989-04-19 | 1992-05-12 | Northwestern University | Labile anchors for solid phase polynucleotide synthesis |
US5227170A (en) * | 1989-06-22 | 1993-07-13 | Vestar, Inc. | Encapsulation process |
US5100662A (en) * | 1989-08-23 | 1992-03-31 | The Liposome Company, Inc. | Steroidal liposomes exhibiting enhanced stability |
US5542935A (en) | 1989-12-22 | 1996-08-06 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Therapeutic delivery systems related applications |
US5469854A (en) * | 1989-12-22 | 1995-11-28 | Imarx Pharmaceutical Corp. | Methods of preparing gas-filled liposomes |
CA2033725C (en) | 1990-01-24 | 2001-05-29 | Folker Pittrof | Pharmaceutical and cosmetic compositions containing a salt of cholanic acid |
US5279833A (en) | 1990-04-04 | 1994-01-18 | Yale University | Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells |
US5264618A (en) * | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
US5665710A (en) * | 1990-04-30 | 1997-09-09 | Georgetown University | Method of making liposomal oligodeoxynucleotide compositions |
EP0527818A4 (en) * | 1990-04-30 | 1993-09-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide modulation of arachidonic acid metabolism |
ATE151076T1 (de) | 1990-07-02 | 1997-04-15 | Hoechst Ag | Oligonucleotid-analoge mit terminalen 3'-3'-bzw. 5'-5'-internucleotidverknüpfungen |
US5135917A (en) * | 1990-07-12 | 1992-08-04 | Nova Pharmaceutical Corporation | Interleukin receptor expression inhibiting antisense oligonucleotides |
US5378825A (en) | 1990-07-27 | 1995-01-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
WO1992005272A1 (en) * | 1990-09-17 | 1992-04-02 | The Regents Of The University Of California | Method and composition for controlling proliferation of cells |
US5271941A (en) * | 1990-11-02 | 1993-12-21 | Cho Chung Yoon S | Antisense oligonucleotides of human regulatory subunit RI.sub.α of cAMP-dependent protein kinases |
DE4110085A1 (de) * | 1991-03-27 | 1992-10-01 | Boehringer Ingelheim Int | 2'-o-alkyl-oligoribonukleotide, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung als antisense-oligonukleotide |
FR2677272B1 (fr) * | 1991-06-05 | 1995-03-03 | Biovecteurs As | Vecteur particulaire a tropisme selectif, procede de preparation et composition pharmaceutique. |
WO1992022303A1 (en) * | 1991-06-18 | 1992-12-23 | Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Selective inhibition of leukemic cell proliferation by bcr-abl antisense oligonucleotides |
US5525719A (en) | 1991-08-30 | 1996-06-11 | Chemgenes Corporation | N-protected-2'-O-methyl-and N-protected-3'-O-methyl-ribonucleosides and their phosphoramidite derivatives |
DE69233046T2 (de) * | 1991-10-24 | 2004-03-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc., Carlsfeld | Derivatisierte oligonukleotide mit verbessertem aufnahmevermögen |
EP0616644B1 (de) * | 1991-12-04 | 2003-07-02 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Fettsäure-desaturase gene aus pflanzen |
US5279957A (en) * | 1992-04-30 | 1994-01-18 | Washington University | cDNA encoding human phospholipase A2 polypeptide |
WO1993024640A2 (en) * | 1992-06-04 | 1993-12-09 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for in vivo gene therapy |
US5320962A (en) * | 1992-07-22 | 1994-06-14 | Duke University | DNA encoding the human A1 adenosine receptor |
NL9201440A (nl) * | 1992-08-11 | 1994-03-01 | Univ Leiden | Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing. |
AU5092893A (en) * | 1992-09-02 | 1994-03-29 | Georgetown University | Method of encapsulating anthracycline glycosides in liposomes |
US6001992A (en) | 1999-01-07 | 1999-12-14 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of novel anti-apoptotic bcl-2-related proteins |
WO1994008625A1 (en) | 1992-10-21 | 1994-04-28 | Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Combination of antineoplastic agent and antisense oligonucleotides for treatment of cancer |
US6015886A (en) | 1993-05-24 | 2000-01-18 | Chemgenes Corporation | Oligonucleotide phosphate esters |
US5417978A (en) * | 1993-07-29 | 1995-05-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use |
FR2710074B1 (fr) | 1993-09-15 | 1995-12-08 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Gène GRB3-3, ses variants et leurs utilisations. |
CA2153251C (en) * | 1993-11-05 | 1998-09-01 | David Samuel Collins | Liposome preparation and material encapsulation method |
US5651981A (en) | 1994-03-29 | 1997-07-29 | Northwestern University | Cationic phospholipids for transfection |
US5696248A (en) | 1994-06-15 | 1997-12-09 | Hoechst Aktiengesellschaft | 3'-modified oligonucleotide derivatives |
US5908635A (en) * | 1994-08-05 | 1999-06-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method for the liposomal delivery of nucleic acids |
IT1275862B1 (it) * | 1995-03-03 | 1997-10-24 | Consiglio Nazionale Ricerche | Trascritto antisenso associato ad alcuni tipi di cellule tumorali ed oligodeossinucleotidi sintetici utili nella diagnosi e nel trattamento |
ATE206131T1 (de) * | 1995-03-13 | 2001-10-15 | Aventis Pharma Gmbh | Phosphonomonoesternnukleinsäuren, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
WO1996038176A1 (fr) | 1995-06-01 | 1996-12-05 | Kishimoto, Tadamitsu | Inhibiteur de la croissance de cellules leucemiques contenant des derives oligonucleotidiques antisens agissant contre le gene de la tumeur de wilms (wt1) |
US6326487B1 (en) | 1995-06-05 | 2001-12-04 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | 3 modified oligonucleotide derivatives |
US5705385A (en) | 1995-06-07 | 1998-01-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
US5756122A (en) * | 1995-06-07 | 1998-05-26 | Georgetown University | Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells |
IL122290A0 (en) | 1995-06-07 | 1998-04-05 | Inex Pharmaceuticals Corp | Lipid-nucleic acid complex its preparation and use |
ATE247971T1 (de) * | 1995-08-01 | 2003-09-15 | Novartis Erfind Verwalt Gmbh | Liposomale oligonukleotidzusammensetzungen |
US5855911A (en) * | 1995-08-29 | 1999-01-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides |
DE19532553A1 (de) * | 1995-09-04 | 1997-03-06 | Hoechst Ag | Verfahren zur Herstellung substituierter N-Ethyl-Glycinderivate |
US6120794A (en) | 1995-09-26 | 2000-09-19 | University Of Pittsburgh | Emulsion and micellar formulations for the delivery of biologically active substances to cells |
US6977244B2 (en) * | 1996-10-04 | 2005-12-20 | Board Of Regents, The University Of Texas Systems | Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides |
US5874224A (en) | 1997-03-11 | 1999-02-23 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Growth factor receptor binding protein |
US6126965A (en) | 1997-03-21 | 2000-10-03 | Georgetown University School Of Medicine | Liposomes containing oligonucleotides |
GB9711919D0 (en) | 1997-06-09 | 1997-08-06 | Ciba Geigy Ag | Oligonucleotide derivatives |
WO1998058630A1 (en) | 1997-06-23 | 1998-12-30 | Sequus Pharmaceuticals, Inc. | Liposome-entrapped polynucleotide composition and method |
US6277981B1 (en) | 1997-07-03 | 2001-08-21 | Thomas Jefferson University | Method for design and selection of efficacious antisense oligonucleotides |
US7285288B1 (en) * | 1997-10-03 | 2007-10-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides |
US6136965A (en) | 1998-07-02 | 2000-10-24 | The Regents Of The University Of California | Deoxynucleic alkyl and alkoxy thiourea compounds |
US6211162B1 (en) | 1998-12-30 | 2001-04-03 | Oligos Etc. Inc. | Pulmonary delivery of protonated/acidified nucleic acids |
US6211349B1 (en) | 1998-12-30 | 2001-04-03 | Oligos Etc., Inc. | Protonated/acidified nucleic acids and methods of use |
US7795232B1 (en) | 2000-08-25 | 2010-09-14 | Genta Incorporated | Methods of treatment of a bcl-2 disorder using bcl-2 antisense oligomers |
-
1995
- 1995-08-29 US US08/520,385 patent/US5855911A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-08-26 PT PT96929888T patent/PT847272E/pt unknown
- 1996-08-26 WO PCT/US1996/014146 patent/WO1997007784A2/en active IP Right Grant
- 1996-08-26 AU AU69129/96A patent/AU6912996A/en not_active Abandoned
- 1996-08-26 CA CA2228944A patent/CA2228944C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-26 DK DK96929888T patent/DK0847272T3/da active
- 1996-08-26 DE DE69630691T patent/DE69630691T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-26 JP JP51064297A patent/JP4291412B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-26 AT AT96929888T patent/ATE253897T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-08-26 EP EP96929888A patent/EP0847272B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-26 ES ES96929888T patent/ES2210385T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-07-09 US US09/112,869 patent/US6042846A/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-06-16 US US10/462,172 patent/US7176302B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-02-13 US US11/674,563 patent/US7754872B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0847272A2 (de) | 1998-06-17 |
PT847272E (pt) | 2004-04-30 |
DK0847272T3 (da) | 2004-03-22 |
US7754872B2 (en) | 2010-07-13 |
US6042846A (en) | 2000-03-28 |
ATE253897T1 (de) | 2003-11-15 |
US20070202157A1 (en) | 2007-08-30 |
AU6912996A (en) | 1997-03-19 |
US20040005353A1 (en) | 2004-01-08 |
JP4291412B2 (ja) | 2009-07-08 |
JPH11512099A (ja) | 1999-10-19 |
WO1997007784A2 (en) | 1997-03-06 |
DE69630691D1 (de) | 2003-12-18 |
ES2210385T3 (es) | 2004-07-01 |
US7176302B2 (en) | 2007-02-13 |
US5855911A (en) | 1999-01-05 |
CA2228944C (en) | 2011-10-18 |
WO1997007784A3 (en) | 1997-04-24 |
CA2228944A1 (en) | 1997-03-06 |
EP0847272B1 (de) | 2003-11-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69630691T2 (de) | Liposomal p-Ethoxy Oligonucleotides | |
DE69820465T2 (de) | Liposomen-umschlossene polynukleotidzusammensetzung sowie verfahren | |
AU677417B2 (en) | Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use | |
DE69633669T2 (de) | Verfahren zur zelltransfektion mit liposomal-verkapselten nukleinsäuren | |
DE69906977T2 (de) | In liposomen verkapselte nukleinsäurekomplexe | |
DE69832293T2 (de) | Zubereitungen zur abgabe von negativ geladenen molekülen | |
DE69535540T2 (de) | Zusammensetzung enthaltend nukleinsäuren und kationische polymere, zubereitung und verwendung | |
DE60036861T2 (de) | Verkapselung biologisch aktiver komplexe in liposomen | |
DE69635609T2 (de) | Nukleinsäure enthaltende zusammensetzung, herstellung und verwendung | |
DE60017406T2 (de) | Verfahren zur herstellung von in lipid verkapselten therapeutischen wirkstoffen | |
DE69534669T2 (de) | Nukleinsaeure enthaltende zusammensetzungen, herstellung und verwendung | |
DE69837819T2 (de) | Kondensierte plasmid-liposome komplex zur transfektion | |
CH652615A5 (de) | Verfahren zur herstellung eines gefriergetrockneten gemisches von potentiellen liposomen. | |
DE60014133T2 (de) | Lipid zur Verwendung in einer Liposomzusammensetzung zur Abgabe eines Mittels an eine Zelle | |
WO2013053480A1 (de) | Zusammensetzung zur einbringung von nukleinsäuren in zellen | |
DE69927669T2 (de) | Für reduzierende bedingungen empfindliche transfektions-verbindungen, pharmazeutische zusammensezungen die diese enthalten und deren verwendung. | |
DE3825374C2 (de) | ||
DE19736592C2 (de) | Tetraetherlipidderivat, ein oder mehrere Tetraetherlipidderivate enthaltendes Liposom oder Lipidagglomerat und pharmazeutische Zusammensetzung | |
WO2014154203A2 (de) | Fusionsmischung | |
EP2719762A1 (de) | Tyrosinaseinhibitoren zur Depigmentierung oder Haarentfernung | |
DE10361917A1 (de) | Verfahren zur Transfektion von Zellen | |
EP0611303B1 (de) | Carboplatin oder Lobaplatin ENTHALTENDE ZUBEREITUNGEN ZUR ANTITUMORTHERAPIE UND/ODER STIMULIERUNG DES HÄMATOPOETISCHEN SYSTEMS | |
DE4446937C2 (de) | Neues Cholesterolderivat, dessen Herstellung und Verwendung für den liposomalen Gentransfer | |
WO2023099722A1 (fr) | Nanoparticules pour la liberation d'acides nucleiques | |
DE102004054731A1 (de) | Systemische Abgabe von CD40 Antisense |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8364 | No opposition during term of opposition |