DE10361917A1

DE10361917A1 - Verfahren zur Transfektion von Zellen

Info

Publication number: DE10361917A1
Application number: DE2003161917
Authority: DE
Inventors: Gerold Enderl; Stefan Fankaenel
Original assignee: Novosom AG
Current assignee: Novosom AG
Priority date: 2003-12-22
Filing date: 2003-12-22
Publication date: 2005-07-21

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Transfektion von kultivierten Zellen unter Einwirkung von erhöhter Schwerkraft. Die Zellen nehmen dabei Makromoleküle und insbesondere Nukleinsäuren auf. In einer Ausführung der Erfindung sind diese Makromoleküle in Liposomen verpackt.

Description

Kationische Partikel zur Verwendung als Transfektionssystem sind im Stand der Technik mehrfach beschrieben, so etwa in der US 5965434 , der JP 04026699 , der WO 99/61512, US 6093816 oder der JP 04364195 . Insbesondere dienen hier die kationischen Komponenten zur effizienten Verpackung von Nukleinsäuren. Durch eine verbleibende kationische Überschußladung am Partikel wird eine gute Transfektion in vitro erreicht. Ihre Verwendung in vivo wird jedoch durch die sofortige Bildung von Aggregaten im Serum eingeschränkt. Gleiches gilt für die Anwendung auf Suspensionszellkulturen. Anionische Liposomen zeigen demgegenüber eine gute Verträglichkeit mit Kulturmedien, Serum oder Blut, sind jedoch nicht zur Verpackung von beispielsweise DNA geeignet.

Aus dem Stand der Technik ist der Einfluss der Oberflächenladung eines Liposoms auf dessen Verwendbarkeit zur effizienten Beladung und zur Transfektion von Zellen bekannt. Dabei ist eine kationische Ladung der Liposomen sowohl Voraussetzung für die Bindung der Nukleinsäuren wie auch für die Anheftung der dann entstehenden Komplexe an Zellen.

Die WO 02/066490, die WO 02/066489 und die WO 02/066012 beschreiben Klassen von Liposomen, deren Oberflächenladung mit dem pH-Wert der Umgebung wechselt. Das wird durch die gleichzeitige Anwesenheit kationischer und anionischer membranständiger Ladungsträger in den Strukturen erreicht. Solche amphoteren Liposomen treten bei einem sauren pH als Polykationen, bei neutralem oder basischem pH aber als Polyanionen auf.

Sie werden bevorzugt so verwendet, dass i) bei einem sauren pH die Nukleinsäuren verkapselt werden, ii) die Liposomen bei neutralem pH in Tiere appliziert werden, wobei die Applikation bevorzugt systemisch in die Blutzirkulation erfolgt und iii) die amphoteren Liposomen nach der Zellaufnahme durch den niedrigen pH des aufnehmenden Endosoms wieder einen kationischen Zustand annehmen und dadurch die Nukleinsäuren direkt in das Zytosol gelangen.

Der anionische Charakter der amphoteren Liposomen in Blut oder Serum ist vorteilhaft für deren Anwendung in vivo, da sich keine Aggregate bilden und nur geringe unspezifische Wechselwirkungen mit Zellen zu beobachten sind. Gerade dieser Vorteil ist aber von grossem Nachteil für die Transfektion von Zellen in vitro, da eben keine Wechselwirkung mit den Zellen erfolgt.

Eine Aufgabe der Erfindung war daher, solche Verfahren zu entwickeln, die eine effiziente Aufnahme von serum-kompatiblen Liposomen in Zellen in vitro ermöglichen und dabei insbesondere keinen pH-Wechsel zur Ausbildung der Wechselwirkung erfordern.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass die kultivierten Zellen zusammen mit den amphoteren Liposomen zentrifugiert werden. Dieses Verfahren führte überraschend dazu, dass die Zellen vermehrt Partikel aufnehmen. Dabei wurde insbesondere kein nachteiliger Effekt auf das Verhalten der so behandelten Zellen beobachtet.

Für die Durchführung des Verfahrens werden Zellen nach dem Stand der Technik in Kultur gehalten. Geeignete Verfahren dafür sind dem Fachmann bekannt. Es ist für die Ausführung der Erfindung nicht wesentlich, ob es sich bei den Kulturzellen um adhärente oder Suspensionzellen handelt. In bevorzugten Ausführungsformen werden Säugerzellen oder -zelllinien verwendet.

Besonders vorteilhaft werden die Kulturzellen vor dem Kontakt mit den Partikeln mit serumfreien Kulturmedium gewaschen. Sie werden nach der Entfernung der Waschflüssigkeit mit einer für die jeweiligen Zellen geeigneten Suspension von Liposomen versetzt und anschliessend zentrifugiert. Die Auswahl der jeweils verwendeten Medien ist durch den Zelltyp bestimmt. Es entspricht der gängigen Praxis, alle Medien und Geräte, darunter auch die Zentrifuge, vor ihrer Verwendung zu temperieren und in einer keimarmen Umgebung zu arbeiten.

Die Zentrifugation wird für mehr als 10 Minuten und bevorzugt für mehr als 30 Minuten durchgeführt. Eine Dauer von mehr als 2 Stunden ist wirtschaftlich selten sinnvoll. Besonders bevorzugt werden die Zellen etwa 1 Stunde lang zentrifugiert.

Die Schwerkraft soll mindestens das 40-fache, bevorzugt das 100- bis 200-fache der Erdbeschleunigung betragen. Höhere Schwerkräfte können die Zeitdauer des Vorganges verkürzen, allerdings besteht dann die Gefahr einer Zellschädigung.

Die transfizierenden Liposomen haben eine mittlere Größe zwischen 30 und 1000 nm, bevorzugt liegt diese zwischen 50 und 300 nm und weiter bevorzugt zwischen 60 und 130 nm. Sie sind bei physiologischem pH negativ oder neutral geladen.

Zweckmäßig ist es, dass die transfizierenden Liposomen einen Wirkstoff enthalten. Dabei zählen Nukleinsäuren, Peptide oder Proteine zu den bevorzugten Wirkstoffen.

In einer besonders bevorzugten Verwendung sind die Wirkstoffe Nukleinsäuren aus bis zu 100 Nukleotiden (Oligonukleotide). Es ist für die Ausführung der erfindungsgemässen Lehre unerheblich, ob als Monomere die natürlichen Ribonukleotide, Deoxyribonukleotide oder Derivate dieser Bausteine Verwendung finden. Zu den gebräuchlichen Derivaten gehören insbesondere Backbone-Modifizierungen wie die Phosphothioate, Morpholino Nucleic Acids, Peptide Nucleic Acids, Locked Nucleic Acids und andere mehr. Die Monomeren können auch gemischt in einer Nukleinsäure vorliegen.

Ebenso ist es unerheblich, ob die Oligonukleotide in linearer oder zirkulärer Form oder als einfache oder doppelte Haarnadelstruktur vorliegen oder ob sie einzelsträngig oder doppelsträngig sind.

Ganz besonders bevorzugt werden antisense-Nukleotide, Decoy-Nukleotide oder siRNA in den Liposomen verpackt.

In einer anderen besonders bevorzugten Verwendung werden grössere Nukleinsäuren als Wirkstoffe verwendet. Auch hier ist es für die Ausführung der erfindungsgemässen Lehr nicht erheblich, ob diese Nukleinsäuren als Ribonukleotide oder Deoxyribonukleotide oder Derivate dieser Bausteine vorliegen. Ebenso ist es unerheblich, ob die grösseren Nukleinsäuren in linearer oder zirkulärer Form oder als einfache oder doppelte Haarnadelstruktur vorliegen oder ob sie einzelsträngig oder doppelsträngig sind oder ob sich Überstrukturn bilden, etwa Aptamere, Ribozyme oder Plasmide mit coiled oder supercoiled-Strukturen.

Ganz besonders bevorzugt werden zirkuläre Plasmide, lineare Expressionskassetten, mRNAs oder Aptamere Ribozyme verpackt.

Die Wirkstoffe können zur leichteren Verfolgbarkeit auch mit Signalmolekülen markiert sein. Diese Markierungen können radioaktiver Natur sein, werden aber oft in Form von Fluoreszensfarbstoffen eingebracht.

Die erfinderische Lehre wird angewendet bei der Transfektion von kultivierten Zellen. Durch den zusätzlichen Schritt der Zentrifugation wird die Aufnahme von Liposomen, die ggf. Wirkstoffe enthalten, erleichtert. Vorteilhaft gegenüber bisher verwendeten kationischen Liposomenträgern ist die geringe Zytotoxizität sowohl der hier verwendeten amphoteren Liposomen wie auch des Verfahrens selbst.

Ein wesentlicher Vorteil ist dadurch gegeben, dass die hier verwendeten Liposomen vollständig serumkompatibel sind und sich sowohl mit kultivierten Zellen als auch in Tierversuchen oder später am Menschen verwenden lassen. Diese Übertragbarkeit erlaubt eine einfache und schnelle Vortestung von Carriern, die später therapeutische Verwendung finden und senkt die Anzahl von Tierversuchen.

Bei der Ausarbeitung des Verfahrens wurde überraschend gefunden, dass die Zellen auch frei gelöste Nukleinsäuren unter den Bedingungen der Zentrifugation besser aufnehmen als ohne eine solche Behandlung. Die Effizienz der Transfektion ist zwar geringer, allerdings entfällt auch der vorherige Einschluss der Substanzen in die amphoteren Liposomen. Für Zwecke der Forschung, etwa bei der Targetvalidierung mit antisense- oder RNAi-Techniken, kann daher auch mit den freien Substanzen gearbeitet werden.

Die oben gemachten Aussagen zu den Verfahrensbedingungen und den geeigneten Substanzen treffen daher sinngemäss auch für die freien Substanzen zu.

Im folgenden soll die Ausführung der Erfindung durch Beispiele weiter erläutert werden, ohne auf die hier gezeigten Anwendungen eingeschränkt zu sein.
Beispiel 1: Verpackung von Nukleinsäuren in Liposomen
Ein phosphothioat-modifiziertes Antisense-Molekül (18bp, Target bcl-2, modifiziert mit Cy3) wird in einer Konzentration von 100μg/ml in 10mM Acetatpuffer pH 4 gelöst.
15μmol Lipide (POPC/DOTAP/CHEMS, molares Verhältnis 50:10:40) werden in in heissem Ethanol gelöst und am Rotationsverdampfer getrocknet.
Der trockene Lipidfilm wird mit der Antisense-Lösung hydratisiert, die entstehende Suspension wird durch Filter mit einer Porenweite von 200nm extrudiert. Anschliessend wird der pH auf 7.5 eingestellt und nicht verkapselte Antisense wird durch Flotation abgetrennt. Die Einschlusseffizienz lag bei etwa 40% der angebotenen Antisense.
Beispiel 2: Effekt der Zentrifugation
HeLa-Zellen wurden in 96-Loch-Platten kultiviert und anschliessend mit 100μl serumfreiem DMEM-Medium versetzt. Je 25ng freie Antisense bzw. liposomal verpackte Antisense aus Beispiel 1 wurden zu den Zellen gegeben. Anschliessend wurde für 1 Stunde mit 1000 rpm (150 g) zentrifugiert (Heraeus Biofuge, Rotor #3331). Im Vergleich dazu wurde das analoge Experiment ohne Zentrifugation durchgeführt. Nach Beendigung der Zentrifugation/Inkubation wurden die Zellen mehrmals mit serumhaltigem Medium gewaschen und für 20 Stunden bei 37°C inkubiert. Die zelluläre Aufnahme des Markers wurde fluoreszenzmikroskopisch bestimmt.
Ohne eine Zentrifugation wird weder freie noch liposomal verpackte Antisense von den Zellen aufgenommen. Nach der Zentrifugation wurde die liposomal verpackte Antisense sehr stark von den Zellen aufgenommen, die freie Antisense etwa 40fach schwächer.
Beispiel 3: Transfektion versus Partikelmenge an HeLa-Zellen
HeLa-Zellen wurden in 96-Loch-Platten bis zu einer Konfluenz von 60..80 kultiviert, dann mit serum freiem DMEM-Medium gewaschen und mit unterschiedlichen Mengen an liposomal verpackter oder frei gelöster Antisense aus Beispiel 1 versetzt. Als eine weitere Kontrolle wurden Leerliposomen nach Beispiel 1 verwendet, denen frei gelöste Antisense zugemischt wurde. Dieser Schritt führt nicht zu einer Verkapselung in die Liposomen.
Der Ansatz wurde bei 37°C für 1 Stunde bei 1000rpm zentrifugiert (Hereaus Biofuge, Rotor #3331). Die Zellen wurden zweimal mit serumhaltigem Medium gewaschen und nach 4 h bei 37°C wurde die zelluläre Aufnahme des Markers fluoreszenzmikroskopisch ausgewertet.
Tabelle: Transfektionseffizienz verschiedener Antisense-Formulierungen
Aus der Tabelle geht hervor, dass nur die liposomal verpackte Antisense effektiv in die Zellen aufgenommen wird. Die Aufnahme von freier Antisense kann bei höheren Konzentrationen erreicht werden. Die blosse Anwesenheit der Liposomen genügt allerdings nicht und führt im Gegenteil zu einer Hemmung der Aufnahme. Die Antisense muss daher wirklich im Innern der Liposomen verpackt sein oder feste Komplexe mit ihnen bilden.
Beispiel 3: Transfektionseffizienz bei verschiedenen Zelltypen
HeLa-, NIH-3T3-, HepG2- und NB 2-11-Zellen wurden in 96-Loch-Platten mit 100μl serumfreiem Medium und mit liposomaler anti-bcl2-antisense versetzt und wie oben zentrifugiert. Die Zellen wurden mit serumhaltigen Medium gewaschen und nach 20 Stunden bei 37°C wurde die zelluläre Aufnahme des Markers fluoreszenz-mikroskopisch ausgewertet.
Alle getesteten Zelltypen nehmen die angebotene Antisense auf, die Effizienz ist für die HeLa-Zellen und die 3T3-Zellen am grössten.
Beispiel 4: Toxizität nach Zentrifugation
HeLa-Zellen wurden in 96-Loch-Platten mit 100μl serumfreiem Medium bei 37°C für 1 Stunde mit 1000 rpm zentrifugiert (Heraeus Biofuge, Rotor #3331). Anschließend wurde an den Zellen ein MTT-Test durchgeführt, um die Zytotoxizität der Zentrifugation auf die Zellen zu bestimmen. Dazu wurden 10μl/well MTT-Lösung (5 mg/ml in PBS) auf die Zellen gegeben. Nach einer vierstündigen Inkubation bei 37°C wurden 100μl/well 0,04N HCl/2-Propanol pro Loch zugegeben. Die Messung der Absorption erfolgte innerhalb einer halben Stunde bei 560 nm.
Im Vergleich zu nicht zentrifugierten Zellen war keine erhöhte Zytotoxizität festzustellen.
Beispiel 5: Intrazelluläre Lokalisation
HeLa- und 3T3-Zellen wurden in 24-Loch-Platten auf Deckgläschen plattiert. Nach 24 Stunden wurde das serumhaltige Medium entfernt und einmal mit serumfreien Medium gewaschen. Für die Zentrifugation wurden 250μl serumfreies Medium zugegeben. Nach Zugabe der verschiedenen Liposomen wurde bei 37°C für 1 Stunde mit 1000 rpm zentrifugiert. Die Zellen wurden mit serumhaltigem Medium gewaschen. Nach 4 Stunden bei 37°C wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit DAPI gefärbt. Nach weiterem Waschen mit PBS und Wasser wurden die Zellen mit MOWIOL auf einen Objektträger aufgebracht.
Die Zellen wurden 15–20 Stunden nach Aufbringen auf den Objektträger unter einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Dabei war eine deutliche Lokalisierung der rotfluoreszierenden Antisense in den Zellen zu beobachten. Bei einzelnen Formulierungen war sowohl bei den HeLa- als auch bei den 3T3-Zellen eine deutliche Kernlokalisierung zu beobachten.

Claims

Verfahren zur Transfektion von Zellen in vitro, dadurch gekennzeichnet dass Zellen gemeinsam mit Wirkstoffen zentrifugiert werden.
Verfahren zur Transfektion von Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirkstoffe in Liposomen verpackt sind.
Verfahren zur Transfektion von Zellen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass amphotere Liposomen eingesetzt werden.
Verfahren zur Transfektion von Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Wirkstoffe in gelöster Form im Kulturmedium vorliegen.
Verfahren zur Transfektion von Zellen nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ein Protein oder ein Peptid ist.
Verfahren zur Transfektioni von Zellen nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff eine Nukleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ein Oligonukleotid aus bis zu 100 Monomeren ist und besonders bevorzugt ein antisense- Nukleotid, Decoy-Nukleotid oder eine siRNA ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff eine Nukleinsäure und besonders bevorzugt ein Plasmid, eine Expressionskassette, eine mRNA, ein Aptamer oder ein Ribozym ist.
Verfahren zur Transfektion von Zellen nach einem oder mehreren der vorgehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Liposomen eine mittlere Größe zwischen 30 und 1000 nm, bevorzugt zwischen 50 und 300 nm, besonders bevorzugt zwischen 60 und 130 nm aufweisen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zentrifugation für mindestens 10 Minuten, bevorzugt für mehr als 30 Minuten und ganz besonders bevorzugt für etwa eine Stunde durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zentrifugation bei mehr als 40facher Schwerkraft, besonders bevorzugt bei 100- bis 200facher Schwerkraft durchgeführt wird.