DE60302784T2 - Kontrolliertes abbaubares polymer-biomolekül oder wirkstoffträger und verfahren zur synthese dieses trägers - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Synthese eines steuerbar abbaubaren polymeren Trägermoleküls zur biomedizinischen Anwendung, beispielsweise Zufuhr von Biomolekülen, Zufuhr diagnostischer Bildgebungszusammensetzungen, Zufuhr von Sensibilisierungszusammensetzungen und zum Tissue Engineering. Insbesondere betrifft die Erfindung ein steuerbar abbaubares Polymergerüst und ein Verfahren zur Synthese von Polymeren zur Verwendung zur Zufuhr von Biomolekülen, wie Nucleinsäuren, Proteinen, Peptiden und Wirkstoffen, zu Zellen, Geweben oder einem eine Behandlung benötigenden Individuum.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Der Hauptpunkt bei Gentherapie ist die Genzufuhr. Genzufuhrsysteme werden derart gestaltet, dass sie den Ort eines Gens im Körper schützen und steuern, indem sie die Verteilung und den Zugang eines Genexpressionssystems zur Zielzelle und/oder die Erkennung durch einen Zelloberflächenrezeptor und den anschließenden intrazellulären Transport und die Kerntranslokation beeinflussen (T. Friedmann, The Development of Human Gene Therapy. Cold Spring Harbor Laboratory Press. San Diego. 1999).
  • Das Interesse an polymeren Genträgern wächst aufgrund der Beschränkungen von viralen Vektoren und auf kationischen lipidbasierten Genträgersystemen. Polymere sind Makromoleküle, die viele hochinteressante Möglichkeiten für die Gestaltung neuer Zufuhrsysteme von kleinen Molekülen von Arzneimitteln, Proteinen, Peptiden, Oligonucleotiden und Genen bieten. Bei derartigen Systemen kann eine viel größere Flexibilität einfach durch Variation der Zusammensetzung des Gemischs, der Polykationmolekülmasse, Polykationarchitektur (linear, willkürlich verzweigt, Dendrimer, Block- und Pfropfcopolymer) und durch Modifikation des Polykationgerüsts durch die Einführung von Seitenketten oder anderen funktionalen Molekülen, wie Zucker, Peptide und Antikörper, erreicht werden (CW Pouton, LW Seymour. Key issues in non-viral gene delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 2001, März 1; 46(1–3): 187–203). Niedrige Immunogenität oder ein Fehlen derselben ist ein weiterer Vorteil gegenüber lipidbasierten Genträgern, was Polymere zu einem biologisch kompatiblen Material zur Anwendung bei Patienten macht.
  • Die üblicherweise als Genträgergerüste verwendeten kationischen Polymere sind Poly(L-lysin) (PLL), Polyethylenimin (PEI), Chitosan, PAMAM-Dendrimere und Poly(2-dimethylamino)ethylmethacrylat (pDMAEMA).
  • Poly(L-lysin)-basierte Polymere, die 1987 Pionierarbeit leisteten, wurden zur Genzufuhr unter Verwendung eines Targetingliganden, beispielsweise Asialoorosomucoid und Folat, zur Erleichterung einer rezeptorvermittelten Aufnahme verwendet (GY Wu und CH Wu, Receptor-mediated in vitro gene transformation by a soluble DNA carrier system. J. Biol Chem. 1987 Apr 5; 262(10): 4429–32; GY Wu und CH Wu, Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo. J. Biol Chem. 1988 Okt 15; 263(29): 14621–4; KA Mislick, JD Baldeschwieler, JF Kayyem, TJ Meade. Transfection of folatepolylysine DNA complexes: evidence fo lysosomal delivery. Bioconjug. Chem. 1995 (Sep–Okt; 6(5): 512–5). Es wurde demonstriert, dass PLL/DNA-Komplexe infolge der Interaktion eines an der Oberfläche des Komplexes gezeigten Liganden mit dem Rezeptor in Zellen internalisiert werden (E Wagner, M Zenke, M Cotten, H Beug, ML Birnstiel. Transferrinpolycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1990 Mai; 87(9): 3410–4). Die PLL- vermittelte Gentransfereffizienz wurde ferner durch die Verwendung von lysosomatotropen Mitteln (beispielsweise Chloroquinin) oder inaktiviertem Adenovirus oder einem von Haemophilus Influenza-Hüllproteinen abgeleiteten Peptid zur Erleichterung der Freisetzung des PLL/DNA-Komplexes aus den Endosomen verbessert (E Wagner, C Plank, K Zatloukal, M Cotten, ML Birnstiel. Influenza virus hemagglutinin HA-2 N-terminal fusogenic peptides augment gene transfer by transferrin-polylysine-DNA complexes: toward a synthetic viruslike gene-transfer vehicle. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Sep 1; 89(17): 7934–8; DT Curiel, E Wagner, M Cotten, ML Birnstiel, S Agarwal, CM Li, S Loechel, PC Hu. High- efficiency gene transfer mediated by adenovirus coupled to DNA-polylysine complexes. Hum Gene Ther. 1992 Apr; 3(2): 147–54). Es ist klar, dass ohne die Verwendung von entweder Targetingliganden oder Endosomlysereagenzien ein Gentransfer mit PLL-Polyplexen allein schlecht ist, da PLL nur aus primärem Amin besteht. Andererseits zeigte PLL mit hohem Molekulargewicht signifikante Toxizität gegenüber den Zellen.
  • Im Gegensatz zu PLL zeigen sowohl verzweigtes Polyethylenimin (PEI) mit hohem Molekulargewicht als auch lineares Polyethylenimin effiziente Gentransfereffizienzen ohne die Notwendigkeit von endosomolytischen oder Targetingmitteln (O Boussif, F Lezoualc'h, MA Zanta, MD Mergny, D Scherman, B Demeneix, JP Behr. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Aug 1; 92(16): 7297–301). Positiv geladene PEI-Polyplexe werden durch Zellen endocytosiert und es wird auch angenommen, dass PEI ein Entkommen aus dem Endosom aufgrund der hohen Dichte sekundärer Amine und tertiärer Amine desselben erleichtert. Ungünstigerweise wurde ebenfalls berichtet, dass PEI mit höherem Molekulargewicht gegenüber Zellen toxisch ist, was das Potential zur Verwendung von PEI als Genzufuhrwerkzeug bei Anwendungen für humane Patienten stark beschränkt.
  • Ein Bereich von Polyamidoamindendrimeren wurde als Genzufuhrsysteme untersucht (JD Eichman, AU Bielinska, JF Kukowska-Latallo, JR Baker Jr. The use of PAMAM dendrimers in the efficient transfer of genetic material into cells. Pharm. Sci. Technol. Today. 2000 Jul; 3(7): 232–245). Terminale Aminogruppen binden DNA durch elektrostatische Mittel, wobei positiv geladene Komplexe gebildet werden, die durch Endocytose aufgenommen werden. Es bestehen Vorteile in Verbindung mit der Sternform des Polymers, da DNA nur mit den primären Oberflächenaminen zu interagieren scheint, wobei die internen tertiären Amine zurückbleiben, die zur Unterstützung des Entkommens des Dendrimer-Gen-Komplexes aus dem Endosom zur Verfügung stehen. Ungünstigerweise wurde ebenfalls berichtet, dass Dendrimere gegenüber Zellen toxisch sind, was die Hauptbeschränkung für deren Anwendung bei humanen Patienten ist. Ferner zeigten nur Polyamidoamindendrimere mit einer hohen Generation eine praktikable Gentransfektionseffizienz, wobei jedoch die Kosten zur Herstellung dieser Polymere sehr hoch sind.
  • Der Hauptpunkt im Hinblick auf Genträgeranwendungen bei medizinischer Gentherapie ist die Sicherheit und das Potential einer Zellschädigung und dann die Transfektionseffizienz. Die oben beschriebenen kationischen Polymere mit großem Molekulargewicht, die für eine effiziente Genzufuhr erforderlich sind, zeigen üblicherweise den ererbten Nachteil, dass sie gegenüber den Zellen toxisch sind. Andererseits zeigen die kationischen Polymere oder Oligomere mit niedrigem Molekulargewicht zwar üblicherweise eine geringe oder keine Cytotoxizität, doch zeigten sie auch keine signifikanten Gentransfektionseffizienzen. Eine der Strategien zur Lösung dieses Konflikts besteht in der Synthese eines biologisch abbaubaren kationischen Polymers, das nach der Zufuhr der Gene zum Kern der gewünschten Zellen zu kleinen Molekülen abgebaut wird.
  • Vor kurzem wurde berichtet, dass mit abbaubaren kationischen Polymeren hergestellte Genträger Gene in Säugerzellen mit dramatisch verminderter Cytotoxizität übertragen (YB Lim, SM Kim, Y Lee, WK Lee, TG Yang, MJ Lee, H Suh, JS Park, J., Cationic Hyperbranched Poly(amino ester): A Novel Class of DNA Condensing Molecule with Cationic Surface, Biodegradable Three-Dimensional Structure, and Tertiary Amine Groups in the Interior, J. Am. Chem. Soc., 123 (10), 2460–2461, 2001). Jedoch kann die niedrigere Gentransfereffizienz im Vergleich zu nichtabbaubaren Polymergerüsten auf dem raschen Abbau dieser Polymere in wässriger Lösung beruhen, der zu einer rasch verlorengegangenen Gentransfereffizienz während der Herstellung des Genzufuhrreagens oder vor der Zufuhr des Gens zu den Zellen führt. Diese Schwierigkeit der Steuerung der Abbaurate und der Synthese von biologisch abbaubaren kationischen Polymeren beschränkt diese Anwendungen eines polymeren Genträgers auf die in-vivo-Genzufuhr und auf Klinikpatienten.
  • Zur Verbesserung der Transfektionseffizienz von PEI mit niedrigem Molekulargewicht berichteten Gosselin et al. (Gosselin, Micheal A., Guo, Menjin, und Lee, Robert J. Efficient Gene Transfer Using Reversibly Cross-Linked Low Molecular Weight Polyethylenimine Bioconjugate Chem. 2001 12: 232–245), dass das PEI mit hohem Molekulargewicht unter Verwendung von Disulfid enthaltenden Linkern, Dithiobis(succinimidylpropionat) (DSP) und Dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidat-2HCl (DTBP) erreicht werden könnte und die gebildeten Polymere zeigten eine vergleichbare Gentransfektionseffizienz und niedrigere Cytotoxizität. Da die cytoplasmatische Umgebung deutlich reduzierend ist, ist es vernünftig, zu erwarten, dass über Vernetzungsreagenzien eingeführte Disulfidbindungen im Cytoplasma reduziert werden, was zum Abbau von PEI-Konjugaten führt, bevor Gene in den Nucleus geliefert werden, wo eine DNA-Transkription erfolgt. Jedoch sind die von Gosselin et al. verwendeten, Disulfid enthaltenden Linker kostenaufwendig, was eine Herstellung dieses Systems in großem Maßstab schwierig und ungünstig macht. Die Polymere mit Disulfid enthaltenden Linkern werden nur unter reduzierenden Bedingungen abgebaut, was Polymeranwendungen unter anderen Bedingungen beschränkt. Ferner offenbaren Gosselin et al. nur die Verwendung von verzweigten PEI-800 Da, das noch Cytotoxizität zeigen kann, wenn eine große Menge der Polymere in einem humanen Körper verwendet wird. Ferner ist es durch das Verfahren von Gosselin schwierig, Polymere mit signifikanter Gentransfereffizienz zu erhalten, wenn die Ausgangsmaterialien kationischen Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht (wie Pentaethylenhexamin, N-(2-Aminoethyl)-1,3-propandiamin) sind.
  • Lynn et al. (David A Lynn, Daniel G. Anderson, David Putnam und Robert Langer. Accelerated Discovery of Synthetic Transfection Vectors: Parallel Synthesis and Screening of a Degradable Polymer Library. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8155–8156) beschreibt ein Verfahren zur Synthese biologisch abbaubarer kationischer Polymere unter Verwendung von Diacrylaten als Linkermoleküle zwischen kationischen Verbindungen. Jedoch sind die gebildeten Polymere linear und sie weisen eine niedrige kationische Dichte auf, was zur Kondensation von DNA unzureichend ist. Die Synthese dieser Polymere erfordert Tage bis zur vollständigen Durchführung und die Menge eines effektiven Produkts, das bei Genzufuhr verwendet werden kann, ist niedrig. Mehr als 100 kationische Polymere wurden nach den Verfahren von Lynn et al. produziert, jedoch zeigten nur zwei dieser Polymere eine effektive Gentransfektionseffizienz. Diese Faktoren bewirken, dass die Herstellung von Polymeren mit hohem Molekulargewicht durch dieses Verfahren schwierig zu erreichen ist.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Es besteht Bedarf an polymeren Transfektionsvektoren, die kationische Polymere mit hohem Molekulargewicht zur effizienten Zufuhr genetischer Materialien sind, jedoch zur Mi nimierung von Cytotoxizität und Zellschädigung steuerbar abbaubar sind. Obwohl der Hauptteil der Beschreibung abbaubare Polymere beschreibt, schließt dies die Verwendung von wesentlich nicht-abbaubaren Polymeren nicht aus.
  • Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Synthese von gesteuert abbaubaren kationischen Polymeren sowie einer Vielzahl von biologisch abbaubaren Polymeren. Biomoleküle, wie Nucleinsäuren und Peptide, sowie synthetische Wirkstoffe und andere Moleküle können mit dem Polymer konjugiert oder komplexiert werden, wodurch ein Zufuhrmechanismus für die interessierenden Moleküle bereitgestellt wird. Ein zeit- und positionskontrollierter Abbau der Polymere ergibt eine hocheffiziente Transfektion eukaryotischer Zellen, insbesondere höherer eukaryotischer Zellen mit den interessierenden Molekülen unter Minimierung einer Zellschädigung.
  • Eine weitere Ausführungsform stellt ein einfaches Verfahren zur Transformation kationischer Verbindungen oder Oligomere mit niedrigerem Molekulargewicht zu effizienten Transfektionsmaterialien mit niedriger Cytotoxizität bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das gesamte Syntheseverfahren unter milden Bedingungen und in sehr kurzer Zeit in einer Synthesestufe vollständig durchgeführt. Daher erfolgt ein problemloses Scaling-up zur Herstellung und Laborverwendung bei sehr niedrigen Kosten, da die meisten Ausgangsmaterialien für dieses Syntheseverfahren im Handel erhältlich sind.
  • Ferner ist das Polymersyntheseverfahren hoch effektiv. Die für Polymere gemäß der bevorzugten Ausführungsform beobachtete Transfektionseffizienz ist in Bezug auf eine durch andere kommerzielle polymere Genträger vermittelte Transfektion hoch.
  • Die hier beschriebenen Polymersyntheseverfahren sind im Hinblick auf die Molekülarten, die zur Herstellung von Polymeren mit hohem Molekulargewicht verwendet werden können, flexibel. Jedes kationische Oligomer oder jede Verbindung mit mindestens drei Amingruppen kann als Ausgangsmaterial zur Herstellung verwendbarer polymerer Genträgerreagenzien mit Addition eines Linkermoleküls verwendet werden. Die Linkermoleküle in dieser Erfindung enthalten hydrolysierbare Bindungen. Sie können auch andere physiologisch, biologisch oder chemisch steuerbare spaltbare Bindungen, wie reduzierbare Bindungen, ein Peptid mit enzymspezifischen Spaltungsstellen oder physikalisch oder chemisch empfindlichen Bindungen, wie optische empfindliche, pH-empfindliche oder ultraschallempfindliche Moleküle, enthalten. Der Abbau von Polymeren der vorliegenden Erfindung kann durch Verfahren, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, Hydrolyse, enzymatischen Verdau, Ultraschallbehandlung und physikalische Abbauverfahren, wie Photolyse, umfassen, erreicht werden.
  • Die hier beschriebenen Polymersyntheseverfahren ergeben ein verwendbares Verfahren zur problemlosen Herstellung einer Polymerbibliothek zur Optimierung der Reaktionsbedingungen für spezielle Anwendungen. Diese Verfahren können auch zur Synthese von Polymerbibliotheken zur Gestaltung und zum Screening eines Polymers, das die von dem Forscher gewünschten Eigenschaften, beispielsweise eine spezifische Abbaurate, aufweist, verwendet werden.
  • Das Polymersyntheseverfahren stellt ferner ein verwendbares Verfahren zur problemlosen Einarbeitung eines Peptids, eines Zuckers oder eines Proteins in ein synthetisiertes Polymer durch einfache Vernetzung der kationischen Verbindung mit einem Linker oder Linkern, die die interessierende(n) funktionelle(n) Gruppe(n) enthalten, bereit. Die Liganden können auch in die synthetisierten Polymere durch herkömmliche Verfahren, wie eine Disulfid enthaltende Gruppe, eingeführt werden. Nucleinsäuren, Peptide, Wirkstoffe, andere funktionelle Gruppen und dergleichen können mit den Polymeren durch ein dem Fachmann bekanntes Verfahren konjugiert bzw. an diese gebunden werden.
  • Weitere bevorzugte Ausführungsformen umfassen biologisch abbaubare kationische Polymere mit steuerbaren Abbauraten, die hohe Gentransfektionseffizienzen und niedrige Cytotoxizitäten im Vergleich zu im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien, wie Lipofectamin (Invitrogen) und SuperFect (Qiagen), zeigen. Der Abbau von durch hier beschriebene Verfahren synthetisierten Polymeren kann durch einfache Einstellung des Verhältnisses von Molekülen in der Polymerzusammensetzung oder durch Änderung verschiedener Linkermoleküle gesteuert werden.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bereitstellung eines abbaubaren kationischen Polymers, das eine Vielzahl kationischer Moleküle und mindestens ein abbaubares Linkermolekül, das die kationischen Moleküle in einer verzweigten Anordnung verbindet, umfasst, wobei die kationischen Moleküle aus der Gruppe von:
    • (i) einer kationischen Verbindung der Formel 1:
      Figure 00090001
      Formel 1 worin: R1 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen oder eine weitere Formel 1 bedeutet; R2 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen bedeutet; R3 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen bedeutet; R4 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen oder eine weitere Formel 1 bedeutet; R5 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen oder eine weitere Formel 1 bedeutet;
    • (ii) einer kationischen Polyaminosäure; und
    • (iii) einem kationischen Polykohlenhydrat ausgewählt sind.
  • Das abbaubare Linkermolekül wird durch die Formel CLn dargestellt, worin C eine Abstandseinheit, die eine gerade oder verzweigte Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen ist, Ether-, Ester-, Amid-, Imid-, Carbonylgruppen mit oder ohne Heteroatome enthalten kann, bedeutet; L eine Acrylat- oder Methacrylateinheit bedeutet, und n eine ganze Zahl von größer als oder gleich zwei bedeutet; und wobei C und L kovalent gebunden sind.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bereitstellung eines Biomaterialzufuhrsystems, das mindestens ein Biomolekül, ein abbaubares kationisches Polymer gemäß der obigen Beschreibung mit Affinität für das Biomolekül und mindestens ein Zufuhrverstärkungsmittel, das in eine eukaryotische Zelle internalisiert werden kann, das Rezeptorerkennung, Internalisierung, Entkommen des Biomoleküls aus dem Endosom, Kernlokalisation, Biomolekülfreisetzung oder Systemstabilisierung in der eukaryotischen Zelle erleichtern kann, umfasst.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bereitstellung eines medizinischen Diagosesystems, das umfasst: ein Bildkontrastmittel, das abbaubare kationische Polymer gemäß der obigen Beschreibung, wobei das Polymer Affinität für Biomoleküle hat, und einen Liganden, Antikörper oder ein Mittel von Interesse, der bzw. das einen spezifischen Rezeptor einer eukaryotischen Zelle, eines Gewebes oder Organs erkennt, wobei der Ligand, Antikörper oder das Mittel an das abbaubare kationische Polymer gekoppelt ist.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein Sensibilisierungsmittel, das durch Licht oder andere physikalische Stimulatoren funktional getriggert werden kann, und das abbaubare kationische Polymer gemäß der obigen Beschreibung, wobei das Polymer Affinität für Biomoleküle hat, umfasst.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • In den im Folgenden angegebenen Figuren werden verschiedene kationische Polymere der vorliegenden Erfindung durch CmLn dargestellt, wobei Cm für eine in Tabelle 1 angegebene kationische Verbindung steht und Ln für ein in Tabelle 2 angegebenes Linkermolekül steht. Beispielsweise steht C1L4 für ein kationisches Polymer, das die kationische Verbindung C1 von Tabelle 1 und das Linkermolekül L4 von Tabelle 2 umfasst.
  • 1 ist eine Erläuterung der Synthese und des Abbaus der abbaubaren kationischen Polymere. "C" steht für eine kationische Verbindung oder ein kationisches Oligomer und "L" steht für ein Linkermolekül.
  • 2 erläutert die DNA-Bindungsaffinität des Oligomers C3, der Polymere C3L1 und C4L1. Die Polymer/DNA-Gewichts verhältnisse sind als 16, 8, 4, 2, 1 und 0,5 angegeben und freie DNA (Kontrolle ohne Polymer) ist als mit einem Polymer/DNA-Gewichtsverhältnis von 0 angegeben. M bezeichnet einen 1-kb-DNA-Molekülmarker.
  • 3 zeigt das Elektrophoresemuster von einigen kationischen Oligomeren und Polymeren. Die Bahnen 1–3 sind verzweigtes PEI, Molekulargewicht 25 kD, 10 kD bzw. 1,8 kD. C3 ist verzweigtes PEI600D, PLL ist Poly-L-lysin mit einem Molekulargewicht von 30 kD und C3L1 ist ein von C3 und L1 abgeleitetes Polymer.
  • 4 erläutert die Transfektionseffizienz des Gens für grün fluoreszierendes Protein (GFP) von verschiedenen Polymeren 24 h nach einer Transfektion, wobei die Y-Achse, die bei der Transfektion verwendeten Polymer/DNA-Gewichtsverhältnisse anzeigt.
  • 5 erläutet das GFP-Signal, das nach der Transfektion von 293 Zellen mit GFP-Gen unter Verwendung der abbaubaren kationischen Polymere und von im Handel erhältlichen Transfektionsreagenzien beobachtet wurde.
  • 6 erläutert die Luciferaseaktivität in 293 Zellen 24 h nach einer pCMV-Luc-Gentransfektion unter Verwendung verschiedener Polymere.
  • 7 erläutert das Überleben von Zellen nach einer Behandlung mit verschiedenen Polymer-DNA-Komplexen.
  • 8A erläutert die Molekulargewichtsänderung von C3L1 mittels Agarosegelelektrophorese nach der Inkubation von C3L1 bei 37°C über 0 h (A), 6 h (B), 12 h (C), 1d (D), 2d (E), 3d (F), 4d (G) und 6d (H). Die Bahn 1 enthält verzweigtes PEI10K und die Bahn 2 enthält verzweigtes PEI25K Die Bahnen 3 und 4 enthalten C4 bzw. C3.
  • 8B erläutert die GFP-Gentransfektionseffizienz durch Verwendung von C3L1 nach der Inkubation von C3L1 bei 37°C über 0 h, 6 h, 12 h, 1d, 2d, 3d, 4d und 6d.
  • 9A erläutert die Molekulargewichtsänderung von C3L2 mittels Agarosegelelektrophorese nach der Inkubation von C3L2 bei 37°C über 0 h (A), 6 h (B), 12 h (C), 1d (D), 2d (E), 3d (F), 4d (G) und 6d (H). Die Bahn 1 enthält BPEI10K und die Bahn 2 enthält C3.
  • 9B erläutert die GFP-Gentransfektionseffizienz durch Verwendung von C3L2 und C3L1 nach deren Inkubation bei 37°C über 0 h, 6 h, 12 h, 1d, 2d, 3d, 4d und 6d.
  • 10 erläutert das FITC-Signal nach der Zufuhr von ODN durch verschiedene Polymere und sie erläutert die Transfektionseffizienz von ODN durch verschiedene Polymere.
  • 11 liefert einige Beispiele für kationische Moleküle, die gemäß im Folgenden beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen verwendet werden können. Jedoch sind kationische Moleküle, die verwendet werden können, nicht auf diese Beispiele beschränkt.
  • 12 liefert einige Beispiele für Linkermoleküle, die gemäß im Folgenden beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen verwendet werden können. Jedoch sind Linkermoleküle, die verwendet werden können, nicht auf diese Beispiele beschränkt.
  • 13 liefert einige Beispiele für andere aminoreaktive Reste, die neben (Meth)acrylatgruppen gemäß hier beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen verwendet werden können. Jedoch sind reaktive Reste, die verwendet werden können, nicht auf diese Beispiele beschränkt.
  • 14 ist eine graphische Darstellung des Prozentanteils von Zellen, in die das GFP-Gen durch verschiedene Polymere (CmLn) transfiziert wurde und in denen eine Proteinexpression erfolgt ist. Verschiedene Kombinationen von kationischen Verbindungen und Linkern wurden zur Herstellung der kationischen Polymere verwendet. Jedoch sind kationische Polymere, die verwendet werden können, nicht auf diese Beispiele beschränkt.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
  • Ein abbaubares kationisches Polymer zur Zufuhr von Biomolekülen (Nucleinsäuren, Peptiden und dergleichen), Arzneimitteln, bei medizinischen Bildgebungsanwendungen verwendeten Molekülen, bei Krebsbehandlungen verwendeten Sensibilisierungsmitteln und bei Tissue Engineering verwendeten Molekülen wird hier beschrieben. Ein Verfahren zur Synthese dieser Polymere wird ebenfalls bereitgestellt.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform können ein kationisches Oligomer oder beliebige Aminogruppen enthaltende Moleküle mit mehr als drei reaktiven Stellen verwendet werden. Diese kationischen Verbindungen mit geringerem Molekulargewicht oder Oligomere zeigen üblicherweise keine oder eine sehr niedrige Transfektionseffizienz, wenn sie als Träger für einen Gen- oder Nucleinsäuretransport in Zellen verwendet werden. Jedoch weisen sie im Vergleich zu Trägern mit höherem Molekulargewicht, die hohe Transfektionseffizienzen zeigen, niedrige oder keine Cytotoxizität auf. Biologisch abbaubare kationische Polymere zeigen typischerweise niedrige Cytotoxizität, jedoch auch eine niedrige Transfektionseffizienz aufgrund eines raschen Abbaus, was sie gegenüber anderen Trägern für Gentransfer und andere Anwendungen weniger konkurrenzfähig macht. Diese abbaubaren kationischen Polymere verbessern die Transfektionseffizienz durch eine Verknüpfung von kationischen Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht oder Oligomeren zusammen mit abbaubaren Linkern. Die Linkermoleküle können biologisch, physikalisch oder chemisch spaltbare Bindungen, beispielsweise hydrolysierbare Bindungen, reduzierbare Bindungen, eine Peptidsequenz mit enzymspezifischen Spaltungsstellen, pH-empfindliche oder ultraschallempfindliche Bindungen, enthalten. Der Abbau dieser Polymere kann durch Verfahren erreicht werden, die ohne hierauf beschränkt zu sein, Hydrolyse, Enzymverdau und physikalische Abbauverfahren, wie optische Spaltung (Photolyse), umfassen.
  • Ferner können die abbaubaren Polymere mit einem viralen oder nicht-viralen Protein zur Verstärkung der Transfektionseffizienz konjugiert oder assoziiert werden. Beispielsweise können Vesicular Stomatitis Virus G Protein (VSVG) und andere Peptide oder Proteine, die dem Fachmann geläufig sind, an die Polymere angefügt werden, um die Transfektionseffizienz zu verbessern.
  • Eines der attraktivsten Merkmale der hier beschriebenen Polymere besteht darin, dass der Abbau der Polymere auf der Basis der Art und Struktur der Linker im Hinblick auf die Rate und die Stelle des Polymerabbaus steuerbar ist.
  • Kationische Oligomere, wie Polyethylenimin (PEI) mit niedrigem Molekulargewicht, Poly(L-lysin) (PLL) mit niedrigem Molekulargewicht, Chitosan mit niedrigem Molekulargewicht und PAMAM-Dendrimere mit niedrigem Molekulargewicht können zur Herstellung der hier beschriebenen Polymere verwendet werden. Ferner kann jedes Amine enthaltende Molekül mit mehr als drei reaktiven Stellen verwendet werden. Kationische Verbindungen können aus den folgenden Verbindungen gewählt werden, ohne hierauf beschränkt zu sein:
    • (i) einer kationischen Verbindung der Formel 1:
      Figure 00160001
      Formel 1 worin: R1 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen oder eine weitere Formel 1 bedeutet; R2 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen bedeutet; R3 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen bedeutet; R4 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen oder eine weitere Formel 1 bedeutet; R5 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen oder eine weitere Formel 1 bedeutet;
    • (ii) einer kationischen Polyaminosäure; und
    • (iii) einem kationischen Polykohlenhydrat.
  • Beispiele für derartige kationische Moleküle umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, die in 11 und Tabelle 1 angegebenen kationischen Moleküle.
  • Tabelle 1: Strukturen von kationischen Verbindungen und Oligomeren gemäß bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung
    Figure 00170001
  • Hier verwendete kationische Polymere können primäre oder sekundäre Aminogruppen umfassen, die mit aktiven Liganden, wie Zuckern, Peptiden, Proteinen und anderen Molekülen, konjugiert sein können. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Lactobionsäure an die kationischen Polymere konjugiert. Die Galactosyleinheit ergibt ein verwendbares Targetingmolekül gegenüber Hepatocytenzellen aufgrund des Vorhandenseins von Galactoserezeptoren auf der Oberfläche der Zellen. In einer weiteren Ausführungsform wird Lactose an die abbaubaren kationischen Polymere zur Einführung von Galactosyleinheiten an dem Polymer konjugiert.
  • Abbaubare verbindende Moleküle bzw. Verknüpfungsmoleküle umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Di- und Multiacrylate, Di- und Multimethacrylate, Di- und Multiacrylamide, Di- und Multiisothiocyanate, Di- und Multiisocyanate, Di- und Multiepoxide, Di- und Multialdehyde, Di- und Multiacylchloride, Di- und Multisulfonylchloride, Di- und Multihalogenide, Di- und Multianhydride, Di- und Multimaleimide, Di- und Multicarbonsäuren, Di- und Multi-á-halogenacetylgruppen und Di- und Multi-N-hydroxysuccinimidester, die mindestens einen biologisch abbaubaren Abstandshalter enthalten. Die im Folgenden angegebene Formel beschreibt einen Linker, der gemäß bevorzugten Ausführungsformen verwendet werden kann: CLn worin C eine Abstandseinheit, die eine gerade oder verzweigte Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen ist, Ether-, Ester-, Amid-, Imid-, Carbonylgruppen mit oder ohne Heteroatome enthalten kann, bedeutet; L eine Acrylat- oder Methacrylateinheit bedeutet, und n eine ganze Zahl von größer als oder gleich zwei bedeutet; und wobei C und L kovalent gebunden sind. Mehrere Beispiele für Linkermoleküle sind in 12 angegeben, jedoch wurden andere Ausführungsformen dieser Moleküle ersonnen und werden hier beschrieben.
  • Mehrere Ausführungsformen reaktiver Reste der Linkermoleküle sind in 13 erläutert, jedoch beschränken diese Beispiele den Umfang der Erfindung nicht. Reaktive Reste können, ohne hierauf beschränkt zu sein, aus Acryloyl-, Maleimid-, Halogenid-, Carboxylacylhalogenid-, Isocyanat-, Isothiocyanat-, Epoxid-, Aldehyd-, Sulfonylchlorid- und N-Hydroxysuccinimidestergruppen oder Kombinationen derselben ausgewählt sein. Weitere Ausführungsformen der Linker- und kationischen Moleküle sind hier offenbart. Die Tabelle 2 enthält in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung verwendete Linker.
  • Tabelle 2: Strukturen biologisch abbaubarer Linkermoleküle, die in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden
    Figure 00200001
  • Die Abbauraten der Polymere können durch Änderung der Polymerzusammensetzung, des Zufuhrverhältnisses und des Molekulargewichts der Polymere gesteuert werden. Beispielsweise werden, wenn Linker mit sperrigeren Alkylgruppen als Linker verwendet werden, die Polymere langsamer abgebaut. Ferner verursacht zunehmendes Molekulargewicht in einigen Fällen eine Verringerung der Abbaurate. Abbauraten der Polymere können durch Einstellung des Verhältnisses von kationischem Polymer zu Linker oder durch Änderung der verschiedenen abbaubaren Linkermoleküle gesteuert werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können nichtabbaubare kationische Polymere produziert werden. Das Linkermolekül bzw. die Linkermoleküle zwischen den kationischen Verbindungen dieser Polymere sind durch die hier beschriebenen Verfahren nicht abbaubar.
  • Acrylatlinker sind viel billiger als Disulfid enthaltende Linker, da die Synthese der Disulfid enthaltenden Linker schwieriger ist. Acrylatlinker können in jeder Wasserlösung hydrolysierbar sein, weshalb ein Acrylatlinker enthaltendes Polymer in verschiedenen Umgebungen, sofern diese Wasser enthalten, abgebaut werden kann. Daher haben Acrylatlinker enthaltende Polymere breite Anwendungsmöglichkeiten im Vergleich zu einem Disulfidlinker enthaltenden Polymeren. Ferner ist die Abbaurate von Polymeren mit Disulfidlinkern üblicherweise die gleiche, während die Abbaurate von mit Acrylatlinkern synthetisierten Polymeren in Abhängigkeit von den verschiedenen verwendeten Acrylatlinkern variieren kann.
  • Die hier beschriebenen Syntheseverfahren zur Herstellung von kationischen Polymeren sind einfach und von relativ niedrigen Kosten. Eine Bibliothek abbaubarer kationischer Polymere kann unter Verwendung von verschiedenen Kombinationen von kationischen Verbindungen oder Oligomeren und Linkermolekülen oder durch Änderung der Verhältnisse von kationischen Verbindungen zu Linkern erhalten werden. Die physika lischen und chemischen Eigenschaften der Polymere in dieser Bibliothek können durch die Verwendung verschiedener Kombinationen von kationischen Verbindungen und Linkern oder durch Änderung des Verhältnisses von kationischen Verbindungen zu Linkermolekülen eingestellt werden. Die Polymere dieser Bibliothek können als abbaubare Genträger zur Einführung von interessierender Plasmid-DNA und Antisense-oligo-DNA in Zellen verwendet werden. Die in 14 gezeigten GFP-Transfektionsergebnisse zeigen, dass mehr als 50% dieser Polymere das GFP-Gen effektiv in Zellen einführen können und zur Expression des Proteins führen.
  • Beispiel 1
  • Syntheseübersicht
  • Die Synthese verzweigter oder leicht vernetzter biologisch abbaubarer kationischer Polymere ist in 1 erläutert. Dieses Syntheseverfahren kann zur Herstellung großer Bibliotheken von verzweigten oder leicht vernetzten biologisch abbaubaren kationischen Polymeren verwendet werden. Der Abbau der kationischen Polymere der vorliegenden Erfindung wird ebenfalls erläutert.
  • In 1 steht C für eine Amin enthaltende kationische Verbindung oder ein Oligomer mit mindestens drei reaktiven Stellen (für eine Michael-Additionsreaktion) und L für eine Verbindung mit mindestens zwei Acrylatgruppen. Die Reaktion zwischen C und L findet unter sehr milden Bedingungen in organischen Lösemitteln statt. Nach der Reaktion können die Polymere durch zwei verschiedene Verfahren gewonnen werden. Bei dem ersten Verfahren wurden die Polymere durch direkte Entfernung der Lösemittel unter vermindertem Druck gewonnen. Bei dem zweiten Verfahren wurden die Polymere durch die Zugabe einer Säure, wie Salzsäure, neutralisiert und die neutralisierten Polymere durch Filtration oder Zentrifugation gewonnen. Verzweigte oder leicht vernetzte wasserlösliche Polymere mit hohem Molekulargewicht können durch Steu erung des Verhältnisses von C zu L, der Reaktionszeit, der Reaktionstemperatur, der Lösemittel und der Konzentration der gelösten Stoffe erhalten werden.
  • Beispiel 2
  • Durch Vernetzung kationischer Oligomere mit Diacrylatlinkern hergestellte Polymere, die durch direkte Entfernung von Lösemitteln gewonnen wurden
  • Die Synthese kationischer Polymere mit hohem Molekulargewicht gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch eine Vielzahl von Verfahren, die dem Fachmann üblicher Erfahrung bekannt sind, durchgeführt werden. Die Synthese eines Polymers, das von einem Polyethyleniminoligomer mit einem Molekulargewicht von 600 (PEI-600) und 1,3-Butandioldiacrylat (1,3-BDODA) abgeleitet ist, wird als allgemeines Verfahren als Modell für weitere Syntheseverfahren, die ähnliche Verbindungen umfassen, die zur Synthese einer Reihe abbaubarer kationischer Polymere verwendet werden können, bereitgestellt. 0,44 g PEI-600 (Aldrich) wurden abgewogen und in eine kleine Ampulle gegeben und mit 6 ml Methylenchlorid versetzt. Nach vollständigem Auflösen des PEI-600 wurden 0,1 g 1,3-BDODA in 2 ml Methylenchlorid unter Rühren langsam in die PEI-Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 h bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Entfernen des organischen Lösemittels unter vermindertem Druck wurden 0,55 g einer transparenten viskosen Flüssigkeit erhalten. Das 1H-NMR-Spektrum zeigte, dass die Acryl-Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung vollständig verschwand. Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Agarosegelelektrophorese abgeschätzt. Andere verzweigte oder leicht vernetzte abbaubare kationische Polymere, die von anderen kationischen Oligomeren und anderen Linkern mit zu den hier verwendeten ähnlichen Strukturen abgeleitet sind, wurden auf ähnliche Weise hergestellt.
  • Beispiel 3
  • Durch Vernetzung kationischer Oligomere mit Diacrylatlinkern hergestellte Polymere, die nach Neutralisation mit einer Säure gewonnen wurden
  • Die Synthese eines Polymers, das von PEI-600 und 1,6-Hexandioldiacrylat (1,6-HDODA) abgeleitet ist, wird als allgemeines Verfahren als Modell für weitere Syntheseverfahren, die ähnliche Verbindungen umfassen, die zur Synthese einer Reihe abbaubarer kationischer Polymere verwendet werden können, bereitgestellt. In eine kleine 20-ml-Ampulle wurden 0,43 g PEI-600 in 2 ml Methylenchlorid unter Verwendung einer Pipette oder Spritze gegeben. 0,23 g (1,0 mmol) 1,6-HDODA wurden rasch zu der obigen PEI-600-Lösung unter Rühren gegeben. Die Konzentration von PEI-600 in der Reaktionslösung wurde durch die Zugabe von weiterem Methylenchlorid auf 0,1 g/ml eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde 5 h bei Raumtemperatur (25°C) gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch durch die Zugabe von 2,5 ml 4 M HCl neutralisiert. Der weiße Niederschlag wurde abfiltriert, mit Methylenchlorid gewaschen und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet. Das erhaltene Polymer wurde mit einem NMR-Spektrometer und Agarosegelelektrophorese charakterisiert. Weitere kationische Oligomere, wie Polypropylenimin und andere Polyalkylenimine mit zu den hier verwendeten ähnlichen Strukturen wurden zur Herstellung der weiteren verschiedenen abbaubaren kationischen Polymere auf ähnliche Weise verwendet.
  • Beispiel 4
  • Durch Vernetzung kationischer Oligomere mit Multiacrylatlinkern hergestellte Polymere
  • Linker des Acrylattyps mit drei oder mehr als drei Acrylatgruppen können zur Vernetzung der kationischen Polymere, die in Beispiel 2 und 3 genannt sind, verwendet werden. Jedoch ist im Vergleich zu Diacrylatlinkern ein geringeres Molverhältnis von Linker zu kationischem Oligomer nötig, wenn Linker mit drei oder mehr Acrylatgruppen verwendet werden. Die Vernetzungsreaktion von PEI-600 mit Trimethylolpropantriacrylat (TMOPTA) wird als allgemeines Verfahren als Modell für weitere Syntheseverfahren, die ähnliche Verbindungen umfassen, bereitgestellt. Zu einer Lösung, die 0,43 g PEI-600 in 2 ml Methylenchlorid enthielt, wurden 0,13 g (0,44 mmol) TMOPTA in 2 ml Methylenchlorid rasch unter Rühren gegeben. Die Konzentration von PEI-600 in der Reaktionslösung wurde durch Zugabe von weiterem CH2Cl2 auf 0,1 g/ml eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde 5 h bei Raumtemperatur (25°C) gerührt und das Polymer wurde durch das Verfahren gemäß Beispiel 3 gewonnen. Polymere, die durch Vernetzung anderer Polyalkylenimine mit anderen Multiacrylatlinkern mit zu den hier verwendeten ähnlichen Strukturen hergestellt wurden, wurden auf ähnliche Weise hergestellt.
  • Beispiel 5
  • Durch Vernetzung von PAMAM-Oligomeren mit Acrylatlinkern hergestellte Polymere
  • Poly(amido-amin)dendrimere (PAMAM) mit terminalen primären oder sekundären Aminogruppen wurden als kationische Oligomere zur Herstellung der abbaubaren kationischen Polymere durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet. Ein Lösemittelgemisch aus Methanol und Methylenchlorid wurde als Lösemittel zur Herstellung einer homogenen Lösung verwendet. 0,1 g PAMAM (zweite Generation, 0,39 mmol primäre Aminogruppen) wurden in einem Lösemittelgemisch aus 0,5 ml Methanol und 1,0 ml Methylenchlorid gelöst. Zu dieser Lösung wurden 40 mg 1,3-BDODA in 1 ml Methylenchlorid unter Rühren gegeben. Nach Rühren bei 5°C während 10 h wurden 0,25 ml 2 M HCl zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Das Polymer wurde durch Zentrifugation gewonnen und unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet. Die Polymere, die von PAMAM-Oligomer und anderen Acrylatlinkern mit zu den hier verwendeten ähnlichen Strukturen abgeleitet sind, wurden auf ähnliche Weise hergestellt.
  • Beispiel 6
  • Durch Vernetzung von Poly(aminosäure)oligomeren mit Acrylatlinkern hergestellte Polymere
  • 0,11 g Poly(L-lysin)hydrobromidoligomer (MG: 1000–3000) und 50 mg Triethylamin wurden in 1,0 ml trockenem DMSO gelöst. Zu der obigen Lösung wurden 42 mg 2,4-Pentandioldiacrylat (2,4-PDODA) in 1,0 ml trockenem DMSO rasch gegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur während 6 h wurde der pH-Wert des Reaktionsgemischs durch Zugabe einer wässrigen 0,5 M HCl-Lösung auf 4,5 eingestellt. Das Polymer wurde durch Dialyse in einer wässrigen HCl-Lösung (pH-Wert 4,0, 4°C) durch Verwendung eines Schlauchmaterials mit einer Molekulargewichtsgrenze von 3000 gereinigt und durch Gefriertrocknungsverfahren gewonnen. Die Polymere, die von anderen Poly(aminosäure)oligomeren, die mehr als drei primäre oder sekundäre Aminogruppen enthalten, und anderen Acrylatlinkern mit zu den hier verwendeten ähnlichen Strukturen abgeleitet sind, wurden auf ähnliche Weise hergestellt.
  • Beispiel 7
  • Durch Vernetzung von Multiaminen mit Acrylatlinkern hergestellte Polymere
  • Neben den von Beispiel 2 bis Beispiel 6 verwendeten kationischen Polymeren können Multiamine mit niedrigen Molekulargewichten ebenfalls zur Herstellung der abbaubaren kationischen Polymere durch das Vernetzungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die Vernetzungsreaktion von Pentaethylenhexamin (PEHA) mit Di(trimethylolpropan)tetraacrylat (DTMOPTA) wird als allgemeines Verfahren als Modell für weitere Syntheseverfahren, die ähnliche Verbindungen umfassen, bereitgestellt. 0,23 g PEHA wurden in eine 2 ml Methylenchlorid enthaltende kleine Ampulle eingewogen. Nach der vollständigen Auflösung von PEHA wurden 0,28 g DTMOPTA in 1 ml Methylenchlorid langsam in die obige Lösung unter Rühren gegeben. Weitere 2 ml Methylenchlorid wurden zugegeben. Nach Rühren während 8 h bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch durch Zugabe von 2 ml 4 M HCl neutralisiert. Die Polymere wurden durch direkte Entfernung der organischen Lösemittel gewonnen und dann unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet. Die Polymere, die von anderen Multiaminen und Acrylatlinkern mit zu den hier verwendeten ähnlichen Strukturen abgeleitet waren, wurden auf ähnliche Weise hergestellt.
  • Beispiel 8
  • Bibliothek abbaubarer kationischer Polymere, die durch Vernetzung von kationischen Oligomeren oder Verbindungen mit Acrylatlinkern hergestellt wurden
  • Auf der Basis der Verfahren gemäß der Beschreibung von Beispiel 2 bis Beispiel 6 wurde eine Bibliothek von verzweigten oder leicht vernetzten wasserlöslichen abbaubaren kationischen Polymeren aus verschiedenen kationischen Oligomeren oder Verbindungen und verschiedenen Linkern hergestellt. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten kationischen Oligomere oder Verbindungen und Linker sind, ohne hierauf beschränkt zu sein, in Tabelle 1 bzw. Tabelle 2 angegeben und die in der vorliegenden Erfindung hergestellten Polymere sind, ohne hierauf beschränkt zu sein, in Tabelle 3 angegeben. Die Eigenschaften der Polymere wurden durch Steuerung des Verhältnisses von kationischer Verbindung zu Linker, der Reaktionszeit, der Reaktionstemperatur, der Lösemittel und Konzentrationen der gelösten Stoffe eingestellt. Einige dieser Polymere wurden durch die Transfektionseffizienz des GFP-Reportergens bewertet (11).
  • Tabelle 3: Polymere, die durch Verwendung verschiedener kationischer Verbindungen und Linker hergestellt wurden
    Figure 00280001
  • Beispiel 9
  • Im Wesentlichen nichtabbaubare kationische Polymere, die durch Vernetzung kationischer Oligomere mit Diepoxidlinkern hergestellt wurden
  • Die Synthese eines durch Vernetzung von PEI-600 mit Glycerindiglycidylether hergestellten Polymers wird als allgemeines Verfahren als Modell für weitere Syntheseverfahren, die zur Herstellung einer Reihe von nichtabbaubaren kationischen Polymeren verwendet werden können, bereitgestellt. 0,43 g PEI-600 und 0,37 g Glycerindiglycidylether wurden in 7,0 ml Methanol gelöst. Die Reaktionslösung wurde 48 h bei 40°C gerührt. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 2,5 ml 4 M HCl (in Dioxan) zu der Reaktionslösung gegeben, was das Auftreten eines weißen Niederschlags bewirkte. Die Polymere wurden durch Zentrifugation gewonnen und bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrocknet. Das erhaltene Polymer wurde mit einem NMR-Spektrometer und Agarosegelelektrophorese charakterisiert. Durch Vernetzung anderer kationischer Oligomere mit anderen Diepoxidlinkern hergestellte Polymere wurden auf ähnliche Weise hergestellt.
  • Beispiel 10
  • Im Wesentlichen nichtabbaubare kationische Polymere, die durch Vernetzung von Multiaminen mit Multiepoxidlinkern hergestellt wurden
  • Die Synthese eines Polymer, das durch Vernetzung von N,N'-Bis(2-aminopropyl)ethylendiamin (BAPEDA) mit Trimethylolpropantriglycidylether (TMOPTE) hergestellt wurde, wird als allgemeines Verfahren als Modell für weitere Syntheseverfahren, die ähnliche Verbindungen umfassen, bereitgestellt. 0,18 g BAPEDA und 0,24 g TMOPTE wurden in 3,0 ml Methanol gelöst. Die Reaktionslösung wurde bei 35°C 74 h gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurden 1,0 ml 4 M HCl (in Dioxan) zu der Reaktionslösung gegeben und die ausgefallenen Polymere wurden durch Entfernen der Lösemittel unter vermindertem Druck gewonnen. Das erhaltene Polymer wurde mit einem NMR-Spektrometer und Agarosegelelektrophorese charakterisiert. Durch Vernetzung anderer Multiamine mit anderen Multiepoxidlinkern hergestellten Polymere wurden auf ähnliche Weise hergestellt.
  • Beispiel 11
  • Konjugation einer Galactosyleinheit an die kationischen Polymere
  • In einer Ausführungsform des Syntheseverfahrens wurden 102 mg des Polymers C3L5 und 50 mg Lactobionsäure zu 10 ml Wasser, das durch Zugabe von wässriger Na2CO3 auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt wurde, gegeben. Fünfundzwanzig (25) mg 1-[3-Dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimid wurden unter kräftigem Rühren zugegeben. Nach Rühren während fünf (5) h bei Raumtemperatur wurde die Reaktionslösung 24 h in Wasser (pH = 3,5) dialysiert. Das galactosekonjugierte Polymer wurde durch Gefriertrocknen gewonnen und durch ein NMR-Spektrometer charakterisiert.
  • Beispiel 12
  • DNA-Retardationsexperiment
  • Die Bindung und Kondensation von DNA ist die erste Stufe des durch ein kationisches Polymer vermittelten Gentransfektionsprozesses. Ein DNA-Retardationsexperiment wird üblicherweise zur Bestimmung von Polymer-DNA-Bindungsaffinität verwendet. Die Polymere mit schlechtem DNA-Bindungsvermögen zeigen üblicherweise eine geringe oder keine Transfektionseffizienz. Das Versuchsprotokoll wird im Folgenden beschrieben. Kurz gesagt, wurden verschiedene Polymeranteile in 10 μl DMEM (ohne Serum und Antibiotikum) zu 0,2 μg Plasmid von grün fluoreszierendem Protein (GFP) in 10 μl DMEM (ohne Serum und Antibiotikum) Tropfen für Tropfen und unter Verwirbeln gegeben. Die gebildeten Komplexe wurden vor einer Elektrophorese 15 min bei Raumtemperatur stehengelassen. Fünf Mikroliter (5 μl) Beladungsfarbstoff wurden zu jedem Komplex gegeben und 15 μl jedes Gemischs wurden in eine jeweilige Vertiefung gegeben. DNA-Komplexe wurden durch Elektrophorese in einem 0,3%igen Agarosegel mit 0,04 M Tris-Acetat-Puffer, pH 7,4, der 1 mM EDTA enthielt, mit 100 V während 30 min analysiert. DNA wurde durch UV-Bestrahlung sichtbar gemacht. Im elektrischen Feld lief freie DNA aus der Vertiefung aus und Plasmidbanden konnten in dem Gel beobachtet werden (Linie 0 jeder Probe in 2). Wenn das Plasmid durch Polymer verpackt wurde, ist dessen Migration vollständig gehemmt und es wurden an dem Gel keine Banden im Gel beobachtet. Wenn das Plasmid jedoch nicht durch das Polymer gebunden ist, wandert das Plasmid aus der Vertiefung und das gebundene Plasmid oder ein Fleck können in dem Gel beobachtet werden. In diesem Experiment war die DNA-Bindungsaffinität der Ausgangsverbindungen der kationischen Verbindungen oder Oligomere, von Pentaethylenhexamin (C1), linearem PEI 423Da (C2), verzweigtem PEI 600Da (C3) und verzweigtem PEI 1200Da (C4) sehr schwach, auch wenn das Polymer/DNA-Verhältnis 16:1 betrug. Das Plasmid leckte immer noch (2, C3). Nach der Vernetzung zeigten alle Polymere, die von den Ausgangsmaterialien der Oligomere oder kationischen Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung abgeleitet sind, hohe Bindungsaffinität. Beispielsweise wurde die DNA-Migration durch C3L1 vollständig gehemmt, wenn das Polymer/DNA-Verhältnis 2:1 betrug (2, C3L1), und die DNA-Migration durch C4L1 vollständig gehemmt, wenn das Polymer/DNA-Verhältnis 4:1 betrug (2, C4L1). Die Ergebnisse in 2 zeigen, dass die durch die vorliegende Erfindung produzierten Polymere DNA-Bindungsaffinitäten erhöhen.
  • Beispiel 13
  • Geschätztes Molekulargewicht von Polymeren durch Agarosegelelektrophorese
  • Das Molekulargewicht ist ein Schlüsselpunkt bei der Bestimmung von DNA-Bindungsaffinität und Transfektionseffizienz. Ein höheres Molekulargewicht ist für eine hohe DNA-Bindungsaffinität sowie Transfektionseffizienz erforderlich. Einer der wichtigen Vorteile der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie kationische Oligomere oder kationische Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht in Polymere mit größerem Molekulargewicht ändern kann. Zur Bewertung des Molekülbereichs von durch die vorliegende Erfindung synthetisierten Polymeren kann ein Agarosegelelektrophoresetest durchgeführt werden. Bei diesem Experiment wurden Polymere in 150 mM NaCl-Lösung auf eine Endkonzentration von 5 mg/ml gelöst. Proben von zwanzig Mikroliter (20 μl) wurden genommen und mit 2 μl 50% Glycerin und 1 μl rot fluoreszierendem Farbstoff von Oregon für jede Vertiefung gemischt und in 0,6% Agarosegel in TAE-Puffer geladen. Eine Elektrophorese wurde mit 100 Volt 30 min durchgeführt und die Polymermolekulargewichte wurden durch Sichtbarmachung des fluoreszierenden Farbstoffs unter UV-Licht oder durch Sichtbarmachung nach Commassieblauanfärbung analysiert. Die Polymermigrationsraten waren von der Größe der Polymere abhängig. Allgemein wandern Polymere mit niedrigem Molekulargewicht in dem Agarosegel schneller als Polymere mit hohem Molekulargewicht. In diesen Experimenten wurden verzweigtes PEI25K, PEI10K, PEI1,8K als Polymermolekulargewichtsstandards in jeweils in Bahn 1 bis Bahn 3 verwendet. Bahn-C3 ist ein kationisches Oligomer, PEI0,6K, als Ausgangsmaterial zur Synthese des Polymers C3L1. Die Ergebnisse zeigten, dass das Molekulargewicht des Polymers C3L1 viel höher als dessen Ausgangsmaterial C3 im Vergleich mit dem Molekulargewichtsstandard ist (3).
  • Beispiel 14
  • In-vitro-Transfektion
  • Die Transfektionsprotokolle variierten in diesen Untersuchungen, die für individuelle Experimente angegeben sind. Die permanenten Zellen (293- und HT1080-Zellen, ATCC) wurden in 24-Vertiefungen-Gewebekulturplatten ausplattiert (2 × 105 Zellen/Vertiefung für 293-Zellen und 8 × 104 Zellen/Vertiefung für HT1080) und über Nacht in DMEM (Gibco) mit 10% FBS (Gibco) inkubiert. Die genaue Mischreihenfolge des Plasmid-Polymer-Komplexes ist ein wichtiger Parameter bei der Bestimmung der Transfektionsleistung. Für jede Vertiefung wurde ein Aliquot von 30 μl DMEM, das verschiedene Mengen der Polymere enthielt, in 30 μl DMEM-Lösung, die 0,6 μg Plasmid-DNA, beispielsweise pCMV-GFP-Plasmid-DNA oder pCMV-luc, enthielt, Tropfen für Tropfen unter Verwirbeln gegeben. Die Polymer-DNA-Lösungen wurden 15 min bei Raumtemperatur inkubiert, um die Bildung von DNA-Polymer-Komplexen zu ermöglichen. Einhundertfünfzig Mikroliter (150 μl) DMEM-Medium, das 10% FBS und Antibiotika enthielt, wurden zu dem DNA- Polymer-Komplex gegeben und dann wurden die Gemische zu den Zellen in individuellen Vertiefungen nach dem Waschen der Zellen mit PBS gegeben. Die Zellen wurden 3 h inkubiert (37°C, 7,5% CO2) und dann wurde das Medium zu DMEM-Medium, das 10% FBS und 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthielt, geändert. Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurden GFP-Signal- und Feuerfliegen-Luciferase-Aktivitäten unter Verwendung der im Folgenden beschriebenen Verfahren detektiert. Lipofectamin und Superfect wurden als positive Kontrolle gemäß dem durch den Hersteller gelieferten Protokoll verwendet.
  • Durch neues synthetisches Polymer vermittelte GFP-Reportergentransfektion
  • Das Gen von grün fluoreszierendem Protein (GFP) wurde bei dem ersten Screening verwendet. Nach der Transfektion wurde das GFP-Signal in Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Filter 515–550 nm) beobachtet. Die Zellen wurden unter Verwendung eines 10 ×-Objektivs photographiert. Der Prozentsatz von Zellen mit GFP-Signal in transfizierten Kulturen wurde aus den Zählraten von drei Feldern für optimale kationische Polymermengen bestimmt. Es wurde ermittelt, dass das Ausgangspolymer, C1, C2, C3 und C4 fast keine Transfektionseffizienz zeigten. Nach der Vernetzung zeigten die von diesen abgeleiteten Polymere hohe Transfektionseffizienz. Beispielsweise betrugen die Transfektionseffizienz von C4L1, C3L1, C3L2, C2L3, C1L3, C1L4 etwa 45% bis 55%, besser als LPEI25KDa (etwa 45%).
  • 5 zeigt die von der Verwendung von C3, C4 und C3L1, C4L1 stammenden typischen Ergebnisse. C3 und C4 zeigten fast kein GFP-Signal in den getesteten Zellen 24 h nach einer Transfektion. C4L1 und C3L1 zeigten ein sehr helles GFP-Signal, das vergleichbar zu dem kommerziellen Transfektionsreagens Lipofectamin (Gibco) war und besser als ein anderes kommerzielles Transfektionsreagens, Superfect (Qiagen), war.
  • Durch neues synthetisches Polymer vermittelte Luciferase-Reportergentransfektion
  • Die Ermittlung der Luciferaseaktivität wurde unter Verwendung eines Chemolumineszenztests nach den Vorschriften des Herstellers (Luciferase Assay System; Promega, Madison, WI, USA) durchgeführt. Kurz gesagt wurden dreißig Stunden nach dem Gentransfer die Zellen zweimal mit PBS gespült und dann mit Lysepuffer (1% Triton X-100, 100 mM K3PO4, 2 mM Dithiothreit, 10% Glycerin und 2 mM EDTA pH-Wert 7,8) 15 min bei Raumtemperatur lysiert. Ein 10-μl-Aliquot des Zelllysats wurde dann mit 50 μl Luciferase-Testreagens mit einer Injektionsvorrichtung bei Raumtemperatur in dem Luminometer gemischt. Die Lichtemission wurde dreifach über 10 s gemessen und als RLUs (relative Lichteinheiten) ausgedrückt. Die relativen Lichteinheiten (RLU) wurden auf den Proteingehalt jeder Probe, der durch Coommassie Protein Assay (Pierce, Rockford, Illinois) bestimmt wurde, genormt. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die Ergebnisse einer Transfektion von 293, HT1080 mit pCMV-luc unter Verwendung verschiedener Transfektionsreagenzien sind in 6 angegebenen. Die Ergebnisse zeigten, dass C4, C3 und C2 keine Transfektionseffizienten aufwiesen; die Luciferaseaktivitäten ähnlich dem Hintergrund waren. Nach der Vernetzung zeigten von diesen kationischen Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht abgeleitetes C3L1, C4L1 und C2L3 hohe Transfektionseffizienzen. Die Luciferaseaktivität von C4L1 betrug 1,88 × 106, höher als verzweigtes PEI25K und Lipofectamin (die Luciferaseaktivität betrug 1,58 bzw. 1,28 × 106) und es zeigte eine 7,9-fach höhere Luciferaseaktivität im Vergleich zu linearem PEI25K. Die Ergebnisse zeigen, dass durch die Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung die Transfektionseffizienz signifikant verbessert werden kann, was zu einem hervorragenden Verfahren zur Herstellung neuer Transfektionsreagenzien führt.
  • Beispiel 15
  • Toxizität des neuen synthetischen Polymers gegenüber Zellen
  • Die Cytotoxizitäten kationischer Genträger auf Säugerzellen wurde unter Verwendung eines 3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid(MTT)-Verfahrens bewertet. Kurz gesagt, wurden HT1080-Zellen, 2 × 104-Zellen/Vertiefung oder 4 × 104 293-Zellen in 96-Vertiefungen-Platten ausgesät und 16–24 h inkubiert. Ein Aliquot von 15 μl DMEM, das die Polymere enthielt, wurde Tropfen für Tropfen in 15 μl DMEM, das 0,3 μg Plasmid enthielt, gegeben und bei Raumtemperatur 15 min inkubiert, um Polymer-DNA-Komplexe zu bilden. Fünfundsiebzig Mikroliter (75 μl) DMEM wurden zu dem Polymer-DNA-Komplexen gegeben und 50 μl des Gemischs wurden zu den Zellen gegeben und 3 h inkubiert (37°C, 7,5% CO2). Das Medium wurde dann entfernt und 10% FBS enthaltendes DMEM-Medium und 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin wurden zugegeben. Nach einer weiteren Inkubation während 24 h wurde das Medium entfernt und 10 μl MTT-Lösung (5,0 mg/ml Sigma) wurden zu jeder Vertiefung gegeben und es wurde 3 h inkubiert. Das Medium wurde dann entfernt und 200 μl DMSO wurden zum Lösen der Formazankristalle zugegeben. Die Extinktion der Lösung wurde bei 570 nm ermittelt. Zelllebensfähigkeiten wurden unter Verwendung der Gleichung: Lebensfähigkeit (%) = {Abs570(Probe)/Abs570(Kontrolle)} × 100ermittelt. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Cytotoxizität von C4L1, C3L1, C2L3, C1L3 niedriger als verzweigtes PEI25K war, da viel mehr Zellen nach einer Transfektion überlebten; die Cytotoxizität für diese Polymere war ähnlich der oder niedriger als die Cytotoxizität, die durch LPEI25K bewirkt wurde (7). Die Ergebnisse zeigen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um leicht synthetische kationische Polymere mit hoher Gentransfektionseffizienz und niedrigerer Cytotoxizität zu erhalten.
  • Beispiel 16
  • Steuerbarer Abbau synthetischer Polymere
  • Zur Bewertung des Abbaus eines neuen synthetischen kationischen Polymers wurde C1L3, das von PEI 600D abgeleitet ist, mit PBS bei 37°C 6 Stunden (h), 12 h, 1 Tag (d), 2d, 3d, 4d und 6d inkubiert. Der Polymerabbau wurde durch das Gelprofil der Molekulargewichtsanalyse (8A) sowie die Transfektionseffizienz (8B) vor und nach der Inkubation bewertet. Die Daten des Molekulargewichtstests zeigten, dass das Molekulargewicht von C1L3 vor der Inkubation im Vergleich zu dem Standardpolymer PEI25K hoch war. Nach einer Inkubation von 6 h bei 37°C waren Polymere zu Oligomeren mit niedrigem Molekulargewicht abgebaut, was dadurch angezeigt wurde, dass die Polymerbanden im oberen Teil des Gels allmählich verschwanden und sich eine Färbungsbande am unteren Teil des Gels ansammelte. Drei Tage nach der Inkubation erschien der größte Teil der Polymere in niedermolekularen Bereichen, was anzeigte, dass die Polymere fast vollständig abgebaut waren (8A). Die Ergebnisse korrelierten mit den Ergebnissen der Transfektionseffizienz, die zeigten, dass 3 Tage nach einer Inkubation bei 37°C die Transfektion von 30% auf 0 verringert war (8B).
  • Polymere mit verschiedenen Abbauraten können ohne weiteres durch einfache Änderung verschiedener Linkerarten erhalten werden. Beispielsweise wurden die Polymere C3L1 und C3L2 aus der gleichen kationischen Verbindung, verzweigtem PEI 600D (C3), jedoch mit verschiedenen hydrolysierbaren Linkern synthetisiert. C3L1 wird unter Verwendung von 1,3-Butandioldiacrylat (L1) synthetisiert und C3L2 wird unter Verwendung von 2-Methyl-2,4-pentandioldiacrylat (L2) synthetisiert. Die gebildeten Polymere zeigten in Gelelektrophoresetests und Transfektionstests verschiedene Abbauraten. Die Transfektionstests zeigten, dass fast keine Änderung der Transfektionseffizienz des C3L2-Polymers nach einer Inkubation von 24 h mit BPS bei 37°C mit nur einer Abnahme von 10% nach einer Inkubation von 3 Tagen mit PBS bei 37°C erfolgt, während die Transfektionseffizienz des Polymers C3L1 signifikante Abnahmen von 40% auf 25% nach 24 h und fast 0% nach 3 Tagen Inkubation unter den gleichen Bedingungen zeigte (9A). Die Daten einer Agarosegelelektrophorese sind ebenfalls mit dem Transfektionstest konsistent, wobei fast kein signifikanter Unterschied bezüglich des Molekulargewichts von C3L2 bestand (9B, unten), während sich das Molekulargewicht von C3L1 nach 6 h änderte und im Vergleich zu C3 nach 4 Tagen Abbau fast das gleiche war (9B, oben). Die Ergebnisse zeigen, dass die Polymerabbaurate steuerbar sein kann und die gewünschte Abbaurate durch Verwendung eines verschiedenen Linkers erreicht werden kann.
  • Beispiel 18
  • Durch neues synthetisches Polymer vermittelte Antisense-Oligodesoxynucleotidzufuhr
  • Die Kapazität der Antisense-ODN-Zufuhreffizienz von C4, C3, C2, C3L1, C2L3, C1L3, BPEI25K und Lipofectamin wurde in diesem Experiment untersucht.
  • Verschiedene Probenanteile in 25 μl DMEM (kein Serum oder Antibiotika) wurden zu 0,3 μg FITC-markiertem ODN in 10 μl DMEM (ohne Serum oder Antibiotika) Tropfen für Tropfen gegeben und gleichzeitig verwirbelt. Fünfzehn min später wurden 150 μl DMEM (ohne Serum oder Antibiotika) zu den Polymer-ODN-Komplexen gegeben und vermischt. Die Endkonzentration von ODN betrug 250 nM. HeLa-705-Zellen in 24-Vertiefungen-Platten wurden mit PBS gewaschen und dann wurden die Polymer-ODN-Komplexe zu den Zellen gegeben. FITC-Signal wurde unter einem Mikroskop beobachtet. C4, C3, C2 zeigten keine Effizienz zur Zufuhr von FITC-markiertem ODN. BPEI25K und Lipofectamin zeigten hohe Effizienz der ODN-Zufuhr. BPEI zeigte höhere Zufuhreffizienz als Lipofectamin und 2 h nach einer ODN-Behandlung zeigten etwa 60–70% der Zellen ein FITC-Signal, wenn das PEI/ODN-Verhältnis 0,25 μg/0,3 μg be trug. Zu diesem Zeitpunkt waren nur 5–10% der Zellen in der Lipofectamingruppe positiv. Vierundzwanzig h nach ODN-Zufuhr zeigten mehr als 85% der Zellen ein FITC-Signal in BPEI25K-Gruppen, während 65% der Zellen ein FITC-Signal in der Lipofectamingruppe zeigten. Alle 3 Proben zeigten eine hohe ODN-Zufuhreffizienz. C3L1, C2L3, C1L3 zeigten eine etwas niedrigere Zufuhreffizienz als BPEI25K und deren Cytotoxizitäten waren viel niedriger als BPEI25K. Die ODN-Zufuhreffizienzen von C3L1, C2L3, C1L3 waren höher als von Lipofectamin (10).

Claims (22)

  1. Abbaubares kationisches Polymer, das eine Vielzahl kationischer Moleküle und mindestens ein abbaubares Linkermolekül, das die kationischen Moleküle in einer verzweigten Anordnung verbindet, umfasst, wobei die kationischen Moleküle aus der Gruppe von: (i) einer kationischen Verbindung der Formel 1:
    Figure 00390001
    Formel 1 worin: R1 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen oder eine weitere Formel 1 bedeutet; R2 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen; R3 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen; R4 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen oder eine weitere Formel 1 bedeutet; R5 ein Wasserstoffatom, eine Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen, eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen oder eine weitere Formel 1 bedeutet; (ii) einer kationischen Polyaminosäure; und (iii) einem kationischen Polykohlenhydrat ausgewählt sind; und wobei das abbaubare Linkermolekül durch die Formel CLn dargestellt wird, worin C eine Abstandseinheit, die eine gerade oder verzweigte Alkyl- oder Heteroalkylgruppe mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen oder eine Aryl- oder Heteroarylgruppe mit 5 bis 30 Atomen ist, Ether-, Ester-, Amid-, Imid-, Carbonylgruppen mit oder ohne Heteroatome enthalten kann, bedeutet; L eine Acrylat- oder Methacrylateinheit bedeutet, und n eine ganze Zahl von größer als oder gleich zwei bedeutet; und wobei C und L kovalent gebunden sind.
  2. Abbaubares kationisches Polymer nach Anspruch 1, wobei das Polymer durch Hydrolyse, enzymatische Spaltung, Reduktion, Photospaltung oder Beschallung abgebaut wird.
  3. Abbaubares kationisches Polymer nach Anspruch 1, wobei die kationischen Moleküle aus der Gruppe von Polyethylenimin (PEI), Polypropylenimin (PPI), Pentaethylenhexamin, N,N'-Bis(2-aminoethyl)-1,3-propandiamin, N-(2-Aminoethyl)-1,3-propandiamin, N-(2-Aminopropyl)-1,3-propandiamin, Spermin, Spermidin, 1,4-Bis(3-aminopropyl)piperazin, 1-(2-Aminoethyl)piperazin, Tri(2-aminoethylamin), verzweigtem oder dendritischem Polyamidoamin (PAMAM), Poly(L-lysin) (PLL) und Chitosan ausgewählt sind.
  4. Abbaubares kationisches Polymer nach Anspruch 1, wobei das Linkermolekül aus der Gruppe von 1,3- Butandioldiacrylat, 1,4-Butandioldiacrylat, 1,6-Hexandioldiacrylat, Di(ethylenglykol)diacrylat, Poly(ethylenglycol)diacrylat, 2,4-Pentandioldiacrylat, 2-Methyl-2,4-pentandioldiacrylat, 2,5-Dimethyl-2,5-hexandioldiacrylat, Trimethylolpropantriacrylat, Pentaerythrittetraacrylat, Di(trimethylolpropantetraacrylat, Dipentaerythritpentaacrylat und einem Polyester mit mindestens drei Acrylat- oder Acrylamidseitengruppen ausgewählt ist.
  5. Abbaubares kationisches Polymer nach Anspruch 1, wobei das Molekulargewicht des Polymers 500 Da bis 1.000.000 Da, vorzugsweise 2.000 Da bis 200.000 Da beträgt.
  6. Abbaubares kationisches Polymer nach Anspruch 1, wobei das Molekulargewicht der kationischen Verbindung 50 Da bis 10.000 Da beträgt.
  7. Abbaubares kationisches Polymer nach Anspruch 1, wobei das Molekulargewicht des Linkermoleküls 100 Da bis 40.000 Da beträgt.
  8. Abbaubares kationisches Polymer nach Anspruch 1, das ferner ein an das Polymer komplexgebundenes Biomolekül umfasst.
  9. Abbaubares kationisches Polymer nach Anspruch 8, wobei das Biomolekül aus einer Nucleinsäure, einem Protein, Peptid, Lipid und Kohlenhydrat ausgewählt ist.
  10. Abbaubares kationisches Polymer nach Anspruch 9, wobei die Nucleinsäure aus der Gruppe von DNA, einzel- oder doppelsträngiger RNA, Ribozym, DNA-RNA-Hybridisierungsmittel und Antisense-DNA ausgewählt ist.
  11. Verwendung eines abbaubaren kationischen Polymers nach Anspruch 10 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines eine Behandlung benötigenden Patienten durch ein Verfahren der Gentherapie.
  12. Verfahren zur Transfektion einer eukaryotischen Zelle, das das Inkontaktbringen der Zelle mit einem Polymer nach Anspruch 10 umfasst.
  13. Verfahren zur Abgabe einer diagnostischen Bildgebungszusammensetzung an ein Individuum, das die Konjugation einer diagnostischen Bildgebungszusammensetzung mit dem abbaubaren kationischen Polymer nach Anspruch 1 und das Verabreichen des konjugierten Polymers an das Individuum umfasst.
  14. Polymerbibliothek, die eine Vielzahl abbaubarer kationischer Polymere nach Anspruch 1 umfasst, wobei die Polymere verschiedene Verhältnisse von kationischer Verbindung zu Linkermolekül umfassen.
  15. Polymerbibliothek, die eine Vielzahl abbaubarer kationischer Polymere nach Anspruch 1 umfasst, wobei die Polymere jeweils ein verschiedenes Linkermolekül umfassen.
  16. Polymerbibliothek, die eine Vielzahl abbaubarer kationischer Polymere nach Anspruch 1 umfasst, wobei die Polymere jeweils ein verschiedenes kationisches Oligomer umfassen.
  17. Biomaterialzufuhrsystem, das umfasst: mindestens ein Biomolekül; das abbaubare kationische Polymer nach Anspruch 1, wobei das Polymer Affinität für das Biomolekül hat; und mindestens ein Zufuhrverstärkungsmittel, das in eine eukaryotische Zelle internalisiert werden kann, das Rezeptorerkennung, Internalisierung, Entkommen des Biomoleküls aus dem Endosom, Kernlokalisation, Biomolekülfrei setzung oder Systemstabilisierung in der eukaryotischen Zelle erleichtern kann.
  18. Biomaterialzufuhrsystem nach Anspruch 17, wobei das Biomolekül eine Nucleinsäure, ein Peptid, Protein oder Kohlenhydrat ist.
  19. Biomaterialzufuhrsystem nach Anspruch 18, wobei das Zufuhrverstärkungsmittel an das abbaubare kationische Polymer gekoppelt ist.
  20. Medizinisches Diagnosesystem, das umfasst: ein Bildkontrastmittel, das abbaubare kationische Polymer nach Anspruch 1, wobei das Polymer Affinität für Biomoleküle hat, und einen Liganden, Antikörper oder ein Mittel von Interesse, der bzw. das einen spezifischen Rezeptor einer eukaryotischen Zelle, eines Gewebes oder Organs erkennt, wobei der Ligand, Antikörper oder das Mittel an das abbaubare kationische Polymer gekoppelt ist.
  21. Pharmazeutische Zusammensetzung, die umfasst: ein Sensibilisierungsmittel, das durch Licht oder andere physikalische Stimulatoren funktional getriggert werden kann; und das abbaubare kationische Polymer nach Anspruch 1, wobei das Polymer Affinität für Biomoleküle hat.
  22. Das biologisch abbaubare kationische Polymer nach Anspruch 10 zur Verwendung in der Medizin.
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