JP7236195B2 - 眼咽頭筋ジストロフィー(opmd)の処置のための試薬およびその使用 - Google Patents
眼咽頭筋ジストロフィー(opmd)の処置のための試薬およびその使用 Download PDFInfo
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Description
本出願は、2016年4月14日出願の米国特許仮出願第62/322,745号の優先権を主張し、その全内容を参照として本明細書に援用する。
エフェクター配列が配列番号5に記載の配列と二本鎖を形成することができる限りにおいて、1、2、3、4、5または6塩基のミスマッチを例外として、配列番号5に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター配列を含むRNA;
エフェクター配列が配列番号7に記載の配列と二本鎖を形成することができる限りにおいて、1、2、3、4、5または6塩基のミスマッチを例外として、配列番号7に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター配列を含むRNA;および
エフェクター配列が配列番号9に記載の配列と二本鎖を形成することができる限りにおいて、1、2、3、4、5または6塩基のミスマッチを例外として、配列番号9に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター配列を含むRNA。
(i)エフェクター配列が配列番号5に記載の配列と二本鎖を形成することができる限りにおいて、1、2、3、4、5または6塩基のミスマッチを例外として、配列番号5に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター配列、および(ii)エフェクター配列と実質的に相補的である配列を含むエフェクター相補配列、を含むRNA;
(i)エフェクター配列が配列番号7に記載の配列と二本鎖を形成することができる限りにおいて、1、2、3、4、5または6塩基のミスマッチを例外として、配列番号7に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター配列、および(ii)エフェクター配列と実質的に相補的である配列を含むエフェクター相補配列、を含むRNA;ならびに
(i)エフェクター配列が配列番号9に記載の配列と二本鎖を形成することができる限りにおいて、1、2、3、4、5または6塩基のミスマッチを例外として、配列番号9に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター配列、および(ii)エフェクター配列に実質的に相補的である配列を含むエフェクター相補配列、を含むRNA。
配列番号4に記載のエフェクター配列、および配列番号4に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むRNA;
配列番号6に記載のエフェクター配列、および配列番号6に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むRNA;ならびに
配列番号8に記載のエフェクター配列、および配列番号8に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むRNA。
配列番号4に記載のエフェクター配列、および配列番号5に記載のエフェクター相補配列、を含むRNA;
配列番号6に記載のエフェクター配列、および配列番号7に記載のエフェクター相補配列、を含むRNA;ならびに
配列番号8に記載のエフェクター配列、および配列番号9に記載のエフェクター相補配列、を含むRNA。
(i)配列番号10に記載のエフェクター配列、(ii)配列番号10に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、および(iii)エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含むshRNA;
(i)配列番号12に記載のエフェクター配列、(ii)配列番号12に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、および(iii)エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含むshRNA;ならびに
(i)配列番号14に記載のエフェクター配列、(ii)配列番号14に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、および(iii)エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含むshRNA。
(i)配列番号10に記載のエフェクター配列、(ii)配列番号11に記載のエフェクター相補配列、および(iii)エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含むshRNA;
(i)配列番号12に記載のエフェクター配列、(ii)配列番号13に記載のエフェクター相補配列、および(iii)エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含むshRNA;ならびに
(i)配列番号14に記載のエフェクター配列、(ii)配列番号15に記載のエフェクター相補配列、および(iii)エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含むshRNA。
(a)本明細書に記載の少なくとも1つのRNA;および
(b)以下から選択される少なくとも1つのRNA:
(i)本明細書に記載のRNA;または
(ii)OPMDの原因であるPABPN1タンパク質に対応するRNA転写物の領域と実質的に相補的である、少なくとも17の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含むRNA;
ここで、(a)のRNAと(b)のRNAは異なるエフェクター配列を含む。
(a)本明細書に記載の、配列番号1に記載の配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含む、第1のRNA;
(b)本明細書に記載の、配列番号2に記載の配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含む、第2のRNA;および
(c)本明細書に記載の、配列番号3に記載の配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含む、第3のRNA。
(a)配列番号4に記載のエフェクター配列を含む第1のRNA;
(b)配列番号6に記載のエフェクター配列を含む第2のRNA;および
(c)配列番号8に記載のエフェクター配列を含む第3のRNA;
(a)配列番号4に記載のエフェクター配列、および配列番号4に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、例えば、配列番号5に記載の配列、を含む第1のRNA;
(b)配列番号6に記載のエフェクター配列、および配列番号6に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、例えば、配列番号7に記載の配列、を含む第2のRNA;ならびに
(c)配列番号8に記載のエフェクター配列、および配列番号8に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、例えば、配列番号9に記載の配列、を含む第3のRNA。
(a)(i)配列番号10に記載のエフェクター配列、(ii)配列番号10に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、例えば、配列番号11に記載の配列、および(iii)エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含む第1のRNA;
(b)(i)配列番号12に記載のエフェクター配列、(ii)配列番号12に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、例えば、配列番号13に記載の配列、および(iii)エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含む第2のRNA;ならびに
(c)(i)配列番号14に記載のエフェクター配列、(ii)配列番号14に記載の配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、例えば、配列番号15に記載の配列、および(iii)エフェクター配列とエフェクター相補配列との間に位置するステムループ配列、を含む第3のRNA。
(i)配列番号16に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA;および
(ii)配列番号18に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(i)配列番号16に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA;および
(ii)配列番号20に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(i)配列番号18に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA;および
(ii)配列番号20に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(i)配列番号16に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(ii)配列番号18に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA;および
(iii)配列番号20に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(a)以下を含むshRNA配列をコードするDNA配列を含む第1の核酸:
(i)配列番号1に記載のPABPN1配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列;および
(ii)エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列;
(b)以下を含むshRNA配列をコードするDNA配列を含む第2の核酸;
(i)配列番号2に記載のPABPN1配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列;および
(ii)エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列;および
(c)以下を含むshRNA配列をコードするDNA配列を含む第3の核酸;
(i)配列番号3に記載のPABPN1配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列;および
(ii)エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列。
配列番号16に記載のshRNA配列をコードするDNA配列を含む第1の核酸;
18に記載のshRNA配列をコードするDNA配列を含む第2の核酸;
配列番号20に記載のshRNA配列をコードするDNA配列を含む第3の核酸。
(a)配列番号16に記載のshRNA配列をコードするDNA配列を含む第1の核酸の上流のU6-1プロモーター;
(b)配列番号18に記載のshRNA配列をコードするDNA配列を含む第2の核酸の上流のU6-9プロモーター;および
(c)配列番号20に記載のshRNA配列をコードするDNA配列を含む第3の核酸の上流のH1プロモーター。
(a)以下を含むshRNA配列をコードするDNA配列を含む核酸を含む第1のddRNAi構築物:
(i)配列番号1に記載のPABPN1配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列;および
(ii)エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列;
(b)以下を含むshRNA配列をコードするDNA配列を含む核酸を含む第2のddRNAi構築物:
(i)配列番号2に記載のPABPN1配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列;および
(ii)エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列;および
(c)以下を含むshRNA配列をコードするDNA配列を含む核酸を含む第3のddRNAi構築物:
(i)配列番号3に記載のPABPN1配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列;および
(ii)エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列。
配列番号16に記載のshRNA配列をコードするDNA配列を含む核酸を含む第1のddRNAi構築物;
配列番号18に記載のshRNA配列をコードするDNA配列を含む核酸を含む第2のddRNAi構築物;および
配列番号20に記載のshRNA配列をコードするDNA配列を含む核酸を含む第3のddRNAi構築物。
(a)OPMDの原因であるPABPN1タンパク質の発現を阻害するための1つ以上の薬剤であって、前記薬剤が以下から選択されるもの:(i)本明細書に記載のRNA、複数のRNA、ddRNAi構築物、複数のddRNAi構築物、発現ベクター、複数の発現ベクターおよび/または組成物;ならびに
(b)(a)において薬剤で標的化されていないmRNA転写物を有する機能性PABPN1タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター。
(a)OPMDの原因であるPABPN1タンパク質の発現を阻害するための1つ以上の薬剤であって、前記薬剤が以下から選択されるもの:(i)本明細書に記載のRNA、複数のRNA、ddRNAi構築物、複数のddRNAi構築物、発現ベクター、複数の発現ベクターおよび/または組成物;ならびに
(b)(a)において薬剤で標的化されていないmRNA転写物を有する機能性PABPN1タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター。
本発明はまた、以下に関する。
[項目1]
PABPN1タンパク質に対応するRNA転写物の領域と実質的に相補的である、少なくとも17の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含むRNAであって、前記RNA転写物の前記領域が配列番号1~3のいずれか1つに記載されるものである、RNA。
[項目2]
前記RNAが、配列番号4、6または8に記載の配列から選択される配列を含む一本鎖RNAである、項目1に記載のRNA。
[項目3]
エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列をさらに含む、項目1に記載のRNA。
[項目4]
前記RNAが、以下からなる群から選択される二重鎖RNA(dsRNA)である、項目3に記載のRNA:
配列番号4に記載のエフェクター配列、および配列番号4に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むdsRNA;
配列番号6に記載のエフェクター配列、および配列番号6に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むdsRNA;ならびに
配列番号8に記載のエフェクター配列、および配列番号8に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むdsRNA。
[項目5]
前記dsRNAが、以下からなる群から選択される、項目3または項目4に記載のRNA:
配列番号4に記載のエフェクター配列、および配列番号5に記載のエフェクター相補配列、を含むdsRNA;
配列番号6に記載のエフェクター配列、および配列番号7に記載のエフェクター相補配列、を含むdsRNA;および
配列番号8に記載のエフェクター配列、および配列番号9に記載のエフェクター相補配列、を含むdsRNA。
[項目6]
前記RNAが、以下からなる群から選択される短鎖ヘアピンRNA(shRNA)である、項目3に記載のRNA:
配列番号10に記載のエフェクター配列、および配列番号10に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むshRNA;
配列番号12に記載のエフェクター配列、および配列番号12に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むshRNA;ならびに
配列番号14に記載のエフェクター配列、および配列番号14に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むshRNA。
[項目7]
前記shRNAが、以下からなる群から選択される、項目6に記載のRNA:
配列番号10に記載のエフェクター配列、および配列番号11に記載のエフェクター相補配列、を含むshRNA;
配列番号12に記載のエフェクター配列、および配列番号13に記載のエフェクター相補配列、を含むshRNA;ならびに
配列番号14に記載のエフェクター配列、および配列番号15に記載のエフェクター相補配列、を含むshRNA。
[項目8]
前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列との間に位置するループ配列を含む、項目6または7に記載のRNA。
[項目9]
前記shRNAが、配列番号16~21のいずれか1つに記載の配列を含む、項目6~8のいずれか一項に記載のRNA。
[項目10]
(a)項目1~9のいずれか一項に記載の少なくとも1つのRNA;および
(b)以下から選択される少なくとも1つのRNA:
(i)項目1~9のいずれか一項に記載のRNA;または
(ii)眼咽頭筋ジストロフィー(OPMD)の原因であるPABPN1タンパク質に対応するRNA転写物の領域と実質的に相補的である、少なくとも17の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含むRNA;
を含み、(a)の前記RNAと(b)の前記RNAとが異なるエフェクター配列を含む、複数のRNA。
[項目11]
(a)配列番号1に記載の配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含む、第1のRNA;
(b)配列番号2に記載の配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含む、第2のRNA;および
(c)配列番号3に記載の配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含む、第3のRNA
を含む、項目10に記載の複数のRNA。
[項目12]
(a)前記第1のRNAが、配列番号4に記載の配列を含む一本鎖RNA分子であり;
(b)前記第2のRNAが、配列番号6に記載の配列を含む一本鎖RNA分子であり;
(c)前記第3のRNAが、配列番号8に記載の配列を含む一本鎖RNA分子である、
項目11に記載の複数のRNA。
[項目13]
(a)前記第1のRNAが、配列番号4に記載のエフェクター配列、および配列番号4に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含む二重鎖RNA(dsRNA)であり;
(b)前記第2のRNAが、配列番号6に記載のエフェクター配列、および配列番号6に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むdsRNAであり;
(c)前記第3のRNAが、配列番号8に記載のエフェクター配列、および配列番号8に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むdsRNAである、
項目11に記載の複数のRNA。
[項目14]
(a)前記第1のdsRNAが、配列番号4に記載のエフェクター配列、および配列番号5に記載のエフェクター相補配列、を含み;
(b)前記第2のdsRNAが、配列番号6に記載のエフェクター配列、および配列番号7に記載のエフェクター相補配列、を含み;
(c)前記第3のdsRNAが、配列番号8に記載のエフェクター配列、および配列番号9に記載のエフェクター相補配列、を含む、
項目13に記載の複数のRNA。
[項目15]
(a)前記第1のRNAが、配列番号10に記載のエフェクター配列、および配列番号10に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含む短鎖ヘアピンRNA(shRNA)であり;
(b)前記第2のRNAが、配列番号12に記載のエフェクター配列、および配列番号12に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むshRNAであり;
(c)前記第3のRNAが、配列番号14に記載のエフェクター配列、および配列番号14に記載の前記配列と実質的に相補的であるエフェクター相補配列、を含むshRNAである、
項目11に記載の複数のRNA。
[項目16]
(a)前記第1のshRNAが、配列番号10に記載のエフェクター配列、および配列番号11に記載のエフェクター相補配列、を含み;
(b)前記第2のshRNAが、配列番号12に記載のエフェクター配列、および配列番号13に記載のエフェクター相補配列、を含み;
(c)前記第3のshRNAが、配列番号14に記載のエフェクター配列、および配列番号15に記載のエフェクター相補配列、を含む、
項目15に記載の複数のRNA。
[項目17]
前記shRNAがそれぞれ前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列との間に位置するループ配列を含む、項目16に記載の複数のRNA。
[項目18]
前記RNAが短鎖ヘアピンRNA(shRNA)である、項目1または6~9のいずれか一項に記載のRNAをコードするDNA配列を含む核酸を含む、DNA依存性RNA干渉(ddRNAi)構築物。
[項目19]
前記複数のRNAがそれぞれ短鎖ヘアピンRNA(shRNA)である、項目10、11または15~17のいずれか一項に記載の複数のRNAをコードするDNA配列を含む核酸を含む、DNA依存性RNA干渉(ddRNAi)構築物。
[項目20]
前記または各shRNAをコードするDNA配列が、
前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列との間に位置するループ配列をコードするDNA配列;および
3’末端にターミネーター配列
を含む、項目18または項目19に記載のddRNAi構築物。
[項目21]
前記shRNAをコードするDNA配列が、配列番号16~21のいずれか1つに記載の配列からなる群から選択される、項目18または20に記載のddRNAi構築物。
[項目22]
(a)配列番号16または17に記載の第1のshRNA配列をコードするDNA配列;
(b)配列番号18または19に記載の前記第2のshRNA配列をコードするDNA配列;および
(c)配列番号20または21に記載の前記第3のshRNA配列をコードするDNA配列
を含む、項目19または20に記載のddRNAi構築物。
[項目23]
shRNA配列をコードする前記または各DNA配列の上流にRNApolIIIプロモーターを含む、項目18~22のいずれか一項に記載のddRNAi構築物。
[項目24]
前記RNApolIIIプロモーターが、U6およびH1プロモーターから選択される、項目23に記載のddRNAi構築物。
[項目25]
(a)前記第1のshRNAをコードするDNA配列が、前記第1のshRNA配列をコードする前記DNA配列の上流にU6-1プロモーターを含み;
(b)前記第2のshRNAをコードするDNA配列が、前記第2のshRNA配列をコードする前記DNA配列の上流にU6-9プロモーターを含み;
(c)前記第3のshRNAをコードするDNA配列が、前記第3のshRNA配列をコードする前記DNA配列の上流にH1プロモーターを含む、
項目22~24のいずれか一項に記載のddRNAi構築物。
[項目26]
配列番号22または23に記載の配列を含む、項目22~25のいずれか一項に記載のddRNAi構築物。
[項目27]
項目18~26のいずれか一項に記載のddRNAi構築物を含む、組成物。
[項目28]
前記ddRNAi構築物が発現ベクター内に含まれる、項目27に記載の組成物。
[項目29]
3つのDNA依存性RNA干渉(ddRNAi)構築物を含む組成物であって、前記組成物が、
(a)以下を含む短鎖ヘアピンRNA(shRNA)配列をコードするDNA配列を含む、第1のddRNAi構築物:
(i)配列番号1に記載のPABPN1配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列;および
(ii)前記エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列;
(b)以下を含むshRNA配列をコードするDNA配列を含む、第2のddRNAi構築物:
(i)配列番号2に記載のPABPN1配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列;および
(ii)前記エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列;および
(c)以下を含むshRNA配列をコードするDNA配列を含む、第3のddRNAi構築物:
(i)配列番号3に記載のPABPN1配列と実質的に相補的である少なくとも17の連続したヌクレオチドの領域を含むエフェクター配列;および
(ii)前記エフェクター配列と実質的に相補的なエフェクター相補配列
を含む、組成物。
[項目30]
(a)前記第1のddRNAi構築物の前記DNA配列によってコードされる前記shRNAが以下:
(i)配列番号10に記載のエフェクター配列;および
(ii)配列番号11に記載のエフェクター相補配列
を含み;
(b)前記第2のddRNAi構築物の前記DNA配列によってコードされる前記shRNAが以下:
(i)配列番号12に記載のエフェクター配列;および
(ii)配列番号13に記載のエフェクター相補配列
を含み;
(c)前記第3のddRNAi構築物の前記DNA配列によってコードされる前記shRNAが以下:
(i)配列番号14に記載のエフェクター配列;および
(ii)配列番号15に記載のエフェクター相補配列
を含む、
項目29に記載の組成物。
[項目31]
各shRNA配列をコードする前記DNA配列が、
前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列との間に位置するループ配列をコードするDNA配列;および
前記shRNAの3’末端のターミネーター配列
を含む、項目29または30に記載の組成物。
[項目20]
(a)前記第1のddRNAi構築物の前記DNA配列によってコードされる前記shRNAが、配列番号16または17に記載の配列を含み;
(b)前記第2のddRNAi構築物の前記DNA配列によってコードされる前記shRNAが、配列番号18または19に記載の配列を含み;
(c)前記第3のddRNAi構築物の前記DNA配列によってコードされる前記shRNAが、配列番号20または21に記載の配列を含む、
項目17~19のいずれか一項に記載の組成物。
[項目32]
各ddRNAi構築物が、前記shRNAをコードする前記DNA配列の上流にRNApolIIIプロモーターを含む、項目29~31のいずれか一項に記載の組成物。
[項目33]
各RNApolIIIプロモーターが、U6プロモーターおよびH1プロモーターから選択される、項目32に記載の組成物。
[項目34]
前記ddRNAi構築物のそれぞれが、発現ベクター内に含まれる、項目29~33のいずれか一項に記載の組成物。
[項目35]
項目1~9のいずれか一項に記載のRNAまたは項目10~17のいずれか1項に記載の複数のRNAを含む組成物。
[項目36]
前記複数のRNAによって標的化されていないmRNA転写物を有する機能性PABPN1タンパク質をコードする核酸をさらに含む、項目35に記載の組成物。
[項目37]
前記ddRNAi構築物の前記shRNAによって標的化されていないmRNA転写物を有する機能性PABPN1タンパク質をコードする核酸をさらに含む、項目27~34のいずれか一項に記載の組成物。
[項目38]
前記機能性PABPN1タンパク質が、配列番号25に記載の配列を含む、項目36または項目37に記載の組成物。
[項目39]
前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸が配列番号24に記載のものである、項目36~38のいずれか一項に記載の組成物。
[項目40]
前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸が、発現ベクター内に含まれる、項目36~39のいずれか一項に記載の組成物。
[項目41]
前記ddRNAi構築物および前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸が同じ発現ベクター内に含まれる、項目27に付加される場合、項目37~40のいずれか一項に記載の組成物。
[項目42]
前記ddRNAi構築物および前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸が異なる発現ベクター内に含まれる、項目27に付加される場合、項目37~40のいずれか一項に記載の組成物。
[項目43]
各ddRNAi構築物が異なる発現ベクター内に含まれ、前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸が前記発現ベクターの少なくとも1つに含まれる、項目29に付加される場合、項目37~40のいずれか一項に記載の組成物。
[項目44]
前記ddRNAi構築物および前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸がそれぞれ異なる発現ベクター内に含まれる、項目29に付加される場合、項目37~40のいずれか一項に記載の組成物。
[項目45]
前記または各発現ベクターがプラスミドである、項目28、34または40~44のいずれか一項に記載の組成物。
[項目46]
前記または各発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターから選択されるウイルスベクターである、項目28、34または40~44のいずれか一項に記載の組成物。
[項目47]
前記または各発現ベクターがカチオン性DNA結合ポリマーと複合体化されている、項目28、34または40~45のいずれか一項に記載の組成物。
[項目48]
前記カチオン性DNA結合ポリマーがポリエチレンイミンである、項目47に記載の組成物。
[項目49]
1つ以上の薬学的に許容される担体をさらに含む、項目27~48のいずれか一項に記載の組成物。
[項目50]
対象における眼咽頭筋ジストロフィー(OPMD)の原因であるPABPN1タンパク質の発現を阻害する方法であって、前記方法が、前記対象に、項目1~9のいずれか一項に記載のRNA、または項目10~17のいずれか一項に記載の複数のRNA、または項目18~26のいずれか一項に記載のddRNAi構築物、または項目27~49のいずれか一項に記載の組成物、を投与することを含む、方法。
[項目51]
眼咽頭筋ジストロフィー(OPMD)を、それに罹患している対象において処置する方法であって、前記方法が、前記対象に、項目1~9のいずれか一項に記載のRNA、または項目10~17のいずれか一項に記載の複数のRNA、または項目18~26のいずれか一項に記載のddRNAi構築物、または項目27~49のいずれか一項に記載の組成物、を投与することを含む、方法。
[項目52]
眼咽頭筋ジストロフィー(OPMD)を、それに罹患している対象において処置する方法であって、前記方法が、対象に、
(a)OPMDの原因であるPABPN1タンパク質の発現を阻害するための1つ以上の薬剤であって、前記薬剤が以下から選択されるもの:(i)項目1~9のいずれか一項に記載のRNA;(ii)項目10~17のいずれか一項に記載の複数のRNA;(iii)項目18~38のいずれか一項に記載のddRNAi構築物を含む発現ベクター;および(iv)項目28、34または40~49のいずれか一項に記載の組成物;ならびに
(b)(a)において前記薬剤により発現される前記shRNAで標的化されていないmRNA転写物を有する機能性PABPN1タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター
を投与することを含む、方法。
[項目53]
前記機能性PABPN1タンパク質が、配列番号25に記載のアミノ酸配列を含む、項目52に記載の方法。
[項目54]
前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸が配列番号24に記載されるものである、項目52または53に記載の方法。
[項目55]
(a)の前記薬剤および(b)の前記発現ベクターが一緒に、同時にまたは連続的に、対象に投与される、項目52~54のいずれか一項に記載の方法。
[項目56]
(a)OPMDの原因であるPABPN1タンパク質の発現を阻害するための1つ以上の薬剤であって、前記薬剤が以下から選択されるもの:(i)項目1~9のいずれか一項に記載のRNA;(ii)項目10~17のいずれか一項に記載の複数のRNA;(iii)項目18~38のいずれか一項に記載のddRNAi構築物を含む発現ベクター;および(iv)項目28、34または40~49のいずれか一項に記載の組成物;ならびに
(b)(a)において前記薬剤により発現される前記shRNAで標的化されていないmRNA転写物を有する機能性PABPN1タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター
を含むキット。
[項目57]
前記機能性PABPN1タンパク質が、配列番号25に記載のアミノ酸配列を含む、項目56に記載のキット。
[項目58]
前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸が配列番号24に記載されるものである、項目56または57に記載のキット。
[項目59]
項目52~55のいずれか一項に記載の方法に従ってOPMDを処置するために使用される場合、項目56~58のいずれか一項に記載のキット。
配列番号1:PABPN1 mRNA領域1と称されるPABPN1タンパク質に対応するmRNA転写物内の領域のRNA配列。
配列番号2:PABPN1 mRNA領域2と称されるPABPN1タンパク質に対応するmRNA転写物内の領域のRNA配列。
配列番号3:PABPN1 mRNA領域3と称されるPABPN1タンパク質に対応するmRNA転写物内の領域のRNA配列。
配列番号4:それぞれssRNA1およびdsRNA1と称される、ssRNAおよびdsRNAのRNAエフェクター配列。
配列番号5:dsRNA1と称されるdsRNAのRNAエフェクター相補配列。
配列番号6:それぞれssRNA2およびdsRNA2と称される、ssRNAおよびdsRNAのRNAエフェクター配列。
配列番号7:dsRNA2と称されるdsRNAのRNAエフェクター相補配列。
配列番号8:それぞれssRNA3およびdsRNA3と称される、ssRNAおよびdsRNAのRNAエフェクター配列。
配列番号9:dsRNA3と称されるdsRNAのRNAエフェクター相補配列。
配列番号10:shRNA1およびshRNA2と称されるshRNAのRNAエフェクター配列。
配列番号11:shRNA1およびshRNA2と称されるshRNAのRNAエフェクター相補配列。
配列番号12:shRNA3およびshRNA4と称されるshRNAのRNAエフェクター配列。
配列番号13:shRNA3およびshRNA4と称されるshRNAのRNAエフェクター相補配列。
配列番号14:shRNA5およびshRNA6と称されるshRNAのRNAエフェクター配列。
配列番号15:shRNA5およびshRNA6と称されるshRNAのRNAエフェクター相補配列。
配列番号16:shRNA1と称されるshRNAのRNA配列。
配列番号17:shRNA2と称されるshRNAのRNA配列。
配列番号18:shRNA3と称されるshRNAのRNA配列。
配列番号19:shRNA4と称されるshRNAのRNA配列。
配列番号20:shRNA5と称されるshRNAのRNA配列。
配列番号21:shRNA6と称されるshRNAのRNA配列。
配列番号22:OPMDトリプル構築物短のDNA配列。
配列番号23:OPMDトリプル構築物長のDNA配列。
配列番号24:ヒトコドン最適化PABPN1 cDNA配列のDNA配列。
配列番号25:コドン最適化ヒトPABPN1タンパク質のアミノ酸配列。
配列番号26:ヒトコドン最適化PABPN1 cDNA配列のDNA配列(Myc-タグを有する)。
配列番号27:コドン最適化ヒトPABPN1タンパク質のアミノ酸配列(Myc-タグを有する)。
配列番号28:突然変異型ヒトPABPN1タンパク質のcDNA配列(FLAGタグを有する)。
配列番号29:突然変異型ヒトPABPN1タンパク質のアミノ酸配列(FLAGタグを有する)。
本明細書を通じて、別段の記載がない限り、または文脈上他の意味を必要としない限り、単一のステップ、特性、組成物、ステップ群または特性群または複数組成物への言及は、1つおよび複数(すなわち、1つ以上)のそのようなステップ、特性、組成物、ステップ群または特性群または複数組成物を包含するものとする。
「RNA」とは、少なくとも1つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β-D-リボフラノース部分の2’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二重鎖RNA、一本鎖RNA、単離されたRNA(部分的に精製されたRNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組換え産生されたRNAなど)、ならびに、1つまたは複数のヌクレオチドの付加、置換および/または変性による、天然に存在するRNAとは異なる変性RNA、を含む。そのような改変は、RNAの末端に、または内部的に、例えばRNAの1つ以上のヌクレオチドにおいて、非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。本開示のRNA分子中のヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドも含み得る。これらの改変されたRNAは、類縁体または天然に存在するRNAの類縁体と称され得る。
一例では、本開示はRNA、すなわち、RNAiを誘発できるものを提供し、ここで、RNAは、PABPN1タンパク質に対応するRNA転写物の領域と実質的に相補的である、少なくとも17の連続したヌクレオチドのエフェクター配列を含み、このRNA転写物の領域は配列番号1~3のいずれか1つに記載される。好ましくは、本開示のRNAは、30ヌクレオチド長未満のエフェクター配列を含む。例えば、好適なエフェクター配列は、17~29ヌクレオチド長の範囲であってもよい。
(i)配列番号4に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むssRNA;および
(ii)配列番号6に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むssRNA。
(i)配列番号4に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むssRNA;および
(ii)配列番号8に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むssRNA。
(i)配列番号6に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むssRNA;および
(ii)配列番号8に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むssRNA。
(i)配列番号4に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むssRNA;
(ii)配列番号6に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むssRNA;および
(iii)配列番号8に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列を含むssRNA。
(i)配列番号4に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号5に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むdsRNA;ならびに
(ii)配列番号6に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号7に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列を含むdsRNA。
(i)配列番号4に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号5に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むdsRNA;ならびに
(ii)配列番号8に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号9に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列を含むdsRNA。
(i)配列番号6に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号7に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むdsRNA;ならびに
(ii)配列番号8に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号9に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列を含むdsRNA。
(i)配列番号4に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号5に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むdsRNA;
(ii)配列番号6に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号7に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むdsRNA;ならびに
(iii)配列番号8に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号9に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列を含むdsRNA。
(i)配列番号10に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA;ならびに
(ii)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA。
(i)配列番号10に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA;ならびに
(ii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA。
(i)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA;ならびに
(ii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA。
(i)配列番号10に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA;
(ii)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA;ならびに
(iii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA。
(i)配列番号16に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA;および
(ii)配列番号18に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(i)配列番号16に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA;および
(ii)配列番号20に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(i)配列番号18に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA;および
(ii)配列番号20に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(i)配列番号16に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(ii)配列番号18に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA;および
(iii)配列番号20に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(i)配列番号10に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshmiRNA;ならびに
(ii)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshmiRNA。
(i)配列番号10に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshmiRNA;ならびに
(ii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshmiRNA。
(i)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshmiRNA;ならびに
(ii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshmiRNA。
(i)配列番号10に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshmiRNA;
(ii)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshmiRNA;ならびに
(iii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshmiRNA。
(i)配列番号16に記載の配列を含むかまたはそれからなるshmiRNA;および
(ii)配列番号18に記載の配列を含むかまたはそれからなるshmiRNA。
(i)配列番号16に記載の配列を含むかまたはそれからなるshmiRNA;および
(ii)配列番号20に記載の配列を含むかまたはそれからなるshmiRNA。
(i)配列番号18に記載の配列を含むかまたはそれからなるshmiRNA;および
(ii)配列番号20に記載の配列を含むかまたはそれからなるshmiRNA。
(i)配列番号16に記載の配列を含むかまたはそれからなるshmiRNA;
(ii)配列番号18に記載の配列を含むかまたはそれからなるshmiRNA;および
(iii)配列番号20に記載の配列を含むかまたはそれからなるshmiRNA。
shRNAまたはshmiRNAである本開示のRNAは、核酸から転写され得る。したがって、一例では、本開示は、本開示のRNAをコードする核酸を提供する。
(i)少なくとも1つのRNAは、エフェクター配列およびエフェクター相補配列を含み、RNAのエフェクター配列は、表4の「エフェクター」と表示された列に記載の配列からなり(一例では、それぞれのRNAのエフェクター相補配列は、表4の「エフェクター相補体」と表示された列に記載の配列からなる);
(ii)少なくとも1つのRNAは、エフェクター配列およびエフェクター相補配列を含み、RNAのエフェクター配列は、OPMDの原因となるPABPN1タンパク質に対応するRNA転写物の領域と実質的に相補的な少なくとも17の連続したヌクレオチドの配列からなる。
(i)配列番号10に記載の配列からなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列からなるエフェクター相補配列、を含むRNAをコードする配列;ならびに
(ii)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むRNAをコードする配列。
(i)配列番号10に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むRNAをコードする配列;ならびに
(ii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むRNAをコードする配列。
(i)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むRNAをコードする配列;ならびに
(ii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むRNAをコードする配列。
(i)配列番号10に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むRNAをコードする配列;
(ii)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むRNAをコードする配列;ならびに
(iii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むRNAをコードする配列。
(i)配列番号10に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA;ならびに
(ii)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA。
(i)配列番号10に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA;ならびに
(ii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA。
(i)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA;ならびに
(ii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA。
(i)配列番号10に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA;
(ii)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA;ならびに
(iii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNA。
(i)配列番号16に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA;および
(ii)配列番号18に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(i)配列番号16に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA;および
(ii)配列番号20に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(i)配列番号18に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA;および
(ii)配列番号20に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(i)配列番号16に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(ii)配列番号18に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA;および
(iii)配列番号20に記載の配列を含むかまたはそれからなるshRNA。
(i)U6プロモーター(例えば、U6-1プロモーター)および6つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号16に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列;および
(ii)U6プロモーター(例えば、U6-9プロモーター)および6つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号18に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列。
(i)U6プロモーター(例えば、U6-1プロモーター)および6つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号16に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列;および
(ii)H1プロモーターおよび5つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号20に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列。
(i)U6プロモーター(例えば、U6-1プロモーター)および6つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号18に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列;および
(ii)H1プロモーターおよび5つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号20に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列。
(i)U6プロモーター(例えば、U6-1プロモーター)および6つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号16に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列;
(ii)U6プロモーター(例えば、U6-9プロモーター)および6つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号18に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列;および
(iii)H1プロモーターおよび5つの連続したチミジン残基を含むターミネーターに、機能し得るように連結された配列番号20に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列。
(i)配列番号10に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物;ならびに
(ii)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物。
(i)配列番号10に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物;ならびに
(ii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物。
(i)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物;ならびに
(ii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物。
(i)配列番号10に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号11に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物;
(ii)配列番号12に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号13に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物;ならびに
(iii)配列番号14に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター配列、および配列番号15に記載の配列を含むかまたはそれからなるエフェクター相補配列、を含むshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物。
(i)U6プロモーター(例えば、U6-1プロモーター)および6つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号16に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物;および
(ii)U6プロモーター(例えば、U6-9プロモーター)および6つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号18に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物;
(i)U6プロモーター(例えば、U6-1プロモーター)および6つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号16に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物;および
(ii)H1プロモーターおよび5つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号20に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物。
(i)U6プロモーター(例えば、U6-9プロモーター)および6つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号18に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物;および
(ii)H1プロモーターおよび5つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号20に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物。
(i)U6プロモーター(例えば、U6-1プロモーター)および6つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号16に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物;
(ii)U6プロモーター(例えば、U6-9プロモーター)および6つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号18に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物;および
(iii)H1プロモーターおよび5つの連続したチミジン残基を含むターミネーター配列に、機能し得るように連結された配列番号20に記載の配列を含むまたはそれからなるshRNAをコードする配列を含むddRNAi構築物。
一例では、本開示のddRNAi構築物は、発現構築物内に含まれる。
細胞培養モデル
OPMDの細胞培養モデルとして有用な細胞系の例は、正常Ala10-ヒトPABPN1-FLAG(Ala10)または突然変異型Ala17-humanPABPN1-FLAG(Ala17)(後者はOPMDの特徴である)を発現するベクターでトランスフェクトした実施例3に記載のHEK293T細胞株(HEK293T、ATCC、Manassas、米国)である。
OPMDの研究に利用可能ないくつかの小型動物モデルがあり、その例は、Uyama et al.,(2005)Acta Myologica,24(2):84-88およびChartier and Simonelig(2013)Drug Discovery Today:technologies,10:e103-107に記載されている。例示的な動物モデルは、本明細書の実施例4および5に記載の、ならびに以前にDavies et al.,(2005)Nature Medicine,11:672-677およびTrollet et al.,(2010)Human Molecular Genetics,19(11):2191-2207に記載されている、A17.1トランスジェニックマウスモデルである。
一例では、本開示は、例えば細胞または動物に対する、機能性PABPN1タンパク質の置換剤を提供する。機能性PABPN1タンパク質は、OPMDの原因ではなく、本開示のRNAによって標的化されるmRNA転写物によってコードもされない。
細胞培養モデル
例示的なOPMDの細胞培養モデルが本明細書に記載され、実施例3に記載される。このようなOPMDの細胞培養モデルは、内因性PABPN1を標的とする本開示の1つ以上のRNAの存在下で、機能性PABPN1タンパク質を置換する本開示の薬剤の能力を評価するために使用され得る。
OPMDを研究するための例示的な動物モデルが記載されている。OPMDを研究するための例示的な動物モデルも、実施例4および5に記載される。
いくつかの例において、本開示のRNAまたはddRNAi構築物または発現ベクターは、組成物中に提供される。いくつかの例では、本開示の機能性PABPN1タンパク質をコードする核酸は、組成物中に提供される。いくつかの例において、本開示のRNAまたはddRNAi構築物または発現ベクターは、本開示の機能性PABPN1タンパク質をコードする核酸と共に組成物中に提供される。
一例では、本開示のRNAまたはddRNAi構築物または発現ベクターまたは組成物は、OPMDの原因であるPABPN1タンパク質を含む内因性PABPN1タンパク質の発現を対象において阻害するために使用され得る。
本開示はまた、キットにおける本開示のRNAまたはddRNAi構築物または発現ベクターまたは組成物を提供する。キットは、容器を含み得る。キットは、典型的には、その投与のための説明書と共に、本開示のRNAまたはddRNAi構築物または発現ベクターまたは組成物を含む。いくつかの例では、キットは、1つより多い本開示のRNAまたはddRNAiまたは発現ベクターまたは組成物を含む。一例では、キットは、以下を含む:(i)第1のキット構成要素として、本開示のRNAまたはddRNAi構築物または発現ベクターまたは組成物、および(ii)第2のキット構成要素として、本開示の機能性PABPN1タンパク質をコードするコドン最適化核酸を含む発現ベクターまたはそれを含む組成物。第1および第2のキットの構成要素は、キットに一緒にパッケージ化されてもよい。
公に入手可能なsiRNA設計アルゴリズム(Ambion、Promega、Invitrogen、OrigeneおよびMWGを含む)を用いて、PABPN1 mRNA配列からddRNAi構築物の設計のために潜在的標的を表す配列を同定した。ヒト、ウシおよびマウスにおいて、保存された配列を選択した。siRNAを合成し、これらにつきインビトロで試験し、ddRNAi構築物への変換のために3つの活性siRNAを選択した。二重鎖RNA(dsRNA)および短鎖ヘアピンRNA(shRNA)の設計の標的として選択された領域に対応するmRNA転写物を表1に示す。
PABPN1を標的とするshRNAの1つまたは3つを発現する自己相補性アデノ随伴ウイルス2型(scAAV2)プラスミドを、PABPN1を標的とするshRNAの1つまたは3つをcAAV2骨格にサブクローニングすることによって生成した。
この実施例は、インビトロでPABPN1の発現をノックダウンするための、実施例2において産生されたPABPN1 pAAV-shRNAプラスミドの能力を実証する。
20mM HEPES、10%ウシ胎児血清(FBS)および2mMグルタミン(PAA laboratories、Yeovil、UK)を含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)中で、ヒト胚性腎細胞(HEK293T、ATCC、Manassas、USA)を増殖させた。
簡潔には、HEK293T細胞を3x105細胞/ウェルで播種し、翌日、pAAV-shRNA5、pAAV-shRNAx3-shortまたはpAAV-shRNAx3-long(4μg/ウェル)のうち1つで、突然変異型hPABPN1-FLAG(pAAV mut-PABPN1-FLAG)(4μg/ウェル)(配列番号27)またはコドン最適化PABPN1(pAAV Opt-hPABPN1-MYC)(4μg/ウェル)(配列番号26)を発現するAAVプラスミドを伴いまたは伴わず、トランスフェクションした。対照として、HEK293T細胞を、HBVポリメラーゼ遺伝子(4μg/ウェル)に対しshRNAを発現するpAAV-HBVpolプラスミドでトランスフェクトした。HEK293T細胞を、抗生物質の非存在下、DMEM 10%FCS中、33℃で48時間インキュベートし、その後、細胞を回収し、ウェスタンブロッティングによる分析のために細胞溶解物を産生した。
NaCl 0.15M、0.1%SDS、50mM Tris(pH8)、2mM EDTAおよびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む10%Triton-X-100を含有するRIPA緩衝液中で細胞をホモジナイズすることにより細胞溶解物を調製した(Complete、Roche Diagnostics)。
この実施例は、実施例2で産生したscAAV8-shRNAx3-long組換えウイルスがインビボで内因性PABPN1の発現をノックダウンする能力およびそのコドン最適化ヒトPABPN1での置換を実証する。突然変異型PABPN1のノックダウンおよび遺伝子の非突然変異形態による置換の生理学的結果も実証される。
A17.1トランスジェニックマウスは以前に記載されている(Davies,Wang et al.,2005、Trollet,Anvar et al.,2010)。A17.1マウスおよびWT FvB対照は、ヘテロ接合キャリア株A17.1(Davies,Wang et al.,2005)をFvBバックグラウンドマウスと交配することによって生成した。ウシPABPN1について、生後4週間でマウスの遺伝子型を決定し、最小疾患設備(Royal Holloway-University of London)で飼料および水を自由に与えて飼育した。
グループ1(A17):両方のTA筋に2.5E+10個のscAAV8-shRNAx3-longのウイルス粒子を含む生理食塩水のIM注射による単回50μlのボーラス。
グループ2(A17):両方のTA筋に1.3E+11個のssAAV9-Opt-hPABPN1のウイルス粒子(コドン最適化hPABPN1を発現する)を含む生理食塩水のIM注射による単回50μlのボーラス。
グループ3(A17):両方のTA筋に2.5E+10個のscAAV8-shRNAx3-longのウイルス粒子および1.3E+11個のssAAV9-Opt-hPABPN1ウイルス粒子を含む生理食塩水のIM注射による単回50μlのボーラス。
グループ4(A17):生理食塩水のみの50μlのボーラス。
グループ5(FvB):生理食塩水のみの50μlのボーラス。
以前にTrollet et al.,(2010)Human Molecular Genetics,19(11):2191-2207に記載された方法論を使用して、注射後18週に、最大等張力および特定力を含むTA筋収縮特性の測定を行った。これらのデータを図4に示す。
製造者の説明書に従いTrizol(Invitrogen)を使用して、骨格筋試料から全RNAを抽出した。RNA試料は、ND-1000NanoDrop分光光度計(NanoDrop Technologies)を用いて定量した。製造者の説明書に従い、M-MLV逆転写酵素(Invitrogen)を用いてRNA(筋肉生検については50~250ng、細胞ペレットについては1~3μg)を逆転写した。SYBR緑色混合緩衝液(LightCycler(登録商標)480Sybr greenI Master)を使用して、合計9ulの反応容量で、cDNAを定量PCR反応に使用した。PCR反応は、次のように行った:95℃で8分、続いて:95℃で15秒、60℃で15秒、72℃で15秒を50サイクル。PCR産物の特異性は、以下のプログラムを用いて融解曲線分析によってチェックした:97℃まで0.11℃/秒で65℃上昇。
RT-PCRおよびリアルタイムRT-PCRに使用されるプライマーの配列は以下の通りである:
PABPN1-FWD 5’-TGACCCGGGGGACGGCGC-3’
PABPN1-REV 5’-ACTCGAGCTTTGATAGCTTCCAGC-3’
RPLP0-FWD 5’-GAGGACCTCACTGAGATTCGG-3’
PRLP0-REV 5’-TTCTGAGCTGGCACAGTGAC-3’
PABPN1タンパク質の核内凝集体の存在を検出するために、マウスから切除したTA筋(10μm)の切片に対して免疫組織化学を行った。簡潔には、TA筋の切片を、1M KCl、30mM HEPES、65mM PIPES、10mM EDTA、2mM MgCl2(pH6.9)中で1時間インキュベートして、可溶性タンパク質を除去した。次いで、切片を0.1M PBS、0.1%Triton X100中の1%正常ヤギ血清でブロックし、抗PABPN1一次抗体と4℃で一晩インキュベートし、同じ緩衝液で1:200に希釈した。次いで、切片をラミニン用抗体と共に1時間室温でさらにインキュベートし、次いで二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。最後に、ヘキストで切片を染色し、核を可視化した。
TA筋の横断連続凍結切片(10μm)に染色を行った。TA筋は、筋肉の長さに沿って10~12の異なる間隔で切断され、最大断面積(CSA)が決定された。組織形態の評価および線維症および結合組織の視覚化のために、筋肉の横断切片を、蛍光灯下でのさらなる検査のためにH&EおよびコラーゲンVIでそれぞれ染色した。中心核生成を評価するために、各セクションで5つの無作為領域を評価した。画像は、Olympus BX60顕微鏡(Olympus Optical、Hamburg、独国)を用いて視覚化し、CCDカメラ(Photometrics CoolSNAP fx;Roper Scientific、Tucson、AZ、米国)を用いてデジタル化し、MetaView画像解析システム(Universal Imaging、Downington、PA、米国)を用いて分析した。これらの領域の線維の総数を計数し、中心核形成した線維の数を線維の総数のパーセンテージとして表した(図5)。
次いで、組織についてウェスタンブロット分析を行い、PABPN1を検出した。簡潔には、プロテアーゼ阻害剤カクテルを用いたRIPA溶液(NaCl 0.15M、HEPES 0.05M、NP-40 1%、デオキシコール酸ナトリウム0.5%、SDS 0.10%、EDTA 0.01M)中の組織をホモジナイズすることによって筋肉溶解物を調製した。タンパク質を4~12%Bis-Trisゲル(Invitrogen)上で分離し、0.1M PBS、0.1%Tween-20中の5%ミルク中でのインキュベーションによりブロックしたニトロセルロース膜(Hybond ECL膜;Amersham Biosciences)に移した。ニトロセルロース膜をハウスキーピング対照としてPABPN1(abcam、1/10,000)またはマウスビンクリン(Sigma、1/10,000)に対して得た一次抗体で染色した。ニトロセルロース膜をさらにHRP結合抗ウサギおよび抗マウス二次抗体(Sigma、それぞれ1/2000および1/1000)と共にインキュベートした。免疫反応性バンドは、増強化学発光試薬(ECL;Amersham Biosciences)で検出し、膜をECL Hyperfilm(Amersham Biosciences)に暴露することによって視覚化した。
筋肉量(図5B)は4ヶ月の処置期間にわたって回復しなかったが、(i)内因性PABPN1を標的とする3つのshRNAを発現するscAAV8-shRNAx3-longのウイルス粒子、および(ii)shRNAによって標的化されていない置換コドン最適化ヒトPABN1を発現するssAAV8 Opt-hPABPN1ウイルス粒子、を投与したグループ3のマウスにつき、全筋力(図5A)が改善され、特定の筋力(図5C)が正常化されたことが示された(図5)。
Claims (26)
- 配列番号8に記載のエフェクター配列、および配列番号9に記載のエフェクター相補配列を含むヘアピンRNA干渉(RNAi)分子をコードするDNA配列を含む核酸。
- 前記エフェクター配列と前記エフェクター相補配列との間に位置するループ配列を含む、請求項1に記載の核酸。
- 前記ヘアピンRNAi分子が、配列番号20または21に記載の配列を含むショートヘアピンRNA(shRNA)である、請求項2に記載の核酸。
- 前記ヘアピンRNAi分子が、一次miRNA(pri-miRNA)骨格を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の核酸。
- 前記ヘアピンRNAi分子が、ショートヘアピンマイクロRNA(shmiR)分子である、請求項4に記載の核酸。
- (a)請求項1~5のいずれか一項に記載の少なくとも1つの核酸;および
(b)少なくとも17の連続したヌクレオチドのエフェクター配列、およびエフェクター相補配列を含むヘアピンRNAi分子をコードするDNA配列を含む少なくとも1つの核酸であって、前記エフェクター配列がPABPN1タンパク質に対応するRNA転写物における対応する長さの領域と実質的に相補的である、前記少なくとも1つの核酸;
を含み、(a)と(b)の前記核酸によってコードされる前記ヘアピンRNAi分子が異なるエフェクター配列を含む、複数の核酸。 - (a)と(b)の前記核酸によってコードされる前記ヘアピンRNAi分子が一次miRNA(pri-miRNA)骨格を含むショートヘアピンマイクロRNA(shmiR)である、請求項6に記載の複数の核酸。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、または請求項6または7に記載の複数の核酸を含む、DNA依存性RNA干渉(ddRNAi)構築物。
- ヘアピンRNAi分子をコードする各DNA配列が筋肉特異的プロモーターに機能し得るように連結されている、請求項8に記載のddRNAi構築物。
- 請求項8または9に記載のddRNAi構築物および(ii)1つ以上の薬学的に許容される担体を含む、組成物。
- 前記ddRNAi構築物が発現ベクター内に含まれる、請求項10に記載の組成物。
- 前記ddRNAi構築物によってコードされる前記ヘアピンRNAi分子によって標的化されないmRNA転写物を有する機能性PABPN1タンパク質をコードする核酸をさらに含む、請求項10または11に記載の組成物。
- 前記機能性PABPN1タンパク質が、配列番号25に記載の配列を含む、請求項12に記載の組成物。
- 前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸が配列番号24に記載のものである、請求項12または13に記載の組成物。
- 前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸が、発現ベクター内に含まれる、請求項12~14のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸が、前記ddRNAi構築物と同じ発現ベクター内に含まれる、請求項15に記載の組成物。
- 前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸と、前記ddRNAi構築物とが異なる発現ベクター内に含まれる、請求項15に記載の組成物。
- (i)前記発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターから選択されるウイルスベクターであるか;または
(ii)前記ddRNAi構築物内のヘアピンRNAi分子をコードする各DNA配列がプロモーターに機能し得るように連結されているか;または
(iii)前記ddRNAi構築物内のヘアピンRNAi分子をコードする各DNA配列が筋肉特異的プロモーターに機能し得るように連結されているか;または
(iv)(i)、(ii)、及び(iii)の任意の組合せである、
請求項11~17のいずれか一項に記載の組成物。 - (i)前記発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターから選択されるウイルスベクターであるか;または
(ii)前記ddRNAi構築物内のヘアピンRNAi分子をコードする各DNA配列がプロモーターに機能し得るように連結されているか;または
(iii)前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸がプロモーターに機能し得るように連結されているか;または
(iv)前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸、および前記ddRNAi構築物内のヘアピンRNAi分子をコードする各DNA配列が同一のプロモーターに機能し得るように連結されているか;または
(v)前記または各プロモーターが筋肉特異的プロモーターである(ii)、(iii)、及び(iv)の任意の組合せであるか;または
(vi)(i)~(v)の任意の組合せである、
請求項16に記載の組成物。 - (i)前記発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターから選択されるウイルスベクターであるか;または
(ii)前記ddRNAi構築物内のヘアピンRNAi分子をコードする各DNA配列がプロモーターに機能し得るように連結されているか;または
(iii)前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸がプロモーターに機能し得るように連結されているか;または
(iv)各プロモーターが筋肉特異的プロモーターである(ii)及び(iii)の任意の組合せであるか;または
(v)(i)~(iv)の任意の組合せである、
請求項17に記載の組成物。 - 対象において眼咽頭筋ジストロフィー(OPMD)の原因であるPABPN1タンパク質の発現を阻害するための、請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、または請求項6または7に記載の複数の核酸、または請求項8または9に記載のddRNAi構築物、または請求項10~20のいずれか一項に記載の組成物を含む組成物。
- 眼咽頭筋ジストロフィー(OPMD)を、それに罹患している対象において処置するための、請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、または請求項6または7に記載の複数の核酸、または請求項8または9に記載のddRNAi構築物、または請求項10~20のいずれか一項に記載の組成物を含む組成物。
- 眼咽頭筋ジストロフィー(OPMD)の処置又は予防のための医薬の製造における、請求項1~5のいずれか一項に記載の核酸、または請求項6または7に記載の複数の核酸、または請求項8または9に記載のddRNAi構築物、または請求項10~20のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- (a)請求項8もしくは9に記載のddRNAi構築物、またはそれを含む発現ベクター;および
(b)(a)において前記ddRNAi構築物により発現されるヘアピン分子によって標的化されないmRNA転写物を有する機能性PABPN1タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター
を含むキット。 - 前記機能性PABPN1タンパク質が、配列番号25に記載のアミノ酸配列を含む、請求項24に記載のキット。
- 前記機能性PABPN1タンパク質をコードする前記核酸が配列番号24に記載されるものである、請求項24または25に記載のキット。
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