RU2451525C2 - Биоразрушаемые катионные полимеры - Google Patents

Биоразрушаемые катионные полимеры Download PDF

Info

Publication number
RU2451525C2
RU2451525C2 RU2008142416/04A RU2008142416A RU2451525C2 RU 2451525 C2 RU2451525 C2 RU 2451525C2 RU 2008142416/04 A RU2008142416/04 A RU 2008142416/04A RU 2008142416 A RU2008142416 A RU 2008142416A RU 2451525 C2 RU2451525 C2 RU 2451525C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
polymer
pei
integer
formula
oligonucleotide
Prior art date
Application number
RU2008142416/04A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2008142416A (ru
Inventor
Йасунобу ТАНАКА (US)
Йасунобу ТАНАКА
Гэнг ЦАО (US)
Гэнг ЦАО
Лей ЙЮ (US)
Лей ЙЮ
Original Assignee
Нитто Денко Корпорэйшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Нитто Денко Корпорэйшн filed Critical Нитто Денко Корпорэйшн
Publication of RU2008142416A publication Critical patent/RU2008142416A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2451525C2 publication Critical patent/RU2451525C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/0206—Polyalkylene(poly)amines
    • C08G73/0213—Preparatory process
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/593—Polyesters, e.g. PLGA or polylactide-co-glycolide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2201/00—Properties
    • C08L2201/06—Biodegradable
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/701—Integrated with dissimilar structures on a common substrate
    • Y10S977/702—Integrated with dissimilar structures on a common substrate having biological material component
    • Y10S977/704—Nucleic acids, e.g. DNA or RNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Biological Depolymerization Polymers (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биоразрушаемым полимерам, пригодным для доставки биологических агентов в клетки. Предложен полимер, содержащий звено формулы (I), где PEI - звено полиэтиленимина с молекулярным весом менее 600 дальтон; R - электронная пара; L выбран из С2-С50 карбоксиалкенила и остатка жирных кислот от C12 до C18; m - целое число от 1 до 30. Предложен также полимерный комплекс с олигонуклеотидом и способ трансфекции клетки эукариот с его использованием. Технический результат - предложенный полимер применим для безопасной и эффективной доставки малой интерферирующей РНК или олигонуклеотидов в клетки. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 5 пр.
Figure 00000001

Description

Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки США №60/789842, поданной 6 апреля 2006, содержание которой в полном объеме включено в настоящее описание в виде ссылки, включая чертежи. Кроме этого настоящая заявка связана с заявкой на патент США №11/216986, поданной 31 августа 2005, которая полностью включена в настоящее описание в виде ссылки, включая чертежи.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композициям и способам доставки биологически активных агентов в клетки. В частности, настоящее изобретение относится к катионным липополимерам, содержащим поли- или олиго-этиленимин (PEI), биодеградируемую группу и относительно гидрофобную группу, и к способам создания и применения таких липополимеров для доставки олигонуклеотидов, таких как малая интерферирующая РНК и антисенс.
Описание предшествующего уровня техники
Для доставки биологически активных агентов доступен ряд методов, таких как доставка плазмидных ДНК в клетки, включая использование вирусных систем трансфекции и невирусных систем трансфекции. Обычно вирусные системы обладают большей эффективностью трансфекции по сравнению с невирусными системами, однако существуют вопросы касательно безопасности вирусных систем. Смотри Verma I.M and Somia N. Nature 389 (1997), p.239-242; Marhsall E.Science 286 (2000), p.2244-2245. Кроме этого получение вирусных векторов обычно бывает сложным и дорогостоящим процессом. Хотя, в основном, невирусные системы трансфекции являются менее эффективными в сравнении с вирусными системами, им уделяют значительное внимание, так как, в основном, считается, что они являются более безопасными и более легкими в получении по сравнению с вирусными системами.
Ряд невирусных систем трансфекции включает использование катионных полимеров, которые образуют комплекс с плазмидными ДНК. Примеры катионных полимеров, которые были использованы в качестве носителей генов, включают поли(L-лизин) (PLL), полиэтиленимин (PEI), хитозан, РАМАМ дендримеры и поли(2-диметиламино)этилметакрилат (pDMAEMA). К сожалению, обычно с PLL эффективность трансфекции является слабой, и высокомолекулярный PLL проявляет значительную токсичность для клеток. В некоторых случаях PEI, молекулярный вес которого находится в диапазоне от 20000 до 25000 дальтон, обеспечивает эффективный перенос генов без необходимости использования эндосомолитических или направляющих агентов. Смотри Boussif О., Lezoualc'h F., Zanta M. A., Mergny M.D., Scherman D., Demeneix В., Behr J.P., ProcNatl Acad Sci USA. Aug. 1, 1995, 92(16) 7297-301. Однако PEI, молекулярный вес которых находится в диапазоне от 400 до 2000 дальтон, являются неэффективными для доставки плазмидных ДНК. В качестве систем для доставки генов был изучен ряд дендримеров полиамидоамина. Смотри Eichman J.D., Bielinska A.U., Kukowska-Latallo J.F., Baker J.R. Jr., Pharm. Sci. Technol. Today 2000 July; 3(7):232-245. К сожалению, было показано, что как PEI, так и дендримеры являются токсичными для клеток, что, таким образом, ограничивает возможность использования PEI в качестве средства доставки генов применительно к пациентам людям. Кроме этого стоимость дендримеров полиамидоамина, обладающих коммерчески эффективным уровнем трансфекции генов, является относительно высокой.
Для доставки генов в клетки млекопитающих были описаны носители для генов, таких как плазмидные ДНК, сделанные с разрушаемыми катионными полимерами с пониженной цитотоксичностью. Смотри Lim Y.B., Kim S.M., Lee W.K., Yang T.G., Lee M.J., Suh H., Park J.S., Am. Chem. Soc., 123 (10), 2460-2461, 2001. К сожалению, данные разрушаемые системы также проявляют низкую эффективность трансфекции плазмидных ДНК по сравнению с неразрушаемыми полимерами. Для улучшения эффективности трансфекции низкомолекулярных PEI, Gosselin и др. показали, что высокомолекулярные PEI могут быть получены посредством использования дисульфид-содержащих линкеров с низкомолекулярным PEI. Смотри Gosselin, Micheal A., Guo, Menjin, and Lee, Robert J. Bioconjugate Chem. 2001. 12:232-245. PEI полимеры, полученные с использованием дитиобис(сукцинимидилпропионата) DSP и диметил-3,3′-дитиобиспропионимидата-2HCl (DTBP), показывали сравнимую эффективность генной трансфекции и пониженную цитотоксичность. Однако дисульфид-содержащие линкеры являются дорогостоящими, что делает крупномасштабное получение данных систем затруднительным и неприемлемым. Полимеры с дисульфид-содержащими линкерами являются разрушаемыми только при восстановительных условиях, что ограничивает применение полимера при других условиях.
Lynn и др. описали способ синтеза биоразрушаемых катионных полимеров с использованием диакрилатов в качестве молекул-линкеров между катионными соединениями. Смотри Lynn, David A.; Anderson, Daniel G.; Putnam, David; and Langer, Robert. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8155-8156. Однако синтез данных полимеров для завершения требует дни, и количества эффективного продукта, которые могут быть использованы для доставки генов, являются низкими. Согласно способам Lynn и др. были получены более одной сотни катионных полимеров, однако лишь только два из этих полимеров показали эффективный уровень трансфекции генов.
Для катионных полимеров, таких как PEI, не было показано, что они являются эффективными для доставки малой интерферирующей РНК. Биоразрушаемые катионные полимеры, полученные согласно способам Lynn и др., не были использованы для доставки малой интерферирующей РНК или олигонуклеотидов.
Таким образом, остается потребность в катионных полимерах, которые могут быть использованы для безопасного и эффективного облегчения доставки малой интерферирующей РНК или олигонуклеотидов в клетки.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение раскрывает некоторые полимерные композиции, которые способны доставлять олигонуклеотиды в клетки. В некоторых вариантах полимер также может образовывать комплекс с другими остатками, такими как агенты для улучшения доставки, и/или соединениями для диагностической визуализации. Кроме этого авторы открыли способы доставки олигонуклеотидов в клетку(и) с использованием полимерных композиций.
Один из вариантов настоящего изобретения включает полимер, содержащий повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из формулы (I):
Figure 00000001
где PEI может быть повторяющимся звеном полиэтиленимина, имеющим молекулярный вес менее чем 600 дальтон. R может быть выбран из группы, состоящей из пары электронов, водорода, С2-С10 алкила, С2-С10 гетероалкила, С5-С30 арила и С2-С30 гетероарила, L может быть выбран из группы, состоящей из С2-С50 алкила, C2-C50 гетероалкила, С2-С20 алкенила, C2-C50 гетероалкенила, C5-C50 арила, C2-C50 гетероарила, С2-С50 алкинила, C2-C50 гетероалкинила, C2-C50 карбоксиалкенила и C2-C50 карбоксигетероалкенила, и m является целым числом, которое может находиться в диапазоне от примерно 1 до примерно 30.
В одном из вариантов PEI может включать, по крайней мере, одно повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из формулы (IIa) и формулы (IIb):
Figure 00000002
где x является целым числом в диапазоне от примерно 1 до примерно 12, у является целым числом в диапазоне от примерно 1 до примерно 6 и z является целым числом в диапазоне от примерно 1 до примерно 13.
В некоторых вариантах полимер может быть биоразрушаемым. Подходящие механизмы, посредством которых полимер может разрушаться, включают, но не ограничиваются ими, гидролиз, ферментативное расщепление, восстановление, фоторасщепление и разрушение ультразвуком. В некоторых вариантах L может быть выбран из группы, состоящей из С2-С50 алкила, С2-С50 гетероалкила, C2-C50 алкенила, С2-С50 гетероалкенила, С2-С50 алкинила и C2-C50 гетероалкинила. В некоторых вариантах L может быть выбран из группы, состоящей из жирных кислот от С12 до C18, холестерина и их производных.
В одном из вариантов полимер может иметь средневесовой молекулярный вес в диапазоне от примерно 500 дальтон до примерно 1000000 дальтон. В другом варианте полимер может иметь средневесовой молекулярный вес в диапазоне от примерно 1000 дальтон до примерно 200000 дальтон.
В некоторых вариантах полимер может быть сетчатым полимером с поперечными связями.
Другой вариант настоящего изобретения включает полимер, который также может содержать олигонуклеотид, который образует комплекс с полимером. Примеры подходящих олигонуклеотидов включают, но не ограничиваются ими, олигомеры РНК, такие как малая интерферирующая РНК, и олигомеры ДНК, такие как антисенс.
Помимо олигонуклеотидов полимер также может содержать агент, улучшающий доставку, способный проникать в клетку эукариот. При необходимости полимер также может содержать диагностическое соединение для визуализации, которое может образовывать комплекс с полимером. Агент, улучшающий доставку, может облегчать одну или несколько из следующих функций в клетке эукариот: узнавание рецептором, интернализацию, выход олигонуклеотида из эндосомы клетки, ядерную локализацию, высвобождение олигонуклеотида и стабилизацию системы. Примеры олигонуклеотидов включают, но не ограничиваются ими, малую интерферирующую РНК и антисенс. В других вариантах агент, улучшающий доставку, может быть присоединен к полимеру.
Один из вариантов настоящего изобретения включает способ трансфекции клетки эукариот, включающий контакт клетки с полимером, в результате чего олигонуклеотид доставляется в клетку, где полимер также может содержать олигонуклеотид.
Другой вариант настоящего изобретения включает способ лечения млекопитающего, включающий установление млекопитающего, нуждающегося в генной терапии, и введение полимера, который соединен с олигонуклеотидом, необходимым млекопитающему, где олигонуклеотид включает малую интерферирующую РНК, которая является эффективной для понижения или подавления экспрессии интересующего гена.
В некоторых вариантах полимер также может включать диагностическое соединение для визуализации, которое образует комплекс с полимером. Один из вариантов настоящего изобретения включает способ доставки диагностического соединения для визуализации млекопитающему, включающий введение полимера млекопитающему, где полимер образует комплекс с диагностическим соединением для визуализации.
Один из вариантов настоящего изобретения включает библиотеку полимеров, содержащую множество полимеров, где, по крайней мере, один из параметров, выбранный из группы, состоящей из R, L, PEI и m, отличается от, по крайней мере, двух параметров полимера.
Другой вариант настоящего изобретения включает медицинскую диагностическую систему, содержащую полимер и лиганд, который может распознавать специфический рецептор клетки эукариот. При необходимости полимер может быть соединен с лигандом.
В еще одном варианте настоящего изобретения фармацевтическая композиция может содержать сенсибилизирующий агент и полимер. Сенсибилизирующий агент может быть чувствительным к облучению видимым светом, ультрафиолетовому облучению или к обоим излучениям. В одном варианте фармацевтическая композиция может содержать сенсибилизирующий агент и полимер, где полимер может иметь сродство к олигонуклеотиду.
В одном из вариантов диагностическая композиция для визуализации может содержать контрастирующий агент для визуализации и полимер. При необходимости диагностическая композиция для визуализации также может содержать агент направленной доставки.
Один из вариантов настоящего изобретения включает полимер, содержащий повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из формулы (I):
Figure 00000001
где PEI является повторяющимся звеном полиэтиленимина, содержащим, по крайней мере, одно повторяющееся звено формулы (IIb):
где z является целым числом в диапазоне от 1 до 13. R может быть выбран из группы, состоящей из пары электронов, водорода, С2-С10 алкила, С2-С10 гетероалкила, C5-С30 арила и С2-С30 гетероарила. L может быть выбран из группы, состоящей из С2-С50 алкила, C2-C50 гетероалкила, С2-С50 алкенила, С2-С50 гетероалкенила, С5-С50 арила, С2-С50 гетероарила, С2-С50 алкинила, С2-С50 гетероалкинила, С2-С50 карбоксиалкенила и С2-С50 карбоксигетероалкенила; и m является целым числом, которое может находится в диапазоне от примерно 1 до примерно 30.
В одном из вариантов PEI, содержащий, по крайней мере, одно повторяющееся звено формулы (IIb), может иметь молекулярный вес менее чем 600 Дальтон.
В некоторых вариантах PEI также содержит повторяющееся звено формулы IIa:
Figure 00000002
где x может быть целым числом в диапазоне от примерно 1 до примерно 12 и у может быть целым числом в диапазоне от примерно 1 до примерно 6.
В одном варианте полимер, где PEI содержит повторяющееся звено формулы (IIa), может иметь молекулярный вес менее чем 600 дальтон.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 является фотографией усиленной экспрессии зеленых флуоресцирующих белков (EFFP) в клетках HT-1080EGFP после обработки малой интерферирующей РНК, входящей в комплекс с липополимерами (YT-10, YT-11, YT-22, YT-23, YT-24 и YT-25), липофектамином 2000 (положительный контроль) и без какой-либо обработки (отрицательный контроль).
Фиг.2 является фотографией усиленной экспрессии зеленых флуоресцирующих белков (EFFP) в клетках HeLa-EGFP после обработки малой интерферирующей РНК, входящей в комплекс с липополимерами (YT-10, YT-11, YT-22, YT-23, YT-24 и YT-25), липофектамином 2000 (положительный контроль) и без какой-либо обработки (отрицательный контроль).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Данный вариант обеспечивает катионные полимеры, содержащие полиэтиленимин, биоразрушаемую группу и относительно гидрофобную «липо» группу. Предпочтительные катионные липополимеры содержат повторяющееся звено, выбранное из группы, состоящей из формулы (I):
Figure 00000001
В формуле (I) PEI является полиэтиленимином, сложноэфирная связь является биоразрушаемой группой и L представляет относительно гидрофобную «липо» группу. Например, в некоторых вариантах L выбран из группы, состоящей из С2-С50 алкила, С2-С50 гетероалкила, C2-C50 алкенила, C2-C50 гетероалкенила, C5-C50 арила, C2-C50 гетероарила, C2-C50 алкинила, C2-C50 гетероалкинила, С2-С50 карбоксиалкенила и С2-С50 карбоксигетероалкенила. В предпочтительном варианте L выбран из группы, состоящей из С2-С50 алкила, C2-C50 гетероалкила, С2-С50 алкенила, С2-С50 гетероалкенила, C2-C50 алкинила и C2-C50 гетероалкинила. В более предпочтительном варианте L выбран из группы, состоящей из жирной кислоты от C12 до C18, холестерина и их производных.
В формуле (I) R может представлять пару электронов или атом водорода. Для специалиста в данной области техники ясно, что если R представляет пару электронов, то повторяющееся звено формулы (I) является катионным при низких pH. Также в формуле (I) R может представлять относительно гидрофобную липогруппу, такую как С2-С10 алкил, С2-С10 гетероалкил, С5-С30 арил и С2-С30 гетероарил, в данном случае будет очевидно, что атом азота несет катионный заряд, как правило, в широком диапазоне pH.
PEI может содержать, по крайней мере, одно повторяющееся звено формулы (IIa) и/или (IIb), в которых x является целым числом в диапазоне от примерно 1 до примерно 12, у является целым числом в диапазоне от примерно 1 до примерно 6 и z является целым числом в диапазоне от примерно 1 до примерно 13.
Figure 00000002
Очевидно, что используемая здесь «формула II» относится к PEI, который содержит формулу (IIb) и (IIa) по отдельности или вместе.
Катионные липополимеры, содержащие повторяющиеся звенья формулы (I), могут быть получены по реакции мономера диакрилата формулы (III) с полиэтиленимином (PEI), как показано на Схеме А ниже:
Схема А
Figure 00000004
Figure 00000005
В формуле (III) R и L имеют такие же значения, как указано выше для катионных липополимеров, содержащих повторяющиеся звенья формулы (I). На Схеме А показано получение полимера, содержащего повторяющееся звено формулы (I).
Показанная на Схеме А реакция может быть проведена посредством перемешивания PEI и диакрилата (III) в общем растворителе, таком как этанол, при перемешивании предпочтительно при комнатной температуре в течение нескольких часов, последующего упаривания растворителя для выделения полученного полимера.
Настоящее изобретение не является связанным с какой-либо теорией, однако считается, что реакция между PEI и диакрилатом (III) включает реакцию Михаэля между одним или несколькими аминами PEI с двойной(ными) связью(ями) диакрилата. Смотри J. March, Advanced Organic Chemistry 3rd Ed., p.711-712 (1985). Приведенный на Схеме А диакрилат может быть получен, как показано в Примерах, описанных далее.
Согласно Схеме А посредством варьирования молекулярного веса и структуры PEI, размера и типа групп R и L в диакрилате (III) и отношения диакрилата (III) к PEI можно получить большое разнообразие полимеров, содержащих повторяющееся звено формулы (I). Могут быть использованы смеси различных диакрилатов и/или смеси различных PEI. PEI могут быть многофункциональными и, таким образом, могут быть способны реагировать с двумя или несколькими диакрилатами. Для получения сетчатых катионных липополимеров могут быть использованы кросс-сшивающие агенты и/или могут подбираться относительные соотношения многофункционального PEI и диакрилата (III) для получения сетчатых катионных липополимеров. Предпочтительно молекулярный вес PEI менее чем 600 дальтон. Предпочтительно мольное отношение PEI к диакрилату находится в диапазоне от примерно 1:0,5 до примерно 1:20. Средне-весовой молекулярный вес катионного липополимера может находиться в диапазоне от примерно 500 дальтон до примерно 1000000 дальтон, предпочтительно в диапазоне от примерно 1000 дальтон до примерно 200000 дальтон. Молекулярный вес может быть определен посредством эксклюзионной хроматографии с использованием ПЭГ стандартов или с помощью электрофореза на агарозном геле. В предпочтительном варианте изобретения обеспечивается библиотека полимеров посредством получения множества катионных липополимеров, в которых R, L, PEI и/или m являются отличными от, по крайней мере, остальных двух параметров полимеров.
Катионный липополимер является разрушаемым, более предпочтительно био-разрушаемым, например разрушаемым посредством механизма, выбранного из группы, состоящей из гидролиза, ферментативного расщепления, восстановления, фоторасщепления и разрушения ультразвуком. Настоящее изобретение не ограничивается теорией, однако считается, что разрушение катионных липополимеров формулы (I) внутри клетки протекает посредством ферментативного расщепления и/или гидролиза сложноэфирных связей.
Катионные липополимеры могут образовывать комплексы с олигонуклеотидами и, таким образом, являться пригодными в качестве носителей для доставки олигонуклеотидов в клетку. Например, полимер может быть использован для лечения млекопитающего, нуждающегося в генной терапии, посредством введения млекопитающему комплекса полимера с олигонуклеотидом, таким как малая интерферирующая РНК, которая эффективна для понижения или подавления экспрессии интересующего гена. Катионные липополимеры, которые содержат олигонуклеотид, входящий в комплекс с полимером, могут быть получены посредством перемешивания катионных липополимеров и олигонуклеотидов в общем растворителе, более предпочтительно посредством способов, описанных далее в примерах.
Катионные липополимеры, которые содержат олигонуклеотиды, присоединенные к полимеру, также могут содержать агенты для улучшения доставки, способные проникать в клетку эукариот. Агенты для улучшения доставки могут быть растворены или смешаны с комплексом или могут быть связаны (например, ковалентно присоединены или образуют комплекс) с катионным липополимером. Агенты для улучшения доставки являются веществами, которые способствуют транспортировке олигонуклеотида в клетку обычно посредством улучшения транспортировки комплекса олигонуклеотид/носитель через мембрану, снижения разрушения во время транспортировки и/или способствуют высвобождению олигонуклеотида из носителя. Предпочтительно транспорт олигонуклеотида, такого как малая интерферирующая РНК, в клетку включает высвобождение олигонуклеотида из носителя после того, как комплекс олигонуклеотид/носитель преодолел клеточную мембрану, мембрану эндосомы и ядерную мембрану. Например, в случае малой интерферирующей РНК комплекс малая интерферирующая РНК/носитель сначала проходит через мембрану клетки. Если это заканчивается эндоцитозом, то комплекс малая интерферирующая РНК/носитель является интернализованным. Носитель, нагруженный малой интерферирующей РНК, окружается клеточной мембраной с образованием пузырька, и затем пузырек отщепляется. В результате образуется клеточная эндосома, которая является большой мембранной структурой, включающей малую интерферирующую РНК и носитель.
В основном агенты для улучшения транспортировки подразделяются на две категории: системы вирусных носителей и системы невирусных носителей. Так как вирусы человека в ходе эволюции разработали пути преодоления вышеуказанных барьеров для транспорта в ядра, вирусы или вирусные компоненты являются пригодными для транспортировки нуклеиновых кислот в клетки. Одним из примеров вирусного компонента, пригодного в качестве агента для улучшения доставки, является белок гемагглютинин (HA-peptide). Данный вирусный белок способствует транспортировке биомолекул в клетки посредством разрушения эндосомы. При кислых значениях pH эндосомы данный белок вызывает высвобождение биологических молекул и носителя в цитозоль. Другие примеры вирусных компонент, пригодных в качестве агентов для улучшения доставки, известны специалисту в данной области техники.
Невирусные агенты для улучшения доставки обычно являются как основанными на полимерах, так и основанными на липидах. В основном они являются поликатионами, которые выступают для сбалансирования отрицательного заряда нуклеиновой кислоты. Поликатионные полимеры показали значительные обнадеживающие результаты в качестве невирусных агентов для улучшения доставки генов, в частности, из-за их способности уплотнять плазмидные ДНК неограниченного размера и из-за соображений безопасности относительно вирусных векторов. Примеры включают пептиды с участками, богатыми основными аминокислотами, такими как олиголизин, олигоаргинин или их комбинациями и PEI. Считается, что данные поликатионные полимеры способствуют транспортировке посредством уплотнения ДНК. Версии поликатионов с разветвленными цепями, такие как PEI и звездообразные дендримеры, могут опосредовать как сжатие ДНК, так и выход из эндосомы. Смотри Boussif и др., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.92: 7297-7301. PEI может быть получен в виде сильноразветвленного полимера с терминальными аминогруппами, которые ионизируются при pH 6,9, и внутренними аминами, которые ионизируются при pH 3,9. Вследствие такой организации PEI может создавать изменение в значении pH везикулы, что приводит к набуханию везикулы и, в конечном счете, высвобождению из окружения эндосомы.
Другим путем улучшения доставки для катионных липополимеров является включение лигандов, которые распознаются рецепторами на клетке, которые являются целью для доставки олигонуклеотида. Затем доставка олигонуклеотида в клетку может быть инициирована посредством узнавания рецептором. В данном контексте термин «лиганд» относится к биомолекуле, которая может связываться со специфическим рецепторным белком, локализованным на поверхности клетки мишени или в ее ядре или цитозоле. В варианте изобретения лиганд может быть антителом, гормоном, феромоном или нейромедиатором или любой другой биомолекулой, способной выступать в качестве лиганда, который связывается с рецептором. В предпочтительном примере лигандом является олигонуклеотид. Под антителом имеется в виду любой белок, продуцируемый В лимфоцитом в ответ на антиген. При связывании лиганда с определенным клеточным рецептором стимулируется эндоцитоз. Примерами лигандов, которые были использованы с различными типами клеток для улучшения транспорта олигонуклеотида, являются галактоза, трансферрин, гликопротеин азиалооросомукоид, нить аденовируса, малярийный белок спорозонта, эпидермальный фактор роста, капсид человеческого вируса папилломы, фактор роста фибробластов и фолевая кислота. В случае фолатного рецептора связанный лиганд интернализуется в ходе процесса, называемого потоцитоз, при котором рецептор связывается с лигандом, расположенный рядом участок мембраны отделяется от клеточной мембраны, и затем интернализованное вещество проходит через мембрану везикулы в цитоплазму. Смотри Gottschalk и др. (1994) Gene Ther 1:185-192. В одном варианте полимер формулы (I) и лиганд, который распознается специфическим рецептором клетки эукариот, могут быть использованы в качестве медицинской системы диагностики.
Считается, что для разрушения эндосомы существуют различные агенты, улучшающие доставку. Например, помимо НА-белка, писанного выше, в качестве эндосомолитических агентов также были использованы частицы дефектного вируса. Смотри Cotton и др. (July 1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89: p. 6094-6098. Обычно невирусные агенты являются либо амфифильными, либо липидной природы.
Высвобождение олигонуклеотидов, таких как малая интерферирующая РНК, в цитоплазму клетки может усиливаться агентами, которые опосредуют разрыв эндосомы, уменьшают разрушение или осуществляют данные процессы вместе. Хлорхинон, который повышает pH эндосомы, использовался для снижения степени разрушения вещества, захваченного в ходе эндоцитоза, посредством ингибирования лизосомальных гидролитических ферментов. Смотри Wagner и др. (1990) Proc Natl Acad Sci USA, vol.87: 3410-3414. Поликатионы с разветвленными цепями, такие как PEI, и звездообразные дендримеры также способствуют высвобождению из эндосомы, как описано выше.
Эндосомальное разрушение может протекать посредством включения субъединиц токсинов, таких как Дифтерийный токсин и Синегнойный экзотоксин, в качестве компонентов химерных белков, которые могут быть включены в катионный комплекс липополимер/биомолекула. Смотри Uherek и др. (1998) J Biol. Chem. Vol.273: 8835-8841. Данные компоненты способствуют продвижению нуклеиновой кислоты через мембрану эндосомы и обратно через эндоплазматический ретикулум.
При попадании в цитоплазму транспортировка олигонуклеотида в ядра может быть улучшена посредством включения сигнала ядерной локализации в олигонуклеотидный носитель. Например, может быть использована специфическая аминокислотная последовательность, которая выполняет функцию сигнала ядерной локализации (NLS). Считается, что NLS на комплексе олигонуклеотид/носитель взаимодействует со специфическими белковыми рецепторами ядерного транспорта, находящимися в цитозоле. Считается, что при сборе комплекса олигонуклеотид/носитель белковый рецептор в комплексе образует множественные контакты с нуклеопоринами, в результате чего происходит транспортировка комплекса через ядерную пору. После того как комплекс олигонуклеотид/носитель достигает своего назначения, он диссоциирует, высвобождает груз и другие компоненты. Для транспорта в ядро может быть использована последовательность Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val (SEQ ID NO.: 1) из SV40 большого Т-антигена. Считается, что данная короткая последовательность из SV40 большого Т-антигена может обеспечивать сигнал, который вызывает транспортировку ассоциированных макромолекул в ядро.
Также катионные липополимеры могут содержать диагностическое соединение для визуализации, такое как флуоресцентный, радиоактивный или рентгеноконтрастный краситель, который образует комплекс с полимером. Комплекс может быть получен посредством перемешивания катионного липополимера и диагностического соединения для визуализации в совместном растворителе. Затем полимер (комплекс с диагностическим соединением для визуализации) может быть введен млекопитающему и отслежен с использованием хорошо известных способов, таких как PET, MRI, СТ, SPECT и т.д. (Смотри Molecular Imaging of Gene Expression and Protein Function In Vivo With PET and SPECT, Vijay Sharma, PhD, Gary D. Luker, MD and David Piwnica-Worms, MD, Ph.D, JOURNAL OFMAGNETIC RESONANCE IMAGING 16: 336-351 (2002)). Диагностическая композиция для визуализации также может быть получена посредством объединения полимера формулы (I) с контрастным агентом для визуализации (например, 1,4,7,10-Тетраазоциклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота (DOTA)-Gd (III) и диэтилентриаминпентауксусная кислота (DTPA) - Gd (III)). При необходимости диагностическая композиция для визуализации может также содержать агент направленной доставки. Подходящие агенты направленной доставки включают, но не ограничиваются ими, RGD пептид и галактозидные группы.
Другой вариант обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую: сенсибилизирующий агент и полимер, где полимер содержит повторяющееся звено формулы (I) и олигонуклеотид, и также может содержать агент, улучшающий доставку, способный проникать в клетку эукариот и/или диагностическое соединение для визуализации, которые образуют комплекс с полимером. Сенсибилизирующий агент может быть соединением, которое подвергается изменениям в свойствах при воздействии света (например, видимого и/или ультрафиолетового излучения) или другого возбуждения, способствуя доставке биомолекулы (например, посредством увеличения скорости разрушения полимера). Сам по себе сенсибилизирующий агент может быть биомолекулой, которая претерпевает изменение активности при возбуждении. Сенсибилизирующий агент может являться лекарством, активируемым светом. Подходящие активируемые светом лекарства включают, но не ограничиваются этим, флуресциин, мероцианин, ксантен и их производные и фотореакционноспособные макроциклы на основе производных пиррола и их производные. Подходящие фотореакционноспособные макроциклы на основе производных пиррола включают, но не ограничиваются ими, природные или синтетические порфирины, природные или синтетические хлорины, природные или синтетические бактериохлорины, синтетические изобактериохлорины, фталоцианины, нафталоцианины и расширенные макроциклические системы на основе производных пиррола, такие как порфицены, сапфирины и тексапфирины.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Figure 00000006
К раствору олеиновой кислоты 1 (10,7 г, 38 ммоль) в дихлорметане (DCM, 200 мл) и N,N-диметилформамиде (DMF, три капли) при 0°С добавляют оксалилхлорид (13 мл, 152 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение примерно 1 часа и затем нагревают до комнатной температуры. Спустя 1 час раствор разбавляют толуолом и упаривают. Остаток растворяют в дихлорметане (200 мл) и охлаждают до 0°С. К раствору добавляют диэтаноламин (10,9 мл, 114 моль), 4-(диметиламино)пиридин (490 мг, 4 ммоль) и триэтиламин (21 мл, 152 ммоль). Раствор перемешивают при 0°С в течение 30 минут и затем, давая нагреться до комнатной температуры, в течение ночи. Реакционную смесь разбавляют дихлорметаном и промывают 1н. HCl и водным NаНСО3. Органическую фазу сушат (Na2SO4) и концентрируют при пониженном давлении. Затем сырой остаток очищают на колонке с силикагелем (10:1 этилацетат:метанол), получая 13,5 г (99,9%) соединения 2 в виде бесцветного масла.
ПРИМЕР 2
Figure 00000007
Триэтиламин (8,1 г, 80 ммоль), ДМАП (0,5 г, 4 ммоль) и 2 (7,1 г, 20 ммоль) растворяют в 200 мл дихлорметана при комнатной температуре. Систему продувают аргоном и раствор охлаждают на ледяной бане. По каплям добавляют акриолилхлорид (5,4 г, 60 ммоль) в 25 мл дихлорметана. После добавления реакцию нагревают до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Реакционную смесь разбавляют дихлорметаном и промывают водой и водным NaHCO3. Органическую фазу сушат (Na2SO4) и концентрируют при пониженном давлении. Затем сырой остаток очищают на колонке с силикагелем (1:3 этилацетат: гексан), получая 7,5 г (81%) соединения 3 (молекулярный вес: 463,65) в виде бесцветного масла.
ПРИМЕР 3
Синтез катионного липополимера проводят согласно Схеме А посредством реакции пентаэтиленгексамина (РЕНА), имеющего молекулярный вес 232 дальтона, с соединением 3, как указано далее. Около 0,1 ммоль (23 мг) РЕНА (Sigma-Aldrich) и около 0,2 ммоль (93 мг) соединения 3 взвешивают и помещают в небольшие сосуды и быстро добавляют и растворяют в 1 мл этанола. Реакционную смесь перемешивают в течение 3 часов при комнатной температуре. Затем реакционную смесь нейтрализуют добавлением 5 мл 2М HCl в эфире. Белый осадок YT-10 собирают центрифугированием, промывают эфиром дважды и сушат при комнатной температуре при пониженном давлении.
Данное описание является общей методикой, которая служит моделью для других синтетических методик, включающих аналогичные соединения, и которая может быть использована для синтеза ряда разрушаемых катионных липополимеров.
Полимер YT-11 получают аналогично, за исключением того, что в реакции используют около 0,3 ммоль (139 мг) соединения 3. Также аналогичным образом используют другие типы PEI для синтеза липополимеров для YT-10, YT-11. Все синтезированные в Примере 3 липополимеры перечислены в Таблице 1. После полимеризации YT-26 являлся плотным гелем и не был нейтрализован.
ТАБЛИЦА 1
Название
липополимера		 Тип PEI Молекулярный вес PEI Количество PEI Количество соединения 3
YT-26 Полиэтиленимин
600 (PEI600)		 600 0,1 ммоль
(60 мг)		 0,8 ммоль
(371 мг)
YT-10 Пентаэтилен гексамин( РЕНА) 232 0,1 ммоль (23 мг) 0,2 ммоль (93 мг)
YT-11 Пентаэтилен гексамин (РЕНА) 232 0,1 ммоль (23 мг) 0,3 ммоль (139 мг)
YT-22 Тетраэтилен пентамин (ТЕРА) 189 0,1 ммоль (18,9 мг) 0,2 ммоль (93 мг)
YT-23 Триэтилен тетрамин (ТЕТА) 146 0,1 ммоль (14,6 мг) 0,2 ммоль (93 мг)
YT-24 Диэтилентетрамин (DETA) 103 0,1 ммоль (10,3 мг) 0,1 ммоль (46 мг)
YT-25 Этилендиамин (EDA) 60 0,1 ммоль (6,0 мг) 0,1 ммоль (46 мг)
ПРИМЕР 4
Стабильная линия клеток EGFP: HT-1080-EGFP и HeLa-EGFP стабильные линии клеток получают из клеток НТ-1080 и HeLa соответственно, со стабильной улучшенной экспрессией гена зеленого флуоресцирующего белка (EGFP), полученного трансфецированием pEGFP-N1 плазмидной ДНК (BD Biosciences Clotech) в клетки НТ-1080 и HeLa. Трансфецированные клетки отбирают и клонируют с использованием способности противостоять неомицину, проводя на pEGFP-N1 плазмидах. Культуры клеток поддерживают в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM), содержащей 10% бычей сыворотки, 100 частей/мл пенициллина и 100 µг/мл стрептомицина при 37°С, 5% СО2. Экспрессию EGFP можно наблюдать с использованием флуоресцентного микроскопа (Olympus). Клетки HT-1080-EGFP и HeLa-EGFP проявляют яркую зеленую флуоресценцию при комбинировании возбуждения под действием синего света и установки зеленого фильтра испускания.
ПРИМЕР 5
Исследование доставки малой интерферирующей РНК: EGFP ген для направленной доставки малой интерферирующей РНК синтезируют с помощью Dharmacon Research Inc. EGFP гена для направленной доставки малой интерферирующей РНК и люциферазного гена, являющегося двухцепочечной РНК, состоящей из 21 пары оснований, последовательность ее кодирующей цепи является NNC GAG AAG CGC GAU САС AUG (SEQ ID NO.: 2).
Перед трансфекцией в 96-луночные планшеты рассеивают клетки НТ-1080-EGFP и HeLa-EGFP по 1,5×104 на каждую лунку. Для каждой лунки аликвоту 7,5 µл раствора, содержащего раствор 1,5 µг липополимера, добавляют к раствору 7,5 µл ДНК, содержащего 15 пикомоль малой интерферирующей РНК, и полностью перемешивают. Смесь ДНК и липополимера инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре, давая образоваться комплексам малой интерферирующей РНК с липополимером. Комплекс добавляют к каждой лунке и клетки инкубируют при 37°С, 5% СО2 в течение 48 часов. В качестве положительного контроля используют липофектамин. Эффективность доставки малой интерферирующей РНК определяют с помощью анализа сигнала зеленого флуоресцентного белка.
Фиг.1 является фотографией усиленной экспрессии зеленых флуоресцирующих белков (EFFP) в клетках HT-1080EGFP после обработки малой интерферирующей РНК с липополимерами (YT-10, YT-11, YT-22, YT-23, YT-24 и YT-25), липофектамином 2000 (положительный контроль) и без какой-либо обработки (отрицательный контроль).
Фиг.2 является фотографией усиленной экспрессии зеленых флуоресцирующих белков (EFFP) в клетках HeLa-EGFP после обработки малой интерферирующей РНК с липополимерами (YT-10, YT-11, YT-22, YT-23, YT-24 и YT-25), липофектамином 2000 (положительный контроль) и без какой-либо обработки (отрицательный контроль).
Как показано на Фиг.1 и 2, без какой либо обработки направленной подавляющей малой интерферирующей РНК экспрессия EGFP не ингибируется, на что указывает сильная флуоресценция. Смотри без обработки на Фиг.1 и 2. При обработке направленной подавляющей малой интерферирующей РНК с липополимерными носителями ингибируется экспрессия EGFP, на что указывает слабая флуоресценция. Смотри YT-10, YT-11, YT-22, YT-23, YT-24, YT-25 и Липофектамин 2000 на Фиг.1 и 2. На клетках HT-1080-EGFP, YT-10, YT-11, YT-22, YT-23, YT-24 и YT-25 показывают значительный эффект ингибирования экспрессии EGFP. Также YT-24 и YT-25 проявляют эффективную доставку малой интерферирующей РНК. Кроме этого YT-11 проявляет способность доставлять малую интерферирующую РНК. Данные результаты показывают, что настоящие липополимеры являются лучшими или сравнимыми агентами для доставки малой интерферирующей РНК по сравнению с коммерческим Липофектамином 2000.
Несмотря на то что изобретение было описано со ссылками на варианты осуществления и примеры, специалисту в данной области техники следует понимать, что могут быть сделаны различные исключения, дополнения и модификации композиции и описанных выше способов без выхода за пределы объема изобретения, и все такие модификации и изменения подпадают под объем изобретения. Таким образом, изобретение ограниченно лишь следующей формулой изобретения.

Claims (16)

1. Полимер, содержащий звено, выбранное из группы, характеризующейся формулой (I)
Figure 00000008

где PEI является звеном полиэтиленимина, имеющего молекулярный вес менее чем 600 Дальтон;
R является электронной парой;
L выбран из группы, состоящей из С2-С50 карбоксиалкенила и остатка жирных кислот от C12 до C18;
и m - является целым числом от 1 до 30.
2. Полимер по п.1, где PEI содержит, по крайней мере, одно звено, выбранное из группы, характеризующейся формулой (IIа) и формулой (IIb)
Figure 00000002


где х является целым числом от 1 до 12, у - является целым числом от 1 до 6 и z является целым числом от 1 до 13.
3. Полимер по п.1, который является биоразрушаемым.
4. Полимер по п.1, где L является С2-С50 карбоксиалкенилом.
5. Полимер по п.1, где L является остатком жирных кислот от С12 до С18.
6. Полимер по п.1, который является сетчатым полимером с поперечными связями.
7. Полимерный комплекс по п.1, содержащий олигонуклеотид, образующий полимерный комплекс с полимером по п.1.
8. Полимерный комплекс по п.7, в котором L является С2-С50 карбоксиалкенилом.
9. Полимерный комплекс по п.8, где PEI содержит, по крайней мере, одно звено, характеризующееся формулой (IIа)
Figure 00000002

в которой x является целым числом от 1 до 12, у - является целым числом от 1 до 6.
10. Полимерный комплекс по п.7, в котором L - является остатком жирных кислот от С12 до С18.
11. Полимерный комплекс по п.10, в котором PEI содержит, по крайней мере, одно звено, характеризующееся формулой (IIа)
Figure 00000002

в которой х является целым числом от 1 до 12, у является целым числом от 1 до 6.
12. Полимерный комплекс по п.7, в котором олигонуклеотид выбирают из группы содержащей RNA-олигомер и DNA-олигомер.
13. Полимерный комплекс по п.7, в котором олигонуклеотид является малой интерферирующей РНК или антисенса.
14. Полимер, содержащий звено, выбранное из группы, характеризующейся формулой (I)
Figure 00000009

где PEI является звеном полиэтиленимина, содержащего, по крайней мере, одно звено, характеризующееся формулой (IIb)

где z является целым числом от 1 до 13;
R является электронной парой;
L выбран из группы, состоящей из С2-С50 карбоксиалкенила и остатка жирных кислот от С12 до С18; и
m является целым числом от 1 до 30.
15. Полимер по п.14, в котором PEI имеет молекулярный вес менее чем 600 Дальтон.
16. Способ трансфекции клетки эукариот, включающий контакт клетки с полимерным комплексом по п.7, в результате чего олигонуклеотид доставляется в клетку.
RU2008142416/04A 2006-04-06 2007-04-03 Биоразрушаемые катионные полимеры RU2451525C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78984206P 2006-04-06 2006-04-06
US60/789,842 2006-04-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2008142416A RU2008142416A (ru) 2010-05-20
RU2451525C2 true RU2451525C2 (ru) 2012-05-27

Family

ID=38490023

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2008142416/04A RU2451525C2 (ru) 2006-04-06 2007-04-03 Биоразрушаемые катионные полимеры

Country Status (13)

Country Link
US (1) US7700541B2 (ru)
EP (1) EP2007432B1 (ru)
JP (1) JP2009532564A (ru)
KR (1) KR20080108153A (ru)
CN (1) CN101415444A (ru)
AU (1) AU2007238965B2 (ru)
BR (1) BRPI0710648A2 (ru)
CA (1) CA2648386A1 (ru)
DK (1) DK2007432T3 (ru)
HK (1) HK1128080A1 (ru)
MX (1) MX2008012692A (ru)
RU (1) RU2451525C2 (ru)
WO (1) WO2007120479A1 (ru)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2549908C1 (ru) * 2014-03-12 2015-05-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" Биодеградируемые аргининсодержащие полимеры
WO2016030736A1 (en) * 2014-08-29 2016-03-03 Air Force Inc. Dental prophylaxis device and air appliance
RU2715227C2 (ru) * 2014-12-19 2020-02-26 Этрис Гмбх Композиция для введения нуклеиновой кислоты в клетки

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7358223B2 (en) * 2004-10-04 2008-04-15 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
SI2730277T1 (sl) 2004-12-22 2020-07-31 Nitto Denko Corporation Nosilec zdravila in komplet za nosilec zdravila za zaviranje fibroze
US20120269886A1 (en) 2004-12-22 2012-10-25 Nitto Denko Corporation Therapeutic agent for pulmonary fibrosis
US9572886B2 (en) 2005-12-22 2017-02-21 Nitto Denko Corporation Agent for treating myelofibrosis
US7700541B2 (en) 2006-04-06 2010-04-20 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
TWI407971B (zh) 2007-03-30 2013-09-11 Nitto Denko Corp Cancer cells and tumor-related fibroblasts
US20080312174A1 (en) * 2007-06-05 2008-12-18 Nitto Denko Corporation Water soluble crosslinked polymers
JP2010539245A (ja) * 2007-09-14 2010-12-16 日東電工株式会社 薬物担体
US20100004315A1 (en) * 2008-03-14 2010-01-07 Gregory Slobodkin Biodegradable Cross-Linked Branched Poly(Alkylene Imines)
DE102008002254A1 (de) * 2008-06-06 2010-01-21 Evonik Röhm Gmbh Monomermischungen, Polymere sowie Beschichtungszusammensetzungen
AU2008359989A1 (en) * 2008-07-30 2010-02-04 Nitto Denko Corporation Drug carriers
CA2795906C (en) 2009-04-13 2019-02-26 Inserm, Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Hpv particles and uses thereof
JP2013528665A (ja) 2010-03-26 2013-07-11 メルサナ セラピューティックス， インコーポレイテッド ポリヌクレオチドの送達のための修飾ポリマー、その製造方法、およびその使用方法
TWI405582B (zh) * 2010-07-13 2013-08-21 Univ Nat Taiwan 用於傳遞物質之載體複合物及其應用
CA2818662C (en) 2010-10-22 2021-07-06 Sungkyunkwan University Foundation For Corporate Collaboration Nucleic acid molecule inducing rna interference, and uses thereof
US9700639B2 (en) 2012-02-07 2017-07-11 Aura Biosciences, Inc. Virion-derived nanospheres for selective delivery of therapeutic and diagnostic agents to cancer cells
EP3514236A1 (en) 2012-05-22 2019-07-24 Olix Pharmaceuticals, Inc. Rna-interference-inducing nucleic acid molecule able to penetrate into cells, and use therefor
US9677073B2 (en) 2012-10-05 2017-06-13 Lipocalyx Gmbh Hydroxylated polyamine derivatives as transfection reagents
WO2014056590A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Lipocalyx Gmbh Carboxylated polyamine derivatives as transfection reagents
WO2014158597A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Elevance Renewable Sciences Natural oil derivatives including (meth)acrylate functional groups
EP4059521A1 (en) 2013-09-18 2022-09-21 Aura Biosciences, Inc. Virus-like particle conjugates for diagnosis and treatment of tumors
JP7027311B2 (ja) 2015-11-16 2022-03-01 オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド ＭｙＤ８８又はＴＬＲ３を標的とするＲＮＡ複合体を使用した加齢黄斑変性の治療
CA3022877A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of angiogenesis-associated diseases using rna complexes that target angpt2 and pdgfb
WO2017134525A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Olix Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT OF ATOPIC DERMATITIS AND ASTHMA USING RNA COMPLEXES THAT TARGET lL4Rα, TRPA1, OR F2RL1
CN105669975B (zh) * 2016-02-03 2018-02-23 华东师范大学 一种超支化铵盐型阳离子表面活性剂及制备和应用
US10301628B2 (en) 2016-04-11 2019-05-28 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using RNA complexes that target connective tissue growth factor
KR101916652B1 (ko) * 2016-06-29 2018-11-08 올릭스 주식회사 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도
CN110770343A (zh) 2017-02-10 2020-02-07 成均馆大学校产学协力团 用于rna干扰的长双链rna

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2242970C2 (ru) * 1999-04-02 2004-12-27 Рисерч Дивелопмент Фаундейшн Композиции полиэтиленимин: днк для аэрозольной доставки
WO2005060934A1 (en) * 2003-11-19 2005-07-07 Expression Genetics, Inc. A novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6509032B1 (en) * 1991-08-28 2003-01-21 Mcmaster University Cationic amphiphiles
DE4142130A1 (de) * 1991-12-20 1993-06-24 Basf Ag Verwendung von polyacetalen auf basis von vinylethern und dihydroxyverbindungen in wasch- und reinigungsmitteln und polyacetale
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
AU696455C (en) 1994-03-23 2006-03-02 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
WO1996000295A1 (en) * 1994-06-27 1996-01-04 The Johns Hopkins University Targeted gene delivery system
US5767168A (en) * 1995-03-30 1998-06-16 The Proctor & Gamble Company Biodegradable and/or compostable polymers made from conjugated dienes such as isoprene and 2,3-dimethyl-1, 3-butadiene
US5811510A (en) * 1995-04-14 1998-09-22 General Hospital Corporation Biodegradable polyacetal polymers and methods for their formation and use
AU739969B2 (en) 1996-05-29 2001-10-25 Cell Genesys, Inc. Cationic polymer/lipid nucleic acid delivery vehicles
US6072101A (en) * 1997-11-19 2000-06-06 Amcol International Corporation Multicomponent superabsorbent gel particles
US20020006664A1 (en) * 1999-09-17 2002-01-17 Sabatini David M. Arrayed transfection method and uses related thereto
ATE377048T1 (de) * 2000-09-06 2007-11-15 Ap Pharma Inc Abbaubare polyacetal-polymere
US6696038B1 (en) * 2000-09-14 2004-02-24 Expression Genetics, Inc. Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent
US7427394B2 (en) * 2000-10-10 2008-09-23 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US6998115B2 (en) 2000-10-10 2006-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
GB2368053A (en) * 2000-10-20 2002-04-24 Nsk Ltd Electric power steering control
US6794965B2 (en) * 2001-01-18 2004-09-21 Arizona State University Micro-magnetic latching switch with relaxed permanent magnet alignment requirements
US6652886B2 (en) * 2001-02-16 2003-11-25 Expression Genetics Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
US20030120355A1 (en) * 2001-06-08 2003-06-26 Urs Hafeli Biocompatible and biodegradable polymers for diagnostic and therapeutic radioisotope delivery
KR100448170B1 (ko) 2001-06-23 2004-09-10 주식회사 태평양 폴리에틸렌이민을 친수성 블록으로 갖고 폴리에스테르계고분자를 소수성 블록으로 갖는 양친성 생분해성 블록공중합체 및 이를 이용한 수용액 상에서의 고분자자기조합 회합체
US6586524B2 (en) * 2001-07-19 2003-07-01 Expression Genetics, Inc. Cellular targeting poly(ethylene glycol)-grafted polymeric gene carrier
AU2003220161A1 (en) 2002-03-12 2003-09-29 Nitto Denko Corporation Vector for transfection of eukaryotic cells
US20030215395A1 (en) * 2002-05-14 2003-11-20 Lei Yu Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier
US20040048260A1 (en) * 2002-09-10 2004-03-11 Fu-Hsiung Chang Transfection of nucleic acid
US20070269891A9 (en) * 2003-01-13 2007-11-22 Yasunobu Tanaka Solid surface with immobilized degradable cationic polymer for transfecting eukaryotic cells
US20040138154A1 (en) * 2003-01-13 2004-07-15 Lei Yu Solid surface for biomolecule delivery and high-throughput assay
US6878374B2 (en) * 2003-02-25 2005-04-12 Nitto Denko Corporation Biodegradable polyacetals
US7332477B2 (en) * 2003-07-10 2008-02-19 Nitto Denko Corporation Photocleavable DNA transfer agent
US7048925B2 (en) * 2003-08-28 2006-05-23 Nitto Denko Corporation Acid-sensitive polyacetals and methods
WO2005032597A1 (en) 2003-09-29 2005-04-14 Nitto Denko Corporation Biodegradable polyacetals for in vivo polynucleotide delivery
US7163677B2 (en) * 2003-10-24 2007-01-16 Nitto Denko Corporation Cationic polymers having degradable crosslinks
US7125709B2 (en) * 2004-02-10 2006-10-24 Nitto Denko Corporation Culture device and method for eukaryotic cell transfection
US7358223B2 (en) * 2004-10-04 2008-04-15 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
US7588754B2 (en) * 2005-05-10 2009-09-15 Nitto Denko Corporation Biodegradable polyacetals and methods
US20060263328A1 (en) * 2005-05-19 2006-11-23 Sang Van Hydrophilic polymers with pendant functional groups and method thereof
WO2007081429A1 (en) 2006-01-04 2007-07-19 Dow Global Technologies Inc. Reactive (meth)acrylate monomer compositions and preparation and use thereof
US7700541B2 (en) 2006-04-06 2010-04-20 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
CN100549044C (zh) * 2006-11-16 2009-10-14 南京慧基生物技术有限公司 可生物降解的交联聚乙烯亚胺及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2242970C2 (ru) * 1999-04-02 2004-12-27 Рисерч Дивелопмент Фаундейшн Композиции полиэтиленимин: днк для аэрозольной доставки
WO2005060934A1 (en) * 2003-11-19 2005-07-07 Expression Genetics, Inc. A novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lim Y. et al. Cationic Hyperbranched Poly(amino ester): A Novel Class of DNA Condensing Molecule with Cationic Surface, Biodegradable Three-Dimensional Structure, and Tertiary Amine Groups in the Interior. J. Am. Chem. Soc., 2001, v.l23, pp.2460-2461. Lynn D.M. et al. Accelerated Discovery of Synthetic Transfection Vectors: Parallel Synthesis and Screening of a Degradable Polymer Library. J. Am. Chem. Soc., 2001, v.123, pp.8155-8156. *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2549908C1 (ru) * 2014-03-12 2015-05-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" Биодеградируемые аргининсодержащие полимеры
WO2016030736A1 (en) * 2014-08-29 2016-03-03 Air Force Inc. Dental prophylaxis device and air appliance
RU2715227C2 (ru) * 2014-12-19 2020-02-26 Этрис Гмбх Композиция для введения нуклеиновой кислоты в клетки

Also Published As

Publication number Publication date
CN101415444A (zh) 2009-04-22
EP2007432A1 (en) 2008-12-31
US7700541B2 (en) 2010-04-20
HK1128080A1 (en) 2009-10-16
JP2009532564A (ja) 2009-09-10
RU2008142416A (ru) 2010-05-20
KR20080108153A (ko) 2008-12-11
DK2007432T3 (da) 2012-12-03
EP2007432B1 (en) 2012-09-19
AU2007238965A1 (en) 2007-10-25
CA2648386A1 (en) 2007-10-25
BRPI0710648A2 (pt) 2011-08-23
WO2007120479A1 (en) 2007-10-25
US20070243157A1 (en) 2007-10-18
MX2008012692A (es) 2008-10-10
AU2007238965B2 (en) 2012-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2451525C2 (ru) Биоразрушаемые катионные полимеры
US8258235B2 (en) Biodegradable cationic polymers
EP1503802B1 (en) Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier
US20020146826A1 (en) Cationic polysaccharide compositions
CN1893924A (zh) 一种新的阳离子脂质聚合物作为生物相容性基因递送剂
Shim et al. Dual mode polyspermine with tunable degradability for plasmid DNA and siRNA delivery
WO2008058457A1 (fr) Polyéthylèneimine réticulé biodégradable et ses utilisations
Tomich et al. Nonviral gene therapy: Peptiplexes
Chen et al. Polyethyleneimine-grafted poly (N-3-hydroxypropyl) aspartamide as a biodegradable gene vector for efficient gene transfection
Arote et al. Folate conjugated poly (ester amine) for lung cancer therapy
AU2012200435A1 (en) "Biodegradable cationic polymers"
Jere et al. Biodegradable poly (B-amino ester) derivatives for gene and siRNA delivery
Aldawsari Preparation and evaluation of amino acid-bearing polymers for enhanced gene expression in tumours

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20140404