BRPI0710648A2 - polìmeros catiÈnicos biodegradáveis - Google Patents

polìmeros catiÈnicos biodegradáveis Download PDF

Info

Publication number
BRPI0710648A2
BRPI0710648A2 BRPI0710648-3A BRPI0710648A BRPI0710648A2 BR PI0710648 A2 BRPI0710648 A2 BR PI0710648A2 BR PI0710648 A BRPI0710648 A BR PI0710648A BR PI0710648 A2 BRPI0710648 A2 BR PI0710648A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
polymer
polymer according
group
formula
approximately
Prior art date
Application number
BRPI0710648-3A
Other languages
English (en)
Inventor
Yasunobu Tanaka
Gang Zhao
Lei Yu
Original Assignee
Nitto Denko Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nitto Denko Corp filed Critical Nitto Denko Corp
Publication of BRPI0710648A2 publication Critical patent/BRPI0710648A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G73/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a linkage containing nitrogen with or without oxygen or carbon in the main chain of the macromolecule, not provided for in groups C08G12/00 - C08G71/00
    • C08G73/02—Polyamines
    • C08G73/0206—Polyalkylene(poly)amines
    • C08G73/0213—Preparatory process
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/593—Polyesters, e.g. PLGA or polylactide-co-glycolide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L2201/00—Properties
    • C08L2201/06—Biodegradable
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/70—Nanostructure
    • Y10S977/701—Integrated with dissimilar structures on a common substrate
    • Y10S977/702—Integrated with dissimilar structures on a common substrate having biological material component
    • Y10S977/704—Nucleic acids, e.g. DNA or RNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Biological Depolymerization Polymers (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Abstract

POLìMEROS CATIÈNICOS BIODEGRADáVEIS Polímeros compreendendo um polietilenoimina tendo um peso molecular menor do que 600 Daltons, um grupo biodegradável e um grupo relativamente hidrofóbico que são úreis para a distribuição de agentes bioativos para células.

Description

polímeros cationicos biodegradáveis
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
Esse pedido reivindica prioridade para o pedidoprovisório US número 60/789.842, depositado em 6 de abril de 2006, que é pelo presente incorporado a titulo dereferência na integra incluindo todos os desenhos.Adicionalmente, esse pedido é relacionado ao pedido depatente US número 11/216.986, depositado em 31 de agosto de2005, que é pelo presente incorporado a titulo de referência na integra incluindo todos os desenhos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃOCampo da invenção
A presente invenção refere-se a composições emétodos para distribuir agentes bioativos para células. Especificamente, a presente invenção refere-se alipopolimeros cationicos compreendendo uma poli- ou oligo-etilenoimina (PEI), um grupo biodegradável e um gruporelativamente hidrofóbico, e a métodos de preparar eutilizar tais lipopolimeros para distribuiroligonucleotideos como siRNA e anti-sentidos.
Descrição da técnica relacionada
Diversas técnicas estão disponíveis paradistribuir agentes bioativos como DNA de plasmídeos paracélulas, incluindo o uso de sistemas de transfecção viral e sistemas de transfecção não viral. Sistemas virais têm,tipicamente, eficiência de transfecção mais elevada do quesistemas não virais, porém tem havido perguntas em relaçãoà segurança de sistemas virais. Vide Verma I.M. e Somia N.,Nature 389 (1997), pág. 239 - 242; Marhsall E. Science 286(2000), pág. 2244-2245. Além disso, a preparação de vetorviral tende a ser um processo complicado e caro. Emborasistemas de transfecção não viral sejam genericamente menoseficientes do que- sistemas virais, os mesmos têm recebidoatenção significativa porque se acredita genericamente quesejam mais seguros e mais fáceis de preparar do quesistemas virais.
Diversos sistemas de transfecção não viralenvolvem o uso de polímeros catiônicos que são complexadosem DNA de plasmídeos. Os exemplos de polímeros catiônicosque foram utilizados como veículos de gene incluem poli(L-lisina) (PLL), polietilenoimina (PEI), quitosana,dendrímeros PAMAM e metacrilato de poli(2-dimetilamino)etila (ρDMAEMA). Infelizmente, a eficiência detransfecção é tipicamente ruim com PLL, e PLL de pesomolecular elevado mostrou toxicidade significativa paracélulas. Em alguns casos, PEI que varia em peso molecularde 20.000 a 25.000 Daltons provê transferência de geneeficiente sem a necessidade de agentes de alvejar ouendosomolíticos. Vide Boussif O., Lezoualc'h F., Zanta M.A., Mergny M.D., Scherman D., Demeneix B., Behr J.P. Proc.Natl. Acad. Sci USA, 1° de agosto de 1995, 92 (16), 7297-301. Entretanto, PEI que varia em peso molecular de 400 a2.000 Daltons não é eficaz para distribuição de DNA deplasmídeos. Uma gama de dendrímeros de poliamidoamina foiestudada como sistemas de distribuição de genes. VideEichman J. D., Bielinska A.U., Kukowska-Latallo J.F., BakerJ. R. Jr., Pharm. Sei. Technol. Today 2000 julho; 3(7):232-245. Infelizmente, tanto PEI como dendrímeros foramreportados como sendo tóxicos para células, desse modolimitando o potencial para uso de PEI como ferramenta dedistribuição de genes em aplicações em pacientes humanos.Além disso, o custo de dendrímeros de poliamidoamina tendoeficiências de transfecção de gene comercialmente práticasé relativamente elevado.Gene, como DNA de plasmídeos, veículos feitos compolímeros catiônicos degradáveis foram reportados comotransferindo genes para células de mamíferos comcitotoxicidade diminuída. Vide Lim Y.B., Kim S.M., Lee Y.,Lee W.K., Yang T.G., Lee M. J., Suh H., Park J.S., J.Am.Chem. Soc., 123 (10), 2460-2461, 2001. Infelizmente, essessistemas degradáveis também apresentaram eficiência detransferência de DNA de plasmídeos mais baixa em comparaçãocom polímeros não degradáveis. Para melhorar a eficiênciade transfecção de PEI com baixo peso molecular, Gosselin eoutros reportaram que PEI com peso molecular mais elevadopoderia ser obtido utilizando ligadores contendo dissulfetocom PEI com peso molecular mais baixo. Vide Gosselin,Miceal A., Guo, Menjin, e Lee, Robert J. - Bioconjugate Chem.2001. 12:232-245. Polímeros de PEI feitos utilizandoditiobis(succinimidil propionato) (DSP) e dimetil-3,3'-ditiobisopropionimidato-2HCl (DTBP) mostraram eficiência detransfecção de gene comparável e citotoxicidade mais baixa.Entretanto, os ligadores contendo dissulfeto são caros, oque torna a preparação em grande escala desse sistemadifícil e indesejável. Os polímeros com ligadores contendodissulfeto são somente degradados sob condições de redução,o que limita as aplicações de polímeros em outrascondições.
Lynn, e outros descreveram um método desintetizar polímeros catiônicos biodegradáveis utilizandodiacrilatos como moléculas ligadoras entre compostoscatiônicos. Vide Lynn, David A.; Anderson, Daniel G.;Putnam, David; e Langer, Robert J. Am. Chem. Soe. 2001,123, 8155-8156. Entretanto, a síntese desses polímerosrequer dias para se completar e a quantidade de produtoeficaz, que pode ser utilizada em distribuição de genes, ébaixa. Mais de cem polímeros catiônicos foram produzidos deacordo com os métodos de Lynn e outros, porém somente doisdesses polímeros mostraram eficiência eficaz de transfecçãode genes. Polímeros catiônicos como PEI não foram mostradoscomo sendo eficazes para distribuição de siRNA. 0 polímerocatiônico biodegradável produzido de acordo com os métodosde Lynn e outros, não foram utilizados para distribuirsiRNA ou oligonucleotídeos.
Desse modo, permanece a necessidade de polímeroscatiônicos que possam ser utilizados para facilitar deforma segura e eficiente a distribuição de siRNA eoligonucleotídeos para células.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os inventores descobriram várias composições depolímeros que são capazes de distribuir oligonucleotídeospara células. Em certas modalidades, o polímero pode seradicionalmente complexado com outras frações como um agentede intensificar distribuição e/ou um composto deimageamento de diagnóstico. Além disso, os inventoresdescobriram métodos para distribuir um oligonucleotídeo20 para a(s) célula(s) utilizando as composições de polímero.
.Uma modalidade revelada aqui inclui um polímerocompreendendo uma unidade recorrente selecionada a partirdo grupo que consiste na fórmula (I):
0 R
/11 I Il \
4— PEi—(CH2)2-C-O-(CH2)2-N-(CH2)2-O-C-(CH2)2-j—^ I / m
mL
0)
25 em que PEI pode ser uma unidade recorrente de
polietilenoimina tendo um peso molecular menor do que 600Daltons. R pode ser selecionado a partir do grupo queconsiste em par de elétrons, hidrogênio, alquila C2-Ci0,heteroalquila C2-C10, arila C5-C30 e heteroarila C2-C30, Lpode ser selecionado do grupo que consiste em alquilaC2-C50, heteroalquila C2-C50, alquenila C2-C50,heteroalquenila C2-C50, arila C5-C50, heteroarila C2-C50,alquinila C2-C50, heteroalquinila C2-C50, carboxialquenilaC2-C50 e carboxi heteroalquenila C2-C50 e m é um númerointeiro que pode estar na faixa de aproximadamente 1 aaproximadamente 30.
Em uma modalidade, o PEI pode compreender pelomenos uma unidade recorrente selecionada do grupo queconsiste na fórmula (IIa) e fórmula (IIb):
<formula>formula see original document page 6</formula>
em que x é um número inteiro na faixa deaproximadamente 1 a aproximadamente 12, y é um númerointeiro na faixa de aproximadamente 1 a aproximadamente 6,e z é um número inteiro na faixa de aproximadamente 1 aaproximadamente 13.
O polímero, em algumas modalidades, pode serbiodegradável. Mecanismos apropriados pelos quais opolímero pode degradar incluem, porém não são limitados a,hidrólise, clivagem de enzima, redução, foto-clivagem esonicação.
Em algumas modalidades, L pode ser selecionado dogrupo que consiste em alquila C2-C50, heteroalquila C2-C50,alquenila C2-C50, heteroalquenila C2-C60, alquinila C2-C50 eheteroalquinila C2-C50. Em outras modalidades, L pode serselecionado do grupo que consiste em ácido graxo C12 a C18,colesterol e derivados dos mesmos.
0 polímero pode ter um peso molecular médioponderai, em uma modalidade, na faixa de aproximadamente500 Daltons a aproximadamente 1.000.000 Daltons. Em outramodalidade, o polímero pode ter um peso molecular médioponderai na faixa de aproximadamente 1.000 Daltons aaproximadamente 200.000 Daltons.
Em algumas modalidades, o polímero pode serreticulado.
Outra modalidade revelada aqui inclui o polímeroque pode compreender adicionalmente um oligonucleotídeo queé complexado com o polímero. Os exemplos deoligonucleotídeos apropriados incluem, porém não sãolimitados a, oligômeros de RNA como siRNA e oligômeros deDNA como anti-sentidos.
Além do oligonucleotídeo, o polímero podecompreender adicionalmente um agente de intensificardistribuição capaz de entrar em uma célula eucariótica. Sedesejado, o polímero pode compreender adicionalmente umcomposto de imageamento de diagnóstico que pode sercomplexado com o polímero. 0 agente de intensificardistribuição pode facilitar uma ou mais das seguintesfunções na célula eucariótica: reconhecimento de receptor,internalização, escapamento do oligonucleotídeo a partir doendossoma de célula, localização de núcleo, liberação deoligonucleotídeo e estabilização de sistema.Oligonucleotídeos exemplares incluem, porém não sãolimitados a, siRNA e anti-sentido. Em outras modalidades, oagente de intensificar distribuição pode se acoplado aopolímero.
Uma modalidade revelada aqui inclui um método detransfectar uma célula eucariótica, compreendendo contatara célula com o polímero para desse modo distribuir ooligonucleotídeo para a célula, em que o polímero podecompreender adicionalmente um oligonucleotídeo.
Outra modalidade revelada aqui inclui um métodode tratar um mamífero compreendendo identificar um mamíferonecessitando de terapia de gene e administrar o polímeroque é conjugado com um oligonucleotídeo ao mamífero, em queo oligonucleotídeo compreende um siRNA que é eficaz paradiminuir ou silenciar a expressão do gene de interesse.
Em algumas modalidades, o polímero podecompreender ainda um composto de imageamento de diagnósticoque é complexado com o polímero. Uma modalidade reveladaaqui inclui um método de distribuir o composto deimageamento de diagnóstico para um mamífero, compreendendoadministrar o polímero a um mamífero, em que o polímero écomplexado com o composto de imageamento de diagnóstico.
Uma modalidade revelada aqui inclui umabiblioteca de polímeros que compreende uma pluralidade dospolímeros, em que pelo menos um parâmetro selecionado dogrupo que consiste em R, L, PEI e m é diferente para pelomenos dois dos polímeros.
Outra modalidade revelada aqui inclui um sistemade diagnóstico médico compreendendo o polímero e um ligandoque pode reconhecer um receptor específico de uma célulaeucariótica. Se desejado, o polímero pode ser acoplado aoligando.
Ainda em outra modalidade revelada aqui umacomposição farmacêutica pode compreender um agentesensibilizador e o polímero. O agente sensibilizador podeser sensível à radiação visível, radiação ultravioleta ouambos. Em uma modalidade, a composição farmacêutica podecompreender um agente sensibilizador e o polímero, em que opolímero pode ter uma afinidade para um oligonucleotídeo.Em uma modalidade, uma composição de imageamentode diagnóstico pode compreender um agente de contraste deimagem e o polímero. Se desejado, a composição deimageamento de diagnóstico pode compreender ainda um agentede alvejar.
Uma modalidade revelada aqui inclui um polímeroque compreende uma unidade recorrente selecionada do grupoque consiste na fórmula (I):
<formula>formula see original document page 9</formula>
em que PEI é uma unidade recorrente depolietilenoimina compreendendo pelo menos uma unidaderecorrente da fórmula (IIb):
<formula>formula see original document page 9</formula>
em que z é um número inteiro na faixa deaproximadamente 1 a aproximadamente 13. R pode serselecionado a partir do grupo que consiste em par deelétrons, hidrogênio, alquila C2-C10, heteroalquila C2-C10,arila C5-C30 e heteroarila C2-C30. L pode ser selecionado dogrupo que consiste em alquila C2-C50, heteroalquila C2-C50,alquenila C2-C50, heteroalquenila C2-C50, arila C5-C50,heteroarila C2-C50, alquinila C2-C50, heteroalquinila C2-C50,carboxialquenila C2-C50 e carboxi heteroalquenila C2-C50; e mé um número inteiro que pode estar na faixa deaproximadamente 1 a aproximadamente 30.
Em uma modalidade, o PEI compreendendo pelo menosuma unidade recorrente da fórmula (IIb) pode ter um pesomolecular menor do que 600 Daltons.
Em algumas modalidades, o PEI compreendeadicionalmente uma unidade recorrente da fórmula IIa:
<formula>formula see original document page 10</formula>
em que x pode ser um número inteiro na faixa deaproximadamente 1 a aproximadamente 12 e y pode ser umnúmero inteiro na faixa de aproximadamente 1 aaproximadamente 6.
Em uma modalidade, o polímero, onde o PEIcompreende ainda uma unidade recorrente da fórmula (IIa),pode ter um peso molecular menor do que 600 Daltons.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1 é uma fotografia de expressão deproteínas de fluorescência verde intensificada (EGFP) emcélulas HT-1080-EGFP após tratamento com siRNA complexadocom os lipopolimeros (YT-10, YT-11, YT-22, YT-23, YT-24 eYT-25), lipofectamina2000 (controle positivo) e semtratamento (controle negativo).
A figura 2 é uma fotografia de expressão deproteínas de fluorescência verde intensificada (EGFP) emcélulas HeLa-EGFP após tratamento com siRNA complexado comos lipopolimeros (YT-10, YT-11, YT-22, YT-23, YT-24 eYT-25), lipofectamina2000 (controle positivo) e semtratamento (controle negativo).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA MODALIDADE PREFERIDA
Uma modalidade provê lipopolimeros catiônicoscompreendendo um polietilenoimina, um grupo biodegradável eum grupo "lipo" relativamente hidrofóbico. Lipopolimeroscatiônicos preferidos compreendem uma unidade recorrenteselecionada do grupo que consiste na fórmula (I):<formula>formula see original document page 11</formula>
Na fórmula (I), PEI é polietilenoimina, asligações de éster são grupos biodegradáveis, e L representaum grupo "lipo" relativamente hidrofóbico. Por exemplo, emcertas modalidades L é selecionada do grupo que consiste emalquila C2-C50, heteroalquila C2-C50, alquenila C2-C50,heteroalquenila C2-C50, arila C5-C50, heteroarila C2-C50,alquinila C2-C50, heteroalquinila C2-C50, carboxialquenilaC2-C50 e carboxi heteroalquenila C2-C50. Em modalidadespreferidas, L é selecionado do grupo que consiste emalquila C2-C50, heteroalquila C2-C50, alquenila C2-C50,heteroalquenila C2-C50, alquinila C2-C50 e heteroalquinilaC2-C50. Nas modalidades mais preferidas, L é selecionado dogrupo que consiste em ácido graxo C12 a C18, colesterol ederivados dos mesmos.
0 R na fórmula (I) pode representar um par deelétrons ou um átomo de hidrogênio. Aqueles versados natécnica entendem que quando R representa um par deelétrons, a unidade recorrente da fórmula (I) é catiônicaem baixo pH. 0 R na fórmula (I) pode representar também umgrupo Iipo relativamente hidrofóbico como alquila C2-C10,heteroalquila C2-C10, arila C5-C30 ou heteroarila C2-C30 emcujo caso será entendido que o átomo de nitrogênio contémuma carga catiônica, genericamente acima de uma ampla faixa de pH.
0 PEI pode conter pelo menos uma unidaderecorrente da fórmula (IIa) e/ou (IIb) em que χ é um númerointeiro na faixa de aproximadamente 1 a aproximadamente 12,y é um número inteiro na faixa de aproximadamente 1 aaproximadamente 6 e z é um número inteiro na faixa deaproximadamente 1 a aproximadamente 13.
<formula>formula see original document page 12</formula>
Será entendido que "fórmula II", como utilizadoaqui, se refere a PEI que compreende fórmulas (IIb) e (IIa)separadamente ou em combinação.
Lipopolimeros catiônicos compreendendo umaunidade recorrente da fórmula (I) podem ser preparados porreação de um monômero de diacrilato da fórmula (III) comuma polietilenoimina (PEI), como mostrado no Esquema Aabaixo:
Esquema A
<formula>formula see original document page 12</formula>
Na fórmula (III), ReL têm os mesmossignificados, como descrito acima, para lipopolimeroscatiônicos compreendendo uma unidade recorrente da fórmula(I). O Esquema A ilustra a preparação de um polímerocompreendendo uma unidade recorrente da fórmula (I).
A reação ilustrada no Esquema A pode serrealizada por intermistura do PEI e diacrilato (III) em umsolvente mútuo como etanol com agitação, preferivelmente em temperatura ambiente por várias horas, a seguir evaporandoo solvente para recuperar o polímero resultante. A presenteinvenção não é limitada por teoria, porém acredita-se que areação entre o PEI e diacrilato (III) envolva uma reação deMichael entre uma ou mais aminas do PEI com ligações duplas do diacrilato. Vide J. March, Advanced Organic Chemistry 3aedição, pág. 711-712 (1985). O diacrilato mostrado noEsquema A pode ser preparado no modo ilustrado nos exemplosdescritos abaixo.
Uma ampla variedade de polímeros compreendendo uma unidade recorrente da fórmula (I) pode ser feita deacordo com o esquema A por variação do peso molecular e daestrutura do PEI, do tamanho e do tipo dos grupos L e R nodiacrilato (III), e da razão de diacrilato (III) para PEI.Misturas de diacrilatos diferentes e/ou misturas de PEI's diferentes podem ser utilizadas. O PEI pode sermultifuncional, e desse modo pode ser capaz de reagir comdois ou mais diacrilatos. Agentes de reticulação podem serutilizados para produzir um lipopolímero catiônicoreticulado e/ou as proporções relativas de PEI multifuncional e diacrilato (III) podem ser ajustadas paraproduzir um lipopolímero catiônico reticulado. O- pesomolecular do PEI é preferivelmente· menor do que 600Daltons. A razão molar de PEI para diacrilato estápreferivelmente na faixa de aproximadamente 1:0,5 a aproximadamente 1:20. O peso molecular médio ponderai dolipopolímero catiônico pode estar na faixa deaproximadamente 500 Daltons a aproximadamente 1.000.000Daltons, preferivelmente na faixa de aproximadamente 1.000Daltons a aproximadamente 200.000 Daltons. Pesosmoleculares podem ser determinados por cromatografia deexclusão de tamanho utilizando padrões PEG ou poreletroforese em gel agarose. Em uma modalidade, umabiblioteca de polímeros é fornecida por preparação de umapluralidade de lipopolimeros catiônicos em que R, L, PEIe/ou m são diferentes para pelo menos dois dos polímeros.
0 lipopolímero catiônico é preferivelmentedegradável, mais preferivelmente biodegradável, porexemplo, degradável por um mecanismo selecionado do grupoque consiste em hidrólise, clivagem de enzima, redução,foto-clivagem e sonicação. A presente invenção não élimitada por teoria, porém acredita-se que degradação dolipopolímero catiônico da fórmula (I) dentro da célulaprossegue por clivagem enzimática e/ou hidrólise dasligações de éster.
Os lipopolimeros catiônicos podem formarcomplexos com um oligonucleotídeo e desse modo são úteis,como veículos para a distribuição de um oligonucleotídeopara uma célula. Por exemplo, o polímero pode ser utilizadopara tratar um mamífero necessitando de terapia de genespor administração ao mamífero do polímero complexado com umoligonucleotídeo como siRNA que é eficaz para diminuir ousilenciar expressão do gene de interesse. Lipopolimeroscatiônicos que compreendem um oligonucleotídeo que écomplexado com o polímero podem ser formados porintermistura dos lipopolimeros catiônicos e
oligonucleotídeos em um solvente mútuo, maispreferivelmente pelos métodos desçritos nos exemplosabaixo.
Lipopolimeros catiônicos que compreendem umoligonucleotídeo que é acoplado . ao polímero podemcompreender adicionalmente um agente de intensificardistribuição capaz de entrar em uma célula eucariótica. 0agente de intensificar distribuição pode ser dissolvido oumisturado com o complexo, ou pode ser acoplado (porexemplo, covalentemente ligado ou complexado) aolipopolimero catiônico. Intensificadorès de distribuiçãosão substâncias que facilitam o transporte de umoligonucleotideo para dentro de uma célula, tipicamente porintensificar o transporte de um complexo deveiculo/oligonucleotideo através de uma membrana, reduzindoa degradação durante o transporte e/ou facilitando aliberação do oligonucleotideo a partir do veiculo. Otransporte de um oligonucleotideo, como um siRNA, paradentro de uma célula envolve preferivelmente a liberação dooligonucleotideo a partir do veiculo após o complexo deveiculo/oligonucleotideo ter cruzado a membrana de célula,membrana de endossoma e membrana nuclear. Por exemplo, nocaso de siRNA, o complexo de veículo/siRNA passaprimeiramente através da membrana da célula. Quando isso érealizado por endocitose, o complexo de veículo/siRNA é,então, internalizado. O veiculo juntamente com a carga-siRNA é envolvido pela membrana de célula pela formação deum bolso e o bolso é subseqüentemente apertado. O resultadoé um endossoma de célula, que é uma estrutura ligada pormembrana grande encerrando a carga de· siRNA e o veiculo. Ocomplexo de veículo-siRNA, então, escapa através ^amembrana de endossoma para dentro do citoplasma, evitandodegradação de enzima no citoplasma e cruza a membrananuclear. Após estar no núcleo, a carga de siRNA se separado veiculo.
Em geral, intensificadorès de distribuição estãocompreendidos em duas categorias: sistemas de veiculo virale sistemas de veiculo não viral. Como virus humanosdesenvolveram modos para superar as barreiras paratransporte para dentro do núcleo, discutido acima, vírus oucomponentes virais são úteis para transportar ácidosnucléicos para dentro de células. Um exemplo de umcomponente viral útil como intensificador de distribuição éo peptideo de hemaglutinina (peptídeo-HA). Esse peptídeoviral facilita a transferência de biomoléculas para dentrode células por ruptura de endossoma. No pH acídico doendossoma, essa proteína causa liberação da biomolécula edo veículo para dentro do citosol. Outros exemplos decomponentes virais úteis como intensificadores dedistribuição são conhecidos por aqueles versados natécnica.
Intensificadores de distribuição não viral sãotipicamente baseados em polímero ou baseados em lipídeo.São genericamente policátions que atuam para equilibrar acarga negativa do ácido nucléico. Polímeros policatiônicosmostram promessa significativa como intensificadores dedistribuição de gene não viral devido em parte a suacapacidade de condensar plasmídeos de DNA de tamanhoilimitado e a preocupações de segurança com vetores virais.Os exemplos incluem peptídeos com regiões ricas emaminoácidos básicos como oligo-lisina, oligo-arginina ouuma combinação dos mesmos e PEI. Acredita-se que essespolímeros policatiônicos facilitem o transporte porcondensação de DNA. Versões de cadeia ramificada depolicátions como PEI e dendrímeros starburst (na forma deestrela) podem mediar tanto condensação de DNA comoliberação de endossoma. Vide Boussif, e outros (1995) Proc.Natl. Acad. Sei. USA vol. 92: 7297-7301. PEI pode serpreparado como um polímero altamente ramificado com aminasterminais que são ionizáveis em pH 6,9 e aminas internasque são ionizáveis em pH 3,9. Devido a essa organização,PEI pode gerar uma alteração em pH de vesícula que leva aintumescimento de vesícula e, eventualmente, liberação apartir de retenção de endossoma.
Outro modo de intensificar distribuição é para olipopolimero catiônico compreender um ligando que éreconhecido por um receptor na célula que foi alvejado paradistribuição de carga de oligonucleotideo. A distribuiçãode oligonucleotideos na célula pode ser iniciada, então,por reconhecimento de receptor. Nesse contexto, o termo"ligando" se refere a uma biomolécula que pode ligar-se auma proteína de receptor específica localizada nasuperfície da célula alvo ou em seu núcleo ou citosol. Emuma modalidade, o ligando pode ser um anticorpo, hormônio,feromônio ou neurotransmissor, ou qualquer biomoléculacapaz de atuar como um ligando, que se liga ao receptor. Emuma modalidade preferida, o ligando é um oligonucleotideo.Um anticorpo se refere a qualquer proteína produzida por umlinfócito B em resposta a um antígeno. Quando o ligando seliga a um receptor de célula específica, a endocitose éestimulada. Exemplos de ligandos que foram utilizados comvários tipos de células para intensificar transporte deoligonucleotideo são galactose, transferrina, aglicoproteína asialoorosomucoide, fibra de adenovírus,proteína de circumsporozite de malária, fator decrescimento epidérmico, cápside de vírus de papilomahumano, fator de crescimento de fibroblasto e ácido fólico.No caso do receptor de folato, o ligando ligado éinternalizado através de um processo denominado potocitose,onde o receptor liga o ligando, a membrana em volta sefecha a partir da superfície da célula, e o materialinternalizado passa, então, através da membrana vesicularpara dentro do citoplasma. Vide Gottschalk, e outros (1994)Gene Ther. 1:185 - 191. Em uma modalidade, o polímero dafórmula (!) e um ligando que reconhece um receptorespecífico de uma célula eucariótica podem ser utilizadoscomo um sistema de diagnóstico médico.
Acredita-se que vários agentes de intensificardistribuição funcionem por ruptura de endossoma. Porexemplo, além da proteína-HA descrita acima, partículas devírus defeituoso também foram utilizadas como agentesendosomolíticos. Vide Cotten, e outros (Julho de 1992)Proc. Natl. Acad. Sei. USA vol. 89: páginas 6094-6098.Agentes não virais são tipicamente anfifílicos ou baseadosem lipídeo.
A liberação de oligonucleotídeos como siRNA nocitoplasma da célula pode ser intensificada por agentes quemediam ruptura de endossoma, diminuem degradação ou desviamtotalmente desse processo. Cloroquína, que eleva o pHendossomal, foi utilizado para diminuir a degradação dematerial submetido a endocitose por inibição de enzimashidrolíticas lisossomais. Vide Wagner e outros (1990) Proc.Natl. Acad. Sci USA vol. 87: 3410-3414. Policátions decadeia ramificada como PEI e dendrímeros starburst tambémpromovem liberação de endossoma como discutido acima.
A degradação endossomal pode ser desviada porincorporação de subunidades de toxinas como a toxina deDifteria e a exotoxina Pseudomonas como componentes deproteínas quiméricas que podem ser incorporadas no complexode biomolécula/lipopolímero catiônico. Vide Uherek, eoutros (1998) J. Biol. Chem. Vol. 273: 8835-8841. Essescomponentes promovem deslocamento do ácido nucléico atravésda membrana endossomal e de volta através do retículoendoplásmico.
Depois da chegada no citoplasma, o transporte dacarga de oligonucleotídeos para o núcleo pode serintensificada por inclusão de um sinal de localizaçãonuclear no veículo de oligonucleotídeos. Por exemplo, umaseqüência de aminoácido especifica que funciona como umsinal de localização nuclear (NLS) pode ser utilizada.Acredita-se que o NLS em um complexo deveiculo/oligonucleotideo interaja com uma proteína dereceptor de transporte nuclear específica localizada nocitosol. Após o complexo de veículo/oligonucleotídeo sermontado, acredita-se que a proteína de receptor no complexofaz contatos múltiplos com nucleoporinas, desse modotransportando o complexo através de um poro nuclear. Após ocomplexo de veiculo/oligonucleotideo atingir seu destino,dissocia-se, liberando a carga e outros componentes. Aseqüência Pro-Lis-Lis-Arg-Lis-Val (SEQ ID NO: 1) a partirde T-antígeno grande SV40 pode ser utilizada paratransportar para dentro dos núcleos. Acredita-se que essaseqüência curta de T-antígeno grande SV40 possa fornecer umsinal que cause o transporte de macromoléculas associadaspara dentro do núcleo.
0 lipopolímero catiônico pode compreenderadicionalmente um composto de imageamento de diagnósticocomo um corante fluorescente, radioativo ou radio-opaco queé complexado com o polímero. 0 complexo pode ser formadopor intermistura do lipopolímero catiônico e do composto deimageamento de diagnóstico em um solvente mútuo. 0 polímero(complexado com o composto de imageamento de diagnóstico)pode ser, então, administrado a um mamífero e rastreadoutilizando-se técnicas bem conhecidas como PET, MRI, CT,SPECT, etc. (vide Molecular Imaging of Gene Expression andProtein Function In Vivo With PET and SPECT, Vijay Sharma,PhD, Gary D. Luker, MD, e David Piwnica-Worms, MD, PhD,JOURNAL OF MAGNETIC RESONANCE IMAGING 16:336-351 (2002)).Uma composição de imageamento de diagnóstico também podeser formada por combinação do polímero da fórmula (I) comum agente de contraste de imageamento (por exemplo,1,4,7, 10-tetraazaciclododecano-l,4,7,10-ácido tetraacétíco(DOTA)-Gd(III) e ácido dietilenotriaminapentaacético(DTPA)-Gd(III)). Se desejado, a composição de imageamentode diagnóstico pode compreender ainda um agente de alvejar.
Agentes de alvejar apropriados incluem, porém não sãolimitados a, grupos de galactose e peptideo RGD.
Outra modalidade provê uma composiçãofarmacêutica compreendendo: um agente sensibilizador e umpolímero, onde o polímero compreende uma unidade recorrenteda fórmula (I) e um oligonucleotídeo, e pode compreenderadicionalmente um agente de intensificar distribuição capazde entrar em uma célula eucariótica e/ou um composto deimageamento de diagnóstico gue é complexado com o polímero.0 agente sensibilizador pode ser um composto que ésubmetido a uma alteração em propriedades após exposição àluz (por exemplo, visível e/ou radiação ultravioleta) ououtros estímulos, desse modo facilitando a distribuição dabiomolécula (por exemplo, por aumento da taxa de degradaçãodo polímero). O agente sensibilizador pode ele próprio seruma biomolécula que é submetida a uma alteração ejnatividade após estímulo. 0 agente sensibilizador pode seruma droga ativada por luz. Drogas ativadas por luzapropriadas incluem, porém não são limitadas a,fluoresceína, merocianina, xanteno e seus derivados e osmacrociclos derivados de pirrol fotorreativos e seusderivados. Macrociclos derivados de pirrol fotorreativosapropriados incluem, porém não são limitados a, porfirinasde ocorrência natural ou sintética, clorinas de ocorrênicanatural ou sintética, bacterioclorinas de ocorrênicanatural ou sintética, isobacterioclorinas sintéticas,ftalocianinas, naftalocianinas e sistemas macrocíclicosbaseados em pirrol expandido como porficenos, safirinas etexafirinas.EXEMPLOS
EXEMPLO 1
<formula>formula see original document page 21</formula>
Cloreto de oxalila (13,5 mL, 152 ramol) foi
adicionado a uma solução de ácido oléico 1 (10,7 g,38 mmol) em diclorometano (DCM, 200 mL) e N,N-dimetilformamida (DMF, três gotas) a 0 °C. A mistura de reação foiagitada por aproximadamente 1 hora e, então, deixadaaquecer em temperatura ambiente. Após 1 hora, a solução foidiluída com tolueno e destilada. O resíduo foi dissolvidoem diclorometano (200 mL) e resfriado a 0 °C. Dietanolamina (10,9 mL, 114 mmol), 4-(dimetilamino)piridina(490 mg, 4 mmol), e trietil amina (21 mL, 152 mmol) foramadicionados à solução. A solução foi agitada a 0 °C por 30minutos e, então, deixada prosseguir em temperaturaambiente durante a noite. A mistura de reação foi diluídacom diclorometano e lavada com HCl IN e NaHCO3 aquoso. Afase orgânica foi seca (Na2SO4) e concentrada sob pressãoreduzida. O resíduo bruto foi, então, purificado em umacoluna de sílica gel (10:1 acetato de etila-.metanol) ,fornecendo 13,5 g (99,9%) de composto 2 como um óleoincolor.
EXEMPLO 2
<formula>formula see original document page 22</formula>
Trietilamina (8,1 g, 80 mmol), DMA (0,5 g,4 mmol) e 2 (7,1 g, 20 mmol) foram dissolvidos em 200 mL dediclorometano em temperatura ambiente. O sistema foi lavadocom argônio e a solução foi resfriada em um banho de gelo.Cloreto de acriolila (5,4 g, 60 mmol) em 25 mL dediclorometano foi adicionado gota a gota. Após a adição, areação foi deixada aquecer a temperatura ambiente e agitadadurante a noite. A mistura de reação foi diluída comdiclorometano e lavada com água e NaHCO3 aquoso. A faseorgânica foi seca (Na2SO4) e concentrada sob pressãoreduzida. O resíduo bruto foi, então, purificado em umacoluna de sílica gel (1:3 acetato de etila:hexano),fornecendo 7,5 g (81%) do composto 3 (peso molecular:463,65) como um óleo incolor.
EXEMPLO 3
A síntese de um lipopolímero catiônico foirealizada de acordo com o Esquema A por reação depentaetilenohexamina (PEHA) tendo um peso molecular de 232Daltons com o composto 3 como a seguir: aproximadamente0,1 mmol (23 mg) de PEHA (Sigma-Aldrich) e aproximadamente0,2 mmol (93 mg) do composto 3 foram pesados e colocados emum pequeno frasco, e 1 mL de etanol foi adicionado edissolvido rapidamente. A mistura de reação foi agitada por 3horas em temperatura ambiente. A seguir, a mistura de reaçãoé neutralizada pela adição de 5 mL de HCl 2M em éter. 0precipitado branco YT-10 foi coletado por centrifugação,lavado com éter por duas vezes, e seco em temperaturaambiente sob pressão reduzida.
Esse é um procedimento geral que serve como ummodelo para outros procedimentos sintéticos envolvendocompostos similares, e pode ser utilizado para sintetizar umasérie de lipopolimeros catiônicos degradáveis. 0 polímero YT-11 foi preparado em um modo similar, exceto queaproximadamente 0,3 mmol (139 mg) do composto 3 foi utilizadopara reação. Além disso, outros tipos de PEIs foramutilizados para síntese de lipopolímero em um modo similarpara YT-IO ou YT-Il. Todos os lipopolimeros sintetizados noexemplo 3 são listados na Tabela 1. YT-26 se tornou um gelduro após polimerização e não foi neutralizado.
TABELA 1
<table>table see original document page 23</column></row><table>EXEMPLO 4
Linhagem de célula estável EGFP: linhagens decélula estáveis HT-1080-EGFP e HeLa-EGFP foram originadas apartir de células HT-1080 e HeLa respectivamente comexpressão de gene de proteína de fluorescência verdeintensificada estável (EGFP), preparada por transfecção deDNA de plasmídeo pEGFP-Nl (BD Bioscences Clontech) paracélulas HT-1080 e HeLa. As células transfectadas foramselecionadas e clonadas utilizando a capacidade deresistência de neomicina, carregadas em plasmídeo pEGFP-Nl.A cultura de células foi mantida em Meio de EagleModificado da Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro bovino,100 unidades/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicinaa 37 °C, 5% de CO2. A expressão de EGFP pode ser observadasob microscópio de fluorescência (Olympus). Ambas ascélulas HT-1080-EGFP e HeLa-EGFP mostraram fluorescênciaverde brilhante pela combinação de luz de excitação azul eajuste de filtro de emissão verde.
EXEMPLO 5
Estudo de distribuição de siRNA: O gene EGFP dealvejar siRNA foi sintetizado por Dharmacon Research Inc.EGFP de alvejar siRNA e gene luciferase eram RNA de fitadupla de 21 bp, a seqüência de fita de sentido dos mesmosera NNC GAG AAG CGC GAU CAC AUG (SEQ ID NO: 2).
1,5 χ 104 células HT-1080-EGFP e HeLa-EGFP foramcolocadas em placa com 96 cavidades para cada cavidade 24 hantes da transfecção. Para cada cavidade, uma alíquota de7,5 μL de solução contendo 1,5 μg de lipopolímero foiadicionada em 7,5 μL de solução de DNA contendo 15 pmol desiRNA e misturado totalmente. O DNA e mistura delipopolímero foram incubados por 15 minutos em temperaturaambiente para permitir a formação de complexos delipopolímero-siRNA. Os complexos foram adicionados a cadacavidade e as células foram incubadas a 37 °C, 5% de CO2por 48 h. Lipofectamina foi utilizada como controlepositivo. A eficiência de distribuição de siRNA foideterminada por análise de sinal GFP.
A figura 1 é uma fotografia de expressão deproteínas de fluorescência verde intensificada (EGFP) emcélulas HT-108O-EGFP após tratamento de siRNA comlipopolimeros (YT-10, YT-11, YT-22, YT-23, YT-24 e YT-25),lipofectamina2000 (controle positivo) e sem tratamento(controle negativo).
A figura 2 é uma fotografia de expressão deproteínas de fluorescência verde intensificada (EGFP) emcélulas HeLa-EGFP após tratamento de siRNA comlipopolimeros (YT-10, YT-11, YT-22, YT-23, YT-24 e YT-25),lipofectamina2000 (controle positivo) e sem tratamento(controle negativo).
Como mostrado nas figuras 1 e 2, sem tratamentode siRNA de alvejar silenciado, a expressão de EGFP não foiinibida, como indicado pela fluorescência intensa. Vide"sem tratamento" nas figuras 1 e 2. Com tratamento de siRNAde alvejar silenciado com os veículos de lipopolimeros, aexpressão de EGFP foi inibida, como indicado pelafluorescência fraca. Vide YT-10, YT-11, YT-22, YT-23, YT-24e YT-25 e Lipofectamina2000 das figuras 1 e 2. Em célulasHT-108O-EGFP, YT-10, YT-11, YT-22 e YT-23 mostraram efeitode inibição significativo em expressão EGFP. YT-24 e YT-25também mostraram distribuição eficaz de siRNA.Adicionalmente, YT-11 mostrou capacidade de distribuirsiRNA. Esses resultados indicam que os lipopolimeros sãoagentes de distribuição de siRNA melhores ou comparáveis emcomparação com Lipofectamina2000 comercial.Embora a invenção tenha sido descrita comreferência a modalidades e exemplos, deve ser reconhecidopor aqueles versados na técnica que várias omissões,adições e modificações podem ser feitas nas composições emétodos descritos acima sem se afastar do escopo dainvenção, e todas essas modificações e alterações pretendemestar compreendidas no escopo da invenção. Por conseguinte,a invenção é somente limitada pelas reivindicações que seseguem.

Claims (23)

1. Polímero compreendendo uma unidade recorrenteselecionada a partir do grupo que consiste na fórmula (1);<formula>formula see original document page 27</formula>em que:PEI é uma unidade recorrente de polietilenoiminatendo um peso molecular menor do que 600 Daltons;R é selecionado do grupo que consiste em par deelétrons, hidrogênio, alquila C2-C10, heteroalquila C2-C10,arila C5-C30 e lieteroarila C2-C30,L é selecionado do grupo que consiste em alquilaC2-C5Or heteroalquila C2-C50, alquenila C2-C50,heteroa lqueni Ia C2-C50, arila C5-C50, heteroarila C2-C50,alquinila C2-C50, heteroalquinila C2-C50, carboxialquenilaC2-C50 e carboxi. heteroalquenila C2-C50, em é um número inteiro na faixa deaproximadamente 1 a aproximadamente 30.
2. Polímero, de acordo com a reivindicação 1, emque o PEI compreende pelo menos uma unidade recorrenteselecionada dc grupo que consiste na fórmula (IIa) efórmula (IIb):<formula>formula see original document page 27</formula>em que χ é um número inteiro na faixa deaproximadamente 1 a aproximadamente 12, y é um númerointeiro na faixa de aproximadamente 1 a aproximadamente 6,e z é um número inteiro na faixa de aproximadamente 1 a aproximadamente 13.
3. Polímero, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2, que é biodeqradável.
4. Polímero, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 3, que é degradável por um mecanismo selecionado a partir do grupo que consiste em hidrólise,clivagem de enzima, redução, foto-clivagem e sonicação.
5. Polímero, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, em que L é selecionado do grupo queconsiste em alquila C2-C50, heteroalquila C2-C50, alquenila C2-C50, heteroalquenila C2-C50, alquinila C2-C50 eheteroalquinila C2-C50.
6. Polímero, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, em que L é selecionado do grupo queconsiste em ácido graxo C12 a C18, colesterol e derivados dos mesmos.
7. Polímero, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 6, tendo um peso molecular médioponderai na faixa de aproximadamente 500 Daltons aaproximadamente 1.000.000 Daltons.
8. Polímero, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 6, tendo um peso molecular médioponderai na faixa de aproximadamente 1.000 Daltons aaproximadamente 200.000 Daltons.
9. Polímero, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, que é reticulado.
10. Polímero, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 9, compreendendo adicionalmente umoligonucleotídeo que é complexado com o polímero.
11. Polímero, de acordo com a reivindicação 10,no qual o oligonucleotídeo é selecionado a partir do grupoque consiste em um oligômero-RNA e um oligômero-DNA.
12. Polímero, de acordo com a reivindicação 10,no qual o oligonucleotídeo é siRNA ou anti-sentido.
13. Polímero, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 12, compreendendo adicionalmente umagente de intensificar distribuição capaz de entrar em umacélula eucariótica.
14. Polímero, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 13, compreendendo adicionalmente umcomposto de imageamento de diagnóstico que é complexado como polímero.
15. Polímero, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 13 ou 14, no qual o agente de intensificardistribuição facilita uma ou mais funções na célulaeucariótica selecionadas do grupo que consiste emreconhecimento de receptor, internalização, escapamento dooligonucleotídeo a partir do endossoma de célula,localização de núcleo, liberação de oligonucleotídeo eestabilização de sistema.
16. Polímero, de acordo com a reivindicação 15,no qual o oligonucleotídeos é selecionado do grupo queconsiste em siRNA e anti-sentido.
17. Polímero, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 13 a 16, no qual o agente de intensificardistribuição é acoplado ao polímero.
18. Polímero compreendendo uma unidade recorrenteselecionada do grupo que consiste na fórmula (I):<formula>formula see original document page 30</formula>em que:PEI é uma unidade recorrente de polietilenoiminacompreendendo pelo menos uma unidade recorrente da fórmula(IIb) :<formula>formula see original document page 30</formula>em que z é um número inteiro na faixa deaproximadamente 1 a aproximadamente 13;R é selecionado a partir do grupo que consiste empar de elétrons, hidrogênio, alquila C2-C10, heteroalquilaC2-C10, arila C5-C30 e heteroarila C2-C30;L é selecionado do grupo que consiste em alquilaC2-C50, heteroalquila C2-C50, alquenila C2-C50,heteroalquenila C2-C50, arila C5-C50, heteroarila C2-C50,alquinila C2-C50, heteroalquinila C2-C50, carboxialquenilaC2-C50 e carboxi heteroalquenila C2-C50, em é um número inteiro na faixa deaproximadamente 1 a aproximadamente 30.
19. Polímero, de acordo com a reivindicação 18,em que o PEI tem um peso molecular menor do que 600Daltons.
20. Polímero, de acordo com a reivindicação 18,em que o PEI compreende adicionalmente uma unidaderecorrente da fórmula IIa:<formula>formula see original document page 31</formula>em que χ é um número inteiro na faixa deaproximadamente 1 a aproximadamente 12 e y é um númerointeiro na faixa de aproximadamente 1 a aproximadamente 6.
21. Polímero, de acordo com a reivindicação 20,em que o PEI tem um peso molecular menor do que 600Daltons.
22. Método de transfectar uma célula eucariótica,compreendendo contatar a célula com o polímero de qualqueruma das reivindicações 10 a 17 para desse modo distribuir ooligonucleotídeo para a célula.
23. Biblioteca de polímeros compreendendo umapluralidade de polímeros conforme qualquer uma dasreivindicações 1 a 21, em que pelo menos um parâmetroselecionado do grupo que consiste em R, L, PEI e m édiferente para pelo menos dois dos polímeros.
BRPI0710648-3A 2006-04-06 2007-04-03 polìmeros catiÈnicos biodegradáveis BRPI0710648A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78984206P 2006-04-06 2006-04-06
US60/789,842 2006-04-06
PCT/US2007/008106 WO2007120479A1 (en) 2006-04-06 2007-04-03 Biodegradable cationic polymers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0710648A2 true BRPI0710648A2 (pt) 2011-08-23

Family

ID=38490023

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0710648-3A BRPI0710648A2 (pt) 2006-04-06 2007-04-03 polìmeros catiÈnicos biodegradáveis

Country Status (13)

Country Link
US (1) US7700541B2 (pt)
EP (1) EP2007432B1 (pt)
JP (1) JP2009532564A (pt)
KR (1) KR20080108153A (pt)
CN (1) CN101415444A (pt)
AU (1) AU2007238965B2 (pt)
BR (1) BRPI0710648A2 (pt)
CA (1) CA2648386A1 (pt)
DK (1) DK2007432T3 (pt)
HK (1) HK1128080A1 (pt)
MX (1) MX2008012692A (pt)
RU (1) RU2451525C2 (pt)
WO (1) WO2007120479A1 (pt)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7358223B2 (en) * 2004-10-04 2008-04-15 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
ES2900801T3 (es) 2004-12-22 2022-03-18 Nitto Denko Corp Portador de fármacos y kit de portador de fármacos para inhibir la fibrosis
US20120269886A1 (en) 2004-12-22 2012-10-25 Nitto Denko Corporation Therapeutic agent for pulmonary fibrosis
US9572886B2 (en) 2005-12-22 2017-02-21 Nitto Denko Corporation Agent for treating myelofibrosis
US7700541B2 (en) 2006-04-06 2010-04-20 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
TWI407971B (zh) 2007-03-30 2013-09-11 Nitto Denko Corp Cancer cells and tumor-related fibroblasts
US20080312174A1 (en) * 2007-06-05 2008-12-18 Nitto Denko Corporation Water soluble crosslinked polymers
CA2698812A1 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Nitto Denko Corporation Drug carriers
JP2011514423A (ja) * 2008-03-14 2011-05-06 エーゲン、インコーポレイテッド 生分解性架橋分枝状ポリ（アルキレンイミン）
DE102008002254A1 (de) * 2008-06-06 2010-01-21 Evonik Röhm Gmbh Monomermischungen, Polymere sowie Beschichtungszusammensetzungen
KR20110051214A (ko) * 2008-07-30 2011-05-17 닛토덴코 가부시키가이샤 약물 담체
ES2683352T3 (es) 2009-04-13 2018-09-26 Inserm - Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale Partículas de HPV y usos de las mismas
EP2553019A1 (en) 2010-03-26 2013-02-06 Mersana Therapeutics, Inc. Modified polymers for delivery of polynucleotides, method of manufacture, and methods of use thereof
TWI405582B (zh) * 2010-07-13 2013-08-21 Univ Nat Taiwan 用於傳遞物質之載體複合物及其應用
CA2818662C (en) 2010-10-22 2021-07-06 Sungkyunkwan University Foundation For Corporate Collaboration Nucleic acid molecule inducing rna interference, and uses thereof
US9700639B2 (en) 2012-02-07 2017-07-11 Aura Biosciences, Inc. Virion-derived nanospheres for selective delivery of therapeutic and diagnostic agents to cancer cells
JP6139671B2 (ja) 2012-05-22 2017-05-31 オリックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＯｌｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ． 細胞内貫通能を持ってｒｎａ干渉を誘導する核酸分子およびその用途
EP2903652B1 (en) 2012-10-05 2022-04-20 BioNTech Delivery Technologies GmbH Hydroxylated polyamine derivatives as transfection reagents
ES2902839T3 (es) 2012-10-08 2022-03-30 Biontech Delivery Tech Gmbh Derivados de poliaminas carboxiladas como reactivos de transfección
WO2014158597A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Elevance Renewable Sciences Natural oil derivatives including (meth)acrylate functional groups
EP3046583B1 (en) 2013-09-18 2019-02-13 Aura Biosciences, Inc. Virus-like particle conjugates for treatment of tumors
RU2549908C1 (ru) * 2014-03-12 2015-05-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" Биодеградируемые аргининсодержащие полимеры
US9743999B2 (en) * 2014-08-29 2017-08-29 Piero A. Policicchio Dental prophylaxis device and air appliance
EP3034539A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Ethris GmbH Compositions for introducing nucleic acid into cells
JP7027311B2 (ja) 2015-11-16 2022-03-01 オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド ＭｙＤ８８又はＴＬＲ３を標的とするＲＮＡ複合体を使用した加齢黄斑変性の治療
EP3411480A4 (en) 2016-02-02 2020-01-22 Olix Pharmaceuticals, Inc. TREATMENT OF ATOPIC DERMATITIS AND ASTHMA USING RNA COMPLEXES THAT TARGETE IL4R, TRPA1, OR F2RL1
JP7003044B2 (ja) 2016-02-02 2022-01-20 オリックス ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド Ａｎｇｐｔ２およびｐｄｇｆｂを標的化するｒｎａ複合体を用いる血管新生関連疾患の処置
CN105669975B (zh) * 2016-02-03 2018-02-23 华东师范大学 一种超支化铵盐型阳离子表面活性剂及制备和应用
US10301628B2 (en) 2016-04-11 2019-05-28 Olix Pharmaceuticals, Inc. Treatment of idiopathic pulmonary fibrosis using RNA complexes that target connective tissue growth factor
KR101916652B1 (ko) * 2016-06-29 2018-11-08 올릭스 주식회사 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도
US11591600B2 (en) 2017-02-10 2023-02-28 OliX Pharmaceuticals. Inc. Long double-stranded RNA for RNA interference

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6509032B1 (en) * 1991-08-28 2003-01-21 Mcmaster University Cationic amphiphiles
DE4142130A1 (de) * 1991-12-20 1993-06-24 Basf Ag Verwendung von polyacetalen auf basis von vinylethern und dihydroxyverbindungen in wasch- und reinigungsmitteln und polyacetale
US5919455A (en) * 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
WO1995025809A1 (en) 1994-03-23 1995-09-28 Ohio University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
EP0769063A1 (en) * 1994-06-27 1997-04-23 The Johns Hopkins University Targeted gene delivery system
US5767168A (en) * 1995-03-30 1998-06-16 The Proctor & Gamble Company Biodegradable and/or compostable polymers made from conjugated dienes such as isoprene and 2,3-dimethyl-1, 3-butadiene
US5811510A (en) * 1995-04-14 1998-09-22 General Hospital Corporation Biodegradable polyacetal polymers and methods for their formation and use
AU739969B2 (en) 1996-05-29 2001-10-25 Cell Genesys, Inc. Cationic polymer/lipid nucleic acid delivery vehicles
US6072101A (en) * 1997-11-19 2000-06-06 Amcol International Corporation Multicomponent superabsorbent gel particles
EP1173224B1 (en) * 1999-04-02 2006-09-06 Research Development Foundation Polyethyleneimine:dna formulations for aerosol delivery
US20020006664A1 (en) * 1999-09-17 2002-01-17 Sabatini David M. Arrayed transfection method and uses related thereto
ATE377048T1 (de) * 2000-09-06 2007-11-15 Ap Pharma Inc Abbaubare polyacetal-polymere
US20040142474A1 (en) 2000-09-14 2004-07-22 Expression Genetics, Inc. Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent
US6696038B1 (en) * 2000-09-14 2004-02-24 Expression Genetics, Inc. Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent
US6998115B2 (en) 2000-10-10 2006-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US7427394B2 (en) * 2000-10-10 2008-09-23 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
GB2368053A (en) * 2000-10-20 2002-04-24 Nsk Ltd Electric power steering control
US6794965B2 (en) * 2001-01-18 2004-09-21 Arizona State University Micro-magnetic latching switch with relaxed permanent magnet alignment requirements
US6652886B2 (en) * 2001-02-16 2003-11-25 Expression Genetics Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
US20030120355A1 (en) * 2001-06-08 2003-06-26 Urs Hafeli Biocompatible and biodegradable polymers for diagnostic and therapeutic radioisotope delivery
KR100448170B1 (ko) * 2001-06-23 2004-09-10 주식회사 태평양 폴리에틸렌이민을 친수성 블록으로 갖고 폴리에스테르계고분자를 소수성 블록으로 갖는 양친성 생분해성 블록공중합체 및 이를 이용한 수용액 상에서의 고분자자기조합 회합체
US6586524B2 (en) * 2001-07-19 2003-07-01 Expression Genetics, Inc. Cellular targeting poly(ethylene glycol)-grafted polymeric gene carrier
WO2003078576A2 (en) 2002-03-12 2003-09-25 Nitto Denko Corporation Vector for transfection of eukaryotic cells
US20030215395A1 (en) * 2002-05-14 2003-11-20 Lei Yu Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier
US20040048260A1 (en) * 2002-09-10 2004-03-11 Fu-Hsiung Chang Transfection of nucleic acid
US20070269891A9 (en) * 2003-01-13 2007-11-22 Yasunobu Tanaka Solid surface with immobilized degradable cationic polymer for transfecting eukaryotic cells
US20040138154A1 (en) * 2003-01-13 2004-07-15 Lei Yu Solid surface for biomolecule delivery and high-throughput assay
US6878374B2 (en) * 2003-02-25 2005-04-12 Nitto Denko Corporation Biodegradable polyacetals
US7332477B2 (en) * 2003-07-10 2008-02-19 Nitto Denko Corporation Photocleavable DNA transfer agent
US7048925B2 (en) * 2003-08-28 2006-05-23 Nitto Denko Corporation Acid-sensitive polyacetals and methods
WO2005032597A1 (en) 2003-09-29 2005-04-14 Nitto Denko Corporation Biodegradable polyacetals for in vivo polynucleotide delivery
US7163677B2 (en) * 2003-10-24 2007-01-16 Nitto Denko Corporation Cationic polymers having degradable crosslinks
US7125709B2 (en) * 2004-02-10 2006-10-24 Nitto Denko Corporation Culture device and method for eukaryotic cell transfection
US7358223B2 (en) 2004-10-04 2008-04-15 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
US7588754B2 (en) * 2005-05-10 2009-09-15 Nitto Denko Corporation Biodegradable polyacetals and methods
US20060263328A1 (en) * 2005-05-19 2006-11-23 Sang Van Hydrophilic polymers with pendant functional groups and method thereof
EP1971652A1 (en) 2006-01-04 2008-09-24 Dow Global Technologies Inc. Reactive (meth)acrylate monomer compositions and preparation and use thereof
US7700541B2 (en) 2006-04-06 2010-04-20 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
CN100549044C (zh) * 2006-11-16 2009-10-14 南京慧基生物技术有限公司 可生物降解的交联聚乙烯亚胺及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US7700541B2 (en) 2010-04-20
JP2009532564A (ja) 2009-09-10
CN101415444A (zh) 2009-04-22
KR20080108153A (ko) 2008-12-11
MX2008012692A (es) 2008-10-10
RU2451525C2 (ru) 2012-05-27
HK1128080A1 (en) 2009-10-16
EP2007432B1 (en) 2012-09-19
US20070243157A1 (en) 2007-10-18
CA2648386A1 (en) 2007-10-25
WO2007120479A1 (en) 2007-10-25
RU2008142416A (ru) 2010-05-20
AU2007238965B2 (en) 2012-03-29
EP2007432A1 (en) 2008-12-31
DK2007432T3 (da) 2012-12-03
AU2007238965A1 (en) 2007-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BRPI0710648A2 (pt) polìmeros catiÈnicos biodegradáveis
US8258235B2 (en) Biodegradable cationic polymers
Zhang et al. History of polymeric gene delivery systems
EP1503802B1 (en) Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier
FI119738B (fi) Nukleiinihapon liuosta ja kationisen polymeerin liuosta sisältävä koostumus ja käytöt
Molla et al. Combinatorial approach to nanoarchitectonics for nonviral delivery of nucleic acids
Gabrielson et al. Multiplexed supramolecular self-assembly for non-viral gene delivery
Jekhmane et al. Virus-like particles of mRNA with artificial minimal coat proteins: particle formation, stability, and transfection efficiency
Liu et al. Folic acid/peptides modified PLGA–PEI–PEG polymeric vectors as efficient gene delivery vehicles: synthesis, characterization and their biological performance
Liu et al. Zinc coordinated cationic polymers break up the paradox between low molecular weight and high transfection efficacy
Kos et al. Gene transfer with sequence-defined oligo (ethanamino) amides bioreducibly attached to a propylenimine dendrimer core
AU2012200435A1 (en) &#34;Biodegradable cationic polymers&#34;
Bandyopadhyay et al. Latest Biomedical Applications of Hyperbranched Polymers: Part 1: As Delivery Vehicle
Yang Development of Synthetic Materials for RNA Delivery
Jere et al. Biodegradable poly (B-amino ester) derivatives for gene and siRNA delivery

Legal Events

Date Code Title Description
B08L Patent application lapsed because of non payment of annual fee [chapter 8.12 patent gazette]

Free format text: REFERENTE AO NAO RECOLHIMENTO DAS 6A E 7A ANUIDADES.

B15K Others concerning applications: alteration of classification

Ipc: C08G 73/02 (2006.01), A61K 47/59 (2017.01), A61K 4

B08I Publication cancelled [chapter 8.9 patent gazette]

Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 8.12 NA RPI NO 2259 DE 22/04/2014 POR TER SIDO INDEVIDA.

B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE AS 6A, 7A, 8A, 9A, 10A, 11A, 12A E 13A ANUIDADES.

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: EM VIRTUDE DO ARQUIVAMENTO PUBLICADO NA RPI 2602 DE 17-11-2020 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDO O ARQUIVAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013.