ES2902839T3 - Derivados de poliaminas carboxiladas como reactivos de transfección - Google Patents

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Christian Reinsch
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Christina Dreher
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Abstract

Uso de un derivado de poliamina para la transfección de polianiones adentro de células, comprendiendo dicha poliamina: una fracción de poliamina que comprende una pluralidad de grupos amino; una pluralidad de sustituyentes carboxilados que comprenden un grupo carboxilo unido mediante un enlazador hidrófobo a grupos amino de dicha fracción de poliamina, en donde cada uno de dichos sustituyentes carboxilados comprende de 6 a 40 átomos de carbono, y cada uno de dichos enlazadores hidrófobos puede comprender de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N, y S, en donde dichos sustituyentes carboxilados son grupos carboxihidrocarbilo o grupos carboxiheterohidrocarbilo, comprendiendo estos últimos dichos de 1 a 3 heteroátomos; y una pluralidad de sustituyentes hidrófobos unidos a grupos amino de dicha fracción de poliamina, en donde cada uno de dichos sustituyentes hidrófobos comprende al menos 2 átomos de carbono y puede comprender de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre O, N, y S siempre que dicho sustituyente hidrófobo tenga al menos 6 átomos de carbono, en donde dichos sustituyentes hidrófobos son grupos hidrocarbilo o grupos heterohidrocarbilo, comprendiendo estos últimos dichos de 1 a 3 heteroátomos, siempre que dicho uso no constituya un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal por medio de terapia.

Description

D E S C R IP C IÓ N
D e riva d o s de p o lia m in a s ca rb o x ila d a s com o re a c tivo s de tra n s fe cc ió n
C a m p o de la inve nc ión
La in ve n c ió n se re fie re a d e riva d o s de p o lia m in a s y al uso de d e riva d o s de p o lia m in a s p ara la tra n s fe c c ió n de á c id os n u c le ico s y o tros p o lia n io n e s en cé lu las , ta l com o se d e fine a d ic io n a lm e n te en las re iv in d ica c io n e s . La inve nc ión ta m b ié n se re fie re a k its y a d e riva d o s de p o lia m in a para los m ism os. Los d e riva d o s de p o lia m in a s de la inve nc ión son tra n s fe c ta n te s e fica ce s con m uy ba ja to x ic id a d que pueden u sa rse para tra n s fe c ta r una a m p lia gam a de d ife re n te s tip o s de cé lu las .
E s ta d o de la té cn ica
La tra n s fe cc ió n es la in trod ucc ión de m a te ria e x te rn a a de n tro de las cé lu las. En el con te x to de la tra n s fe cc ió n , "a d e n tro de las cé lu las " s ign ifica el tra n sp o rte de la m a te ria e x te rn a a tra vé s de al m e no s una m e m b ra n a b io lóg ica . El tra n sp o rte a d ic io n a l p ue de o cu rr ir a d e n tro de co m p a rtim e n to s c e lu la re s u o rg á n u lo s . P o r el con tra rio , una m era inc lu s ió n del m a te ria l en e n d o so m a s , v e s ícu la s p in o c ítica s o fa g o c ítica s o liso so m a s no se co n s id e ra una tra n s fe cc ió n .
La m a te ria e x te rn a p uede a b a rca r m o lécu la s com o pép tidos , p ro te ína s y d ive rso s tip o s de á c id os nuc le icos ; los ú ltim os p ueden s e r tan p eq ue ño s com o o lig o n u c le ó tid o s o tan la rgos com o p lásm idos . T a m b ié n p uede in c lu ir co n ju n to s de ta le s m o lécu las . En c u a lq u ie r caso, las m o lécu la s o con ju n to s son g ran d es e h id ró filos, dos c a ra c te rís tica s que im p iden su cap ta c ió n c e lu la r no a s is tida . P o r tan to , la tra n s fe cc ió n re qu ie re el uso de re a c tivo s a u x ilia re s e sp ec ífico s . E ntre o tros , las p o lia m in a s pueden se r ta le s re ac tivos . Las p o lia m ina s fo rm a n p o lica tio n e s en so lu c ió n , lo que fa c ilita la fo rm a c ió n de c o m p le jo s con p o lia n io n e s com o los á c id o s nuc le icos . E s to s c o m p le jo s son las e n tid a d e s co m p e te n te s de tra n s fe c c ió n real.
La tra n s fe c c ió n de c o m p le jo s de una p o lia m in a y un p lá sm id o fue d e m o s tra d a p o r B o u s s if y col. (P ro c N atl A ca d Sci U S A (1995 ), 92 (16): 7297 -7301 ) o en la p ub lica c ió n U S 6013240), u tiliza n d o p o lie tile n im in a ra m ifica d a (P E I) com o po liam ina . M ie n tra s m a n ten ían el con cep to , o tros b uscaron m e jo ra r la te cn o lo g ía p or d ive rsos m ed ios. Las e s tra te g ia s para m e jo ra r los tra n s fe c ta n te s inc luyen
(i) se le cc ió n de un ta m a ñ o o co n fig u ra c ió n e sp e c ífico s del po lica tión , com o PEI linea l de una d e te rm in a d a long itud (p u b lica c ió n W O 2009 /016507 );
(ii) uso de m u ltím e ro s m e ta b ó lica m e n te láb iles de ta le s p o lica tion e s (G o sse lin y col. (2001 ) B ioco n j C hem , 12 (6 ): 989 ­ 994 ; Lynn y o tro s (2001 ) J A m C h e m S o c 123 (33): 8155 -8156 ; s o lic itu d de p a te n te W O 2007 /020060 de G o p fr ich e t al.; so lic itud de pa ten te W O 2007 /120479 de T a n a ka et al.);
(iii) e m p le o de m e zc la s de líp id os (p a te n te U S 7 ,601,367 de M o n a h a n e t a l.) o
(iv ) m o d ifica c io n e s q u ím ica s de la e s tru c tu ra del po lím ero , p o r e je m p lo , in je rto de a m in o á c id o s a ro m á tico s (en la so lic itud de p a ten te W O 2009 /074970 de A d ib et al.), in je rto de res tos de h is tid in a o im id azo l (en la so lic itud de paten te W O 2009 /011402 ), a lq u ila c io n e s co m o en W a k e fie ld e t al. (2005 ) B io co n j C h e m 16 (5): 1204 -1208 o la m o d ifica c ió n con co le s te ro l (en la so lic itu d de pa ten te U S 2007 /0154447 de F e rg u so n e t al.).
Las m o d ific a c io n e s h id ró fu g a s m e jo ran la p e n e tra c ió n en la m e m b ra n a de un tra n s fe c ta n te (vé a se W a ke fie ld e t al.), p e ro e s tán a so c ia d a s con una m e n o r e s ta b ilid a d de l co m p le jo en so lu c ió n ; el m a te ria l fo rm u la d o tie n d e a fo rm a r a g re g a d o s . El in je rto de p o lie tile n g lico l (P E G ) (p o r M a ta r e t al. en la so lic itud de paten te W O 2009 /021017 o en R ozem a e t al (2007 ) P roc N atl A cad Sci U S A 104 (32): 12982 -12987 ) co n tra rre s ta la a gre g ac ión , pero p o r o tro lado com p ite con la a c tiv id a d b io ló g ica y d eb e s e r re ve rs ib le co m o se m u e s tra en la p u b lica c ió n de R ozem a.
C om o se d e sp re n d e de las m u ch as e s tra te g ia s d ife re n te s y del g ran n ú m e ro de in fo rm es , el d e sa rro llo de nue vo s tra n s fe c ta n te s es un te m a de in te nsa in ve s tig a c ió n . Su uso tie n e una im p o rta n c ia c o m e rc ia l sus tan c ia l; Los re a c tivo s de tra n s fe cc ió n tu v ie ro n un vo lu m e n de m e rcad o de a p ro x im a d a m e n te 200 m illo ne s de U S D en 2011 (F ros t & Sullivan, G lo b a l T ra n s fe c tio n M arke ts , N 6F 0-01).
A d ic io n a lm e n te , Incan i e t al. (S o ft M a tte r 6 , 10: 2124 - 2138 (2010 )) d e sc rib e n la m o d ifica c ió n lip íd ica e h id ró fo b a de p o rta d o re s c a tió n ico s en ru ta a v e c to re s de g e n e s su p e rio re s . P h ilip p et al. (R e a c tive and F u n c tio n a l P o lym e rs 71, 3: 288 - 293 (2010 )) d e sc rib e la m o d ifica c ió n fu n c io n a l de o lig o e tile n im in a re ticu la d a con a m id a p ara m e jo ra r la e n tre g a de A R N ip . O sku e e e t al. (T h e Jo u rn a l o f G e n e M e d ic in e 11, 10: 921 - 932 (2009 )) d e sc rib e el in je rto de ca rb o x ila to de a lq u ilo en p o lie tile n im in a com o un e n foq ue s im p le para p ro d u c ir un n a n o p o rta d o r de A D N con baja tox ic idad . D ehshah ri e t al. (B io m a te ria le s 30, 25: 4187 - 4194 (2009 )) d e sc rib e la e fic ie n c ia de tra n s fe re n c ia de g enes de d e riva d o s de a lq u il-o lig o a m in a h id ró fo b o s de p o lie tile n im in a con a lto co n te n id o de a m ina p rim aria .
A d e m á s, la p ub lica c ió n W O 01 /76643 (A 1 ) d escribe el d esarro llo de un v e c to r de exp re s ió n que con tien e una secu en cia g e n ó m ica a n tigé n ica , que está un ida a un co n ju g a d o a g re g a d o de p ro te ín a -p o lím e ro p o lica tió n ico . Se re v isan las m o d ifica c io n e s de d ive rso s p o lím e ro s ca tió n ico s con g rup o s h id ró fob os . Entre o tras cosa s, las p o lie tile n im in a s (P E I) se m o d ifica n con g rup o s h id ró fob os . Este d o cu m e n to no d e sc rib e un d e riva d o de p o lia m in a que co m p re n d a una fra cc ió n de p o lia m in a y una p lu ra lida d de s u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s que co m p re n d a n un g rup o ca rb o x ilo un ido m e d ia n te un e n la za d o r h id ró fo b o a g rup o s a m ino de la fra cc ió n po liam ina ; en d on de cada uno de d ich os su s titu ye n te s c a rb o x ila d o s co m p re n d e de 6 a 40 á to m o s de ca rbo no .
La pub lica c ió n U S 2003 /077827 (A 1 ) d e sc rib e un p ro ce d im ie n to de tra n s fe cc ió n de cé lu las que co m p re n d e a p lica r c é lu la s d ire c ta m e n te sob re á c id o s n u c le ico s q ue e stán in m o v iliza d o s en c o m p le jo s de tra n s fe c c ió n en una su p e rfic ie y q ue tra n s fe c ta n las cé lu las . La p ub lica c ió n W O 2011 /120953 (A 1) d e sc rib e una n ue va c lase de p o lím e ro s ca tió n ico s q ue se a u to e n sa m b la n con un in te rru p to r de d iso lu c ió n s e n s ib le al pH y sus uso s para e n tre g a r m o lé cu la s de in te ré s a una cé lu la . La p ub lica c ió n W O 2007 /006700 (A 1 ) d e sc rib e d e n d rím e ro s de poli (p ro p ile n im in a ) m o d ifica d o s , que co m p re n d e n g rup o s de a m o n io in te rn os ca tió n ico s y g rup o s te rm in a le s e x te rn o s no tó x ico s , c o m p o s ic io n e s fa rm a c é u tic a s q ue co m p re n d e n d ich o s d e n d rím e ro s , p ro ce d im ie n to s p ara la p ro d u cc ió n de d ich o s d e n d rím e ro s y su uso com o a g e n te s de tra n s fe cc ió n de fa c to re s te ra p é u tico s b io a c tivo s an ió n icos , para su uso en te ra p ia gén ica , en p a rtic u la r para el tra ta m ie n to del cáncer. La pub lica c ió n W O 98 /59064 (A 1 ) d e sc rib e co m p le jo s de ácido n uc le ico y p o lie tile n im in a (P E I), en los que PEI se m odifica con un po lím ero h id ró filo a co p la d o co va le n te m e n te al m ism o, ta l com o p o lie tile n g lico l, y p ro ce d im ie n to s para p rep a ra rlos .
Los d os c rite r io s m ás im p o rta n te s en el d e sa rro llo y la m e jo ra de tra n s fe c ta n te s son (i) una a lta re lac ió n s e ñ a l-ru id o y (ii) tra n s fe cc ió n e fic ien te a tra vé s de un g ran n úm e ro de tip o s de cé lu las d ife re n te s . La re lac ió n se ñ a l/ru id o d e sc rib e el e fe c to de l co m p le jo de tra n s fe c c ió n en c o m p a ra c ió n con el tra n s fe c ta n te so lo o en co m p a ra c ió n con un co m p le jo de tra n s fe cc ió n q ue co m p re n d e un á c id o n u c le ico irre le van te .
P o r tan to , un o b je tivo de la inve nc ión es p ro p o rc io n a r un tra n s fe c ta n te para tra n s fe c ta r p o lia n io n e s a d e n tro de cé lu las y un p ro ce d im ie n to para tra n s fe c ta r cé lu las . O tro o b je tivo es p ro p o rc io n a r un tra n s fe c ta n te q ue sea s u p e r io r a los m a te ria le s d isp o n ib le s c o m e rc ia lm e n te en los c rite r io s (i) y /o (ii). D ada la g ran can tid a d y d ive rs ida d de e n fo q u e s u tiliza d o s a n te rio rm e n te , no se p udo id e n tif ica r n in g u n a ra zón e sp e c ífica q ue h u b ie ra g u ia d o ta l invenc ión .
R esu m e n de la inve nc ión
Los o b je tivo s a n te rio re s se log ran m e d ia n te el uso de las re iv in d ica c io n e s 1 a 9, el d e riva d o de p o lia m in a de las re iv in d ica c io n e s 10 a 12, el co m p le jo de la re iv in d ica c ió n 13, el k it de la re iv in d ica c ió n 14 y el re c ip ie n te de la re iv in d ica c ió n 15.
La p re se n te inve nc ión e stá d e fin id a p o r las re iv in d ica c io n e s a d ju n tas . C u a lq u ie r o b je to m e n c io n a d o a co n tin u a c ió n en el p re se n te d o c u m e n to y q ue no se e n c u e n tre d e n tro de l a lc a n c e de las re iv in d ica c io n e s a d ju n ta s no fo rm a p arte de la p re se n te inve nc ión .
D ivu lg a c ió n a d ic io n a l
Los s ig u ie n te s a sp e c to s (e le m e n to s (1 ) a (30 )) ta m b ié n se d e sc rib e n en el p rese n te d o cu m e n to , pero de p o r s í no fo rm a n p arte de la inve nc ión :
(1 ) U so de un d e riva d o de p o lia m in a para la tra n s fe cc ió n de p o lia n io n e s a de n tro de cé lu las ; d icha po lia m ina com p re nd e :
una fra cc ió n p o lia m in a que co m p re n d e una p lu ra lid a d de g ru p o s am ino ;
una p lu ra lida d de s u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s que co m p re n d e n un g rup o ca rb o x ilo u n ido m e d ia n te un e n la za d o r h id ró fo b o a g ru p o s a m ino de d ich a fra cc ió n po lia m ina ; y
una p lu ra lida d de su s titu ye n te s h id ró fo b o s u n id os a g ru p o s a m ino de d ich a fra cc ió n po liam ina ;
d ich o e n la za d o r h id ró fo b o tie n e un logP de 3 a 20 d e te rm ina do para un com p ue s to o b ten ib le a p artir de d icho e n la za d o r re e m p la za n d o e n la ce s de d icho e n la za d o r al g rup o ca rb o x ilo y el g rupo a m ino de d icha p o lia m ina p o r e n la ce s a á to m os de h id ró ge n o ; y
d ich o su s titu ye n te h id ró fo b o tie n e un logP de 1.5 a 20 d e te rm in a d o para un co m p u e s to o b te n ib le a p a rtir de d icho s u s titu ye n te h id ró fo b o re e m p la za n d o el e n la ce de d icho su s titu ye n te h id ró fo b o a un g rupo a m ino de d ich a fra cc ió n p o lia m in a p o r un e n la ce a un á to m o de h id ró ge n o .
(2 ) U so de un d e riva d o de p o lia m in a para la tra n s fe cc ió n de p o lia n io n e s en cé lu las ; d ich a p o lia m in a com p re nd e :
una fra cc ió n p o lia m in a que co m p re n d e una p lu ra lida d de g ru p o s am ino ;
una p lu ra lida d de s u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s que co m p re n d e n un g rup o ca rb o x ilo u n ido m e d ia n te un e n la za d o r h id ró fo b o a g rup o s a m ino de d ich a fra cc ió n po lia m ina , en d o n d e cad a uno de d ich os s u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s co m p re n d e de 6 a 40 á to m o s de ca rbo no , p re fe rib le m e n te de 6 a 20 á to m o s de ca rbo no , y m ás p re fe rib le m e n te de 8 a 16 á to m os de ca rbo no , y cad a uno de d ich os e n la za d o re s h id ró fo b o s p uede c o m p re n d e r de 1 a 3 h e te ro á to m o s se le cc io n a d o s e n tre O, N y S; y
una p lu ra lida d de s u s titu ye n te s h id ró fo b o s u n id os a g ru p o s a m ino de d ich a fra cc ió n p o lia m ina , en d on de cada uno de d ich o s s u s titu ye n te s h id ró fo b o s co m p re n d e al m e no s 2 á to m o s de ca rbo no , p re fe rib le m e n te de 6 a 40 á to m o s de ca rb o n o , y p ue de c o m p re n d e r de 1 a 3 h e te ro á to m o s se le cc io n a d o s e n tre O, N y S s ie m p re que d icho su s titu ye n te h id ró fo b o te n g a al m e no s 6 á to m o s de ca rbo no .
(3) El uso según el punto 1 o 2, en el que cad a uno de d ichos sus titu yen tes ca rbo x ila do s de d icho d e riva do de po liam ina co m p re n d e uno cua lqu ie ra o m ás de las s ig u ie n te s fra cc io n e s com o d icho e n la za d o r h id ró fob o : a lq u ile n o , a lq u en ilen o , a lq u in ilen o , c ic lo a lq u ile n o , c ic lo a lq u e n ile n o , a rile n o y co m b in a c io n e s de los m ism os ; y /o
cad a uno de d ich o s su s titu ye n te s h id ró fo b o s de d ich o d e riva d o de p o lia m in a co m p re n d e uno cu a lq u ie ra o m ás de las s ig u ie n te s fra cc io n e s : a lqu ilo , a lq u en ilo , a lq u in ilo , c ic lo a lq u ilo , c ic lo a lq u e n ilo , a rilo y co m b in a c io n e s de los m ism os. (4 ) D e riva d o de p o lia m in a según se d e fine en el pun to 1 o 2.
(5 ) D e riva d o de p o lia lq u ile n im in a que tie n e uno o m á s su s titu ye n te s c a rb o x ia lq u ilo q ue co m p re n d e n de 6 a 40 á to m os de ca rbo no , y uno o m ás s u s titu ye n te s h id ró fo b o s se le cc io n a d o s e n tre s u s titu ye n te s h id ro ca rb u ro s que tie n e n al m e no s 2 á to m o s de ca rbo no , p re fe rib le m e n te de 6 a 40 á to m os de carbono, en d o n d e cad a uno de d ich os su s titu ye n te s h id ró fo b o s p uede s e r o p uede c o m p re n d e r un g rup o a lq u ilo y /o ca d a uno de d ich o s s u s titu y e n te s h id ró fo b o s puede s e r o p uede c o m p re n d e r un g rup o arilo .
(6 ) El d e riva d o de p o lia lq u ile n im in a seg ún el pun to 5, en el q ue los s u s titu ye n te s c a rb o x ia lq u ilo y los su s titu ye n te s h id ró fo b o s en d icho d e riva d o de p o lia lq u ile n im in a tie n e n una re lac ión m o la r de 10: 1 a 0.1: 1 (la re lac ió n C /A), p re fe rib le m e n te la re lac ió n C /A de e s to s g ru p o s es de 3: 1 a 0.33 : 1.
(7 ) El d e riva d o de p o lia m in a o d e riva d o de p o lia lq u ile n im in a seg ún cu a lq u ie ra de los pun to s 4 a 6 , en el que d ich os su s titu y e n te s ca rb o x ila d o s son to d o s igu a les y d ich os su s titu ye n te s h id ró fo b o s son to d o s igua les, y la sum a de á to m os de ca rb o n o en uno de d ich o s s u s titu y e n te s c a rb o x ila d o s m ás a q u e llo s en uno de d ich o s s u s titu y e n te s h id ró fo b o s es de 10 a 30, p re fe rib le m e n te de 15 a 25.
(8 ) C o m p le jo de un á c id o n u c le ico o una p ro te ína con el d e riva d o de p o lia m in a de la inve nc ión .
(9 ) Un k it q ue com p re nd e :
(i) un d e riva d o de p o lia m in a com o se d e fin e en el p re se n te d ocum e n to ,
(ii) una so lu c ió n re g u la d o ra q ue tie n e un pH e n tre 4 y 8 , y
(iii) o p c io n a lm e n te un m a nu a l con in s tru cc io n e s de uso.
(10 ) Un p ro ce d im ie n to p ara tra n s fe c ta r cé lu las con un á c id o n u c le ico o una p ro te ína , que co m p re n d e m e zc la r d icho á c id o n u c le ico o una p ro te ín a con un d e riv a d o de p o lia m in a com o se d e fin e en el p re se n te d o cu m e n to , p o r e jem p lo , en un re g u la d o r a cu o so y tra ta n d o d ich a s cé lu la s con la m e zc la o b te n id a en el paso ante rio r.
(11) Un re c ip ie n te que co m p re n d e m ú ltip les co m p a rtim e n to s q ue con tien en una co m p o s ic ió n lio filizada que com p re nd e un tra n s fe c ta n te , d icho tra n s fe c ta n te p uede se r o puede c o m p re n d e r el d e riva d o de p o lia m in a com o se d e fine en cu a lq u ie ra de los p u n to s 1 a 7.
T a m b ié n se d escribe :
(12 ) Un uso de una ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a para la tra n s fe cc ió n de p o lia n io n e s a d e n tro de cé lu las.
(13 ) El uso de a cu e rd o con el pun to 12, en el q ue la fra cc ió n p o lia m in a de d ich a ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a se s e le cc io n a de l g ru p o q ue co n s is te en p o lia lq u ile n im in a s , p o lia lila m in a s , p o liv in ila m in a s , p o lilis ina s y p o lio rn itin as , en d o n d e d ich as p o lia lq u ile n im in a s son p re fe rib le m e n te p o lie tile n im in a s , p o lip ro p ile n im in a s o p o lib u tile n im in a s u o lig o sp e rm in a s y h o m ó lo g o s de las m ism as, y en d o n d e d icha fra cc ió n po lia m ina co m p re n d e entre 12 y 100000 á to m os de n itróg en o , m ás p re fe rib le m e n te e n tre 20 y 5000 á to m o s de n itrógeno .
(14 ) El uso seg ún c u a lq u ie ra de los p u n to s 12 o 13, en d on de la fra cc ió n c a rb o x ia lq u ilo es una fra cc ió n c a rb o x ia lq u ilo a lifá tico que tie n e e n tre 4 y 40 á to m os de ca rbo no , p re fe rib le m e n te e n tre 6 y 20 á to m o s de ca rb o n o y m ás p re fe rib le m e n te e n tre 8 y 16 á to m o s de ca rbo no .
(15 ) El uso se g ú n cu a lq u ie ra de los p u n to s 12 a 14, en d onde la fra cc ió n a lq u ilo es una fra cc ió n a lq u ilo a lifá tico que tie n e al m e no s 2 á to m o s de ca rbo no , p re fe rib le m e n te e n tre 6 y 40 á to m o s de ca rbo no .
(16 ) El uso según cua lqu ie ra de los pun tos 12 a 15, en d on de to d a s las fra cc io n e s c a rb o x ia lq u ilo de d ich a c a rb o x ia lq u ila lq u il-p o lia m in a son igu a les y to d a s las fra cc io n e s a lq u ilo son igua les , y la sum a de á to m o s de ca rb o n o en la fra cc ió n ca rb o x ia lq u ilo y la fra cc ió n de a lq u ilo e stá e n tre 10 y 30, p re fe rib le m e n te e n tre 15 y 25.
(17) El uso según cua lqu ie ra de los p un tos 12 a 16, en d on de d ich a ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a es una ca rb o x ia lq u ila lq u il-p o lia lq u ile n im in a linea l q ue co m p re n d e u n id a d e s e s tru c tu ra le s de la s ig u ie n te fó rm u la (6 )
-[C H 2-N R 6-(C H 2 )x ]-(6 )
d on de
x es un n ú m e ro e n te ro de 1 a 10, en d on de el v a lo r de x p ue de s e r igua l o d ife re n te e n tre d ife re n te s g ru p o s (C H 2 )x , R 6 es h id ró ge n o , C rH 2r+1 o C s-1H 2s-2C O O H
r es un n ú m e ro e n te ro de 2 a 40,
s es un n ú m e ro e n te ro de 4 a 40;
o
en d onde d ich a c a rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a es una ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d a que co m p re n d e u n id a d e s e s tru c tu ra le s de cad a una de las fó rm u la s (7), (8 ) y (9):
-[C H 2-N R 6-(C H 2 )x ]-(7 )
-[C H 2-N R 7-(C H 2 )x ]-(8 )
-(C H 2)y-N R 62 (9 )
d on de
R6, x, r y s son com o se d e fin ie ro n a n te r io rm e n te y
R7 co m p re n d e una o m ás u n id a d e s se le cc io n a d a s de las fó rm u la s (7), (8) y (9);
y es un n úm e ro e n te ro de 1 a 10, p re fe rib le m e n te de 2 a 10, en d on de el v a lo r de y puede s e r el m ism o o d ife re n te e n tre m ú ltip le s ca so s de g ru p o s (C H 2)y;
y en d on de el n úm e ro de á to m o s de n itró g e n o p o r m o lé cu la de d ich a ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia lq u ile n im in a linea l o ra m ifica d a e stá e n tre 12 y 100000.
(18 ) El uso según cua lqu ie ra de los pun tos 12 a 17, en d o n d e la re lación m o la r de fra cc io n e s ca rb o x ia lq u ilo a fra cc io n e s a lq u ilo en d ich a ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a e stá d en tro de l in te rva lo de 6 : 1 a 0.33: 1, p re fe rib le m e n te de 2 : 1 a 0.5: 1.
(19 ) El uso se g ú n cu a lq u ie ra de los p u n to s 12 a 18, en d onde al m e n o s 10% m o lar, p re fe rib le m e n te e n tre 25 y 80% m o lar, m á s p re fe rib le m e n te e n tre 30 y 60 % m o la r de g rup o s a m in o de d ich a p o lia m in a están su s titu id o s p o r d icho ca rb o x ia lq u ilo y d ich o s g ru p o s a lq u ilo (g ra d o de sus titu c ión ).
(20 ) El uso de según cu a lq u ie ra de los p un to s 12 a 19, en d on de los p o lia n io n e s son á c id o s n uc le icos .
(21 ) El d e riva d o de p o lia lq u ile n im in a seg ún el pun to 5, que es una ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a , en d o n d e d icha ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a tie n e un tip o de fra cc ió n de ca rb o x ia lq u ilo y un tip o de fra cc ió n de a lq u ilo , y la sum a de á to m o s de ca rb o n o en el tip o de fra cc ió n de c a rb o x ia lq u ilo y el tip o de fra cc ió n a lq u ilo e stá e n tre 10 y 30, p re fe rib le m e n te e n tre 15 y 25.
(22 ) El d e riva d o de p o lia lq u ile n im in a según los p u n to s 21, en d o n d e d icho d e riva d o de p o lia lq u ile n im in a es una p o lie tile n im in a ra m ifica d a , en d o n d e a d e m á s d ich a fra cc ió n de ca rb o x ila lq u ilo tie n e e n tre 8 y 16 á to m o s de c a rb o n o y en d o n d e d ich a fra cc ió n de a lq u ilo t ie n e de 8 a 10, de m o do p re fe rib le a p ro x im a d a m e n te 9, á to m o s de carbono . (23 ) C o m p le jo de un á c ido n uc le ico con una ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a com o se d e fine en cu a lq u ie ra de los pun tos a n te r io re s 12 a 22.
(24 ) Un k it q ue com p re nd e :
(i) una ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a com o se d e fin e en cu a lq u ie ra de los p un to s 12 a 19 o 21 a 22,
(ii) una so lu c ió n re g u la d o ra q ue tie n e un pH e n tre 4 y 8 y una fu e rza ión ica de 0.2 m o l/L o m enos, p re fe rib le m e n te de 0.1 m o l/L o m enos, y
(iii) o p c io n a lm e n te un m a nu a l con in s tru cc io n e s de uso.
(25 ) El k it de l p u n to 24, en d o n d e d ich a p o lia m in a se p ro p o rc io n a com o una so lu c ió n y en d o n d e el d is o lve n te es un a lco h o l in fe rio r se le cc io n a d o de l g rup o de e tano l, p ropano l, 1.2-d ih id ro x ip ro p a n o o isop ro pa no l, o m e zc la s que co m p re n d e n a gu a y e n tre 33 y 100% de ta l a lco h o l in fe rio r.
(26 ) El k it de l a rtícu lo 24, en d o n d e d ich a p o lia m in a se p ro p o rc io n a en fo rm a seca.
(27 ) El k it de los a rtícu lo s 24 o 26, en d o n d e d ich a p o lia m in a se p ro p o rc io n a en fo rm a lio filizada .
(28 ) El kit de cua lqu ie ra de los pun tos 24 a 27, en d o n d e d icha p o lia m ina se d ep os ita en una p laca de p oc illos m ú ltip les .
(29 ) Un kit co m o en el pun to 28, en d o n d e los p oc illos de d icha p laca de p oc illos m ú ltip le s con tien en d ife re n te s c a n tid a d e s de d icha po lia m ina , p re fe rib le m e n te g ra d ie n te s de d ich a s p o lia m in a s en p ozos ve c in o s o en d on de d e te rm in a d o s p oc illos e stán vac íos .
(30 ) Un p ro ce d im ie n to de tra n s fe c c ió n de c é lu la s con un p o lia n ió n , q ue c o m p re n d e m e zc la r d ich o p o lia n ió n con una ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a com o se d e fine en cu a lq u ie ra de los pun to s 12 a 22 en a gua o un re g u la d o r a cu o so y tra ta r d ich a s cé lu la s con la m e zc la o b te n id a en el paso ante rio r.
Las p o lia m in a s se m o d ifica ro n q u ím ica m e n te con s u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s que co m p re n d e n un g rup o ca rb o x ilo u n id o m e d ia n te un e n la za d o r h id ró fob o a una p o lia m ina y con su s titu ye n te s h id ró fob os . Las p o lia m in a s m o d ifica d a s u tiliz a d a s en la p rese n te inve nc ión se ind ican com o p o lia m in a s ca rb o x ila d a s , co n ve rtid a s en h id ró fu g a s o com o p o lia m in a s m o d ifica d a s o com o d e riva d o s de p o lia m in a a lo la rg o de esta d esc ripc ió n . En una fo rm a de re a liza c ió n , las p o lia m in a s se m o d ifica ron q u ím ica m e n te con su s titu ye n te s c a rb o x ia lq u ilo y s u s titu ye n te s a lqu ilo . E s ta s p o lia m in a s m o d ifica d a s se d e n o m in a n c a rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a s en el p re se n te d ocum e n to . S o rp re n d e n te m e n te , se d escub rió q ue una co m b in a c ió n de a m ba s m o d ifica c io n e s era s u p e r io r a c u a lq u ie ra de las m o d ifica c io n e s ind iv idua les, ya q ue se lo g ra b a una a lta re lac ió n se ñ a l/ru id o y una tra n s fe c c ió n m ás e fica z. L os n u e vo s re a c tivo s p re se n ta n e stos re su lta d o s en n u m e ro so s tip o s de c é lu la s y ta m b ié n son s u p e r io re s a los m a te ria le s d is p o n ib le s c o m e rc ia lm e n te y a los d e sc rito s en el e s ta d o de la té cn ica .
D e sc rip c ió n d e ta lla d a de la inve nc ión
El d e riva d o de p o lia m in a de esta inve nc ión tie n e su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s y su s titu ye n te s h id ró fo b o s en una po lia m ina , en d onde e s to s s u s titu ye n te s p ueden co m p re n d e r, in d e p e n d ie n te m e n te e n tre sí, uno, dos o tres h e te ro á to m o s se le cc io n a d o s e n tre o x íg en o , n itró g e n o o azu fre . La ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a de la inve nc ión es un d e riva d o de p o lia m in a que tie n e s u s titu ye n te s ca rb o x ia lq u ilo co m o d ich o s su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s y su s titu ye n te s a lq u ilo com o d ich o s s u s titu ye n te s h id ró fo b o s en una po liam ina .
El d e riva d o de p o lia m in a de la inve nc ión se puede o b te n e r m e d ia n te p ro ce d im ie n to s co n o c id o s en la té cn ica . Un p os ib le p ro ce d im ie n to es la d e riva tiza c ió n de una p o lia m in a con un á c ido ca rb o x ílico h a lo g e n a d o q ue fo rm a d icho su s titu ye n te c a rb o x ila d o tra s la sus titu c ió n n u c le o fílica del h a ló g e n o p o r un g rup o a m ino de la p o lia m ina , y con un c o m p u e s to h id ró fob o h a lo g e n a d o q ue fo rm a d icho su s titu ye n te h id ró fo b o tra s la su s titu c ió n n uc le ó fila de l h a ló ge no p o r un g rup o a m ino de la po lia m ina . La ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a de la inve nc ión se p ue de o b te n e r de fo rm a a ná log a . Un p os ib le p ro ce d im ie n to es la a lq u ila c ión de una p o lia m in a con un á c ido h a lo a lca n o ico y con un h a lo a lcan o m e d ia n te su s titu c ió n n u c leo fílica . Los su s titu ye n te s h a ló g e n o o halo pueden se r á to m os de c loro, b rom o o yodo, p re fe rib le m e n te de b rom o. M ás a d e la n te se dan m ás d e ta lle s sob re la p re p a ra c ió n del d e riva d o de p o lia m in a y la ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a .
P o lia m in a s
La po lia m ina que se puede u sa r com o m a te ria l de partida para p ro d u c ir el d e riva d o de p o lia m in a de la in ve n c ió n es un co m p u e s to p o lim é rico que tien e una p lu ra lida d de á to m os de n itróg en o que fo rm an una p lu ra lida d de g rup o s am ino. E s to s á to m o s de n itró g e n o p ueden ca rg a rse en so lu c io n e s a cu o sa s m e d ia n te p ro to na c ión . La m a yo ría de las a m ina s a lifá tica s tie n e n un pK s u p e rio r a 8 o 9, lo q ue s ign ifica q ue están ca rg a d a s su s ta n c ia l o co m p le ta m e n te en so lu c io n e s a cu o sa s q ue tie n e n un pH de a lre d e d o r de 7.4, que es el pH fis io ló g ico , o a va lo re s de pH m ás bajos.
Las fra cc io n e s a m ina que tie n e n un pK p o r d eb a jo de 6 , p o r e je m p lo , p ir id in as o a n ilin a s , son g rup o s a m in o m e no s p re fe rid o s de la p o lia m ina . Los va lo re s de pK de las d ive rsa s a m ina s están fá c ilm e n te d isp on ib le s , ya que se c itan con fre cu e n c ia en los a rtícu lo s re sp e c tivo s de la W ik ip e d ia en ing lé s q ue se e n cu e n tra n en e n .w ik ip e d ia .o rg o se p ueden ca lc u la r u sa nd o so ftw a re , p o r e jem p lo , base de d a tos A C D /p K a (A d van ce d C h e m is try D eve lo pm en t, O n ta rio , C anadá).
La p lu ra lid a d de á to m os de n itró g e n o de las p o lia m in a s p ueden s e r g rup o s a m ino p rim a rios , se cu n d a rio s , te rc ia rio s y /o cu a te rn a rio s , ta m b ié n pueden fo rm a r parte de s is te m a s de an illo . Los g rup o s a m ino p rim a rios , secu nd a rio s , te rc ia rio s y /o c u a te rn a rio s p ueden p re se n ta rse en la m ism a m o lé cu la de po lia m ina . Se p re fie ren los g rup o s a m ino p rim a rios , se cu n d a rio s y te rc ia rio s , ya q ue pueden a lq u ila rse co m o se d escrib ió a n te rio rm e n te . Las p o lia m ina s pueden c o m p re n d e r a d e m á s g rup o s e x tre m o s (g rupos te rm in a le s ) que ta m b ié n p ueden s e r g rupos am ino ; sin em ba rg o , d ich os g ru p o s e x tre m o s ta m b ié n p ueden se r in ic ia do re s o g ru p o s de te rm in a c ió n de la re acc ión de p o lim e riza c ió n que se usó para p re p a ra r la p o lia m ina .
En el caso de d e te rm in a d a s p o lia m in a s linea les , los g rup o s a m ino in te rn os p ueden s e r g rup o s a m ino se cu n d a rio s ; e je m p lo s de ta le s p o lia m in a s son p o lia lq u ile n im in a s . En o tra s p o lia m in a s line a le s , los g ru p o s a m in o no fo rm a n p arte de la ca d e n a p rin c ip a l d e l p o lím e ro s ino de c a d e n a s la te ra le s o fo rm a n la ca d e n a la te ra l p o r s í m ism a. En el ca so de p o lia m in a s ra m ifica d as , los g rup o s a m ino in te rn os q ue fo rm an p un tos de ra m ifica c ión son g e n e ra lm e n te g ru p o s am ino te rc ia rio s , m ie n tra s q ue los g rup o s a m ino in te rn os q ue no son pun to s de ra m ifica c ión son g e n e ra lm e n te g rup o s a m ino secu n d a rio s . Las ram as de ta le s p o lím e ro s a m e n u d o te rm in a n en g ru p o s a m in o p rim arios .
En lo su ce s ivo se d esc rib e n las p o lia m in a s que p ueden u sa rse para p ro d u c ir el d e riva d o de p o lia m ina , en p a rticu la r la ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a de la inve nc ión . D e sp u é s se d e sc rib e n el d e riva d o de p o lia m in a y la ca rb o x ia lq u il-a lq u ilp o lia m in a de la invenc ión .
En una p rim e ra fo rm a de re a liza c ió n g en era l, una p lu ra lida d de á to m o s de n itró g e n o de la p o lia m in a u tilizab le para p re p a ra r el d e riva d o de p o lia m ina y la ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a de la inve nc ión son parte de la e s tru c tu ra p o lim é rica de la po liam ina . La p o lia m in a p uede se r una po lia m ina linea l que tie n e la p lu ra lida d de á to m o s de n itrógeno d e n tro de la ca d e n a de l po lím ero . T a l p o lia m in a p ue de s e r una p o lia lq u ile n im in a q ue co m p re n d e v a r ia s u n id a d e s de la fó rm u la ( 1):
(C H 2-N R 1-(C H 2 )x ]-,
d onde x es un núm e ro e n te ro de 1 a 10 y R 1 es h id rógeno . En una fo rm a de re a liza c ió n , x p uede se r un n úm ero entero de 1 a 5, p re fe rib lem e n te 1 o 2 o 3. El v a lo r de x p uede se r igua l o d ife re n te entre d ife re n te s g rupos (C H 2)X en la m ism a m o lé cu la de p o lia m ina . P o r e je m p lo , x p uede o sc ila r en tre d os o tre s v a lo re s d ife re n te s de x a lo largo de la ca d en a de p o lím e ro de la po lia m ina , p o r e je m p lo , e n tre va lo re s de x de 2 y 3, e n tre va lo re s de 2 y 4, o e n tre v a lo re s de 2 y 5. En las p o lia m in a s de fó rm u la (1), e se n c ia lm e n te to d o s los g ru p o s a m ino d e n tro de la ca d e n a de l p o lím e ro son g rup o s a m ino secu nd a rio s .
Si m es el n úm ero de u n id a d e s re pe titiva s de fó rm u la (1 ) en la p o lia lq u ile n im ina , m p uede s e r un n úm e ro e n te ro de 12 a 100000, p re fe rib le m e n te de 12 a 20000 , m ás p re fe rib le m e n te de 20 a 10000, de l m o do m ás p re fe rib le de 20 a 5000.
E je m p lo s de p o lia m in a s que se co n v ie rte n en la fra cc ió n de p o lia m ina de d icho d e riva d o de p o lia m in a m e d ia n te a lq u ila c ió n , en p a rtic u la r m e d ia n te su s titu c ió n nuc leo fílica , son p o lia lq u ile n im in a s , p re fe rib le m e n te p o lie tile n im in a s , p o lip ro p ile n im in a s , p o lib u tile n im in a s u o lig o sp e rm in a s u h o m ó lo g o s de las m ism as. La fra cc ió n de p o lia m in a puede co m p re n d e r de 12 a 20000 á to m os de n itrógeno, m ás p re fe rib lem e n te de 20 a 10000 á to m os de n itrógeno p or m o lécu la de po lia m ina , o com o se d e fine a n te r io rm e n te para m.
A lte rn a tiva m e n te , la p o lia m in a q ue p uede co n ve rtirse en la fra cc ió n de p o lia m in a de d ich o d e riva d o de po lia m ina m e d ia n te a lq u ila c ión , en p a rtic u la r m e d ia n te sus titu c ió n nuc leo fílica , puede se r una po lia m ina ra m ifica d a , p re fe rib le m e n te una p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d a . T a l p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d a se p ue de d e fin ir p o r te n e r u n id ad es e s tru c tu ra le s de cad a una de las s ig u ie n te s fó rm u la s (2 ) a (4):
-[C H 2-N R 1-(C H 2 )x ]- (2 )
-[C H 2-N R 2-(C H 2 )x ]- (3 )
-(C H 2)y-N R 32 (4 )
d on de
R 1 y x son co m o se d e fin ie ro n a n te rio rm e n te ;
R2 co m p re n d e u n id a d e s de fó rm u la (2), (3 ) y /o de fó rm u la (4);
R3 re p re se n ta h id ró ge n o ; y
y es un n úm ero e n te ro de 1 a 10, en d on de el v a lo r de y p uede se r el m ism o o d ife re n te e n tre d ife re n te s g rup o s (C H 2)y.
En la p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d a , una ca d e n a p rinc ip a l de la m ism a p uede e s ta r fo rm a d a p o r las u n id a d e s d iva le n te s de fó rm u la (2 ) q ue co m p re n d e n g ru p o s a m ino secu nd a rio s . A d e m á s, la p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d a , en p a rticu la r una ca d e n a p rinc ip a l de la m ism a, co m p re n d e al m enos 1 u n idad de fó rm u la (3 ) que co m p re n d e el n itró g e n o te rc ia rio un ido a R2 co m o un pun to de ra m ifica c ión . Las ca d e n a s p o lim é ricas ra m ifica d as co m p re n d e n al m e no s una o m ás un idades, g e n e ra lm e n te m ú ltip les , de fó rm u la (2), y pueden c o m p re n d e r a d e m á s una o m ás u n id a d e s de fó rm u la (3), lo que con d u ce a una ra m ifica c ión ad ic iona l. P o r tan to , la p o lia lq u ile n im ina ra m ifica d a puede se r un d e n d rím e ro o un po lím ero d e n d ro n iza d o . En m u ch os casos, e stas p o lia lq u ile n im in a s ra m ifica d a s co m p re n d e n los e le m e n to s e s tru c tu ra le s (2), (3 ) y (4 ) en una se cu e n c ia a le a to ria que co n d u ce a e s tru c tu ra s irre g u la re s o p o lia m in a s a le a to ria s . El g rup o m o n o va le n te de fó rm u la (4 ) d e fine los g rup o s te rm in a le s de la p o lia lq u ile n im in a q ue p ue de n e s ta r p re se n te s en una ca d e n a p rinc ipa l, a s í com o en c a d e n a s ra m ifica d a s . M ú ltip le s e s tru c tu ra s de cada una de las fó rm u la s (2), (3 ) y (4 ) p re se n te s en la p o lia lq u ile n im in a p ue de n s e r igu a les o d ife re n te s en té rm in o s de x, R2 y R3.
El g rad o de ra m ifica c ión en la p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d a p uede s e r de l 1 al 40% , p re fe rib le m e n te de l 10 al 40% , m ás p re fe rib le m e n te del 15 al 30% . El e xp e rto en la m a te ria sabe cóm o c u a n tif ica r la ra m ifica c ió n de un p o lím ero , p o r e je m p lo , m e d ia n te titu la c io n e s de pH y cu a n tifica c ió n de los d ife re n te s co m p a rtim e n to s de la cu rva de t itu la c ió n o m e d ia n te m e d ic io n e s de 1H -N M R .
U na m e d id a del g rad o de ra m ifica c ión en una p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d a es la re lac ió n de g rup o s a m ino p rim arios , s e cu n d a rio s y te rc ia rio s . M ie n tra s que una p o lia lq u ile n im in a linea l tie n e e xc lu s iva m e n te g rup o s a m ino se cu n d a rio s com o g rup o s a m ino in te rnos, las p o lia lq u ile n im in a s ra m ifica d a s tie n e n g rup o s a m ino te rc ia rio s ta le s com o los de fó rm u la (3), cuya can tid a d a u m e n ta con el g rad o c re c ie n te de ra m ifica c ión . La re lac ió n m o la r de g ru p o s am ino p rim a rio s en la p o lia m ina ra m ifica d a p uede se r de l 1 al 40% , p re fe rib le m e n te del 15 al 30% . La re lac ió n m o la r de g rup o s a m ino se cu n d a rio s p uede se r de l 15 al 85% , p re fe rib le m e n te de l 30 al 70% . La re lac ió n m o la r de g rup o s am ino te rc ia rio s p ue de s e r de l 1 al 40% , p re fe rib le m e n te de l 15 al 30% .
E je m p lo s de p o lia m in a s ra m ifica d a s q ue p ue de n co n v e rtirse en la fra cc ió n p o lia m in a de d ich o d e riva d o de p o lia m in a o de d icha ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a son p o lia lq u ile n im in a s ra m ifica d as , p re fe rib le m e n te p o lie tile n im in a s ra m ifica d as , p o lip ro p ile n im in a s ra m ifica d a s o p o lib u tile n im in a s ra m ifica d as . Las p o lia m in a s ra m ifica d as , ta le s com o las p o lia lq u ile n im in a s ra m ifica d a s , p ueden te n e r e n tre 12 y 100000 á to m o s de n itróg en o , m ás p re fe rib le m e n te entre 20 y 20000 á to m o s de n itró g e n o p o r m o lé cu la de po lia m ina . En o tra s fo rm a s de re a liza c ió n , el n ú m e ro de á to m o s de n itró g e n o en ta le s p o lím e ro s e stá e n tre 20 y 5000 á to m o s de n itró g e n o p or m o lé cu la de p o lia m ina .
En la s ig u ie n te ta b la 1 se lis tan e je m p lo s de p o lia m in a s que tie n e n una e s tru c tu ra p rinc ip a l ca rg a d a en m e d io a cu oso a pH neu tro p ara su uso para p re p a ra r el d e riva d o de p o lia m in a o la ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a de la invenc ión :
T a b la 1:
Figure imgf000008_0001
En la T a b la 1, M r s ig n ifica p eso m o le cu la r re la tivo en té rm in o s de l peso m o le c u la r p ro m e d io en n ú m e ro (M n).
O tro e je m p lo de p o lia m in a ra m ifica d a es la p o lie tile n im in a de la s ig u ie n te e s tru c tu ra :
Figure imgf000009_0001
n es un n úm e ro e n te ro ta l q ue el peso m o le c u la r p rom ed io en n úm e ro Mn es a p ro x im a d a m e n te 10 000 y tie n e un N ú m e ro C A S 9002 -98 -6. E s tá d isp o n ib le co m e rc ia lm e n te en S ig m a -A ld rich , c a tá lo g o no. 408727. En los e je m p lo s se e n u m e ra n o tras p o lia m in a s ra m ifica d as .
Las p o lia m in a s ta m b ié n p ueden fo rm a r co n ju n to s m u ltim é rico s de o lig ó m e ro s de p o lia m ina . Los e je m p lo s de los co n ju n to s m u ltim é rico s se d e sc rib e n en G o sse lin e t al. (2001 ) B ioco n j C hem , 12 (6 ): 989 -994 ; Lynn e t al. (2001 ) J A m C h e m S oc 123 (33): 8155 -8156 ; so lic itud de pa ten te W 02007 /020060 de G o p fr ich et al. o so lic itud de p a ten te W O 2007 /120479 de T a n a ka e t al..
En una se g u n d a fo rm a de re a liza c ió n g en era l, los á to m os de n itró g e n o ca rg a d o s de la p o lia m in a u tilizab le para p re p a ra r el d e riv a d o de p o lia m in a o la c a rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a de la in ve n c ió n no fo rm a n p arte de la e s tru c tu ra po lim é rica , s ino que están p rese n te s en las ca d e n a s la te ra les de la p o lia m ina . En a lg u n a s fo rm a s de re a liza c ió n , la p o lia m in a p ue de s e r d e riva d o s de p o lie tile no , ta le s com o p o lia lila m in a , p o liv in ila m in a , p o lia c rila to c a tio n iza d o o un p o lié te r de v in ilo de e s tru c tu ra (5),
(5 ) -[C H 2-C H R 4]p-,
d on de
R 4 se se le cc io n a de -N H 2, -C H 2-N H 2, -O -C H 2-C H 2-N H 2 o -C (= O )O -R 5 , en d onde
R 5 se s e le cc io n a de — C H 2-C H 2-N H 2, — C H 2-C H 2-N H -C H 3, -C H 2-C H 2-N -(C H 3 )2 y -C H 2-C H 2-N -(C H 2-C H 3)2.
La va r ia b le p es un núm e ro e n te ro que ind ica el ta m a ñ o del po lím ero y puede v a r ia r e n tre 20 y a p ro x im a d a m e n te 50000. En fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid as , p e stá e n tre 20 y 5000 , en fo rm a s de re a liza c ió n m ás p re fe rid a s p e stá e n tre 100 y 2000.
En o tra s fo rm a s de re a liza c ió n , las p o lia m in a s son p o lip é p tid o s ta le s co m o po lilis ina s , p o lio rn it in a s y p o lia rg in in a s . El n ú m e ro de re s idu os de a m in o á c id o s en e stos p o lip é p tid o s p uede s e r el d e fin id o a n te r io rm e n te para p. En o tras fo rm a s de re a liza c ió n m ás, las p o lia m in a s p ueden te n e r una e s tru c tu ra de a zú c a r ta l com o q u itosa no .
A l igua l que con la p rim e ra fo rm a de re a liza c ió n g en era l, los p o lím e ro s de la se g u n d a fo rm a de re a liza c ió n g en era l ta m b ié n p ueden s e r de tipo lineal, ra m ifica d o o d en d rím e ro , ta m b ié n p ueden se r con ju n to s m u ltim é rico s de o lig ó m e ro s de p o lia m ina .
Los e je m p lo s de p o lia m in a s q ue t ie n e n ca d e n a s la te ra le s c a rg a d a s p ara la s e g u n d a fo rm a de re a liza c ió n g e n e ra l se lis tan en la T a b la 2 a con tin u a c ió n :
T a b la 2
Figure imgf000009_0002
P ara lo g ra r un a lto re n d im ie n to en la tra n s fe c c ió n , una p o lia m in a co m o las d e s c rita s a n te r io rm e n te se m o d ifica ta n to con s u s titu ye n te s c a rb o x ila d o s com o con s u s titu ye n te s h id ró fob os , p o r e je m p lo , con s u s titu ye n te s c a rb o x ia lq u ilo y a lq u ilo , p a ra o b te n e r el d e riva d o de p o lia m in a de la inve nc ión . Los s u s titu y e n te s ca rb o x ila d o s co m p re n d e n al m e no s 6 á to m o s de ca rbo no .
S u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s
Los s u s titu y e n te s ca rb o x ila d o s co m p re n d e n un g rup o c a rb o x ilo e n la za d o m e d ia n te un e n la za d o r h id ró fob o a g ru p o s a m ino de la p o lia m ina , d icho e n la za d o r h id ró fo b o p uede te n e r un co e fic ie n te de partic ión logP de e n tre 3 y 20, p re fe rib le m e n te de 3 a 10, y m á s p re fe rib le m e n te de 4 a 9, d e te rm in a d o p ara un co m p u e s to q ue se p ue de o b te n e r a p a rtir de d icho e n la za d o r re em p la za n d o e n la ce s de d icho e n la za d o r al g rup o ca rbo x ilo y el g rupo a m ino de la po liam ina p o r e n la ce s a á to m os de h id ró ge n o . Los p ro ce d im ie n to s para d e te rm in a r el logP son co n o c id o s p o r e l e xp e rto en la m a te ria y co m p re n d e n la d e te rm in a c ió n e xp e rim e n ta l de la d is trib u c ió n de l co m p u e s to e n tre el a gu a y el 1-o c ta n o l, u o b te n e r d ich os va lo re s de fu e n te s de re fe ren c ia com o W ik ip e d ia , la ve rs ió n en ing lés, o c a lc u la r el logP u tilizan do so ftw a re com o A C D /L a b s 7.0 (A d va n ce d C h e m is try D eve lo p m e n t, O n ta rio , C an ad á).
Un su s titu ye n te c a rb o x ila d o p uede c o m p re n d e r uno o d os g rup o s ca rbo xilo , p re fe rib le m e n te un g rupo ca rbo x ilo . C ada s u s titu ye n te c a rb o x ila d o co m p re n d e de 6 a 40 á to m o s de ca rbo no , p re fe rib le m e n te de 6 a 20 á to m o s de ca rb o n o y m ás p re fe rib le m e n te de 8 a 16 á to m o s de ca rbo no . Los e n la za d o re s h id ró fo b o s de d ich o s su s titu y e n te s ca rb o x ila d o s p ueden c o m p re n d e r de 1 a 3, p re fe rib le m e n te 1 o 2, h e te ro á to m o s se le cc io n a d o s e n tre O, N y S. P re fe rib le m e n te , los h e te ro á to m o s se se le cc io n a n e n tre O y S. En una fo rm a de re a liza c ió n , se se le cc io n a n 1 o 2 h e te ro á to m o s de O, N y S, p re fe rib le m e n te O y S, pueden e s ta r co n te n id o s en el e n la za d o r h id ró fob o . P o r tan to , los su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s p ue de n se r g ru p o s ca rb o x ih id ro ca rb ilo o p ueden s e r g rup o s ca rb o x ih e te ro h id ro ca rb ilo que co m p re n d e n de 1 a 3 h e te ro á to m o s se le cc io n a d o s e n tre O, N y S, p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o s e n tre O y S. E ntre la p lu ra lida d de su s titu y e n te s c a rb o x ila d o s de una m o lé cu la de d ich o d e riva d o de po lia m ina , p uede h a b e r e xc lu s iva m e n te g rupos c a rb o x ih id ro ca rb ilo , e xc lu s iva m e n te g rup o s c a rb o x ih e te ro h id ro ca rb ilo , o p uede h a b e r g ru p o s ca rb o x ih id ro ca rb ilo y g ru p o s ca rb o x ih e te ro h id ro ca rb ilo . En una fo rm a de re a liza c ió n , la p lu ra lid a d de s u s titu y e n te s c a rb o x ila d o s son to d o s g ru p o s ca rb o x ih id ro ca rb ilo . En o tra fo rm a de re a liza c ió n , la p lu ra lida d de s u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s son to d o s g rup o s ca rb o x ih e te ro h id ro ca rb ilo .
C u a n d o los s u s titu ye n te s c a rb o x ila d o s son g rup o s ca rb o x ih id ro ca rb ilo , las fra cc io n e s h id ro ca rb ilo de d ich os g rup o s ca rb o x ih id ro c a rb ilo pueden se r fra cc io n e s h id ro ca rb ilo a lifá tico sa tu rad o , fra cc io n e s h id ro ca rb ilo a lifá tico insa tu ra d o , fra cc io n e s h id ro ca rb ilo a lic íc lico , fra cc io n e s h id ro ca rb ilo a ro m á tico o fra cc io n e s que com p re nd en dos o m ás fra cc io n e s la lis ta m e n c io n a d a a n te rio rm e n te .
Los e je m p lo s de los g ru p o s ca rb o x ih id ro ca rb ilo son g rup o s ca rb o x ia lq u ilo , g ru p o s c a rb o x ia lq u e n ilo , g rupos ca rb o x ia lq u in ilo , g ru p o s ca rb o x ic ic lo a lq u ilo , g ru p o s c a rb o x ic ic lo a lq u e n ilo , g ru p o s c a rb o x ia lq u ilc ic lo a lq u ilo , g rupos ca rb o x ic ic lo a lq u ila lq u ilo , g ru p o s ca rb o x ia lq u ilc ic lo a lq u ila lq u ilo , g ru p o s ca rb o x ia rilo , g rup o de ca rb o x ia lq u ila r ilo , g rupo de c a rb o x ia rila lq u ilo , g rup o de ca rb o x ia lq u ila r ila lq u ilo . T a m b ié n se ind ican a c o n tin u a c ió n e je m p lo s y d e fin ic io n e s de los g ru p o s h id ro ca rb ilo a los que está un ido el g rup o ca rb o x i en el con te x to de los su s titu ye n te s h id ró fob os . P ueden co m b in a rse m ú ltip le s g ru p o s h id ro c a rb ilo d ife re n te s . S in e m b a rg o , se a p lica n los v a lo re s de logP y /o las d e fin ic io n e s de l n ú m e ro de á to m o s de ca rb o n o d a d a s a n te rio rm e n te .
Es p o s ib le re e m p la za r 1, 2 o 3, p re fe rib le m e n te 1 o 2, de los á to m o s de ca rb o n o de las fra cc io n e s h id ro ca rb ilo de los su s titu y e n te s c a rb o x ila d o s p o r o x íg en o , n itró g e n o o a zu fre , fo rm a n d o de ese m o do fra cc io n e s ca rb o x ih e te ro h id ro ca rb ilo . S e e n tie n d e que c u a lq u ie r su s titu c ió n fo rm a l de e ste tip o p o r un h e te ro á to m o inc lu irá el a ju s te de los á to m o s de h id ró g e n o u n id os para a ju s ta rse a la v a le n c ia de l h e te ro á to m o in te rca m b ia d o . En fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid as , ta le s fra cc io n e s ca rb o x ih e te ro h id ro ca rb ilo co m p re n d e n uno o m ás g rup o s fu n c io n a le s se le cc io n a d o s e n tre -O -, -S -, -N (H )C (O ) -, -C (O )O -, -O C (O )N (H )-, -C (O ) -, -C (O )-N (H )-, -N (H )-C (O )-O -, -O -C (O )- o -S -5 - en el h id ró fo b o e n la za do r.
En un a sp e c to de la inve nc ión , los e n la za d o re s h id ró fo b o s son o co m p re n d e n g ru p o s a lq u ile n o ta le s com o g rupos a lq u ile n o line a le s o ra m ifica d os , o los e n la za d o re s son o co m p re n d e n g rup o s c ic lo a lq u ile n o . Los g ru p o s a lq u ile n o p ueden s e r g ru p o s n -a lq u ile n o o isoa lqu ilen o . E je m p lo s de g rup o s a lq u ile n o son g rup o s p rop ilen o , bu tileno , pen tileno , h ex ilen o , h ep tileno , oc tilen o , n on ilen o , d ec ilen o , und ec ilen o , d o d e c ile n o , te tra d e c ile n o o h exa d e c ile n o . E jem p lo s de g ru p o s c ic lo a lq u ile n o son g ru p o s c ic lo p e n tile n o , c ic lo h e x ile n o y c ic lo h e p tile n o . E je m p lo s de g ru p o s a lq u ilc ic lo a lq u ilo son m e tilc ic lo p e n tile n o , e tilc ic lo p e n tile n o , p ro p ilc ic lo p e n tile n o , b u tilc ic lo p e n tile n o , p e n tilc ic lo p e n tile n o , h e x ilc ilo p e n tile n o , m e tilc ic lo h e x ile n o , e tilc ic lo h e x ile n o , p ro p ilc ic lo h e x ile n o , b u tilc ic lo h e x ile n o , p e n tilc ic lo h e x ile n o y h e x ilc ic lo h e x ile n o . U no o m ás de e s to s p ue de n co m b in a rse en un e n la za d o r h id ró fobo .
Los s u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s pueden s e r o pueden c o m p re n d e r g ru p o s c a rb o x ia lq u ilo o c a rb o x ic ic lo a lq u ilo y co m p re n d e n de 6 a 20. T a le s su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s pueden s e le cc io n a rse del g rup o que co n s is te en g rup o s ca rb o x i-n -a lq u ilo , g ru p o s c a rb o x ia lq u ilo ra m ifica d o o g ru p o s c a rb o x ia lq u ilo c íc lico o isó m e ro s de co n s titu c ió n y co n fo rm a c ió n . En una fo rm a de re a liza c ió n p re fe rida , los g rup o s c a rb o x ila lq u ilo son ra d ica les de á c id os se le cc io n a d o s e n tre á c ido h exano ico , á c ido h ep ta no ico , á c ido oc ta no ico , á c id o non an o ico , á c ido d ecan o ico , ácido u n d ecan o ico , á c id o d o d e ca n o ico , á c id o te tra d e ca n o ico , á c id o h e xa d e ca n o ico , á c id o 2 -c ic lo h e x ila cé tico , á c id o 4 -c ic lo h e x ilb u tír ico , á c id o 6-c ic lo h e x ilh e xa n o ico , á c id o 2 -(2 ', 3' o 4 ' e tilc ic lo h e x il)-a c é tic o o á c id o 4-(2 ', 3 'o 4 ' e tilc ic lo h e x il)-b u tír ico o á c ido 6 - (2', 3' o 4 ' e tilc ic lo h e x il)-h e xa n o ico .
En o tro a sp e c to de la inve nc ión , los e n la za d o re s h id ró fo b o s son o co m p re n d e n g rup o s a rilen o y tie n e n de 6 a 20 á to m o s de ca rbo no . Los g ru p o s a rilo q ue fo rm a n d ich os g rup o s a rilen o inc lu ye n g ru p o s h id ro ca rb ilo a ro m á tico (g ru p o s arilo de so lo c a rb o n o ) y g ru p o s h e te ro h id ro ca rb ilo a ro m á tico (g ru p o s h e te roa rilo ). E je m p lo s de los p rim e ro s son fen ilo , na ftilo , a n tra ce n ilo y fen an trilo . Los g ru p o s h e te roa rilo que con tie n e n n itróg en o p re fe rib le m e n te te n d rá n un v a lo r de pK de <5 para e v ita r ca rg a s ca tió n ica s a d ic io n a le s a pH neu tro . E je m p lo s de ta le s g ru p o s h e te ro a rilo que con tie n e n n itró g e n o son g ru p o s indo lilo , g ru p o s p iraz in ilo , g ru p o s p irida z in ilo , g ru p o s p ir im id in ilo , g ru p o s c ino lin ilo , g rup o s fta la z in ilo y g ru p o s purin ilo . Los g ru p o s h e te ro h id ro ca rb ilo q ue co n tie n e n o x íg e n o q ue fo rm a n g ru p o s h id ro x ilo tien en p re fe rib le m e n te un pK > 12 para e v ita r ca rg a s n eg a tiva s a pH neutro.
E je m p lo s de g ru p o s a lq u ila rilo son g rup o s m e tilfe n ilo (to lilo ), e tilfe n ilo , 4 -iso p ro p ilfe n ilo y x ililo . E je m p lo s de g rup o s a rila lq u ilo (a ra lq u ilo ) son g ru p o s bencilo , fe n ile tilo y tr itilo . E je m p lo s de g ru p o s a lq u ila rila lq u ilo son g ru p o s m e tilb e n c ilo y 4 -iso p ro p ilb e n c ilo .
Las fra cc io n e s ca rb o x ia rila lq u ilo pueden ser, p o r e jem p lo , ra d ica les d e riva d o s de á c ido o, m o p -m e til b en zo ico , o ácido o-, m - o p -etil b en zo ico . Las fra cc io n e s ca rb o x ia lq u ila r ila lq u ilo p ueden ser, p o r e je m p lo , á c ido o-, m - o p -m e til fe n ila cé tico . Las fra cc io n e s ca rb o x ia lq u e n ila r ila lq u ilo p ue de n s e r o de, p o r e je m p lo , á c id o o-, m - o p -m e tilc iná m ico .
M ú ltip le s su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s , ta le s com o los que son o co m p re n d e n g ru p o s c a rb o x ia lq u ilo p rese n te s en el d e riva d o de p o lia m in a de la inve nc ión , p ue de n s e r ig u a le s o d ife re n te s . P o r s im p lic id a d , p ueden se r igua les . El g rup o c a rb o x ilo de l su s titu ye n te c a rb o x ila d o puede e s ta r un ido a c u a lq u ie r á to m o de ca rb o n o del e n la za d o r h id ró fobo . P re fe r ib le m e n te , el g ru p o c a rb o x ilo e s tá u n id o a un á to m o de ca rb o n o de la s ig u ie n te m a ne ra : si z es el n úm e ro de á to m o s de ca rb o n o en la ca d e n a de c a rb o n o m ás la rga en el su s titu y e n te c a rb o x ila d o (co m o el g rup o ca rb o x ia lq u ilo ) al á to m o de ca rb o n o q ue e stá u n ido a un á to m o de n itró g e n o de po lia m ina , el g rup o ca rb o x ilo e stá u n ido a un á to m o de ca rb o n o en u na p o s ic ió n q ue e s tá a m ás de z /2 p o s ic io n e s de á to m o a le ja d a s d e l n itró g e n o de la p o lia m ina , si el á to m o de c a rb o n o u n id o al n itró g e n o de la p o lia m in a se cu e n ta co m o p o s ic ió n 1. S i el v a lo r de z /2 no es un n ú m e ro e n te ro , la d e fin ic ió n a n te r io r c o n d u ce a la p os ic ió n d e fin id a p o r el s ig u ie n te e n te ro > z /2. En una fo rm a de rea lizac ión , el g rup o ca rb o x ilo está un ido al á to m o de ca rb o n o de l e n la za d o r h id ró fo b o que está m ás a le ja d o (en té rm in o s del n ú m e ro de á to m o s de c a rb o n o ) de l á to m o de n itró g e n o de p o lia m in a al q ue está co n e c ta d o el e n la za d o r h id ró fob o (ca d e n a de a lq u ile n o en el ca so de g ru p o s ca rb o x ia lq u ilo ). El g rup o ca rb o x ilo p ue de e s ta r u n ido al á to m o de ca rb o n o q ue e stá m ás a le ja d o de l n itró g e n o de la p o lia m in a d en tro del su s titu ye n te c a rb o x ila d o (o g rup o ca rb o x ia lq u ilo ), com o al á to m o de ca rb o n o te rm in a l (p o s ic ió n o m e g a ) de los su s titu y e n te s c a rb o x ila d o s (o g ru p o ca rb o x ia lq u ilo ) en ca so de un su s titu ye n te c a rb o x ila d o lineal.
Los p os ib le s g ru p o s d ad os a n te r io rm e n te para los e n la za d o re s h id ró fo b o s pueden sus titu irse s ie m p re q ue se cum p lan los va lo re s de logP d ad os a n te rio rm e n te . A lte rn a tiva m e n te , los p os ib le s g ru p o s d ad os a n te r io rm e n te para los e n la za d o re s h id ró fo b o s se pueden su s titu ir s iem p re que se cum p lan los núm e ro s de á to m o s de ca rbo no y los núm eros de p o s ib le s h e te ro á to m o s com o se d e fin ió a n te rio rm e n te .
S u s titu ye n te s h id ró fo b o s
Los su s titu ye n te s h id ró fo b o s están u n id os a g ru p o s a m ino de la p o lia m ina y pueden te n e r un logP de 1.5 a 20, p re fe rib le m e n te de 2 a 15, m ás p re fe rib le m e n te de 2.5 a 10, d e te rm in a d o para un co m p u e s to o b te n ib le a p a rtir de d ich o s u s titu ye n te h id ró fo b o re e m p la za n d o su e n la ce a un g rupo a m in o de la p o lia m in a p o r un e n la ce a un á to m o de h id ró ge n o . Los p ro ce d im ie n to s para d e te rm in a r el logP son co n o c id o s p o r los e xp e rto s en la té c n ica y co m p re n d e n la d e te rm in a c ió n e xp e rim e n ta l de la d is trib u c ió n de l co m p u e s to e n tre el a gua y el 1-o c ta n o l, o la o b ten c ión de d ich os v a lo re s de fu e n te s de re fe re n c ia co m o W ik ip e d ia , la ve rs ió n en ing lés, o e l c á lcu lo de l logP u tiliza n d o so ftw a re co m o A C D /L a b s 7.0 (A d va n ce d C h e m is try D eve lo p m e n t, O n ta rio , C anadá).
Los su s titu ye n te s h id ró fo b o s co m p re n d e n de 2 a 40 á to m o s de ca rb o n o , en a lg u n o s a sp e c to s de 3 a 40 á to m o s de ca rbo no , en a sp e c to s p re fe rid os de 6 a 40 á to m o s de ca rb o n o y en a sp e c to s m ás p re fe rid os de 6 a 20 á to m os de ca rb o n o . Los s u s titu ye n te s h id ró fo b o s p ueden c o m p re n d e r de 1 a 3, p re fe rib le m e n te 1 o 2, h e te ro á to m o s se le cc io n a d o s e n tre O, N y S, s ie m p re q ue d ich os s u s titu ye n te s h id ró fo b o s co m p re n d a n 6 o m ás á to m o s de ca rbo no . P re fe r ib le m e n te , los h e te ro á to m o s se se le cc io n a n e n tre O y S. P o r tan to , los s u s titu ye n te s h id ró fo b o s p ueden se r g ru p o s h id ro ca rb ilo o g ru p o s h e te ro h id ro ca rb ilo , c o m p re n d ie n d o e s to s ú ltim o s de 1 a 3 h e te ro á to m o s com o se m e n c io n ó a n te rio rm e n te . E ntre la p lu ra lida d de su s titu ye n te s h id ró fo b o s de una m o lé cu la de d icho d e riva d o de p o lia m ina , p ue de h a b e r e xc lu s iva m e n te g ru p o s h id ro ca rb ilo , e xc lu s iva m e n te g ru p o s h e te roh id roca rb ilo , o p uede h ab e r g ru p o s h id ro ca rb ilo y g rup o s h e te ro h id ro ca rb ilo . En una fo rm a de rea lizac ión , la p lu ra lida d de su s titu ye n te s h id ró fo b o s son to d o s g ru p o s h id ro carb ilo . En o tra fo rm a de rea lizac ión , la p lu ra lida d de su s titu ye n te s h id ró fo b o s son to d o s g rup o s h e te ro h id ro ca rb ilo .
C u a n d o los su s titu ye n te s h id ró fo b o s son g ru p o s h id ro ca rb ilo , se pueden s e le cc io n a r e n tre g ru p o s a lqu ilo , g rup o s a lq u en ilo , g ru p o s a lq u in ilo , g rup o s c ic lo a lq u ilo , g rup o s c ic lo a lq u e n ilo , g ru p o s c ic lo a lq u ila lq u ilo , g rup o s a lq u ilc ic lo a lq u ilo , g ru p o s a lq u ilc ic lo a lq u ila lq u ilo , g ru p o s a rilo , g ru p o s a lq u ila rilo , g ru p o s a rila lq u ilo y g rup o s a lq u ila rila lq u ilo y g ru p o s que co m p re n d e n dos o m ás g rup o s de la lis ta m e n c io n a d a a n te rio rm e n te . S ie m p re q ue el su s titu ye n te h id ró fo b o co m p re n d a 6 o m ás á to m os de ca rbo no , es p os ib le re e m p la za r 1, 2 o 3 de los á to m o s de c a rb o n o de d ich os g ru p o s h id ro ca rb ilo p o r o xíg en o , n itró g e n o o azu fre , p re fe rib le m e n te o x íg e n o o azu fre , fo rm a n d o a s í su s titu y e n te s h e te ro h id ro ca rb ilo . D ich os su s titu y e n te s h e te ro h id ro ca rb ilo p ueden c o m p re n d e r g ru p o s fu n c io n a le s se le cc io n a d o s e n tre -O -, -S -, -N (H )C (O )-, -C (O )O -, -O C (O )N (H )-, -C (O )-, -C (O )-N (H )-, -N (H )-C (O )-O -, -O -C (O )-, o -S -S-.
En un a sp ec to de la invenc ión , los sus titu ye n te s h id ró fo b o s son o com p re nd en g ru p o s a lq u ilo ta le s com o g ru p o s a lq u ilo lin e a le s o ra m ifica d os , o g ru p o s c ic lo a lq u ilo . Los g ru p o s a lq u ilo p ue de n s e r g ru p o s n -a lq u ilo o isoa lqu ilo . E je m p lo s de g ru p o s a lq u ilo son g rup o s p rop ilo , butilo , pen tilo , hex ilo , hep tilo , octilo , non ilo , dec ilo , u nd ec ilo , d o d e c ilo , te tra d e c ilo o h exad ec ilo . E je m p lo s de g rup o s c ic lo a lq u ilo son g ru p o s c ic lo p e n tilo , c ic lo h e x ilo y c ic lo he p tilo .
E je m p lo s de g rup o s a lq u e n ilo son g rup o s p rop e n ilo , bu ten ilo , pen ten ilo , hexen ilo , h ep te n ilo , octen ilo , nonen ilo , d ece n ilo , u nd ecen ilo , d od ecen ilo , te tra d e c e n ilo y h e xad ece n ilo . E je m p lo s de g ru p o s a lq u in ilo son g rup o s p rop in ilo , bu tin ilo , p en tin ilo , h ex in ilo , h ep tin ilo , o c tin ilo , non in ilo , d ec in ilo , und ec in ilo , d od ec in ilo , te tra d e c in ilo y h exad ec in ilo .
E je m p lo s de g rup o s c ic lo a lq u e n ilo son g ru p o s c ic lo p e n te n ilo , c ic lo h e xe n ilo y c ic lo h e p te n ilo .
Los g ru p o s c ic lo a lq u ila lq u ilo son g ru p o s en los que un g rup o c ic lo a lq u ilo está un ido a un g rupo a lq u ile n o co rre sp o n d ie n te a un g rupo a lq u ilo . A lg u n o s e je m p lo s son c ic lo p e n tilm e tilo , c ic lo p e n tile tilo , c ic lo h e x ilm e tilo , c ic lo h e x ile tilo , etc.
Los g ru p o s a lq u ilc ic lo a lq u ilo son g ru p o s en los que un g rup o a lq u ilo está un ido a un g rupo c ic lo a lq u ile n o co rre sp o n d ie n te a un g rup o c ic lo a lq u ilo . E jem p lo s de g rup o s a lq u ilc ic lo a lq u ilo son m e tilc ic lo p e n tilo , e tilc ic lo p e n tilo , p ro p ilc ic lo p e n tilo , b u tilc ic lo p e n tilo , p e n tilc ic lo p e n tilo , h e x ilc ilo p e n tilo , m e tilc ic lo h e x ilo , e tilc ic lo h e x ilo , p ro p ilc ic lo h e x ilo , b u tilc ic lo h e x ilo , p e n tilc ic lo h e x ilo y h ex ilc ic lo h e x ilo .
Los g ru p o s a lq u ilc ic lo a lq u ila lq u ilo son g rup o s en los q ue un g rup o a lq u ilo e stá u n ido a un g rup o c ic lo a lq u ila lq u ile n o .
En o tro a sp e c to de la inve n c ió n , el s u s titu y e n te h id ró fo b o co m p re n d e g rup o s a rilo y tie n e de 6 a 20, p re fe rib le m e n te de 7 a 15 á to m o s de ca rbo no . Los g ru p o s a rilo inc luyen g rup o s h id ro ca rb ilo a ro m á tico s (g ru p o s arilo de so lo c a rb o n o ) y g ru p o s h e te ro h id ro ca rb ilo a ro m á tic o s (g ru p o s he te roa rilo ). E je m p lo s de los p rim e ros son fen ilo , n a ftilo y fe n a n trilo . Los g rup o s h e te ro a rilo que con tien en n itró g e n o tie n e n p re fe rib le m e n te un v a lo r de pK de <5 para e v ita r ca rga s ca tió n ica s a d ic io n a le s a pH neu tro . E je m p lo s de ta le s g ru p o s h e te ro a rilo q ue co n tie n e n n itróg en o son g ru p o s indo lilo , g ru p o s p iraz in ilo , g rup o s p ir ida z in ilo , g ru p o s p ir im id in ilo , g ru p o s c ino lin ilo , g ru p o s fta la z in ilo y g ru p o s purin ilo . Los g ru p o s h e te ro h id ro ca rb ilo q ue co n tie n e n o x íg e n o q ue fo rm a n g ru p o s h id ro x ilo tie n e n p re fe rib le m e n te un p K > 12 para e v ita r ca rg a s n e g a tiva s a pH neutro.
E je m p lo s de g ru p o s a lq u ila rilo son g ru p o s m e tilfe n ilo (to lilo ), e tilfe n ilo , 4 -iso p ro p ilfe n ilo , m e tilin d o lilo y x ililo . E je m p lo s de g rup o s a rila lq u ilo (a ra lq u ilo ) son g ru p o s bencilo , fe n ile tilo , in d o lilm e tilo y tr itilo . E je m p lo s de g ru p o s a lq u ila rila lq u ilo son g ru p o s m e tilb e n c ilo y 4 -iso p ro p ilb e n c ilo .
D ife re n te s su s titu ye n te s h id ró fo b o s en una m o lé cu la del d e riva do de po lia m ina pueden se r igu a les o pueden se r d ife re n te s . P o r s im p lic id a d , p ueden se r igua les.
Los p o s ib le s g ru p o s d a d o s a n te r io rm e n te para los su s titu y e n te s h id ró fo b o s p u e d e n e s ta r su s titu id o s s ie m p re q ue se cu m p la n los n ú m e ro s de á to m o s de c a rb o n o y los n ú m e ro s de p o s ib le s h e te ro á to m o s com o se d e fin ió a n te r io rm e n te para el s u s titu ye n te h id ró fo b o sus titu ido .
D e riva d o s de p o lia m in a p re fe rid os
El d e riv a d o de p o lia m in a de la in ve n c ió n p ue de s e r un d e riva d o de p o lia lq u ile n im in a line a l q ue c o m p re n d e u n id a d e s de la s ig u ie n te fó rm u la ( 10):
-[C H 2-N R 10-(C H 2 )x ]- ( 10)
d on de
x es un n úm ero entero de 1 a 10, en d on de el v a lo r de x puede se r el m ism o o d ife re n te entre d ife re n te s g ru p o s (C H 2)x ,
R 10 es h id ró ge n o ,
el su s titu ye n te c a rb o x ila d o que co m p re n d e un g rupo ca rbo x ilo u n ido a tra vé s de un e n la za d o r h id ró fo b o (co m o se d e fin e a n te r io rm e n te ) al n itró g e n o de a m in o al q ue R 10 está un ido, o el su s titu ye n te h id ró fo b o com o se d e fine a n te rio rm e n te ,
cad a uno de los cu a le s e stá p re se n te en una m o lé cu la de d ich a p o lia lq u ile n im in a e n tre d ife re n te s ca so s de R 10.
El n úm e ro de á to m os de n itróg en o p o r m o lé cu la de d icha p o lia lq u ile n im in a linea l u o tra fra cc ió n de p o lia m in a del d e riva d o de p o lia m in a p uede s e r de 12 a 100000, p re fe rib le m e n te de 12 a 20000 , m ás p re fe rib le m e n te de 20 a 10000 y de l m o do m ás p re fe rib le de 20 a 5000. M ú ltip le s ca so s de R 10 p ue de s e r igua l o d ife ren te .
El d e riva d o de p o lia m in a linea l q ue se d e fin ió a n te r io rm e n te p o r m e d io de las u n id a d e s re p e tid a s de la ca d e n a de po lím ero tie n e g ru p o s te rm in a le s q ue son g e n e ra lm e n te com o se fo rm an en la p rod u cc ión de la po lia m ina sub yacen te . P o r tan to , no e x is ten lim ita c io n e s en la inve nc ión con re sp e c to a los g rup o s te rm in a le s . En el caso de p o lie tile n im in a s line a le s , p u e d e h a b e r g ru p o s te rm in a le s h id ro x ie tilo . Los e je m p lo s de g ru p o s te rm in a le s son los de fó rm u la (13 ) q ue se d e fine n a con tin u a c ió n .
A lte rn a tiva m e n te , el d e riva d o de p o lia m in a de la inve nc ión es un d e riva d o de p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d o que co m p re n d e u n id a d e s de cad a una de las fó rm u la s (11), (12 ) y (13):
-[C H 2-N R 10-(C H 2 )x ]- ( 11)
-[C H 2-N R 11-(C H 2 )x ]- ( 12)
-(C H 2)y-N R 102 (13 )
d on de
R 10 y x son com o se d e fin ie ro n a n te rio rm e n te ;
R 11 co m p re n d e una o m ás u n id a d e s se le cc io n a d a s de las fó rm u la s (11), (12 ) y (13);
y es un n úm ero e n te ro de 1 a 10, en d on de el v a lo r de y puede se r el m ism o o d ife re n te e n tre d ife re n te s g ru p o s (C H 2)y; y
en d o n d e el núm e ro de á to m o s de n itróg en o p o r m o lécu la de d icha p o lia lq u ile n im in a linea l o ra m ifica d a es de 12 a 100000.
El n úm e ro de á to m os de n itróg en o p o r m o lé cu la de d icha p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d a p uede s e r com o se d e fin ió a n te rio rm e n te para la p o lia lq u ile n im in a linea l. El g rad o de ra m ifica c ión en la p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d a p uede s e r del 1 al 40% , p re fe rib le m e n te del 10 al 40% , m ás p re fe rib le m e n te del 15 al 30% . El e xp e rto en la m a te ria sab e cóm o c u a n tif ic a r la ra m ifica c ió n de un po lím ero , p o r e je m p lo , m e d ia n te titu la c io n e s de pH y cu a n tif ica c ió n de los d ife re n te s c o m p a rtim e n to s de la cu rva de t itu la c ió n o m e d ia n te a n á lis is de 1H N M R.
Las c o m b in a c io n e s de su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s y su s titu ye n te s h id ró fo b o s en los d e riva d o s de p o lia m in a se pueden c a ra c te r iza r p o r su re lac ión m o lar. Se e n co n tró que los d e riva d o s de p o lia m in a (ta les com o d e riva d o s de p o lie tile n im in a ) de la inve n c ió n fu n c io n a n m e jo r si los s u s titu ye n te s c a rb o x ila d o s y los s u s titu ye n te s h id ró fo b o s tien en una re la c ió n m o la r de 10: 1 a 0.1: 1 (la re lac ió n C /A ). En una fo rm a de re a liza c ió n p re fe rid a , la re lac ió n C /A de e stos g ru p o s es de 3: 1 a 0.33 : 1.
C u a n d o se in je rta so b re una po lia m ina , el g rad o de su s titu c ió n (D O S ) es o tra ca ra c te rís tica de re leva nc ia . El D O S se d e fine com o el p o rce n ta je m o la r de la sum a de s u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s y su s titu ye n te s h id ró fo b o s p or g rup o a m ino de la p o lia m ina . El D O S es co m o m ín im o del 10% , p re fe rib le m e n te del 25 al 80% , m ás p re fe rib le m e n te del 30 al 60% . Un e xp e rto en la m a te ria sab e có m o d e te rm in a r el D O S de un d e riva d o de po lia m ina . E s to se p ue de lo g ra r m id ie n d o los á to m o s de n itróg en o re s id u a le s en un p o lím ero , p o r e je m p lo , u sa nd o la re acc ión de n in h id rin a . O tra p os ib ilid a d es el uso de e sp e c tro sc o p ia de 1H -N M R .
En a lg u no s a sp ec tos , la invenc ión se p rac tica con una com b ina c ión de un tip o e sp ec ífico de su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s y un tip o e sp e c ífico de su s titu ye n te s h id ró fo b o s p or m o lécu la de d e riva d o de p o lia m ina . En ta le s a sp ec tos , la su m a de á to m o s de ca rbo no de un su s titu ye n te ca rb o x ila d o m ás los de un su s titu ye n te h id ró fob o es de 10 a 30, p re fe rib le m e n te e sta su m a es de 15 a 25.
En a sp e c to s a d ic io n a le s , se re a liza n c o m b in a c io n e s e sp e c ífica s e n tre un tip o de po lia m ina , m a sa m o le c u la r de p o lia m ina , ta m a ñ o de los s u s titu ye n te s c a rb o x ila d o s y ta m a ñ o de los s u s titu ye n te s h id ró fob os . En una fo rm a de re a liza c ió n p re fe rid a de ta l a sp ec to , el d e riva d o de p o lia m in a tie n e una fra cc ió n de de p o lie tile n im in a linea l de 2 a 500 kD a (en té rm in o s de p eso m o le c u la r p ro m e d io en n ú m e ro ), los s u s titu y e n te s c a rb o x ila d o s tie n e n de 11 a 16 á to m o s de ca rb o n o y son á c id o s n -a lq u ilca rb o x ílico s y los s u s titu ye n te s h id ró fo b o s tie n e n de 3 a 12 á to m o s de ca rb o n o y son a lqu ilos , p re fe rib le m e n te n -a lq u ilo s o a lq u ilc ic lo h e x ilo s .
En o tras fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid as , el d e riva d o de p o lia m ina tie n e una fra cc ió n de p o lie tile n im in a ra m ifica d a de 0.5 a 200 kD a (en té rm in o s de p eso m o le cu la r p ro m e d io en núm ero ), los su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s tien en de 11 a 16 á to m o s de ca rbo no y son á c id os n -a lq u ilca rb o x ílico s y los su s titu ye n te s h id ró fo b o s tien en de 6 a 12 á to m os de ca rbo no y son a lq u ilo s , p re fe rib le m e n te n -a lq u ilo s o a lq u ilc ic lo h e x ilo s .
En fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid a s a d ic ion a le s , el d e riva d o de p o lia m in a tie n e una fra cc ió n de p o lie tile n im in a linea l de 2 a 500 kD a (en té rm in o s de peso m o le c u la r p ro m e d io en n úm e ro ), los s u s titu y e n te s c a rb o x ila d o s tie n e n de 11 a 16 á to m o s de c a rb o n o y son á c id o s n -a lq u ilca rb o x ílico s y los s u s titu ye n te s h id ró fo b o s tie n e n de 6 a 12 á to m o s de ca rb o n o y son a rilos , p re fe rib le m e n te s e le cc io n a d o s entre a rilos que co m p re n d e n una fra cc ió n de bencilo , iso p ro p ilb e n c ilo , n a ftilo o indo lilo .
En o tras fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid as , el d e riva d o de p o lia m in a tie n e una fra cc ió n de p o lie tile n im in a ra m ifica d a de 0.5 a 200 kDa (en té rm in o s de p eso m o le cu la r p ro m e d io en núm e ro ), los su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s tie n e n de 11 a 16 á to m o s de ca rb o n o y son g ru p o s á c id o n -a lq u ilca rb o x ílico , y los su s titu y e n te s h id ró fo b o s tie n e n de 6 a 12 á to m o s de ca rb o n o y son g ru p o s q ue con tien en a rilo , p re fe rib le m e n te se le cc io n a d o s de g ru p o s q ue co m p re n d e n una fra cc ió n de bencilo , iso p ro p ilb e n c ilo , na ftilo o indo lilo .
En o tras fo rm a s m ás de re a liza c ió n p re fe ridas , el d e riva do de p o lia m in a tie n e una fra cc ió n de o lig o sp e rm in a o fra cc ió n de h om ó log o de o lig o sp e rm in a linea l de 1 a 10 kDa (en té rm in o s de peso m o le c u la r p ro m e d io en núm e ro ), los s u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s tie n e n de 11 a 16 á to m os de ca rb o n o y son g rup o s á c ido n -a lq u ilca rb o x ílico , y los s u s titu ye n te s h id ró fo b o s tie n e n de 4 a 10 á to m o s de c a rb o n o y son a lq u ilo s , p re fe rib le m e n te g ru p o s n -a lqu ilo .
En una fo rm a de re a liza c ió n , el d e riva d o de p o lia m in a de la in ve n c ió n es una ca rb o x ia lq u il-a lq u il po lia m ina . Las fra cc io n e s a lq u ilo c o m p re n d e n al m enos 2 á to m o s de ca rbo no . En a lg u n o s a sp e c to s de la inve nc ión , las fra cc io n e s a lq u ilo tie n e n de 3 a 40 á to m o s de ca rbo no . En a sp e c to s p re fe rid os , las fra cc io n e s a lq u ilo son g rup o s a lq u ilo line a le s q ue tie n e n de 6 a 40 á to m o s de ca rbo no , en a sp e c to s m ás p re fe rid o s el n úm e ro de á to m o s de c a rb o n o es de 6 a 20. M ú ltip le s g ru p o s a lqu ilo p rese n te s en una p o lia m ina pueden se r igua les o d ife rentes. En o tros a sp ec tos de la invención , las fra cc io n e s a lq u ilo ta m b ié n co m p re n d e n a n illos a ro m á tico s y tie n e n de 6 a 40 á to m o s de ca rbo no .
C a rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a
La ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a p uede s e r una ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia lq u ile n im in a linea l q ue co m p re n d e , o co n s is te e se n c ia lm e n te en, u n id a d e s de fó rm u la (6 ):
-[C H 2-N R 6-(C H 2)x ]-(6 ),
d o n d e x es un n ú m e ro e n te ro de 1 a 10, y d on de el v a lo r de x p uede s e r igua l o d ife re n te e n tre d ife re n te s g rup o s (C H 2)x ; R6 es h id ró ge n o , un g rup o a lq u ilo de fó rm u la C rH2r+1 o un g rup o c a rb o x ia lq u ilo de fó rm u la Cs-1H2s-2C O O H . C a d a u no de e s to s g ru p o s R6 e s tá p re se n te en una m o lé cu la de d ich a ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a e n tre d ife re n te s ca so s de R6; r es un n ú m e ro e n te ro de 2 a 40 y s es un núm e ro e n te ro de 4 a 40. Las fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid as para x son las d e fin id a s a n te r io rm e n te en el con te x to de la fó rm u la (1). El n úm e ro r es p re fe rib le m e n te de 6 a 40, m ás p re fe rib le m e n te de 6 a 20. El núm e ro s es p re fe rib le m e n te de 4 a 20, m ás p re fe rib le m e n te de 6 a 20, e inc lu so m ás p re fe rib le m e n te de 8 a 16.
El n ú m e ro de á to m o s de n itró g e n o p o r m o lé cu la de d ich a c a rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia lq u ile n im in a linea l p ue de s e r de 12 a 100000, p re fe rib le m e n te de 12 a 20000 , m ás p re fe rib lem e n te de 20 a 10000 y de l m o do m ás p re fe rib le de 20 a 5000.
La ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a linea l q ue se d e fin ió a n te r io rm e n te p o r m e d io de las u n id a d e s re p e tid a s de la ca d en a p o lim é rica tie n e g ru p o s te rm in a le s que son g e n e ra lm e n te com o se fo rm a n en la p rod u cc ió n de la po lia m ina su b ya ce n te . P o r tan to , no e x is ten lim ita c io n e s en la inve nc ión con re spe cto a los g ru p o s e x tre m o s. Los e je m p lo s de g ru p o s e x tre m o s son los de fó rm u la (9 ) q ue se d e fine n a con tin u a c ió n .
A lte rn a tiv a m e n te , d icha ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a es una ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d a . La ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d a p uede se r una que co m p re n d a u n id a d e s e s tru c tu ra le s de cada una de las fó rm u la s (7), (8 ) y (9):
-[C H 2-N R 6-(C H 2 )x ]- (7 )
-[C H 2-N R 7-(C H 2 )x ]- (8 )
-(C H )y -N R 62 (9 )
d on de
R6, x, r y s son com o se d e fin ie ro n a n te rio rm e n te ;
R7 co m p re n d e una o m ás e s tru c tu ra s se le cc io n a d a s de las fó rm u la s (7), (8) y (9);
y es un n ú m e ro e n te ro de 1 a 10, p re fe rib le m e n te de 2 a 10, m á s p re fe rib le m e n te de 2 a 6 , en d on de el v a lo r de y p ue de s e r igua l o d ife re n te e n tre d ife re n te s ca so s de g rup o s (C H 2)y.
R7 p uede s e r un g rup o de fó rm u la (9 ) o R7 co m p re n d e una o m ás u n id a d e s de fó rm u la (7 ) y /o (8). T a m b ié n es pos ib le q ue R7 co m p re n d e una o m ás u n id a d e s de fó rm u la (7 ) y una o m ás u n id ad es de fó rm u la (8 ). C om o la c a rb o x ia lq u ila lq u il-p o lia lq u ile n im in a es po lim é rica , una m o lé cu la de la m ism a g e n e ra lm e n te co m p re n d e m ú ltip le s g ru p o s R 7 que d ifie re n en e s tru c tu ra .
El n ú m e ro de á to m o s de n itró g e n o p o r m o lé cu la de d ich a c a rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d a p uede se r de 12 a 100000, p re fe rib le m e n te de 20 a 20000 , m ás p re fe rib le m e n te de 20 a 10000 y de l m o do m ás p re fe rib le de 20 a 5000.
El g rad o de ra m ifica c ión en la p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d a p uede s e r de l 1 al 40% , p re fe rib le m e n te de l 10 al 40% , m ás p re fe rib le m e n te del 15 al 30% . El e xp e rto en la m a te ria sabe cóm o c u a n tif ica r la ra m ifica c ió n de un p o lím ero , p o r e je m p lo , m e d ia n te titu la c io n e s de pH y cu a n tifica c ió n de los d ife re n te s co m p a rtim e n to s de la cu rva de titu la c ió n .
Las re la c io n e s m o la re s de g rup o s c a rb o x ia lq u ilo y a lq u ilo en la ca rb o x ia lqu il-a lqu M -p o lia lqu ilen im ina d escrita a n te r io rm e n te p ue de n s e r co m o se d e fin e m á s a de lan te . El g ra d o de s u s titu c ió n (D O S ) ta m b ié n p ue de s e r el q ue se d e fin e m ás ade lan te .
En a lg u n o s a sp ec tos , la inve nc ión que usa una ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia lq u ile n im in a se p rac tica con co m b in a c io n e s e sp e c ífica s de fra cc io n e s c a rb o x ia lq u ilo y a lq u ilo . En fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid as , un g rupo c a rb o x ia lq u ilo se co m b in a con un g ru p o a lq u ilo a lifá tico y la su m a de á to m o s de ca rb o n o en a m b a s fra cc io n e s está e n tre 10 y 30, en fo rm a s de re a liza c ió n m ás p re fe rid a s e s ta su m a e s tá e n tre 15 y 25. En e s ta s fo rm a s de re a liza c ió n , un tip o de g rup o ca rb o x ia lq u ilo se co m b in a p re fe rib le m e n te con un tip o de g ru p o a lqu ilo .
En a sp e c to s a d ic io n a le s se re a liza n c o m b in a c io n e s e sp e c ífica s e n tre un tip o de p o lia m ina , m a sa m o le c u la r de po lia m ina , long itud de los g ru p o s c a rb o x ia lq u ilo y lon g itu de s de los g rup o s a lq u ilo . En una fo rm a de re a liza c ió n p re fe rid a de ta l a sp ec to , la p o lia m in a es una p o lie tile n im in a linea l de e n tre 2 y 30 kD a (en té rm in o s de peso m o le cu la r p ro m e d io en n úm e ro ), el g ru p o c a rb o x ia lq u ilo t ie n e de 8 a 16 á to m o s de ca rb o n o y el a lq u ilo t ie n e de 6 a 16 á to m o s de ca rbo no . Inc luso m ás p re fe rid a s son las c o m b in a c io n e s en las que el g rup o c a rb o x ia lq u ilo tie n e de 10 a 16 á to m os de ca rbo no y el a lq u ilo tie n e 9 á to m o s de ca rbo no . En o tra fo rm a de re a liza c ió n p re fe rid a , la p o lie tile n im in a es un p o lím e ro ra m ifica d o de a p ro x im a d a m e n te 10 kD a y el g rup o ca rb o x ia lq u ilo t ie n e e n tre 8 y 16 á to m o s de c a rb o n o y el a lq u ilo tie n e e n tre 6 y 16 á to m o s de ca rbo no , m á s p re fe rib le m e n te 9 á to m o s de ca rbo no .
Las c o m b in a c io n e s de g ru p o s ca rb o x ia lq u ilo y a lq u ilo en la ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a se p ueden c a ra c te r iza r p o r su re lac ión m olar. Se e n co n tró que las ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a s (ta les com o las ca rb o x ia lq u il-a lq u ilp o lie tile n im in a s ) de la inve nc ión fu n c io n a n m e jo r si las fra cc io n e s c a rb o x ia lq u ilo y a lq u ilo t ie n e n una re lac ió n m o la r de 6 : 1 a 0.33: 1 (la re lac ió n C /A ). En una fo rm a de re a liza c ió n p re fe rid a , la re lac ió n C /A de e s to s g ru p o s e stá e n tre 3: 1 y 0.8: 1. En una fo rm a de re a liza c ió n m ás p re fe rid a , la p o lia m in a es una p o lie tile n im in a que e stá su s titu id a con un g ru p o ca rb o x ia lq u ilo C11 y un g rup o a lq u ilo C9, en d o n d e la re lac ió n C /A es de 2: 1 a 0.5: 1, m ás de m o do p re fe rib le a p ro x im a d a m e n te 1.
C u a n d o se in je rta sob re un p o lím ero , el g rad o de sus titu c ió n (D O S ) es o tra ca ra c te rís tica de re leva nc ia . El D O S se d e fin e co m o el p o rce n ta je m o la r de la su m a de fra cc io n e s c a rb o x ia lq u ilo y fra cc io n e s a lq u ilo p o r g ru p o a m in o de la po lia m ina . El D O S es com o m ín im o del 10% , p re fe rib le m e n te e n tre el 25 y el 80% , m ás p re fe rib le m e n te e n tre el 30 y el 60% . Un e xp e rto en la m a te ria sa b e cóm o d e te rm in a r e l D O S de un d e riva d o de p o lia m ina . E s to se puede lo g ra r m id ie n d o los á to m os de n itró g e n o re s id u a le s en un po lím ero , p o r e je m p lo , u sando la re acc ión de n in h id rin a . O tra p os ib ilid a d es el uso de e sp e c tro sc o p ia de 1H -N M R .
En un e je m p lo p a rticu la rm e n te p re fe rid o , la po lia m ina es una p o lie tile n im in a que e stá su s titu id a con un ácido c a rb o x ílico C11 y un g rup o a lq u ilo C9, en d o n d e la re lac ió n C /A es de 2: 1 a 0.5: 1, y el D O S e stá e n tre 35 y 45% .
La s ig u ie n te ta b la 3 lis ta a lg u n a s fo rm a s de re a liza c ió n e sp e c ífica s de d e riva d o s de po lia m ina . P ara o b te n e r una lista de las a b re v ia tu ra s o n o m b re s s im bó licos , co n su lte los e je m p lo s 11 y 15.
T a b la 3
Figure imgf000015_0001
P o lím e ro M r de la F racc ión F ra cc ió n h id ró fu g a R e la c ió n D O S
p o lia m in a en c a rb o x ilo C /A
kDa
D e riva d o s de p o lia m in a s p ara la tra n s fe c c ió n de A R N b ica te n a rio p eq ue ño
Figure imgf000016_0001
p o lie tile n im in a 70 kDa C 16 e tilc ic lo h e x ilo 0.75 -5 25 -50 % ra m ifica d a
Figure imgf000016_0005
Figure imgf000016_0006
X = 2.4 o 2.5 1 -4kD a C11 ... C 16 B utilo 50 -100 % X = 2.3 1 -6kD a H ex ilo 50 -100 %
X = 2.3
Figure imgf000016_0003
2 -6 kD a
Figure imgf000016_0004
D ec ilo
Figure imgf000016_0002
50 -100 %
A lo la rgo de esta d esc ripc ió n , las fó rm u la s e s tru c tu ra le s se dan en fo rm a no ca rg a d a o no ion izada . S in e m ba rg o , para el e xp e rto en la m a te ria está c la ro que los á to m os de n itróg en o de e stas e s tru c tu ra s p ueden p ro to na rse , e sp e c ia lm e n te en so lu c io n e s acuosas. P o r tan to , los co m p u e s to s d e fin id o s p o r m e d io de cu a lq u ie ra de e stas fó rm u la s ta m b ié n co m p re n d e n los c o m p u e s to s o iones en los que cu a lq u ie ra de los á to m o s de n itró g e n o e stá en un e sta do carga do .
P re p a ra c ió n de d e riva d o s de p o lia m in a s
Los d e riva do s de p o lia m in a de la inve nc ión se pueden p re p a ra r m e d ia n te la m o d ifica c ió n de cu a lq u ie ra de las p o lia m in a s d e sc rita s a n te r io rm e n te con los su s titu ye n te s c a rb o x ila d o s y los s u s titu ye n te s h id ró fo b o s d e sc rito s a n te rio rm e n te . D ich os p ro ce d im ie n to s son b ien c o n o c id o s en la té c n ica y se ilus tra n a d ic io n a lm e n te en los e je m p los . P o r e je m p lo , los su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s y los su s titu ye n te s h id ró fo b o s se in trod uce n m e d ia n te sus c o rre sp o n d ie n te s c o m p u e s to s h a lo g e n a d o s d e riva tiza n d o la p o lia m in a en co n d ic io n e s a lca lin a s con ác id os ca rb o x ílico s h a lo g e n a d o s y un co m p u e s to h id ró fo b o ha lo ge na do . S e p re fie re el b rom o com o á to m o de h a ló g e n o en e s to s co m p u e s to s . En una fo rm a de re a liza c ió n p re fe rid a , esto se log ra m e d ia n te el uso de á c ido a, u> -b rom ocarboxílico y c o m p u e s to s de b rom o ta le s com o b ro m o a lca n o s o b ro m o a rilo s com o co m p u e s to s de h a lógeno . E stas dos d e riva tiza c io n e s p ueden re a liza rse c o n se cu tiva m e n te o en p a ra le lo u sa nd o una m e zc la de l á c ido ca rb o x ílico h a lo g e n a d o y el co m p u e s to h id ró fo b o h a lo ge na do . La re lac ió n de m e zc la del á c ido ca rb o x ílico h a lo g e n a d o y el co m p u e s to h id ró fo b o h a lo g e n a d o se e ligen a d e cu a d a m e n te para lo g ra r la re lac ió n m o la r d e se a d a de ca rb o x ilo y g ru p o s h id ró fo b o s en el d e riva do de p o lia m ina que se va a p reparar. En una ap ro x im ac ió n , la re lac ión m o la r de m e zc la de l á c ido ca rb o x ílico h a lo g e n a d o y el co m p u e s to h id ró fob o h a lo g e n a d o en la re acc ión de m o d ifica c ió n p ara le la c o rre sp o n d e a la re lac ió n m o la r de s u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s y s u s titu ye n te s h id ró fo b o s en el d e riva d o de p o lia m ina . La re lac ión m o la r de su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s y las fra cc io n e s h id ró fu g a s en el p roducto o b ten ido se pueden ana liza r, p o r e je m p lo , m e d ia n te 1H -N M R . P ueden u sa rse d e sv ia c io n e s en la re lac ión m o la r e n co n tra d a de la re lac ió n m o la r d e se a d a para a ju s ta r la re lac ión de m e zc la de l á c ido ca rb o x ílico h a lo g e n a d o y el co m p u e s to h id ró fob o h a lo g e n a d o con el fin de o b te n e r una p o lia m in a m o d ifica d a su s titu id a con la re lac ió n m o la r d e se a d a de e s to s s u s titu ye n te s . P ara el e xp e rto en la m a te ria e stá c la ro que el g rad o de sus titu c ión d e se a d o (D O S ) p ue de lo g ra rse y, si es n ecesa rio , a ju s ta rse de m a n e ra s im ila r u tiliza n d o ca n tid a d e s m o la res re la tivas a d e cu a d a s de l á c id o ca rb o x ílico h a lo g e n a d o y del c o m p u e s to h id ró fo b o h a lo ge na do , p o r una parte , p a ra la c a n tid a d de p o lia m in a p o r o tra . La re a cc ió n se lleva a ca b o g e n e ra lm e n te en un d iso lve n te o rgá n ico , p re fe rib le m e n te un d iso lve n te o rg á n ico p o la r ta l com o a lco ho les . En o tras fo rm a s de re a liza c ió n , la in trod ucc ión de su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s y s u s titu ye n te s h id ró fo b o s se logra m e d ia n te ac ila c ió n u sa nd o los c o rre sp o n d ie n te s á c id os d ica rb o x ílico s , sus a n h íd rid o s o c lo ru ros , o m e d ia n te a d ic ión de M icha e l u sa n d o los re sp e c tivo s d e riva d o s in sa tu ra d o s de l á c id o c a rb o x ílico y de l co m p u e s to h id ró fo b o h a lo ge na do .
Los d e riva d o s de p o lia m in a s de la p re se n te in ve n c ió n son d ife re n te s de los co m p u e s to s d e sc rito s en e l e s ta d o de la té cn ica . W a ke fie ld e t al. (2005 ) B ioco n j C he m 16 (5): 1204 -1208 in fo rm a n sob re co p o lím e ro s de é te r a m in o e til-v in ílico y é te re s a lq u il-v in ílico s q ue tie n e n g ru p o s a lq u ilo con uno a cu a tro á to m o s de ca rb o n o . En co n tra s te con la p re se n te inve nc ión , los p o lím e ro s de W a ke fie ld no co m p re n d e n fra cc io n e s ca rbo xilo , p o r lo q ue ca re ce n de un tip o e se n c ia l de g rup o fu n c io n a l en el po lím ero . Los d e riva d o s de p o lia m ina s de la p re se n te inve nc ión ta m b ié n son d ife re n te s de las p o lie tile n im in a s m o d ifica d a s p re se n ta d a s p or van V lie t e t al. (2008 ) en C h e m b io ch e m , 2008 , 9, 1960-1967. A llí, las p o lie tile n im in a s se m o d ifica ro n s is te m á tica m e n te con fra cc io n e s d od ec ilo , b en c ilo y m e tilo . De nuevo , los g rupos ca rb o x ia lq u ilo e se n c ia le s en los d e riva d o s de p o lia m in a de la p re se n te in ve n c ió n no se u tilizan en va n V lie t. A d e m á s, se p ro d u ce una fo rm a c ió n e x te n sa de g rup o s a m ino cu a te rn iza d o s m e d ia n te el uso de yo d u ro de m etilo .
En co n tra s te con W a k e fie ld o va n V lie t, la so lic itu d de p a ten te W O 08 /074488 y O sku e e e t al. (2010 ) J G e n e M ed 12: 729 -738 , am bas, g u a rd an s ile n c io sob re el uso de g ru p o s a lq u ilo a d ic ion a le s . De hecho , la so lic itud de pa ten te W O 08 /074488 d ife re n c ia c la ra m e n te e n tre el uso de g ru p o s c a rb o x ia lq u ilo (los T E E en e sa p u b lica c ió n ) y las m o d ifica c io n e s m e ra m e n te h id ró fu g a s lo g ra d a s p o r a lq u ila c ió n (p á g in a 60 del d o cu m e n to A 2). O skue e , p o r o tro lado, e n se ñ a q ue el e fe c to de la c a rb o x ila c ió n e stá m e d ia do p o r una ca rga su p e rfic ia l reduc ida , una ca ra c te rís tica q ue no e stá m e d ia d a p o r la a lq u ila c ión .
U so de los d e riva d o s de p o lia m in a s de la inve nc ión com o tra n s fe c ta n te s
El d e riva d o de p o lia m in a de la inve nc ión , ta l com o ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a , se usa para la tra n s fe cc ió n de p o lia n io n e s a d e n tro de cé lu las . P o r tan to , e s to s d e riva d o s de p o lia m in a ta m b ié n se d e n o m in a n en el p rese n te d o cu m e n to tra n s fe c ta n te s de la invenc ión .
Los p o lia n io n e s se p ue de n s e le cc io n a r de l g ru p o de p ép tid os , p ro te ín a s y á c id o s n uc le icos . En d e te rm in a d a s fo rm a s de re a liza c ió n , los p o lia n io n e s son p ro te ín a s se le cc io n a d a s de a n ticu e rp o s . En fo rm a s de re a liza c ió n e sp e c ífica s , los a n ticu e rp o s son de tip o IgG . En o tras fo rm a s de re a liza c ió n , se u tilizan fra g m e n to s de a n ticu e rp o s , ta le s co m o Fab, Fab', fra g m e n to s F (ab ')2 u n id os p o r e n la ce s d isu lfu ro o fra g m e n to s F (ab ')2 q u ím ica m e n te u n id os o fra g m e n to s scFv. En una fo rm a de re a liza c ió n p re fe rid a , los p o lia n io n e s son á c id o s n uc le icos .
Los á c id os n uc le icos , com o se usan en e ste d o cu m e n to , son p o lin u c le ó tid o s u o lig o n u c le ó tid o s que inc lu ye n , sin lim itac ió n , A D N o A R N o d e riva d o s o a n á lo g o s de los m ism os. P o lin u c le ó tid o , com o se usa en este d ocum e n to , se re fie re a c u a lq u ie r p o lirr ib o n u c le ó tid o o p o lid e so x irr ib o n u c le ó tid o q ue p uede se r de A R N o A D N sin m o d ific a r o de A R N o A D N m o d ifica d o o de A D N /A R N m ixto. Los p o lin u c le ó tid o s p ueden s e r m o n o ca te n a rio s o b ica ten a rio s . Un p lá sm ido es un e je m p lo de p o lin u c le ó tid o b ica ten a rio , un A R N m es un e je m p lo de p o lin u c le ó tid o m o n o ca te n a rio . Los o lig o nu c le ó tid os , com o se usan en este d ocum e n to , se d e finen com o m o lécu la s con dos o m ás n uc leó tido s , a m e nu do m ás de tres, y g en e ra lm e n te m ás de d iez y m enos de cien, que pueden se r de A R N o A D N sin m o d ifica r o de A D N /A R N m ix to o de a R n o A D N m o d ificad o . d o n d e las m o d ifica c io n e s inc lu ye n p u e n te s de a n illo co m o los q ue se e n cu e n tra n en L N A (á c ido s n uc le ico s b lo q ue ad os ), d ive rsa s m o d ifica c io n e s en la p os ic ión 2 ' de l n uc leó s id o com o 2 'M e , 2 'O M e, 2 'M O E y 2 'F o en d on de se u tilizan a zú ca re s d is tin to s de ribosa , ta le s com o a ra b in o sa en los n u c le ó tid o s 2 'F A N A , g lice ro le s en los á c id os n u c le ico s d e s b lo q u e a d o s o e s tru c tu ra s de hex ito l. El ta m a ñ o de un o lig o n u c le ó tid o puede d e p e n d e r de m u ch o s fa c to re s , inc lu ido el uso fin a l de l o lig o n u c le ó tid o . Los e je m p lo s típ ico s de o lig o n u c le ó tid o s son A R N ip , inh ib id o res an tisen tid o , m iA R N , A D N z im a s y a p tám e ro s . E sen c ia lm e n te , to d o s los á c id os n uc le icos q ue llevan ca rg a s n eg a tiva s en su e s tru c tu ra son co m p a tib le s para su uso con los tra n s fe c ta n te s de la inve nc ión , esto inc luye d ive rso s á c id os n u c le ico s m o d ifica d o s de e s tru c tu ra ta le s com o a q u e llo s que co m p re n d e n e n la ce s de fo s fo tio a to o e n la ce s de fo s fo d itio n a to . En con tras te , los á c id os n uc le icos no ca rg a d o s ta le s co m o los c o n s tru id o s a p a rtir de m e tilfo s fo n a to s o á c id os n uc le ico s p e p tíd ico s (P N A ) son m e no s c o m p a tib le s con los tra n s fe c ta n te s de la invenc ión .
P ara tra n s fe c ta r un á c id o n u c le ico u o tro p o lia n ió n , g e n e ra lm e n te se p repa ra un c o m p le jo e n tre el á c ido n u c le ico (u o tro p o lia n ió n ) y el tra n s fe c ta n te . El e xp e rto en la m a te ria co n oce la fo rm a c ió n de co m p le jo s e n tre re a c tivo s de tra n s fe c c ió n y p o lia n io n e s . G e n e ra lm e n te , e sto se p ue de lo g ra r co m b in a n d o una p rim e ra so lu c ió n q ue co m p re n d e el tra n s fe c ta n te y una se g u n d a so lu c ió n que co m p re n d e el po lian ión o á c ido nuc le ico . N o rm a lm e n te , el núm e ro de cargas ca tió n ica s p ro p o rc io n a d a s p o r el tra n s fe c ta n te es m a yo r que el núm e ro de ca rga s n eg a tiva s en el p o lia n ió n . Esta re lac ió n se co n o ce com o re lac ió n N /P en la té cn ica , en d onde N ind ica el n ú m e ro de ca rg a s fo rm a le s de n itró g e n o en el tra n s fe c ta n te y P el núm e ro de g ru p o s fo s fa to en un ácido nuc le ico . En a lg u na s fo rm a s de re a liza c ió n , la re lac ió n N /P p ara el uso de l d e riva d o de p o lia m in a en co m b in a c ió n con á c id os n u c le ico s e stá e n tre 2 y 20, en las fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid a s d ich a re la c ió n e s tá e n tre 5 y 15 y en fo rm a s de re a liza c ió n aún m á s p re fe rid a s la re la c ió n N /P es a p ro x im a d a m e n te 10.
En o tra s fo rm a s de re a liza c ió n , la re lac ió n N /P e stá e n tre 2 y 6 , m ás p re fe rib le m e n te a lre d e d o r de 4. D e p e n d ie n d o de la re lac ió n N /P , los co m p le jo s e n tre un á c id o n uc le ico y un d e riva d o de p o lia m in a p ue de n te n e r d ife re n te s ca rg a s y un ta m a ñ o de p a rtícu la s d ife re n te . Los co m p le jo s que tie n e n un v a lo r N /P de a p ro x im a d a m e n te 10 o m ás tie n e n una ca rga su p e rfic ia l n eu tra o lig e ra m e n te p o s itiva según se d e te rm in a m e d ia n te m e d ic io n e s de p o ten c ia l ze ta . El ta m a ñ o de p a rtícu la de ta le s co m p le jo s está e n tre 200 y 1000 nm, en fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid a s e n tre 250 y 500 nm, seg ún se d e te rm in a m e d ia n te la d isp e rs ió n d in á m ica de la luz.
Los co m p le jo s que tie n e n una N /P de a p ro x im a d a m e n te 6 o m enos tien en una carga su p e rfic ia l neu tra a n eg a tiva seg ún lo d e te rm in a d o p o r las m e d ic io n e s de l p o te n c ia l ze ta . El ta m a ñ o de p a rtícu la de los co m p le jo s q u e tie n e n una N /P de a p ro x im a d a m e n te 6 o m e n o r e stá e n tre 50 y 500 nm , en fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid a s e n tre 100 y 200 nm, seg ún se d e te rm in a m e d ia n te la d isp e rs ió n d in á m ica de la luz.
Es b ien sa b id o p o r el e xp e rto en la té cn ica que el ta m a ñ o de p a rtícu la y la ca rga su p e rfic ia l de una p a rtícu la son d e te rm in a n te s para la d is trib uc ió n de p a rtícu la s en la c ircu la c ió n s is té m ica de un a n im a l ve rte b ra d o , un m a m ífe ro o en h um a no s . Las p a rtícu la s q ue tie n e n un ta m a ñ o de 150 nm o m e n o s p u e d e n a lc a n z a r el p a ré n q u im a h e p á tico d esde el to rre n te san gu íne o , m ie n tra s que se e xc luye n las p a rtícu la s g ran d es . P o r el con tra rio , los tu m o re s , los s itio s de in fla m a c ió n o las cé lu las del e s tro m a en el bazo pueden a lca n za rse m e d ia n te p a rtícu la s m ás g ra n d e s de hasta a p ro x im a d a m e n te 500 nm.
La fo rm a c ió n del co m p le jo e n tre el tra n s fe c ta n te de la inve nc ión y el po lia n ió n a tra n s fe c ta r se lleva a cabo g e n e ra lm e n te . La fo rm a c ió n de co m p le jo s e n tre los po lia n io ne s, com o el á c ido nuc le ico , im p lica una in te ra cc ió n de ca rg a con el tra n s fe c ta n te . T a l in te ra cc ió n se log ra en s o lu c ió n a cu o s a en un ra ng o de pH e n tre 3 y 9 d o n d e a m b o s c o m p le jo s e stán ion izad os . En a lg u n a s fo rm a s de re a liza c ió n , el pH p ara la fo rm a c ió n de l c o m p le jo e stá e n tre 4 y 8 y en las fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid a s d icho pH e stá e n tre 5 y 7. El pH de la so lu c ió n que fo rm a el co m p le jo se a jus ta m e d ia n te el uso de u na o m ás su s ta n c ia s re gu lad o ras . En p rinc ip io , se p ue de u tiliz a r c u a lq u ie r su s ta n c ia re g u la d o ra q ue te n g a un pK d en tro de l in te rva lo a n te s m e n c io n a d o y q ue no sea tó x ica para las cé lu las . En fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid a s se u tilizan re g u la d o re s b a sa d o s en ace ta to , m a lea to , succ ina to , ca rbo na tos , fo s fa to s , c itra to , m e tile tilsu lfo n a to (M E S ), B is -T ris , B is -T ris -p ro p a n o , tr is -(h id ro x im e til)a m in o m e ta n o , tr ic in a o re g u la d o re s de la serie G ood ta le s co m o H E P E S , TE S , M O P S , BES, M o PS O , A C E S , P IP E S , A D A , H E P P S . Los re g u la d o re s m ás p re fe rid o s son a ce ta to , fo s fa to s , c itra to o H E P E S .
La so lu c ió n en la q ue se p ro d u ce la fo rm a c ió n de l c o m p le jo p ue de c o m p re n d e r o tro s in g re d ie n te s ta le s com o sa le s o a zú ca re s s ie m p re q ue e stas su s ta n c ia s no com p itan con la fo rm a c ió n de l co m p le jo o sean tó x ica s para las cé lu las . En fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid as , la ca n tid a d de sa les está lim ita d a de m o do que la fu e rza ión ica to ta l de la so lu c ió n sea in fe rio r a 0.2 m o l/L , en fo rm a s de re a liza c ió n m ás p re fe rid a s la fu e rza ión ica sea in fe rio r a 0.1 m o l/L . U na sa l b ien to le ra d a p o r las cé lu la s es el c lo ru ro de sod io . S e p re fie re una fu e rza ión ica ba ja p o r d e b a jo de 0.1 m o l/l para la un ión de o lig o n u c le ó tid o s m ie n tra s que, para la fo rm a c ió n de co m p le jo s con p o lin uc leó tido s , ta le s com o p lá sm id o s o A R N m , la fu e rz a ión ica p ue de s e r m ayo r.
P ara e v ita r el e stré s o sm ó tico d u ra n te la a d ic ión de l co m p le jo de tra n s fe c c ió n a las cé lu las , se p ueden a g re g a r a zú ca re s a la so lu c ió n de fo rm a c ió n de l co m p le jo para a ju s ta r la o sm o la rid a d . En a lg u n a s fo rm a s de re a liza c ió n , la a d ic ión de a zú ca re s e stá lim itada de m o do que la o sm o la rid a d to ta l de la so lu c ió n a ñ a d id a a las cé lu las e sté e n tre 150 y 500 m o sm /L , en fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid a s la o sm o la rid a d e sté e n tre 270 y 310 m o sm /L . En fo rm a s de re a liza c ió n p re fe rid as , se u tilizan g lucosa , saca ro sa o tre h a lo s a para a ju s ta r la o sm o la rid a d de la m e zc la de tra n s fe cc ió n .
S o rp re n d e n te m e n te se e nco n tró que la m e zc la de tra n s fe cc ió n ta m b ié n se puede p re p a ra r u sando d e te rm in a d o s m e d io s con co m p o s ic ió n d esco n o c id a . En m u ch o s casos, la m e zc la de tra n s fe cc ió n p od ría p re p a ra rse con m e d io s de cu ltivo ce lu la r, co m o D M E M y O p tim e m (m a rca co m e rc ia l de L ife T e ch n o lo g ie s ).
Los tra n s fe c ta n te s de la p rese n te inve nc ión p ueden te n e r una so lu b ilid a d lim itada en a gua o so lu c io n e s re gu lad a s. La so lu b ilid a d es fu n c ió n de l pH y la ion izac ión a co m p a ñ a n te de l d e riva d o de p o lia m in a de la inve nc ión . C om o reg la gen e ra l, e stos co m p u e s to s tie n e n una m e jo r so lu b ilid a d en a gu a tra s la a c id ifica c ió n , p o r e jem p lo , en m e d io s que te n g a n un pH de 7 o m enos. P o r el co n tra rio , los d e riva d o s de p o lia m in a son fá c ilm e n te s o lu b le s en a lc o h o le s com o, p o r e je m p lo , e tano l, p ropano l, 1.2-d ih id ro x ip ro p a n o o iso p ro p a n o l (q ue ta m b ié n se d e n o m in a n a q u í co le c tiva m e n te com o "a lco h o l de ca d e n a co rta ") a pH 9 o sup e rio r. D e p e n d ie n d o del pH, ta m b ié n es p os ib le e m p le a r m e zc la s de a lco h o le s de ca d e n a corta con a gua com o d iso lve n te , p o r e je m p lo , m e zc la s q ue te n g a n e n tre 33 y 100% de e tano l, p ropano l, 1.2-d ih id ro x ip ro p a n o o iso p ro p a n o l para fo rm a s m e no s ion iza d a s de la tra n s fe c ta n te s o m e zc la s q ue ten ga n e n tre 0 y 66% de d ich os a lco h o le s para fo rm a s m ás ion iza d a s de los tra n s fe c ta n te s . En d e te rm in a d a s fo rm a s de re a liza c ió n , los tra n s fe c ta n te s se a lm a ce n a n com o so lu c io n e s m a d re q u e con tien en e n tre 20 y 200 m M (á to m o s de n itró g e n o b a sad os en el tra n s fe c ta n te ) del tra n s fe c ta n te en a lco h o le s in fe rio re s ta le s com o a lco h o le s de ca d e n a corta . A co n tin u a c ió n , p ue de n g e n e ra rse c o n c e n tra c io n e s de tra b a jo de a p ro x im a d a m e n te 0.1 m M a 5 m M de l tra n s fe c ta n te m e d ia n te la d ilu c ión de l s to c k en una so lu c ió n re g u la d o ra acu osa . N o rm a lm e n te , los a lco h o le s de ca d e n a corta no n ece s ita n e lim in a rse de la m e zc la de tra n s fe cc ió n y son to le ra d o s p o r las cé lu las .
En una fo rm a de re a liza c ió n e sp ec ífica , los tra n s fe c ta n te s se u tilizan según el s ig u ie n te p ro to co lo de tra n s fe cc ió n :
1) El d e riva d o de p o lia m ina se su m in is tra com o una so lu c ió n de 50 m M (b a sa d a en el co n te n id o de n itró g e n o ) en e ta no l del 33 al 100% , p re fe rib le m e n te e ta no l al 70% .
2 ) S e p rep a ra re g u la d o r de tra n s fe c c ió n que co m p re n d e d ih id ro g e n o fo s fa to de so d io 10 m M e h id ró x id o de so d io 3 mM .
3) La p o lia m in a m o d ifica d a se d ilu ye en re g u la d o r de tra n s fe cc ió n h asta una so lu c ió n 1 mM .
4 ) El A R N ip se d ilu ye en re g u la d o r de tra n s fe cc ió n h as ta A R N ip de 22 pM . D ado que el n úm e ro p ro m e d io de fo s fa to s en el A R N ip es de a p ro x im a d a m e n te 45, la co n ce n tra c ió n to ta l de fó s fo ro es de a p ro x im a d a m e n te 1 mM .
5) Las so lu c io ne s de tra ba jo de la po liam ina y el A R N ip se com b ina n en una re lac ió n de 10+1, lo que da com o resu ltado una re lac ió n N /P de 10 y una co n ce n tra c ió n de l A R N ip en la m e zc la de co m p le ja c ió n de 2 pM.
6 ) Se a ñ a d e n h as ta 20 pl de la m e zc la de tra n s fe cc ió n p re p a ra d a en (5 ) p o r 100 pl de m e d io de cé lu la s cu ltivad as . En una fo rm a de re a liza c ió n a lte rn a tiva , los tra n s fe c ta n te s se u tilizan con el s ig u ie n te p ro to co lo genera l:
1) El d e riva d o de p o lia m in a se su m in is tra com o una so lu c ió n de 50 m M (b a sa d a en el p eso de l m o n ó m e ro ) en e ta no l de l 33 al 100% , p re fe rib le m e n te al 70% .
2 ) Se p re p a ra re g u la d o r de tra n s fe cc ió n q ue co m p re n d e á c id o c ítr ico de 10 m M e h id ró x id o de sod io de 19 mM. 3) La p o lia m in a m o d ifica d a se d ilu ye en re g u la d o ra de tra n s fe c c ió n h as ta una so lu c ió n 1.8 mM.
4 ) A R N ip se d ilu ye en re g u la d o r de tra n s fe cc ió n a A R N ip de 4 pM.
5) Las so lu c io n e s de tra b a jo de la p o lia m ina y el A R N ip se com b ina n en una re lac ió n de 1+1, lo que da com o resu ltado una re lac ió n N /P de a p ro x im a d a m e n te 10 y una co n ce n tra c ió n de l A R N ip d u ra n te la co m p le ja c ió n de 2 pM.
6 ) Se a ñ a d e n h as ta 20 pl de la m e zc la de tra n s fe cc ió n p re p a ra d a en (5 ) p o r 100 pl de m e d io de cé lu la s cu ltivad as . Los tra n s fe c ta n te s q ue t ie n e n un ta m a ñ o de p a rtícu la p eq ue ño se p ueden p re p a ra r u tiliza n d o el s ig u ie n te p ro to co lo g e n e ra l 3:
1) El d e riva d o de p o lia m ina se su m in is tra com o una so lu c ió n de 56 m M (b a sa d a en el co n te n id o de n itró g e n o ) en e ta no l de 33 a 100, p re fe rib le m e n te e ta no l al 70% .
2 ) S e p re p a ra re g u la d o r de tra n s fe c c ió n q ue co m p re n d e d ih id ro g e n o fo s fa to de sod io de 10 m M e h id ró x id o de sod io de 3 mM.
3) El A R N ip se d ilu ye en re g u la d o r de tra n s fe cc ió n hasta A R N ip de 18 pM . D ado q ue el n ú m e ro p rom ed io de fo s fa to s en el A R N ip es de a p ro x im a d a m e n te 45, la co n ce n tra c ió n to ta l de fó s fo ro es de a p ro x im a d a m e n te 0.75 mM.
4 ) La so lu c ió n de A R N ip se a ñ a d e d ire c ta m e n te a la p o lia m in a m o d ifica d a en una re lac ió n de 20+1 , lo q ue da co m o re su lta d o una re lac ió n de N /P de 4 y una co n ce n tra c ió n del A R N ip en la m e zc la de co m p le ja c ió n de 17 pM.
5) S e a ña de n hasta 10 pl de la m e zc la de tra n s fe cc ió n p o r 100 pl de m e d io de cé lu las cu ltiva d a s o se a d m in is tra a a n im a les .
Si b ien la p re p a ra c ió n de co m p le jo s de tra n s fe cc ió n a p a rtir de dos so lu c io n e s se re a liza a m e nu do , re qu ie re la p re p a ra c ió n se p a ra d a de las so lu c io n e s que con tie n e n tra n s fe c ta n te y á c ido nuc le ico . Las so lu c io n e s d eben e s ta r lim p ia s o e s té rile s para su fu n c io n a m ie n to en cu ltivo ce lu la r; ta m b ié n p ue de n te n e r una v id a útil lim itad a . U na m e jo ra a d ic io n a l es el uso de un tra n s fe c ta n te seco q ue se re co n s titu ye con re g u la d o r de tra n s fe c c ió n a n tes de su uso. Para e ste p ro p ó s ito el tra n s fe c ta n te se p uede se ca r de su so lu c ió n en a lco h o le s de ca d e n a corta . Un ben e fic io p a rticu la r de ta l p ro ce d im ie n to es el a b a s te c im ie n to de a lícu o ta s p eq ue ña s y d e fin id a s de tra n s fe c ta n te que tien en una v id a útil m uy larga . El tra n s fe c ta n te seco se puede re h id ra ta r con re g u la d o r de tra n s fe cc ió n . En a lg u n a s fo rm a s de re a liza c ió n , el tra n s fe c ta n te se co ta m b ié n p uede re h id ra ta rse con una so lu c ió n q ue ya co n tie n e el á c ido nuc le ico .
En o tra s fo rm a s de re a liza c ió n , el tra n s fe c ta n te se p ro p o rc io n a en fo rm a lio filizad a . En un a sp e c to p re fe rid o de d icha fo rm a de rea lizac ión , el tra n s fe c ta n te se lio filiza a p a rtir de una so lu c ió n que co m p re n d e un s is te m a re g u la d o r a ju s ta d o para p ro d u c ir un pH e n tre 5 y 7 y q ue a d e m á s co m p re n d e un a zú c a r en una can tid a d p ara p ro d u c ir una o sm o la rid a d to ta l de e n tre 100 y 500 m o sm /L tra s la re co n s titu c ió n . p o r e je m p lo , sa ca ro sa o tre h a lo s a o g lu cosa de 270 m M . En e s ta fo rm a de re a liza c ió n , el á c id o n u c le ico se p ro p o rc io n a com o una so lu c ió n a cu o sa d ilu id a y se usa d ire c ta m e n te p ara la re co n s titu c ió n de l tra n s fe c ta n te lio filizad o , de m o do q ue la h id ra ta c ió n y la fo rm a c ió n de l co m p le jo o cu rran en un so lo paso. La m e zc la de tra n s fe cc ió n re su ltan te se puede a ñ a d ir luego d ire c ta m e n te a las cé lu las que se van a tra n s fe c ta r.
Los tra n s fe c ta n te s de esta inve nc ión se pueden c o m e rc ia liz a r en fo rm a de un k it que o p c io n a lm e n te co m p re n d e a d e m á s un A R N ip para las re a cc io n e s de con tro l.
En una p rim e ra re a liza c ió n , el k it co n tie n e lo s igu ien te :
A ) U na so lu c ió n de tra n s fe c ta n te en un a lco ho l de ca d e n a corta , en la que el a lco ho l p uede se r e ta no l al 70 % y el tra n s fe c ta n te p uede te n e r una co n ce n tra c ió n de a p ro x im a d a m e n te 50 m M (b a sa d o en á to m o s de n itró g e n o en el tra n s fe c ta n te ),
B) U na so lu c ió n re g u la d o ra que tie n e un pH e n tre 4 y 8 y una fu e rza ión ica p o r d eb a jo de 0.2, p re fe rib le m e n te p o r d e b a jo de 0.1,
C ) Un m a nu a l con in s tru cc io n e s com p le ta s , o p c io n a lm e n te ta m b ié n un m a nu a l b reve con in s tru cc io n e s re sum id as . En una se g u n d a fo rm a de re a liza c ió n , d icho k it co m p re n d e lo s igu ien te :
A ) U na so lu c ió n de l tra n s fe c ta n te co m o se d e sc rib e en la p rim e ra fo rm a de re a liza c ió n , en la q ue la so lu c ió n se d iv id e en a lícu o tas . P re fe rib le m e n te , el n úm e ro de a lícu o ta s e stá e n tre 5 y 100, m ás p re fe rib le m e n te el n ú m e ro de a lícu o ta s e stá e n tre 6 y 20. S e p re fie re a d e m á s q ue cada a lícu o ta co n te n g a e n tre 10 y 1000 n m o l de tra n s fe c ta n te (b a sa d o en el m o nó m ero ),
B) U na so lu c ió n re g u la d o ra q ue te n g a un pH e n tre 4 y 8 y una fu e rza ión ica p o r d e b a jo de 0.2, p re fe rib le m e n te p o r d e b a jo de 0.1,
C ) Un m a nu a l con in s tru cc io n e s com p le ta s , o p c io n a lm e n te ta m b ié n un m a nu a l b reve con in s tru cc io n e s re sum id as . En una te rce ra fo rm a de re a liza c ió n , d ich o k it co m p re n d e lo s igu ien te :
A ) U na so lu c ió n de l tra n s fe c ta n te com o se d e sc rib e en la p rim e ra fo rm a de re a liza c ió n , en la q ue la so lu c ió n se d iv id e en a lícu o ta s y en la que d ich as a lícu o ta s se d isp o n e n en una m ic ro p la ca que tie n e entre 6 y 1576 pocillos , p re fe rib le m e n te 24, 96 o 384 poc illos , y en la q ue cad a a lícu o ta co n tie n e e n tre 10 y 1000 n m o l de tra n s fe c ta n te , B) U na so lu c ió n re g u la d o ra q ue te n g a un pH e n tre 4 y 8 y una fu e rza ión ica p o r d e b a jo de 0.2, p re fe rib le m e n te p o r d e b a jo de 0.1,
C ) Un m a nu a l con in s tru cc io n e s com p le ta s , o p c io n a lm e n te ta m b ié n un m a nu a l b reve con in s tru cc io n e s re sum id as . En una cua rta fo rm a de re a liza c ió n , d icho k it co m p re n d e lo s igu ien te :
A ) Un tra n s fe c ta n te seco d iv id ido en a lícu o tas . P re fe rib le m e n te , el núm e ro de a lícu o ta s está e n tre 5 y 100, m ás p re fe rib le m e n te el n ú m e ro de a lícu o ta s e s tá e n tre 6 y 20. S e p re fie re a d e m á s q ue cad a a lícu o ta c o n te n g a e n tre 10 y 1000 nm ol de tra n s fe c ta n te (b a sa d o en el m o nó m ero ),
B) U na so lu c ió n re g u la d o ra q ue te n g a un pH e n tre 4 y 8 y una fu e rza ión ica p o r d e b a jo de 0.2, p re fe rib le m e n te p o r d e b a jo de 0.1,
C ) Un m a nu a l con in s tru cc io n e s com p le ta s , o p c io n a lm e n te ta m b ié n un m a nu a l b reve con in s tru cc io n e s re sum id as . En una q u in ta fo rm a de re a liza c ió n , d ich o k it co m p re n d e lo s igu ien te :
A ) Un tra n s fe c ta n te seco d iv id id o en a lícu o tas , en d o n d e d ich as a lícu o ta s se d isp o n e n en una m ic ro p la ca que tie n e e n tre 6 y 1576 p oc illos , p re fe rib le m e n te la m ic ro p la ca tie n e 24, 96 o 384 p oc illos , y en d o n d e ca d a a lícu o ta co n tie n e e n tre 10 y 1000 nm ol de tra n s fe c ta n te ,
B) U na so lu c ió n re g u la d o ra q ue te n g a un pH e n tre 4 y 8 y una fu e rza ión ica p o r d e b a jo de 0.2, p re fe rib le m e n te p o r d e b a jo de 0.1,
C ) Un m a nu a l con in s tru cc io n e s com p le ta s , o p c io n a lm e n te ta m b ié n un m a nu a l b reve con in s tru cc io n e s re sum id as . En una sex ta fo rm a de re a liza c ió n , d ich o k it co m p re n d e lo s igu ien te :
A ) Un tra n s fe c ta n te lio filiz a d o d iv id id o en a lícu o ta s . P re fe r ib le m e n te , el n ú m e ro de a líc u o ta s e stá e n tre 5 y 100, m ás p re fe rib le m e n te el n ú m e ro de a lícu o ta s e stá e n tre 6 y 20. S e p re fie re a d e m á s q ue cad a a lícu o ta c o n te n g a e n tre 10 y 1000 nm ol de tra n s fe c ta n te (b a sa d o en el m o nó m ero ),
B) U na so lu c ió n re g u la d o ra que tie n e un pH e n tre 4 y 8 y una fu e rza ión ica p o r d eb a jo de 0.2, p re fe rib le m e n te p o r d e b a jo de 0.1,
C ) Un m a nu a l con in s tru cc io n e s com p le ta s , o p c io n a lm e n te ta m b ié n un m a nu a l b reve con in s tru cc io n e s re sum id as . En una sé p tim a fo rm a de re a liza c ió n , d ich o k it co m p re n d e lo s igu ien te :
A ) Un tra n s fe c ta n te lio filiza d o d iv id id o en a lícu o tas , en d on de d ich a s a lícu o ta s se d isp o n e n en una m ic ro p la ca que tie n e e n tre 6 y 1576 pocillos , p re fe rib le m e n te 24, 96 o 384 poc illos , y en d on de cada a lícu o ta con tien e e n tre 10 y 1000 nm ol de tra n s fe c ta n te ,
B) U na so lu c ió n re g u la d o ra que tie n e un pH e n tre 4 y 8 y una fu e rza ión ica p o r d eb a jo de 0.2, p re fe rib le m e n te p o r d e b a jo de 0.1,
C ) un m a nu a l con in s tru cc io n e s com p le ta s , o p c io n a lm e n te ta m b ié n un m a nu a l b reve con in s tru cc io n e s re sum id as .
En d e te rm in a d o s a sp ec tos de la te rce ra , q u in ta y sép tim a fo rm as de re a liza c ió n , to d o s los p oc illos de d icha m ic ro p la ca co n tie n e n la m ism a ca n tid a d de tra n s fe c ta n te . En o tros a sp ec tos , los p oc illos co n tie n e n d ife re n te s c a n tid a d e s de tra n s fe c ta n te . D ich os d ise ñ o s p ueden in vo lu c ra r g ra d ie n te s de los tra n s fe c ta n te s en p ozos con tinu os , lo que es útil d u ra n te la o p tim izac ión de las re lac io ne s N /P con los á c id os nuc le icos . En o tros a sp ec tos , d e te rm in a d o s pozos pueden e s ta r vac íos , p o r e je m p lo , para la g en e rac ión de d ilu c io n e s en se rie a p a rtir de una m e zc la de com p le ja c ió n . Las F ig uras 1 a 4 ilus tran a d e m á s ta le s d ise ñ o s de ca n tid a d e s o rd e n a d a s de tra n s fe c ta n te s en el e je m p lo de una p laca de 96 poc illos .
En o tra s fo rm a s a d ic io n a le s de re a liza c ió n , los co m p le jo s de l d e riva d o de p o lia m in a de e sta inve nc ión con uno o m ás á c id o s n uc le icos se fo rm an , lio filizan y co m e rc ia liza n com o un p rod u cto com p le to . E s ta so lu c ió n o fre ce un g rado de in te g ra c ió n aún m a yo r en co m p a ra c ió n con los p rod u cto s co m e rc ia liza d o s a c tu a lm e n te . T a m b ié n b rinda una o p o rtu n id a d de c e n tra liz a r el co n tro l de ca lid ad de l p roducto , inc lu ida la fo rm a c ió n de pa rtícu la s , en el s itio del fa b rica n te . O tras ve n ta ja s de los co m p le jo s lio filizad os son su p ro lo n g a d a e s ta b ilidad de a lm a ce n a m ie n to y la ausen c ia de los a lco h o le s de ca d e n a co rta u tiliza d o s co m o d iso lve n te para las p o lia m in a s m o d ificad as .
Los co m p le jo s lio filiza d o s e n tre un d e riva d o de p o lia m in a y uno o m ás á c id o s n u c le ico s son de p a rticu la r ve n ta ja para a p lica c io n e s in v ivo q ue inc lu ye n la in ve s tig a c ió n con a n im a le s o para uso te ra p é u tico .
Los co m p le jo s lio filiza d o s se pueden p re p a ra r con cu a lq u ie ra de los p ro ce d im ie n to s g e n e ra le s 1 a 3 d e sc rito s a n te r io rm e n te con la inc lu s ió n de una e ta pa de lio filizac ió n y re h id ra ta c ió n d e sp u é s de la com p le ja c ió n .
En una fo rm a de re a liza c ió n e sp e c ífica , los co m p le jo s e n tre las p o lia m in a s m o d ific a d a s de la in ve n c ió n y uno o m ás á c id o s n u c le ico s se p rep a ran seg ún el s ig u ie n te p ro to co lo 4:
1) La po lia m ina m o d ifica d a se sum in is tra com o una so lu c ió n de 50 m M (b asa da en el con ten ido de n itróg en o ) en e ta no l de l 33 al 100% .
2 ) S e p re p a ra re g u la d o r de tra n s fe c c ió n q ue co m p re n d e d ih id ro g e n o fo s fa to de sod io de 10 m M e h id ró x id o de sod io de 3 mM.
3) La p o lia m in a m o d ifica d a se d ilu ye en re g u la d o r de tra n s fe cc ió n h asta una so lu c ió n de 1 m M.
4 ) El A R N ip se d ilu ye en re g u la d o r de tra n s fe cc ió n hasta A R N ip de 22 pM . D ado que el n úm e ro p ro m e d io de fo s fa to s en el A R N ip es de a p ro x im a d a m e n te 45, la co n ce n tra c ió n to ta l de fó s fo ro es de a p ro x im a d a m e n te 1 mM .
5) Las so lu c io n e s de tra b a jo de la p o lia m ina y A R N ip se com b in a n en una re lac ió n de 10+1, lo q ue da com o re su ltad o una re lac ió n N /P de 10 y una co n ce n tra c ió n de l A R N ip en la m e zc la de co m p le ja c ió n de 2 pM.
6 ) Los co m p le jo s se d iv id en o p c io n a lm e n te en a lícu o tas , se lio filizan , se se llan con un se llo he rm é tico y se a lm acen an .
7) Los co m p le jo s lio filiza d o s se re h id ra tan con agua.
8 ) S e a ña de n h asta 20 pl de l co m p le jo re h id ra ta d o p o r 100 pl de m e d io de cé lu la s cu ltiva d a s o los co m p le jo s re h id ra ta d o s se a d m in is tra n a un a n im a l o s e r hum ano .
En una fo rm a de re a liza c ió n e sp e c ífica , los c o m p le jo s e n tre las p o lia m in a s m o d ific a d a s de la in ve n c ió n y uno o m ás á c id o s n u c le ico s se p rep a ran seg ún el s ig u ie n te p ro to co lo 5:
1) La po lia m ina m o d ifica d a se sum in is tra com o una so lu c ió n de 56 m M (b a sa d a en el con ten ido de n itróg en o ) en e ta no l de l 33 al 100% .
2 ) S e p re p a ra re g u la d o r de tra n s fe c c ió n q ue co m p re n d e d ih id ro g e n o fo s fa to de sod io de 10 m M e h id ró x id o de sod io de 3 mM.
3) El A R N ip se d ilu ye en re g u la d o r de tra n s fe cc ió n hasta A R N ip de 18 pM . D ado q ue el n úm e ro m e d io de fo s fa to s en el A R N ip es de a p ro x im a d a m e n te 45, la co n ce n tra c ió n to ta l de fó s fo ro es de a p ro x im a d a m e n te 0.75 mM.
4 ) La s o lu c ió n de A R N ip se a ñ a d e d ire c ta m e n te a la p o lia m in a m o d ific a d a en una re lac ió n de 20+1 , lo q ue da co m o re su lta d o una re lac ió n N /P de 4 y una co n ce n tra c ió n de l A R N ip en la m e zc la de co m p le ja c ió n de 17 pM.
5) Los co m p le jo s se d iv id en o p c io n a lm e n te en a lícuo tas , se lio filizan , se se llan con un se llo he rm é tico y se a lm acen an .
6 ) Los co m p le jo s lio filiza d o s se re h id ra tan con agua.
7) S e a ña de n h asta 10 pl de l co m p le jo re h id ra ta d o p o r 100 pl de m e d io de cé lu la s cu ltiva d a s o los co m p le jo s re h id ra ta d o s se a d m in is tra n a un a n im a l o un se r hum ano .
La a d m in is tra c ió n de á c id o s n u c le ico s co m p le ja d o s a a n im a le s o se res h um a no s es con o c id a p o r los e xp e rto s en la té c n ica y los á c id os n u c le ico s co m p le ja d o s p ueden a d m in is tra rse p o r v ía s is té m ica o tó p ic a en las d os is re q u e rid a s para la ind icac ión e sp ec ífica . Las ca n tid a d e s de á c id o n uc le ico a d m in is tra d a s p ueden v a r ia r e n tre 0.1 |jg y 100 mg por kg de peso co rp o ra l y p ueden a d m in is tra rse una o v a r ia s v e ce s o en re g ím e n e s de d o s ifica c ió n co m p le jo s o in te rm ite n tes , com o una d os ifica c ió n d ia ria , una d os ifica c ió n cada dos d ías o 3 ve ce s p or sem ana, una ve z a la se m a n a o una v e z al m es o una co m b in a c ió n de d ich os re g ím e ne s .
D e sc rip c ió n de las fig u ra s
F ig u ra s 1-4: Las fig u ra s m u es tra n d ive rso s d ise ñ o s de tra n s fe c ta n te s d isp u e s to s en m ic ro p la ca s . Los n ú m e ro s en las m ic ro p la ca s e sq u e m á tica s d en o tan una can tida d de tra n s fe c ta n te en nm ol (b a sa d o en á to m os de n itró g e n o ) d e p o s ita d a en cada pocillo . Las fig u ra s to m a n com o e je m p lo p la cas de 96 p oc illos y co lo ca n los tra n s fe c ta n te s en d e te rm in a d a s filas ve rtica le s . S e e n tie n d e que se pueden d e riv a r fá c ilm e n te d ise ñ o s s im ila re s de esta e s tru c tu ra gen e ra l, p o r e je m p lo , d on de los p a tro n e s se o rg a n iza n h o rizo n ta lm e n te , con p o zo s m á s o m e no s va c ío s , y con uso p arc ia l de la p laca.
Fig. 1 C a n tid a d de tra n s fe c ta n te en nm ol c o lo ca d a en d e te rm in a d o s p o c illo s de una p laca de 96 poc illos , d is trib u c ió n un ifo rm e.
Fig. 2 C an tid a d de tra n s fe c ta n te en nm ol co lo ca d o en d e te rm in a d o s p oc illos de una p laca de 96 poc illos , para s im p lif ic a r la o p tim iza c ió n de la re lac ió n N/P.
Fig. 3 C an tid a d de tra n s fe c ta n te en nm ol c o lo ca d o en d e te rm in a d o s p o c illo s de una m ic ro p la ca , in c lu id o s los p oc illos v a c ío s para d ilu c io n e s en se rie de los co m p le jo s de tra n s fe cc ió n .
Fig. 4 C a n tid a d de tra n s fe c ta n te en nm ol co lo ca d o en d e te rm in a d o s p oc illos de una m ic ro p la ca , lo que fa c ilita una o p tim iza c ió n s im p le de la re lac ió n N /P y la d ilu c ión en se rie de los c o m p le jo s de tra n s fe cc ió n .
E je m p lo s
La inve n c ió n se ilus tra a ho ra a d ic io n a lm e n te con los s ig u ie n te s e je m p los .
E je m p lo 1 - M o d ifica c ió n de p o lia m in a s
La PEI line a l (b a se lib re ) q u e t ie n e una m a sa m o le c u la r m e d ia de 2 kD a o 25 kD a e ra de P o lysc ie n ce s , a rtíc u lo s de l ca tá lo g o 24313 y 23966 , re sp e c tiva m e n te . La PEI ra m ifica d a (b ase lib re) de un ta m a ñ o de 10 kDa era de A ld rich , a rtícu lo de c a tá lo g o 408727. Los p o lím e ro s se d iso lv ie ro n en e ta n o l a b so lu to a una c o n ce n tra c ió n de 250 m o no -m M ; es d ec ir, la co n ce n tra c ió n de n itró g e n o s fue 250 m M . Se d iso lv ie ro n b ro m u ro de p rop ilo , b ro m u ro de hex ilo , b ro m u ro de n on ilo y b ro m u ro de d o d e c ilo (to do s de S IG M A ) en e ta no l a b so lu to a 250 m M y é s te r m e tílico de l á c ido 3-b ro m o p ro p a n o ico , é s te r m e tílico de l á c id o 6-b ro m o h e xa n o ico , é s te r e tílico de l á c id o 8-b ro m o o c ta n o ico , é s te r m e tílico de l á c id o 11-b ro m o u n d e ca n o ic o o é s te r m e tílico de l á c id o 16 -b ro m o h e xa ca n o ico se d iso lv ie ro n en e ta n o l a b so lu to a 500 m M . S e u tilizó K 2C O 3 com o una so lu c ió n de 6 M en agua.
P ara la m o d ifica c ió n de p o lia m ina de 100 jm o l (b a sa d a en m o n ó m e ro ), se p ip e te a ro n las s ig u ie n te s so lu c io n e s p o r reacc ión :
400 j l de so lu c ió n de p o lia m in a
X j l de l é s te r de á c id o w -b ro m o c a rb o x ílic o
Y j l de l 1 -b ro m o a lca n o
C on e ta no l h as ta 650 j l
33 j l de K 2C O 3
T o d a s las m e zc la s se se lla ro n y se incu ba ro n d u ra n te 7 d ías a 60 °C en un horno . Luego , se a gre g a ro n 250 j l de N aO H de 2 N, las m e zc la s se se lla ro n n u e va m e n te y se incu ba ro n d u ra n te o tros 2 d ías a 60 °C. P ara las p rue b as in ic ia les , se to m a ro n p e q u e ñ a s a lícu o ta s de la m e zc la de re acc ión y se d ilu ye ro n 1: 100 en e ta no l al 75% /ag ua . Se tra n s fir ie ro n 42 j l de cada m u e s tra d ilu ida a una p laca de 96 p oc illos y se seca ron .
E je m p lo 2: co m p le ja c ió n con A R N ip
Las p o lia m in a s m o d ifica d a s se h id ra ta ron d u ra n te 20 m in en 50 j l de re g u la d o r pH 4 (H A c de 10 m M , N a H 2P O 4 de 10 m M , pH 4 con N aO H ). Se a ña d ie ro n 50 j l de un A R N ip (2 jM en re g u la d o r pH 4 ) y d e sp u é s de 2 -3 m in la so lu c ió n de A R N ip -p o lím e ro se llevó a pH 7 u sa nd o 10 j l de N aO H de 160 mM .
E je m p lo 3: cu ltivo de cé lu las
Las cé lu la s H eLa se cu ltiva ro n en 100 |jl de m edio R P M I1640 (P A A Lab G m b H ) su p le m e n ta d o con FC S al 10% (S ig m a -A ld rich ), so lu c ió n 1x P e n /S tre p (P A A lab G m b H ) (de a cu e rd o con las in s tru cc io n e s de l fa b ric a n te ) y se se m b ra ro n a una d en s id a d de 4000 cé lu la s /p o c illo en una p laca de 96 poc illos . La d en s id a d de las cé lu la s v iva s se m id ió u tilizan do el c o n ta d o r C o u n te ss C e ll (In v itrog en ). Las cé lu las se cu ltiva ron en una incu ba do ra h u m id ifica d a a 37 °C y C O 2 al 5%.
24 h d e spu és de la s iem b ra en p laca, a las cé lu las se su m in is tró un m e d io com p le to fre sco y se tra n s fe c ta ro n el m ism o día.
E je m p lo 4 - T ra n s fe cc ió n de cé lu las
Las cé lu las H eLa se tra n s fe c ta ro n con los co m p le jo s de p o lia m in a -A R N ip tra n s fir ie n d o 10 j l de m a te ria l com o se o b tu vo en el e je m p lo 2 p o r poc illo . E s ta a d ic ión da co m o re su lta d o una c o n ce n tra c ió n de 100 nM de PLK-1 A R N ip en el m e d io de cu ltivo ce lu la r. Las cé lu las se cu ltiva ro n d u ra n te tre s d ías a 37 °C y C O 2 al 5% en una incu ba do ra h u m id ifica d a sin c a m b ia r el m e d io de cu ltivo .
E je m p lo 5 - T ip o de A R N ip
El A R N ip u tiliza d o a q u í se d irige al gen P LK -1, cuyo p ro d u c to es un c o m p o n e n te e se n c ia l en el c ic lo ce lu la r. La re gu lac ió n d e c re c ie n te de la p ro te ína d iana da com o re su ltad o d e ten c ión m itó tica y apop tos is . P o r tan to , la tra ns fecc ión de cé lu las se m o n ito riza u tiliza n d o un e n sayo de v ia b ilid a d ce lu la r. El A R N ip que se d irige a PLK-1 y un A R N ip de co n tro l no re la c io n a d o usa do s en este d o cu m e n to fue ro n p u b lica d o s p or H a u p e n th a l e t al. (2007 ) Int J C ance r, 121, 206 -210.
E je m p lo 6 : e n sa yo de v ia b ilid a d
Se e n sa yó la v ia b ilid a d de las cé lu las d e sp u é s de tre s d ía s u tiliza n d o el e n sa yo C e ll T ite r B lue (C TB , P ro m e ga ). El m e d io se d e sca rtó y a las c é lu la s se su m in is tró un m e d io co m p le to nue vo su p le m e n ta d o con el re a c tivo C T B (5: 1, vo l/vo l). 90 -100 m in d e sp u é s de la incu ba c ió n a 37 °C y 5 % de C O 2 en una in cu b a d o ra h u m id ifica da , las m u e s tra s se tra n s fir ie ro n a una p la ca de f lu o re sc e n c ia n e g ra y el ca m b io de c o lo r de las m u e s tra s se m id ió m e d ia n te un le c to r de flu o re sce n c ia a E x560 n m /E m 590 n m . La seña l se n orm a lizó al 100% u sando cé lu la s no tra ta d a s cu ltivad as en la m ism a p laca de cu ltivo y al 0% con p oc illos en los q ue no se se m b ra ro n cé lu las .
E je m p lo 7 - T ra n s fe cc ió n con p o lia m in a s m o d ifica d a s
Las s ig u ie n te s ta b la s m u e s tra n el % de cé lu la s v iva s en re lac ió n con un c u ltivo s in tra ta r co m o una m é tr ica para la re g u la c ió n d e c re c ie n te de PLK-1 d e sp u é s de la tra n s fe cc ió n ce lu la r. En el e xp e rim e n to , se e n sa ya ro n en p ara le lo p o lia m in a s ca rb o x ila d a s , a lq u ila d a s y co -m o d ifica d a s .
T a b la 4 - T ra n s fe cc ió n u sa nd o p o lie tile n im in a s ca rb o x ila d a s
Eq. de 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8
c a rb o x ilo 1
C 3 105 109 108 105 106 106
C 6 103 110 111 111 112 108
P E I2k C 8 103 98 99 102 99 103 103
C11 98 96 75 98 108 114
C 16 23 93 99 102 103 104
C 3 94 99 101 101 102 102
C 6 96 99 104 107 105 105
P E I25 k C 8 102 98 100 105 102 105 105
C11 94 56 49 60 106 113
C 16 27 40 98 103 105 105
C 3 92 94 91 97 104 102
C 6 93 94 91 92 109 107
bPEI C 8 79 85 90 92 93 103 101
C11 44 43 30 67 102 105
C 16 56 106 104 106 107 107
1) e q u iva le n te s de é s te r m e tílico de l á c id o w -b ro m o c a rb o x ílic o a ñ a d id o s p or
n itró g e n o de l p o lím e ro PEI___________________________________________________
T a b la 5 - T ra n s fe cc ió n u sa nd o p o lie tile n im in a s a lq u ila d a s
Figure imgf000023_0001
Eq. a lq u ilo 2 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5 0.7
C 6 100 93 78 83 84 86 91 106
C9 101 107 109 99 72 74 67 107
C 12 114 108 92 66 73 112 68 112
C3 110 104 106 109 109 108 102 103 108
C 6 100 84 61 39 36 37 70 86
P E I25 k C9 95 93 91 88 55 64 78 87
C 12 93 89 77 62 87 90 102 109
C3 88 94 94 87 93 88 92 91 85
C 6 70 55 53 57 57 55 71 102 bPEI
C 8 45 43 55 55 78 79 99 104
C11 78 80 93 104 105 108 107 107
2) e q u iva le n te s de w -b ro m o a lca n o s a ñ a d id o s p o r n itró g e n o de l p o lím e ro PEI
T a b la 6 - T ra n s fe cc ió n u sa n d o p o lie tile n im in a s co -m o d ifica d a s
Eq de ca rb o x ilo 0 0.063 0.13 0.19 0.25 0.38 0.51 0.63 0.89
a lc a n o 3
C11- C3 93 99 97 98 102 100 106 106
C11- C 6 92 44 26 25 50 60 40 88
94
P E I2 k C 11 - C9 95 72 21 20 19 40 26 85
C 11 - C 12 98 73 24 18 16 12 35 104
C 11 - C3 90 90 90 90 82 64 87 100
C 11 - C 6
96 99 36 23 21 26 31 31 54
P E I25 k C 11 - C9 84 30 24 23 21 26 29 52
C 11 - C 12 72 42 22 24 20 23 22 2 Z
C 11 - C3 83 65 34 36 31 28 23 97
C 11 - C 6 48 39 27 29 25 # N V 52 97
bPEI 74
C 11 - C9 18 16 20 # N V # N V 4 Z 78 106
C 11 - C 12 34 26 29 28 22 26 50 104
3) e q u iva le n te s co m b in a d o s de é s te r m e tílico de l á c id o u > -b rom o-undecano ico y 1-b ro m o a lca n o a ñ a d id o s p o r n itró g e n o de l p o lím e ro PEI, re lac ió n de á c id o u> -b rom ocarboxílico a b ro m o a lca n o
1.25: 1
Las p o lie tile n im in a s u tiliza d a s a q u í son e se n c ia lm e n te tra n s fe c ta n te s in a c tivo s en las co n d ic io n e s del e nsayo , so lo la PEI ra m ifica d a m u e s tra una a c tiv id a d déb il. A lg u n a s de las m o d ifica c io n e s in d iv id u a le s con fra cc io n e s a lq u ilo o ca rb o x ilo p rod u ce n una a c tiv id a d m e jo ra d a y re d u cc io n e s de la v ia b ilid a d ce lu la r p o r d e b a jo de l 50 % e stán re sa ltad a s en las ta b la s . Las m o d ifica c io n e s co m b in a d a s con fra cc io n e s c a rb o x ia lq u ilo y a lq u ilo m u e s tra n una a c tiv ida d m ucho m a yo r en las cé lu la s y la m e jo ra es e v id e n te p ara una a m p lia g am a de D O S.
E je m p lo 8 : e fic ie n c ia de tra n s fe c c ió n en d ife re n te s tip o s de cé lu las
T ra n s fe c ta n te : Se m o d ifica ron 5 m m o l de PEI ra m ifica d a con é s te r m e tílico del á c ido 11 -b ro m o u n d e ca n o ico y b rom uro de non ilo com o se d e sc rib e en el e je m p lo 1, to d o s los d e m á s re a c tivo s se lleva ro n a esca la . El g rado de sus titu c ió n fu e de a p ro x im a d a m e n te el 40% , la re lac ió n e n tre los m o d ifica d o re s de a p ro x im a d a m e n te 1. La PEI m o d ifica d a se p u rificó a p a rtir de la m e zc la de re a cc ió n u sa nd o c ro m a to g ra fía de e xc lu s ió n p o r ta m a ñ o en N aO H de 10 m M , e ta no l al 70% .
C o m p le ja c ió n : Se p ro p o rc ion ó tra n s fe c ta n te p u rificado en una so lu c ió n que co n ten ía e tano l al 30% y N aO H de 10 mM . Los p o lím e ro s se d ilu ye ro n en re g u la d o r D (c itra to de 10 mM , a ju s ta d o a pH 5.0 con N a O H ) o re g u la d o r F (fo s fa to de 10 m M , a ju s ta d o a pH 6.5 con N a O H ) h asta una co n ce n tra c ió n de 4 m M . P ara o b te n e r una re lac ió n de NP de 10, se co m p le ja ro n 150 j l de los p o lím e ro s d ilu id o s con 150 j l de so lu c ió n de A R N ip de 10 jM (P lk1 o co n tro l re vu e lto ) en re g u la d o r D o F. Se h ic ie ron d ilu c io n e s en se rie de e stos co m p le jo s en los re sp e c tivo s re g u la d o re s en una p laca de 96 p oc illos para o b te n e r co n ce n tra c io n e s de 500 nM a 2 nM en las cé lu las .
T ra n s fe cc ió n : Las cé lu las se tra n s fe c ta ro n con los co m p le jo s de p o lím e ro -A R N ip tra n s fir ie n d o un vo lu m e n de 10 jl /p o c il lo de la "p la ca de co m p le ja c ió n " a la p laca de cé lu las (co lu m n a 1-10). Las cé lu las se cu ltiva ro n d u ra n te tre s d ías a 37 °C y C O 2 al 5% en una in cu b a d o ra h u m id ifica d a sin c a m b ia r el m e d io de cu ltivo .
E n s a yo de v ia b ilid a d : Se e n sa yó la v ia b ilid a d de las c é lu la s d e sp u é s de tre s d ía s u tiliz a n d o el e n sa yo C e ll T ite r B lue (C TB , P ro m e ga ). El m e d io se d e sca rtó y a las cé lu la s se su m in is tró un m e d io co m p le to re c ie n te su p le m e n ta d o con el re ac tivo C TB (120 j l , 5: 1, vo l/vo l). Para las cé lu las N IH 3T3, Ju rka t y T H P -1 , el re ac tivo de m e d io C TB se a ña d ió d ire c ta m e n te al m e d io ce lu la r, sin d esca rta rlo . 90 -100 m in (240 m in para cé lu las N IH 3T3, Ju rka t y T H P -1 ) d e sp u é s de la in cu b a c ió n a 37 °C y C O 2 al 5% en una in cu b a d o ra h u m id ifica da , las m u e s tra s se tra n s fir ie ro n a una p laca de flu o re sc e n c ia negra y el cam b io de c o lo r de las m u e s tra s se m id ió m e d ia n te un le c to r de flu o re sc e n c ia a E x560 n m /E m 590 n m .
T a b la 7 - L is ta de tip o s de cé lu las
Figure imgf000025_0001
El re n d im ie n to de la p o lia m in a m o d ifica d a se m id ió co m o E C 50, la co n ce n tra c ió n de A R N ip n ece sa ria para una inh ib ic ió n de l c re c im ie n to c e lu la r del 50% . En para le lo , se llevó a cabo la m ism a p rueba u tiliza n d o un A R N ip no re la c io n a d o y ta m b ié n se ca lcu ló el v a lo r de EC50. La re lac ió n se ñ a l-ru id o se d e fine luego com o la re lac ión entre E C 50 (co n tro l) y E C 50 (P LK -1 ).
T a b la 8 - T ra n s fe cc ió n y re lac ión se ñ a l/ru id o para una p o lia m in a m o d ifica d a
Figure imgf000025_0002
Los d a tos d e m u e s tra n una tra n s fe c c ió n m uy e fica z de l A R N ip a d e n tro de d ife re n te s tip o s de cé lu las , inc lu ido el c re c im ie n to c e lu la r en su sp e n s ió n . La re acc ión de tra n s fe c c ió n es m u y b ien to le ra d a p o r las cé lu la s con p ocos o cas i n in g ún s ign o de to x ic id a d in d ica d o p o r re la c io n e s se ñ a l/ru id o de 3 o m ás.
E je m p lo 9: e fic ie n c ia de tra n s fe cc ió n y re lac ión s e ñ a l/ru id o de re a c tivo s com e rc ia le s .
En el m ism o e xp e rim e n to q ue se d e sc rib e en el e je m p lo 8, se p rob a ron v a r io s tra n s fe c ta n te s c o m e rc ia le s en para le lo , los re su lta d o s de d ich a p rue b a se lis tan en la ta b la 9.
T ra n s fe c ta n te s co m e rc ia le s : In te rfe rin (P o lyp lu s , F ran c ia ), R ibo ce llin (B io C e llC h a lle n g e , A le m a n ia ), T ra n s IT -T K O (M irus , EE. UU .), S iP o rt N e o F X (A m b io n /L ife T e ch n o lo g ie s C orp .), D h a rm a fe c t (D h a rm a c o n /T h e rm o F ish e r) y L ip o fe c ta m in e R N A iM A X (In v itro g e n /L ife T e ch n o lo g ie s C o rp .) se m a n ip u la ro n y c o m p le ja ro n con Plk1 y s c r A R N ip de a cu e rd o con las ins tru cc io n e s del fab rican te . Se re a liza ro n d ilu c io n e s en serie en O p tim e m I (G ib co /L ife T e ch n o lo g ie s ) para o b te n e r co n ce n tra c io n e s de A R N ip de 100 nM a 2 nM en las cé lu las .
T a b la 9 - T ra n s fe cc ió n y re lac ió n se ñ a l/ru id o para re a c tivo s com e rc ia le s
Figure imgf000025_0003
Figure imgf000026_0002
A u n q u e la tra n s fe c c ió n pudo lo g ra rse en m u ch os casos, en p a rtic u la r con los re a c tivo s D h a rm a fe c t y R N A iM A X , las re la c io n e s se ñ a l/ru id o son su s ta n c ia lm e n te m ás b a jas a lo la rgo de la p rueba.
E je m p lo 10 - C a ra c te riza c ió n a na lítica
T ra n s fe c ta n te : Se m o d ifica ron 5 m m o l de PEI ra m ifica d a con é s te r m e tílico del á c ido 11 -b ro m o u n d e ca n o ico y b rom uro de n on ilo co m o se d e s c rib e en el e je m p lo 1, to d o s los d e m á s re a c tivo s se lle va ro n a e sca la . Se a ñ a d ie ro n re a c tivo s a lq u ila n te s p ara a lc a n z a r un g rad o de su s titu c ió n de a p ro x im a d a m e n te el 40% , la re lac ió n e n tre los m o d ifica d o re s de a p ro x im a d a m e n te 1. La PEI m o d ifica d a se purificó a p a rtir de la m ezc la de reacc ión usa nd o c ro m a to g ra fía de exc lus ión p o r ta m a ñ o en N aO H de 10 m M , e ta no l al 70% .
A n á lis is : La co n ce n tra c ió n e s tim a d a de PEI fue de a p ro x im a d a m e n te 60 m M (b a sa d a en el m o n ó m e ro ) en e ste punto. Se m e zc ló 1 m l de la so lu c ió n con 0.5 m l de á c id o m e to x ia cé tico 100 m M y 25 pl de N aO H de 2N. La m e zc la se secó al vac ío , se d iso lv ió en 700 pl de C D 3 O D y se a na lizó m e d ia n te 1H R M N. S eñ a les : á c ido m e to x ia cé tico 4.0 ppm ; e s tru c tu ra de bPEI 2.4 -2.7 p p m , C H 3 te rm in a l de la fra cc ió n de a lq u ilo 0.8 p p m y C H 2 -C O O H te rm in a l del ca rb o x ia lq u ilo 2.1ppm.
T a b la 10 - A n á lis is de l e sp e c tro de 1H RM N
Figure imgf000026_0003
E je m p lo 11: M ás d e riva d o s de p o lia m in a s
Las s ig u ie n te s p o lia m in a s se so m e tie ro n a la re acc ión de m o d ifica c ió n d e sc rita en el e je m p lo 1:
T a b la 11: P o lia m in a s
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
Los p o lím e ro s se d iso lv ie ro n en e ta no l a b so lu to a una co n ce n tra c ió n de 250 m o no -m M ; es dec ir, la c o n ce n tra c ió n de n itró g e n o fue 250 mM .
Los co m p u e s to s de c a rb o x ilo p ara la m o d ifica c ió n de p o lia m in a s se e lig ie ro n de la s ig u ie n te ta b la 12 y se d iso lv ie ro n en e ta no l a b so lu to a una c o n ce n tra c ió n de 250 mM :
T a b la 12: C o m p u e s to s de ca rb o x ilo para la m o d ifica c ió n de p o lia m ina s.
Figure imgf000027_0002
Los co m p u e s to s h id ró fo b o s p ara la m o d ifica c ió n de las p o lia m in a s se e lig ie ro n de la s ig u ie n te ta b la 13 y ta m b ié n se d iso lv ie ro n en e ta no l a b so lu to a una c o n ce n tra c ió n de 250 mM :
T a b la 13: C o m p u e s to s h id ró fo b o s para la m o d ifica c ió n de p o lia m ina s.
Figure imgf000027_0003
P ara la m o d ifica c ió n de 100 |jm o l de p o lia m in a (b a sa d a en m o n ó m e ro ), se p ip e te a ro n las s ig u ie n te s so lu c io n e s p o r reacc ión :
- 400 j l de so lu c ió n de p o lia m ina
- X j l del é s te r de á c id o w -b ro m o c a rb o x ílic o
- Y j l del c o m p u e s to de h id ro ca rb u ro b rom ad o
- E tan o l a b so lu to h asta 650 j l
- 33 j l de K2C O 3
Las ca n tid a d e s co m b in a d a s de X Y se e lig ie ron para un g rad o de sus titu c ió n de los g rup o s a m ino de la po lia m ina e n tre 0 y 100% y X e Y se s e le cc io n a ro n a d ic io n a lm e n te para c o m p le m e n ta rs e e n tre s í y d a r d ive rsa s re la c io n e s C /A e n tre 0 (so lo su s titu ye n te s h id ró fo b o s ) y el uso e xc lu s ivo del su s titu ye n te ca rbo x ilo , ind icad o com o C /A = 99 en las ta b la s s igu ien tes .
T o d a s las m e zc la s se se lla ro n y se incu ba ro n d u ra n te 7 d ías a 60 °C en un horno . Luego , se a gre g a ro n 250 j l de N aO H de 2 N, las m e zc la s se se lla ro n n u e va m e n te y se incu ba ro n d u ra n te o tros 2 d ías a 60 °C. P ara las p rue b as in ic ia les , se to m a ro n p eq ue ña s a lícu o ta s de la m e zc la de re acc ión y se d ilu ye ro n 1 :100 en e ta no l al 75% /a g u a . Se tra n s fir ie ro n 42 j l de cada m u e s tra d ilu ida a una p laca de 96 p oc illos y se seca ron .
E je m p lo 12: T ra n s fe cc ió n de A R N ip u tiliza n d o p o lia m in a s m od ificad as .
Las p o lia m in a s m o d ifica d a s de l e je m p lo 11 se co m p le ja ro n con A R N ip d ir ig id o a PLK-1 y sus p ro p ie d a d e s de tra n s fe cc ió n se a na liza ro n com o se d e scribe en los e je m p lo s 2 a 6 con la e xce pc ión del uso de re g u la d o r F (N a H 2 P O 4 de 10 m M , sa ca ro sa de 225 m M , pH 7.2 (a ju s ta d o con N a O H )) para la c o m p le ja c ió n y tra n s fe cc ió n de A R N ip .
Los re su lta d o s de las re a cc io n e s de tra n s fe cc ió n se d esc rib e n en la ta b la 14 para p o lia m in a s m o d ifica d a s d on de la fra cc ió n h id ró fu g a es un a lq u ílico a lifá tico o c íc lico y en la ta b la 15 d onde d icho g rup o h id ró fo b o es un a rilo o a lqu ila rilo . T a b la 14: tra n s fe c c ió n de A R N ip u tiliza n d o d e te rm in a d a s p o lia m in a s en las que el g rupo lipo fílico es un a lq u ilo . Los n ú m e ro s m ás b a jos ind ican una tra n s fe cc ió n e x ito sa de las cé lu la s y e stán re sa lta d o s para va lo re s <= 50.
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Los d a tos de esta ta b la 14 d e m u e s tra n que m u ch as de las p o lia m ina s m o d ifica d a s son ca p a ce s de tra n s fe c ta r cé lu las con A R N ip . El g rup o h id ró fo b o se se le cc io n ó de fra cc io n e s a lq u ilo a lifá tico s o c íc lico s y a m b o s d ie ron com o re su ltad o la fo rm a c ió n de v e h ícu lo s a c tivo s in d e p e n d ie n te m e n te de sus d ife re n c ia s e stru c tu ra les .
Los v e h ícu lo s a c tivo s se fo rm a ro n a p a rtir de p o lia m in a s que te n ía n pesos m o le cu la re s m uy d ife re n te s y una a rq u ite c tu ra d ife re n te (lin ea l o ra m ifica d a ). T a m b ié n es e v id e n te a p a rtir de los d a tos que los co m p o n e n te s ca rb o x ilo e h id ró fo b o a c tú an s in é rg ica m e n te , m ie n tra s q ue las m o d ific a c io n e s in d iv id u a le s co n tr ib u ye n poco, si es q ue lo hacen , a las p ro p ie d a d e s de l veh ícu lo .
T a b la 15: tra n s fe cc ió n de A R N ip u tiliza n d o d e te rm in a d a s p o lia m in a s en las que el g rup o h id ró fo b o es un arilo , a lq u ila rilo o he te roa rilo .
Figure imgf000029_0002
Los d a to s de la ta b la 15 d e m u e s tra n q ue m u ch a s de las p o lia m in a s m o d ifica d a s son ca p a ce s de tra n s fe c ta r cé lu las con A R N ip . El g rup o h id ró fob o se se le cc io n ó entre fra cc io n e s a rilo o a lq u ila rilo y to d o s d ie ron com o re su lta d o la fo rm a c ió n de v e h ícu lo s a c tivo s in d e p e n d ie n te m e n te de sus d ife re n c ia s e stru c tu ra les .
Los v e h ícu lo s a c tivo s se fo rm a ro n a p a rtir de p o lia m in a s que te n ía n pesos m o le cu la re s m uy d ife re n te s y una a rq u ite c tu ra d ife re n te (lin ea l o ra m ifica d a ). T a m b ié n es e v id e n te a p a rtir de los da tos q ue los c o m p o n e n te s c a rb o x ilo e h id ró fo b o a c tú an s in é rg ica m e n te , m ie n tra s q ue las m o d ific a c io n e s in d iv id u a le s co n tr ib u ye n poco, si es q ue lo hacen , a las p ro p ie d a d e s de l veh ícu lo .
E je m p lo 13: T ra n s fe cc ió n de p lá sm ido s
C u ltivo de cé lu las : Las cé lu las H eLa se cu ltiva ron en 100 pl de m e d io R P M I1640 (P A A Lab G m b H ) su p le m e n ta d o con FC S al 10% (S ig m a -A ld rich ), so lu c ió n 1x P en /S trep (P A A lab G m b H ) (de a cu e rd o con las in s tru cc io n e s de l fa b rica n te ) y se sem b ra ro n a 8000 c é lu la s /p o c illo de una p laca de 96 poc illos . Las cé lu las se cu ltiva ron en una incu ba do ra h u m id ifica d a a 37 °C y C O 2 al 5% . 24 h d e sp u é s de la s ie m b ra en p laca, a las cé lu la s se su m in is tró m e d io co m p le to fre sco y se tra n s fe c ta ro n el m ism o día.
C o m p le ja c ió n : S e p ro p o rc io n a ro n p o lia m in a s en p la cas de 96 p oc illos , cad a poc illo co n te n ía p o lím e ro de 3 m M en e ta n o l al 70% , se p ro p o rc io n ó A D N p lá sm id o (p C M V -L u c ) com o so lu c ió n m a dre de 0.011 p g /p l en re g u la d o r F (N a H 2 P O 4 de 10 m M , sa ca ro sa de 225 m M , pH 7.2 (a ju s ta d o con N aO H )). S e a co m p le ja ro n 10 pl de p o lia m in a s con 90 pl de A D N -p lá sm id o m e d ia n te m e zc la . 10 -15 m in u to s d e sp u é s de la c o m p le ja c ió n , se u sa ro n 10 pl de la m e zc la para la tra n s fe cc ió n de cé lu la s H eLa, lo q ue d io com o re su lta d o 100 ng de A D N p lá sm ido /po c illo .
D e te rm in a c ió n de la e xp re s ió n de luc ife rasa : Las cé lu las se p rep a ra ron para la cu a n tifica c ió n de luc ife rasa 24 h d e sp u é s de la tra n s fe cc ió n . P o r tan to , las p la cas de cu ltivo se e q u ilib ra ro n a te m p e ra tu ra a m b ie n te d u ra n te a prox . 10 m in u tos . D e sp u é s de d e s c a rta r el m ed io , las c é lu la s se la va ro n una v e z con P BS. Las cé lu la s se lisa ron u sa n d o 100 pl de 1 xB e etle Lys is Ju ice (P JK G m bH , A le m a n ia ) y se p rep a ra ron para la m e d ic ión de la lu m in isce n c ia 5 m in u tos m ás ta rde . La e xp re s ió n de lu c ife ra sa se cu a n tif icó u sa nd o un le c to r de p la cas de lu m in isce n c ia T E C A N .
E je m p lo 14: R e su lta d o s de la tra n s fe cc ió n de p lá s m id o s
Las p o lia m in a s m o d ifica d a s del e je m p lo 11 se co m p le ja ro n con el p lá sm ido y se e nsaya ro n para d e te rm in a r sus p ro p ie d a d e s de tra n s fe cc ió n co m o se d e sc rib e en el e je m p lo 13.
Los re su lta d o s de las re a cc io n e s de tra n s fe cc ió n se d esc rib e n en la ta b la 16 para p o lia m in a s m o d ifica d a s d on de la fra cc ió n lipo fílica es un a lq u ilo a lifá tico o c íc lico ; en la ta b la 17 d on de d ich o g rup o lipo fílico es un a rilo o a lq u ila rilo y en la ta b la 18 d o n d e la fra cc ió n de c a rb o x ilo co m p re n d e un a rilo o a lq u ila rilo .
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Los d a tos de e sta ta b la 16 d e m u e s tra n q ue m u ch a s de las p o lia m in a s ca rb o x ila d a s , co n ve rtid a s en h id ró fug as , son ca p a ce s de tra n s fe c ta r un p lá sm id o d e n tro de cé lu las . El g rup o h id ró filo se se le cc io n ó de fra cc io n e s a lq u ilo a lifá tico o c íc lico y a m ba s d ie ron co m o re su lta d o la fo rm a c ió n de ve h ícu lo s a c tivo s in d e p e n d ie n te m e n te de sus d ife re n c ia s e s tru c tu ra le s .
Los v e h ícu lo s a c tivo s se fo rm a ro n a p a rtir de p o lia m in a s q ue tie n e n p esos m o le cu la re s m u y d ife re n te s , a rq u ite c tu ra d ife re n te (lin ea l o ra m ifica d a ) y q u ím ica d ife re n te (p o lie tile n im in a s , p o lia lila m in a , p o liv in ila m in a ). T a m b ié n es e v id e n te a p a rtir de los d a tos que los co m p o n e n te s ca rb o x ilo e h id ró fo b o a c túan s in é rg ica m e n te , m ie n tra s q ue las m o d ifica c io n e s in d iv id u a le s co n trib u ye n poco, si es que lo hacen , a las p ro p ie d a d e s de l ve h ícu lo .
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Los d a tos de e sta ta b la 17 d e m u e s tra n q ue m u ch a s de las p o lia m in a s ca rb o x ila d a s , co n ve rtid a s en h id ró fug as , son c a p a ce s de tra n s fe c ta r c é lu la s con un p lá sm ido . El g rup o h id ró fo b o se s e le cc io n ó e n tre fra cc io n e s a rilo o a lq u ila rilo y to d a s d ie ron com o re su lta d o la fo rm a c ió n de v e h ícu lo s a c tivo s in d e p e n d ie n te m e n te de sus d ife re n c ia s e s tru c tu ra les .
Los v e h ícu lo s a c tivo s se fo rm a ro n a p a rtir de p o lia m in a s q ue tie n e n p esos m o le cu la re s m u y d ife re n te s , a rq u ite c tu ra d ife re n te (lin e a l o ra m ifica d a ) y q u ím ica d ife re n te (p o lie tile n im in a s , p o lia lilm in a ). T a m b ié n es e v id e n te a p a rtir de los d a to s q ue los co m p o n e n te s ca rb o x ilo e h id ró filo a c tú an de fo rm a s in é rg ica , m ie n tra s q ue las m o d ifica c io n e s in d iv id u a le s co n trib u ye n poco, si es q ue lo hacen , a las p ro p ie d a d e s de l ve h ícu lo .
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Los d a tos de e sta ta b la 18 d e m u e s tra n q ue m u ch a s de las p o lia m in a s ca rb o x ila d a s , co n ve rtid a s en h id ró fug as , son ca p a ce s de tra n s fe c ta r cé lu las con un p lá sm ido . El g rupo ca rb o x ilo se se le cc io n ó de á c id os ca rb o x ílico s que co m p re n d e n fra cc io n e s arilo o a lq u ila rilo y to d a s d ie ron com o re su lta d o la fo rm a c ió n de v e h ícu lo s a c tivos in d e p e n d ie n te m e n te de sus d ife re n c ia s e s tru c tu ra le s .
Los v e h ícu lo s a c tivo s se fo rm a ro n a p a rtir de p o lím e ro s q ue t ie n e n p esos m o le c u la re s m u y d ife re n te s o a rq u ite c tu ra d ife ren te . T a m b ié n es e v id en te a p a rtir de los d a tos que los co m p o n e n te s ca rbo x ilo e h id ró fob o a c túan s iné rg ica m e n te , m ie n tra s q ue las m o d ifica c io n e s in d iv id u a le s co n trib u ye n poco, si es q ue lo hacen , a las p ro p ie d a d e s de l veh ícu lo . E je m p lo 15: S ín te s is de d ive rsa s o lig o sp e rm in a s ca rb o x ila d a s , h id ro fo b iza d a s y h o m ó lo g o s de las m ism as.
A p a rtir de 1,4 -d ia m in o b u ta n o d isp o n ib le c o m e rc ia lm e n te (1 ) el in te rm e d io cen tra l 21 se o b tuvo en una s ín tes is de tres pasos.
E sq u e m a 1: R uta s in té tica h ac ia el in te rm e d io cen tra l 21.
Figure imgf000038_0001
El co m p u e s to 2 es fá c ilm e n te a cce s ib le m e d ia n te la a d ic ión de a c rilo n itr ilo al 1,4 -d iam in o b u tano (1 ) en el p a s o a. D e sp u é s de esto , se in tro d u je ro n d os g ru p o s p ro te cc ió n b oc en la m o lécu la , lo q ue co n d u jo al co m p u e s to 3. El n itrilo 3 luego se re du jo con h id ró ge n o , en p re se n c ia de un e xce so de b u tilam in a , para d a r 21.
E sq u e m a 2: La re acc ión de o lig o m e riza c ió n
P ara la fo rm a c ió n de o lig o sp e rm in a s , se h izo re a c c io n a r 21 con 1,4 -d ic lo ro b u t-2 -in o en co n d ic io n e s de a lq u ila c ió n e s tá n d a r para d a r el d ím e ro 41, el tr ím e ro 42 y una se rie de o lig ó m e ro s m ás largos:
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D e sa fo rtu n a d a m e n te , la fra cc ió n N -C H 2-C = C no es e s ta b le y es s u sce p tib le de esc is ión . P o r tan to , el tr ip le e n la ce de los co m p u e s to s 41, 42 o los o lig ó m e ro s su p e rio re s se re du je ron se g u id o p o r la e lim in a c ió n de los g ru p o s Boc.
Se lleva ron a cab o re acc io n e s a n á lo g a s u tiliza n d o 1,5 -d ia m in o p e n ta n o o 1,6 -d ia m in o h e xa n o co m o m a te ria l de partida .
1, d an do lu g a r a una se rie de h o m ó lo g o s de o lig o sp e rm in a o p o lia lq u ile n im in a s en las q ue la v a r ia b le x q ue d e n o ta el e sp a c ia m ie n to e n tre los g ru p o s n itró g e n o o sc ila e n tre 2 y 3, 2 y 4, o 2 y 5.
A d e m á s de la fo rm a c ió n de los h o m ó lo g o s de o lig o sp e rm in a , el ta m a ñ o de los s u s titu ye n te s h id ró fo b o s se va rió s is te m á tic a m e n te e n tre bu tilo (co m o se ilus tra en e ste e je m p lo ), e tilo , h ex ilo y d ec ilo , p ro d u c ie n d o una m a triz de d ife re n te s p o lia lq u ile n im in a s q ue tie n e n v a r ia c io n e s en sus g ru p o s a lq u ile n o , sus s u s titu ye n te s h id ró fo b o s y su g rad o de o lig o m e riza c ió n .
Las o lig o sp e rm in a s y sus h om ó log os (en co n ju n to las p o lia lq u ile n im in a s de este e je m p lo ) se d esa la ro n usa nd o S e p h a d e x G 25 y los o lig ó m e ro s in d iv id u a le s se p u rifica ron u sa nd o c ro m a to g ra fía de in te rca m b io ión ico en C M -S e p h a ro s e F a s t F lo w y S P -S e p h a ro se F a s t F low . Las o lig o sp e rm in a s se e lu yen de la c o lu m n a de in te rca m b io ión ico según su g rad o de p o lim e riza c ió n y se ind ican con n ú m e ro s ro m a no s I a X II, en d on de los n úm e ro s m ás a ltos re p re se n ta n o lig ó m e ro s m ás la rgos. El g rad o de p o lim e riza c ió n se d e te rm in ó con e sp e c tro sco p ía de m asas y o sc iló d esde trím e ro s h as ta a p ro x im a d a m e n te e ico sá m e ro s .
Las fra cc io n e s q ue con ten ía n los o lig ó m e ro s se p a ra d o s se e x tra je ro n de l re g u la d o r u sa nd o d ic lo ro m e ta n o en co n d ic io n e s bás icas , se se ca ron al va c ío y se d iso lv ie ro n en e ta no l a bso lu to a una co n ce n tra c ió n de n itróg en o de 250 mM .
En un paso p os te rio r, se d e riva tiza ro n m u e s tra s de 50 p m o l de cad a o lig ó m e ro con 0, 10, 15, 20 o 25 p m o l de los á c id o s w -b ro m o c a rb o x ílic o s C3, C6, C8, C11 y C 16 u tiliza n d o el p ro to co lo g e n e ra l de l e je m p lo 11.
E jem p lo 16: T ran sfe cc ió n de cé lu la s u sa n d o c a rb o x il-h id ro ca rb u ro -o lig o s p e rm in a s La p rueba de tra n s fe cc ió n de las d ive rsa s o lig o sp e rm in a s ca rb o x ila d a s , y co n ve rtid a s en h id ró fug as , y sus re sp e c tivo s h o m ó lo g o s se re a lizó u tiliza n d o el A R N ip que se d irige a P LK -1, las cé lu las H eLa y las co n d ic io n e s y e nsa yo s de cu ltivo c e lu la r d e sc rito s en los e je m p lo s 2 a 7.
La s ig u ie n te ta b la 19 es una lis ta de los re su lta d o s o b te n id o s u sa n d o las c a rb o x il-h id ro ca rb u ro -o lig o s p e rm in a s com o tra n s fe c ta n te s para A R N ip .
T a b la 19: Inh ib ic ión de la v ia b ilid a d c e lu la r de las cé lu la s H eLa tra s la tra n s fe c c ió n de un A R N ip c ito tó x ico u sando o lig o sp e rm in a s ca rb o x ila d a s , c o n ve rtid a s en h id ró fug as . Los n ú m e ro s x ind ican las lo n g itu d e s de o sc ila c ió n de las u n id a d e s de a lq u ile n o seg ún la fó rm u la (1), los n ú m e ro s ro m a n o s para los o lig ó m e ro s ind ican el g rad o de p o lim e riza c ió n de los o lig ó m eros . Los n ú m e ro s de la ta b la m u e s tra n la v ia b ilid a d c e lu la r re s ta n te , los n ú m e ro s ba jos ind ican una tra n s fe c c ió n e fic ien te .
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Los d a tos de e sta ta b la 19 d e m u e s tra n q ue m u ch a s de las o lig o sp e rm in a s ca rb o x ila d a s , co n ve rtid a s en h iid ró fug as , son ca p a ce s de tra n s fe c ta r cé lu las . Los v e h ícu lo s a c tivos se fo rm a ro n a p a rtir de o lig o sp e rm in a s que te n ía n pesos m o le cu la re s m uy d ife re n te s y e ran de d ife re n te a rq u ite c tu ra m o le cu la r ya q ue se hab ía va r ia d o el e sp a c ia m ie n to entre los á to m o s de n itrógeno. T a m b ié n es ev id en te a p a rtir de los da tos que los co m p o n e n te s ca rbo x ilo e h id ró fo b o s actúan s in é rg ica m e n te , ya que las o lig o sp e rm in a s a lq u ila d a s m u e s tra n poca o n in g un a ac tiv ida d en la tra n s fe cc ió n ce lu la r m ie n tra s q ue la in tro d u cc ió n de las fra cc io n e s c a rb o x ilo co n d u ce a e s tru c tu ra s p o rta d o ra s activas .
E jem p lo 17: P a rtícu la s n e u tra s y a n ió n ica s de p o lia m in a s m o d ifica d a s y á c id o n u c le ico S e p rep a ra ron re g u la d o re s que co n te n ía n sa ca ro sa de 280 m M , d ih id ro g e n o fo s fa to de sod io de 10 m M e h id ró x id o de sod io de 3 m M (pH 6.5 ) o h id ró x id o de sod io de 7 m M (pH 7.2). Se p rep a ra ro n so lu c io n e s m a dre de l A R N ip de l e je m p lo 5 en los re g u la d o re s p ara o b te n e r 10 v e ce s las c o n c e n tra c io n e s lis ta d a s en la ta b la 20.
La p o lia m in a m o d ifica d a del e je m p lo 8 se p ro p o rc io n ó co m o una so lu c ió n q u e te n ía una co n c e n tra c ió n de p o lia m in a m o d ifica d a de 56 m M (co m o m o n o -m M ) en e ta n o l al 70% , h id ró x id o de so d io de 10 m M ; S e m e zc la ro n rá p id a m e n te 50 |jl de d icha so lu c ió n de p o lia m in a m o d ifica d a con 4.1 m l de c u a lq u ie r re gu lad o r. Se d e te rm in a ro n las fo rm a s co lo id a le s y el ta m a ñ o de p a rtícu la y el p o te n c ia l ze ta de la fa se d isp e rsa u sa n d o M A L V E R N Z e ta s iz e r 3000H S A .
Se m e zc la ron rá p id am en te 900 j l de las d ive rsas so lu c io n e s de A R N ip con las d isp e rs io n e s de la p o lia m ina m o d ifica d a en re g u la d o r para o b te n e r las re la c io n e s N /P lis ta da s en la ta b la 20 y se re g is tra ro n de nue vo el ta m a ñ o y el p o ten c ia l ze ta .
T a b la 20: T a m a ñ o y p o te n c ia l ze ta de co m p le jo s e n tre una p o lia m in a m o d ifica d a y A R N ip que tie n e n d ive rsas p ro p o rc io n e s de N/P.
Figure imgf000040_0001
O b s e rva c io n e s g e n e ra le s : las p o lia m in a s m o d ifica d a s se d e sa rro lla n a p a rt ir de p a rtícu la s q ue tie n e n un ta m a ñ o de a p ro x im a d a m e n te 500 nm y un p o ten c ia l ze ta cas i neutro. La a d ic ión de p e q u e ñ a s ca n tid a d e s de A R N ip q ue da com o re su lta d o re la c io n e s N /P de 12 o m ás no a lte ra su s ta n c ia lm e n te el ta m a ñ o o la ca rga su p e rfic ia l de las p artícu la s . Sin e m ba rg o , la a d ic ión de m a yo re s ca n tid a d e s de A R N ip co n d u jo a la fo rm a c ió n de p a rtícu la s a n ió n ica s de a p ro x im a d a m e n te el m ism o ta m a ñ o . C a n tid a d e s in te rm e d ia s de A R N ip con du cen a un p o ten c ia l ze ta in te rm e d io y a la fo rm a c ió n de a gre g ad os . El co m p o rta m ie n to de los s is te m a s p uede e n te n d e rse com o la in te ra cc ió n de dos p o lie le c tro lito s de ca rga o pu es ta , d on de la a g re g ac ión se p ro d u ce en las co n d ic io n e s de n e u tra liza c ió n de ca rga d e sc rita s en E n d e rt e t al. (2004 ) "N a n o ca p s u le s fro m lip o so m a l te m p la te s", págs. 238 -248 en C a rrie r B ase d Drug D e live ry , O x fo rd U n ive rs ity P ress.
O b se rva c io n e s e sp e c ífica s : A pH 6.5, la inve rs ión de ca rga h ac ia el e s ta do co m p le ta m e n te a n ió n ico re qu ie re una N /P de 4, m ie n tra s que el m ism o p ro ce d im ie n to se co m p le ta a N /P 6 a un pH de 7.2. Esta o bse rva c ión está en con son an c ia con la ion iza c ió n m ás fu e rte de las a m in a s de la e s tru c tu ra de PEI a va lo re s de pH m ás bajos.
E je m p lo 18: L io filiza c ió n de tra n s fe c ta n te s
La p o lia m in a m o d ifica d a de l E je m p lo 8 se p ro p o rc io n ó com o so lu c ió n en e ta no l al 70% , h id ró x id o de sod io de 10 mM con una c o n ce n tra c ió n de n itróg en o de 56 m M . S e inye cta ro n rá p id a m e n te d ive rsa s ca n tid a d e s de la so lu c ió n tra n s p a re n te del tra n s fe c ta n te en una fase h o m o g é n e a q ue co m p re n d ía saca ro sa de 280 m M y fos fa to de sod io de 20 m M a ju s ta d o s con N aO H a pH 6.5 de m o do que la co n ce n tra c ió n fina l de tra n s fe c ta n te fu e ra 0.15 m M o 0.03 m M . Los ta m a ñ o s m e d io s de p a rtícu la s y p o lid isp e rs id a d e s fue ro n 389 nm (PI de 0.09 ) y 332 nm (PI de 0.11 ) para las m u es tra s q ue te n ía n n itró g e n o de 0.15 m M o 0.03 mM , re sp e c tiva m e n te .
Se co lo ca ro n a lícu o ta s de 100 pl cad a una en p la ca s de 96 p oc illos . Los m a te ria le s se co n g e la ro n d u ra n te 4 h o ra s a -18 °C y se tra n s fir ie ro n a un lio filiza d o r. La lio filiz a c ió n se p ro d u jo a una p res ió n co n s ta n te de 0.12 m b a r d u ra n te 20 horas . D e sp u é s de sa ca rla s de la cá m a ra de lio filizac ió n , las p la cas se se lla ro n rá p id a m e n te u sa nd o un se lla d o r té rm ico .
A l d ía s igu ien te , se ro m p ie ro n los se llo s y las m u e s tra s se re h id ra ta ro n con agua. El p ro d u c to lio filizad o se d iso lv ió rá p ida y h o m o g é n e a m e n te . El ta m a ñ o de p a rtícu la y la p o lid isp e rs id a d se d e te rm in a ro n com o a n te rio rm e n te .
D en tro de los 15 m in u tos d e sp u é s de c o m e n z a r la re h id ra ta c ió n , los tra n s fe c ta n te s co lo id a le s re su lta n te s te n ía n un ta m a ñ o de p a rtícu la m e d io de 423 nm (P I 0.13 ) cu a n d o se co lo ca ro n 15 n m o l de tra n s fe c ta n te en cad a poc illo . Los tra n s fe c ta n te s c o lo id a le s re su lta n te s te n ía n un ta m a ñ o de p a rtícu la m e d io de 356 n m (PI 0.12 ) cu a n d o se co lo ca ro n 3 nm ol de tra n s fe c ta n te en cad a pocillo .

Claims (15)

R E IV IN D IC A C IO N E S
1. U so de un d e riva d o de p o lia m in a para la tra n s fe cc ió n de p o lia n io n e s a d e n tro de cé lu las , c o m p re n d ie n d o d icha p o lia m ina :
una fra cc ió n de p o lia m in a q ue co m p re n d e una p lu ra lida d de g ru p o s am ino ;
una p lu ra lida d de s u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s que co m p re n d e n un g rup o ca rb o x ilo u n ido m e d ia n te un e n la za d o r h id ró fo b o a g ru p o s a m ino de d icha fra cc ió n de p o lia m ina , en d on de cada uno de d ich os su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s co m p re n d e de 6 a 40 á to m o s de ca rbo no , y cad a uno de d ich o s e n la za d o re s h id ró fo b o s p u e d e c o m p re n d e r de 1 a 3 h e te ro á to m o s se le cc io n a d o s de O, N, y S, en d on de d ich os su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s son g ru p o s c a rb o x ih id ro ca rb ilo o g ru p o s c a rb o x ih e te ro h id ro ca rb ilo , c o m p re n d ie n d o e s to s ú ltim o s d ich os de 1 a 3 h e te ro á to m o s; y
una p lu ra lida d de s u s titu ye n te s h id ró fo b o s u n id os a g ru p o s a m ino de d icha fra cc ió n de p o lia m ina , en d on de cada uno de d ich os s u s titu ye n te s h id ró fo b o s co m p re n d e al m e no s 2 á to m os de ca rb o n o y puede c o m p re n d e r de 1 a 3 h e te ro á to m o s se le cc io n a d o s e n tre O, N, y S s ie m p re que d ich o su s titu ye n te h id ró fo b o te n g a al m enos 6 á to m os de ca rb o n o , en d on de d ich o s s u s titu ye n te s h id ró fo b o s son g ru p o s h id ro ca rb ilo o g ru p o s h e te ro h id ro ca rb ilo , co m p re n d ie n d o e stos ú ltim o s d ich os de 1 a 3 h e te ro á to m o s, s ie m p re q ue d ich o uso no co n s titu ya un p ro ce d im ie n to de tra ta m ie n to de l cu e rp o h u m a n o o a n im a l p o r m e d io de te rap ia .
2. El uso según la re iv in d ica c ió n 1, en d o n d e cad a uno de d ich o s s u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s co m p re n d e de 6 a 20 á to m o s de ca rb o n o , y p re fe rib le m e n te de 8 a 16 á to m o s de ca rb o n o , y /o en d on de ca d a uno de d ich o s s u s titu ye n te s h id ró fo b o s co m p re n d e de 6 a 40 á to m o s de ca rbo no .
3. El uso según una c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 o 2, en d on de la fra cc ió n de p o lia m in a de d ich o d e riva d o de p o lia m in a se se le cc io n a del g rup o que con s is te en p o lia lq u ile n im in a s , p o lia lila m in a s , p o liv in ila m in a s , p o lilis in a s y p o lio rn itin a s , en d o n d e d ich as p o lia lq u ile n im in a s son p re fe rib le m e n te p o lie tile n im in a s , p o lip ro p ile n im in a s , p o lib u tile n im in a s u o lig o sp e rm in a s u h o m ó lo g o s de las m ism as, y en d o n d e d icha fra cc ió n de p o lia m ina co m p re n d e de 12 a 100000 á to m o s de n itróg en o , m ás p re fe rib le m e n te de 20 a 5000 á to m o s de n itrógeno .
4. El uso seg ún una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 3, en d o n d e d icho d e riva d o de po lia m ina es un d e riva d o de p o lia lq u ile n im in a linea l q ue co m p re n d e u n id a d e s de la s ig u ie n te fó rm u la (10):
-[C H 2 -N R 10-(C H 2)x]- (10 )
d on de
x es un n ú m e ro e n te ro de 1 a 10. en d on de el v a lo r de x p ue de s e r igua l o d ife re n te e n tre d ife re n te s g rup o s (C H 2)x , R 10 es h id ró ge n o ,
un su s titu ye n te c a rb o x ila d o que co m p re n d e un g rup o ca rb o x ilo un ido m e d ia n te un e n la za d o r h id ró fo b o al n itróg en o de a m in o al q ue R 10 e stá un ido, o
un su s titu ye n te h id ró fobo ,
cad a uno de los cu a le s e stá p re se n te en d ich a p o lia lq u ile n im in a e n tre d ife re n te s ca so s de R m ,
o
en d on de d ich o d e riva d o de p o lia m in a es un d e riva d o de p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d o que co m p re n d e u n id a d e s de cad a una de las fó rm u la s (11), (12 ) y (13):
-[C H 2 -N R 10-(C H 2)x]- (11 )
-[C H 2 -N R 11-(C H 2)x]- (12 )
-(C H 2)y-N R 102 (13)
d on de
R 10 y x son com o se d e fin ie ro n a n te rio rm e n te ;
R 11 co m p re n d e una o m ás u n id a d e s se le cc io n a d a s de las fó rm u la s (11), (12 ) y (13);
y es un n ú m e ro e n te ro de 1 a 10. en d on de el v a lo r de y p ue de s e r igua l o d ife re n te e n tre d ife re n te s g rup o s (C H 2)y; y en d o n d e el núm e ro de á to m o s de n itróg en o p o r m o lécu la de d icha p o lia lq u ile n im in a linea l o ra m ifica d a es de 12 a 100000.
5. El uso según una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 4, en d o n d e la re lac ión m o la r de su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s a su s titu ye n te s h id ró fo b o s en d icho d e riva d o de p o lia m ina está d en tro del in te rva lo de 10:1 a 0.1 :1, p re fe rib le m e n te de 3:1 a 0.33 :1.
6. El uso según una c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 5, s ien do d icho d e riva d o de p o lia m in a una c a rb o x ia lq u ila lq u il-p o lia m in a , en d on de d ich o s s u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s de d icho d e riva d o de p o lia m in a son fra cc io n e s ca rb o x ia lq u ilo , y d ich o s s u s titu ye n te s h id ró fo b o s de d ich o d e riva d o de p o lia m in a son fra cc io n e s a lqu ilo ; y en d onde to d a s las fra cc io n e s c a rb o x ia lq u ilo de d icha ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a p ueden s e r igu a les y to d a s las fra cc io n e s a lq u ilo pueden se r igua les, y la sum a de á to m os de ca rbo no en la fra cc ió n ca rb o x ia lq u ilo y la fra cc ió n a lq u ilo p ue de s e r de 10 a 30. p re fe rib le m e n te de 15 a 25.
7. El uso según la re iv in d ica c ió n 6, en d on de d icha ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a es una ca rb o x ia lq u il-a lq u ilp o lia lq u ile n im in a linea l q ue co m p re n d e u n id a d e s de la s ig u ie n te fó rm u la (6):
-[C H 2 -N R 6-(C H 2)x ]- (6 )
en d onde
x es un n ú m e ro e n te ro de 1 a 10, en d on de el v a lo r de x p ue de s e r igua l o d ife re n te e n tre d ife re n te s g rup o s (C H 2)x , R6 es h id ró ge n o , C rH2r+1 o Cs-1H2s-2C O O H , cad a uno de los cua les está p rese n te en d icha ca rb o x ia lq u il-a lq u ilp o lia lq u ile n im in a e n tre d ife re n te s ca so s de R6,
r es un n ú m e ro e n te ro de 2 a 40.
s es un n ú m e ro e n te ro de 4 a 40;
o
en d onde d ich a c a rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a es una ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia lq u ile n im in a ra m ifica d a que co m p re n d e u n id a d e s de cad a una de las fó rm u la s (7), (8 ) y (9):
-[C H 2 -N R 6-(C H 2)x ]- (7 )
-[C H 2 -N R 7-(C H 2)x ]- (8 )
-(C H 2)y-N R 62 (9)
en d onde
R6, x, r y s son com o se d e fin ie ro n a n te rio rm e n te ;
R7 co m p re n d e una o m ás u n id a d e s se le cc io n a d a s de las fó rm u la s (7), (8 ) y (9);
y es un n ú m e ro e n te ro de 1 a 10. en d on de el v a lo r de y p ue de s e r igua l o d ife re n te e n tre d ife re n te s g rup o s (C H 2)y; y en d on de el n úm ero de á to m os de n itró g e n o p or m o lé cu la de d ich a ca rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia lq u ile n im in a linea l o ra m ifica d a e stá e n tre 12 y 100000.
8. El uso seg ún una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 6 o 7, en d o n d e al m e no s 10% m olar, p re fe rib le m e n te e n tre 25 y 80 % m o lar, m ás p re fe rib le m e n te e n tre 30 y 60 % m o la r de g ru p o s a m ino de d icha p o lia m in a e s tá n su s titu id o s p o r d ich o ca rb o x ia lq u ilo y d ich o s g rup o s a lq u ilo (g ra do de sus titu c ión ).
9. El uso según una cua lqu ie ra de las re iv ind ica c ion es 1 a 8, en d onde los p o lia n io ne s son á c id os n uc le icos o pro te ínas.
10. D e riva do de p o lia m in a a d e cu a d o para la tra n s fe cc ió n de p o lia n io n e s a de n tro de cé lu las , c o m p re n d ie n d o d icha p o lia m ina :
una fra cc ió n de p o lia m in a que co m p re n d e una p lu ra lida d de g ru p o s am ino ;
una p lu ra lida d de s u s titu ye n te s ca rb o x ila d o s que co m p re n d e n un g rup o ca rb o x ilo u n ido m e d ia n te un e n la za d o r h id ró fo b o a g ru p o s a m ino de d icha fra cc ió n de p o lia m ina , en d on de cada uno de d ich os su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s co m p re n d e de 6 a 40 á to m o s de ca rb o n o , p re fe rib le m e n te de 6 a 20 á to m o s de ca rbo no , y m ás p re fe rib le m e n te de 8 a 16 á to m os de ca rbo no , y cad a uno de d ich os e n la za d o re s h id ró fo b o s p uede c o m p re n d e r de 1 a 3 h e te ro á to m o s se le cc io n a d o s e n tre O, N, y S, en d on de d ich os su s titu ye n te s ca rb o x ila d o s son g rup o s ca rb o x ih id ro c a rb ilo o g rup o s ca rb o x ih e te ro h id ro ca rb ilo , c o m p re n d ie n d o e stos ú ltim o s d ich os de 1 a 3 h e te ro á to m o s; y
una p lu ra lida d de s u s titu ye n te s h id ró fo b o s u n id os a g ru p o s a m ino de d icha fra cc ió n de p o lia m ina , en d on de cada uno de d ich o s su s titu y e n te s h id ró fo b o s c o m p re n d e al m e n o s 2 á to m o s de ca rb o n o , p re fe rib le m e n te de 6 a 40 á to m o s de ca rbo no , y puede c o m p re n d e r de 1 a 3 h e te ro á to m o s se le cc io n a d o s e n tre O, N, y S s iem p re que d icho su s titu ye n te h id ró fo b o te n g a al m e n o s 6 á to m o s de ca rb o n o , en d o n d e d ich o s s u s titu ye n te s h id ró fo b o s son g ru p o s h id ro ca rb ilo o g ru p o s h e te ro h id ro ca rb ilo , c o m p re n d ie n d o e s to s ú ltim o s d ich os de 1 a 3 h e te roá tom o s.
11. El d e riva d o de p o lia m in a seg ún la re iv in d ica c ió n 10, que es un d e riva d o de p o lia lq u ile n im in a linea l o ra m ifica d o com o se d e fine en la re iv in d ica c ió n 4.
12. El d e riva d o de p o lia m in a seg ún la re iv in d ica c ió n 10, q ue es una c a rb o x ia lq u il-a lq u il-p o lia m in a com o se d e fin e en la re iv in d ica c ió n 6 o 7.
13. C o m p le jo de un á c id o n u c le ico o una p ro te ín a con un d e riva d o de p o lia m in a com o se d e fine en una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s p rece de n te s .
14. Un k it q ue com p re nd e :
(i) un d e riva d o de p o lia m in a com o se d e fine en una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 12,
(ii) una so lu c ió n re g u la d o ra q ue tie n e un pH e n tre 4 y 8, y
(iii) o p c io n a lm e n te un m a nu a l con in s tru cc io n e s de uso;
en d on de d ich o d e riva do de po lia m ina se p uede p ro p o rc io n a r com o una so luc ión y en d onde el d iso lve n te es un a lcoho l in fe rio r se le cc io n a d o del g rup o que co n s is te en e tano l, p ropano l, 1 ,2 -d ih id ro x ip ro p a n o e isop ro pa no l, o m e zc la s que co m p re n d e n a gua y e n tre 33 y 100% de d icho a lco ho l in fe rio r; o en d on de d icho d e riva d o de p o lia m in a se puede p ro p o rc io n a r en fo rm a seca, ta l com o en fo rm a lio filizada .
15. Un re c ip ie n te que co m p re n d e m ú ltip les co m p a rtim e n to s q ue con tien en una co m p o s ic ió n lio filizad a q ue co m p re n d e un tra n s fe c ta n te , en d o n d e d ich o tra n s fe c ta n te es o co m p re n d e el d e riva d o de p o lia m in a com o se d e fine en una c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 a 12, n o ta b le m e n te d icho tra n s fe c ta n te es o co m p re n d e la ca rb o x ia lq u il-a lq u ilp o lia m in a co m o se d e fine en una cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 6 a 8.
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