ES2919864T3 - Derivados de poliamina hidroxilada como reactivos de transfección - Google Patents

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Abstract

La invención proporciona derivados de poliamina hidroxilada, su uso para la transfección de los polianiones en células y un método de transfección de células con un polianión, que comprende la mezcla de dicha polianión con dicho derivado de poliamina hidroxilada en un tampón y tratando células con la mezcla obtenida en el anterior en el anterior paso. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Derivados de poliamina hidroxilada como reactivos de transfección
Campo de la invención
La invención se refiere a derivados de poliamina y al uso de derivados de poliamina para la transfección de ácidos nucleicos y otros polianiones en células. La invención también se refiere a kits y derivados de poliamina para los mismos. Los derivados de poliamina de la invención son transfectantes eficaces con una toxicidad muy baja que se pueden usar para transfectar un amplio rango de diferentes tipos de células.
Estado de la técnica
La transfección es la introducción de materia extraña en las células. Dentro del contexto de la transfección, "en las células" significa el transporte de la materia extraña a través de al menos una membrana biológica. Puede ocurrir un transporte adicional hacia los compartimentos celulares o los orgánulos. Por el contrario, una mera inclusión del material en endosomas, vesículas pinocíticas o fagocíticas o lisosomas no se considera una transfección.
La materia extraña puede abarcar moléculas tales como péptidos, proteínas y diversos tipos de ácidos nucleicos; estos últimos pueden ser tan pequeños como los oligonucleótidos o tan largos como los plásmidos. También puede incluir ensamblajes de dichas moléculas. En cualquier caso, las moléculas o ensamblajes son grandes e hidrofílicos, dos características que impiden su captación celular sin ayuda. Por lo tanto, la transfección requiere el uso de reactivos auxiliares específicos. Entre otros, las poliaminas pueden ser tales reactivos. Las poliaminas forman policationes en solución, lo que facilita la formación de complejos con polianiones tales como los ácidos nucleicos. Estos complejos son las entidades competentes de transfección reales.
La transfección de complejos de una poliamina y un plásmido se demostró mediante Boussif et al. (Proc Natl Acad Sci USA (1995), 92(16):7297-7301) o en US6013240), utilizando polietilenimina ramificada (PEI) como poliamina. Manteniendo el concepto, otros buscaron mejorar la tecnología por diversos medios. Las estrategias para mejorar los transfectantes incluyen:
(i) selección de un tamaño específico o configuración del policatión, tal como PEI lineal de cierta longitud (WO2009/016507);
(ii) uso de multímeros metabólicamente lábiles de tales policationes (Gosselin et al. (2001) Bioconj Chem, 12(6):989-994; Lynn et al (2001) J Am Chem Soc 123 (33): 8155-8156; WO2007/020060 de Gopfrich et al.; WO2007/120479 de Tanaka et al.);
(iii) empleo de mezclas de lípidos (US7.601.367 de Monahan et al.) o
(iv) modificaciones químicas del esqueleto del polímero, por ejemplo, injerto de aminoácidos aromáticos (véase WO2009/074970 de Adib et al.), injerto de fracciones de histidina o imidazol (en WO 2009/011402), alquilaciones como en Wakefield et al. (2005) Bioconj Chem 16(5):1204-1208 o la modificación con colesterol (en US2007/0154447 de Ferguson et al.).
Las modificaciones hidrófobas mejoran la penetración de la membrana de un transfectante (véase Wakefield et al.) pero están asociadas con una menor estabilidad del complejo en solución; el material formulado tiende a formar agregados. El injerto de polietilenglicol (PEG) (por Matar et al. en WO2009/021017 o en Rozema et al (2007) Proc Natl Acad Sci USA. 104 (32): 12982-12987) contrarresta la agregación pero por otro lado compite con la actividad biológica y debe ser reversible como se muestra en la publicación de Rozema.
Como es evidente a partir de las muchas estrategias diferentes y del gran número de informes, el desarrollo de novedosos transfectantes es un tema de intensa investigación. Su uso tiene una relevancia comercial sustancial; los reactivos de transfección tenían un volumen de mercado de aproximadamente 200 millones de dólares estadounidenses en 2011 (Frost & Sullivan, Global Transfection Markets, N6F0-01).
Adicionalmente, Incani et al., Soft Matter, 6, 10:2124 - 2138 (2010) describe la modificación hidrófoba y de lípidos de los portadores catiónicos en la ruta hacia vectores genéticos superiores. Philipp et al., Reactive and Functional Polímeros 71, 3: 288 - 293 (2010) describen la modificación funcional de la oligoetilenimina reticulada con amida para mejorar el suministro de ARNip. Lue et al., Biomaterials, 32 (2011), 9925-9939 describen una estrategia para mejorar la actividad de transfección tolerante al suero de vectores policatión por hidroxilación superficial.
Además, el documento WO0176643 (A1) describe el desarrollo de un vector de expresión que contiene una secuencia genómica antigénica, que se une a un conjugado de polímero policatiónico de proteína agregada. Se revisan las modificaciones de diversos polímeros catiónicos con grupos hidrófobos. Entre otras cosas, las polietileniminas (PEI) se modifican con grupos hidrófobos. El documento US2003077827 (A1) describe un método de transfección de células que comprende aplicar células directamente sobre ácidos nucleicos que están inmovilizados en complejos de transfección sobre una superficie y que transfectan las células. El documento WO2011120953 (A1) describe una clase de polímeros catiónicos que se autoensamblan con un interruptor de disolución sensible al pH y sus usos para suministrar moléculas de interés a una célula. El documento WO2007006700 (A1) describe dendrímeros de poli-(propilenimina) modificados, que comprenden grupos catiónicos internos de amonio y grupos terminales externos no tóxicos, composiciones farmacéuticas que comprenden dichos dendrímeros, métodos para la producción de dichos dendrímeros y su uso como agentes de transfección para factores terapéuticos bioactivos aniónicos, para uso en terapia génica, en particular para el tratamiento del cáncer. El documento WO9859064 (A1) describe complejos de ácido nucleico y polietilenimina (PEI), en los que PEI se modifica con un polímero hidrofílico acoplado covalentemente, tales como polietilenglicol, y procesos para prepararlos.
Los dos criterios más importantes en el desarrollo y la mejora de los transfectantes son (a) una alta relación señal a ruido y (b) una transfección eficaz en un gran número de tipos de células diferentes. La relación señal a ruido describe el efecto del complejo de transfección en comparación con el transfectante solo o en comparación con un complejo de transfección que comprende un ácido nucleico irrelevante.
Por lo tanto, es un objetivo de la invención proporcionar un transfectante para transfectar polianiones en células. Otro objetivo es proporcionar un transfectante que sea superior a los materiales comercialmente disponibles en los criterios (a) y/o (b). Dada la gran cantidad y diversidad de enfoques utilizados anteriormente, no se pudo identificar una justificación específica que hubiera guiado tal invención.
Breve descripción de la invención
Los objetivos anteriores se logran mediante el uso de las reivindicaciones 1 a 10, el derivado de poliamina de las reivindicaciones 11 a 13, el complejo de la reivindicación 14, el kit de la reivindicación 15 y el recipiente de la reivindicación 16.
La presente invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier asunto objeto mencionado en este documento a continuación y que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la presente invención.
Divulgación adicional
También se describen aquí, pero como tales no forman parte de la invención, los siguientes aspectos identificados como ítems (1) a (30):
(1) Uso de un derivado de poliamina para la transfección de polianiones en células, comprendiendo dicha poliamina:
Una fracción de poliamina que comprende una pluralidad de grupos amino;
una pluralidad de sustituyentes hidroxilados que comprenden un grupo hidroxilo unido a través de un enlazador hidrófobo a grupos amino de dicha fracción de poliamina; y
una pluralidad de sustituyentes hidrófobos unidos a grupos amino de dicha fracción de poliamina;
teniendo dicho enlazador hidrófobo un logP de 2 a 20 determinado para un compuesto obtenible a partir de dicho enlazador reemplazando los enlaces de dicho enlazador al grupo hidroxilo y el grupo amino de dicha poliamina por enlaces a átomos de hidrógeno; y
teniendo dicho sustituyente hidrófobo un logP de 1.5 a 20 determinado para un compuesto obtenible a partir de dicho sustituyente hidrófobo sustituyendo el enlace de dicho sustituyente hidrófobo a un grupo amino de dicha fracción de poliamina por un enlace a un átomo de hidrógeno.
(2) Uso de un derivado de poliamina para la transfección de polianiones en células, comprendiendo dicha poliamina:
Una fracción de poliamina que comprende una pluralidad de grupos amino;
una pluralidad de sustituyentes hidroxilados que comprenden un grupo hidroxilo unido mediante un enlace hidrófobo a grupos amino de dicha fracción de poliamina, en el que cada uno de dichos sustituyentes hidroxilados comprende de 4 a 40 átomos de carbono, preferiblemente de 4 a 20 átomos de carbono, y más preferiblemente de 6 a 12 átomos de carbono, y cada uno de dichos enlazadores hidrófobos puede comprender de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre O, N y S; y
una pluralidad de sustituyentes hidrófobos unidos a grupos amino de dicha fracción de poliamina, en el que cada uno de dichos sustituyentes hidrófobos comprende al menos 2 átomos de carbono, preferiblemente de 3 a 40 átomos de carbono, y puede comprender de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N y S siempre que dicho sustituyente hidrófobo tenga al menos 6 átomos de carbono.
(3) El uso de acuerdo con el ítem 1 o 2, en el que cada uno de dichos sustituyentes hidroxilados de dicho derivado de poliamina comprende uno o más de las siguientes fracciones como dicho enlazador hidrófobo: alquileno, alquenileno, alquinileno, cicloalquileno, cicloalquenileno, arileno y combinaciones de las mismos; y/o
cada uno de dichos sustituyentes hidrófobos de dicho derivado de poliamina comprende uno cualquiera o más de las siguientes fracciones: alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo y combinaciones de las mismas. (4) Derivado de poliamina como se define en el ítem 1 o 2.
(5) Derivado de polialquilenimina que tiene uno o más sustituyentes hidroxialquilo que comprenden de 4 a 40 átomos de carbono, y uno o más sustituyentes hidrófobos seleccionados de sustituyentes hidrocarburo que tienen al menos 2 átomos de carbono, preferiblemente de 3 a 40 átomos de carbono, donde cada uno de dichos sustituyentes hidrófobos puede ser o puede comprender un grupo alquilo y/o cada uno de dichos sustituyentes hidrófobos puede ser o puede comprender un grupo arilo.
(6) El derivado de polialquilenimina de acuerdo con el ítem 5, en el que los sustituyentes hidroxialquilo y los sustituyentes hidrófobos en dicho derivado de polialquilenimina tienen una relación molar de 10:1 a 0.1:1 (la relación C/A), preferiblemente la relación C/A de estos grupos es de 3:1 a 0.33:1.
(7) El derivado de poliamina o derivado de polialquilenimina de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 4 a 6, en el que dichos sustituyentes hidroxilados son los mismos y dichos sustituyentes hidrófobos son los mismos, y la suma de átomos de carbono en uno de dichos sustituyentes hidroxilados más los de uno de dichos sustituyentes hidrófobos es de 10 a 30, preferiblemente de 15 a 25.
(8) Complejo de un ácido nucleico o una proteína con el derivado de poliamina de la invención.
(9) Un kit que comprende:
(i) un derivado de poliamina como se define en el presente documento,
(ii) una solución tampón que tenga un pH entre 4 y 8, y
(iii) opcionalmente un manual con instrucciones de uso.
(10) Un método para transfectar células con un ácido nucleico o una proteína, que comprende mezclar dicho ácido nucleico o una proteína con un derivado de poliamina como se define en el presente documento, por ejemplo en un tampón acuoso y tratando dichas células con la mezcla obtenida en el paso anterior.
(11) Un recipiente que comprende múltiples compartimentos que contienen una composición liofilizada que comprende un transfectante, dicho transfectante puede ser o puede comprender el derivado de poliamina como se define en cualquiera de los ítems 1 a 7.
También se describe:
(12) Un uso de una hidroxialquil-alquil-poliamina para la transfección de polianiones en células.
(13) El uso de acuerdo con el ítem 12, en el que la fracción de poliamina de dicha hidroxialquil-alquil-poliamina se selecciona del grupo que consiste en polialquileniminas, polialilaminas, polivinilaminas, polilisinas y poliornitinas, en el que dichas polialquileniminas son preferiblemente polietileniminas, polipropileniminas, polibutileniminas u oligoesperminas u homólogos de los mismos, y en donde dicha fracción de poliamina comprende entre 12 y 100000 átomos de nitrógeno, más preferiblemente entre 20 y 5000 átomos de nitrógeno.
(14) El uso de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 12 o 13, en el que la fracción de hidroxialquilo es una fracción de hidroxialquilo alifático que tiene entre 4 y 40 átomos de carbono.
(15) El uso de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 12 a 14, en el que la fracción de alquilo es una fracción de alquilo alifático que tiene al menos 2 átomos de carbono, preferiblemente entre 6 y 40 átomos de carbono.
(16) El uso de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 12 a 15, en el que todas las fracciones hidroxialquilo de dicha hidroxialquil-alquil-poliamina son iguales y todas las fracciones alquilo son iguales, y la suma de átomos de carbono en la fracción de hidroxialquilo y la fracción de alquilo está entre 10 y 30, preferiblemente entre 15 y 25.
(17) El uso de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 12 a 16, en el que dicha hidroxialquil-alquil-poliamina es una hidroxialquil-alquil-polialquilenimina lineal que comprende unidades estructurales de la siguiente fórmula (6)
-[CH2-NR6-(CH2)x ]- (6)
en donde
x es un número entero de 1 a 10, donde el valor de x puede ser igual o diferente entre diferentes grupos (CH2)x, R6es hidrógeno, CrH2r+1 o CsH2sOH,
r es un número entero de 2 a 40,
s es un número entero de 4 a 40;
o
en donde dicha hidroxialquil-alquil-poliamina es una hidroxialquil-alquil-polialquilenimina ramificada que comprende unidades estructurales de cada una de las fórmulas (7), (8) y (9):
-[CH2-NR6-(CH2)x ]-(7)
-[CH2-NR7-(CH2)x ]-(8)
-(CH2)y-NR62 (9)
en donde
R6, x, r y s son como se definen arriba y
R7 comprende una o más unidades seleccionadas de las fórmulas (7), (8) y (9);
y es un número entero de 1 a 10, preferiblemente de 2 a 10, donde el valor de y puede ser igual o diferente entre múltiples apariciones de grupos (cH2)y;
y donde el número de átomos de nitrógeno por molécula de dicha hidroxialquil-alquil-polialquilenimina lineal o ramificada está entre 12 y 100000.
(18) El uso de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 12 a 17, en el que la relación molar de fracciones hidroxialquilo a fracciones alquilo en dicha hidroxialquil-alquil-poliamina está dentro del rango de 6:1 a 0.33:1, preferiblemente de 5:1 a 1.5:1.
(19) El uso de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 12 a 18, en el que al menos el 10 % en moles, preferiblemente entre el 25 y el 80 % en moles, más preferiblemente entre el 30 y el 60 % en moles de los grupos amino de dicha poliamina están sustituidos por dicho hidroxialquilo y dichos grupos alquilo (grado de sustitución).
(20) El uso de acuerdo con uno cualquiera de los ítems 12 a 19, en el que los polianiones son ácidos nucleicos. (21) Hidroxialquil-alquil-poliamina que es una polietilenimina ramificada que tiene uno o más sustituyentes hidroxialquilo y uno o más sustituyentes alquilo.
(22) La hidroxialquil-alquil-poliamina de acuerdo con el ítem 21, en donde dicha hidroxialquil-alquil-poliamina tiene un tipo de fracción de hidroxialquilo y un tipo de fracción de alquilo, y la suma de átomos de carbono en el tipo de fracción de hidroxialquilo y el tipo de la fracción de alquilo está entre 10 y 30, preferiblemente entre 15 y 25.
(23) Complejo de un ácido nucleico con una hidroxialquil-alquil-poliamina como se define en uno cualquiera de los ítems anteriores.
(24) Un kit que comprende:
(i) una hidroxialquil-alquil-poliamina como se define en uno cualquiera de los ítems 12 a 19,
(ii) una solución tampón que tenga un pH entre 4 y 8 y una fuerza iónica de 0.2 mol/lo menos, preferiblemente de 0.1 mol/l o menos, y
(iii) opcionalmente un manual con instrucciones de uso.
(25) El kit del ítem 24, donde dicha poliamina se proporciona como una solución y donde el disolvente es un alcohol inferior seleccionado del grupo de etanol, propanol, 1,2-dihidroxipropano o isopropanol, o mezclas que comprenden agua y entre 33 y 100 % de dicho alcohol inferior.
(26) El kit del ítem 24, en el que dicha poliamina se proporciona en forma seca.
(27) El kit de los ítems 24 o 26, en el que dicha poliamina se proporciona en forma liofilizada.
(28) El kit de uno cualquiera de los ítems 13 a 16, en el que dicha poliamina se deposita en una placa multipocillo. (29) Un kit como el del ítem 28, en el que los pocillos de dicha placa multipocillo contienen diferentes cantidades de dicha poliamina, preferiblemente gradientes de dichas poliaminas en pocillos vecinos o en el que ciertos pocillos están vacíos.
(30) Un método para transfectar células con un polianión, que comprende mezclar dicho polianión con una hidroxialquil-alquil-poliamina como se define en uno cualquiera de los ítems 12 a 22 en agua o un tampón acuoso y tratar dichas células con la mezcla obtenida en el anterior paso.
Las poliaminas se modificaron químicamente con sustituyentes hidroxilados que comprendían un grupo hidroxilo unido mediante un enlazador hidrófobo a una poliamina y con sustituyentes hidrófobos. Las poliaminas modificadas utilizadas en la presente invención se denominan poliaminas hidrofobizadas hidroxiladas o como poliaminas modificadas o como derivados de poliamina a lo largo de esta descripción. En una realización, las poliaminas se modificaron químicamente con sustituyentes hidroxialquilo y sustituyentes alquilo. Estas poliaminas modificadas se denominan aquí hidroxialquil-alquil-poliaminas. Sorprendentemente, se encontró que una combinación de sustituyentes hidroxilados y sustituyentes hidrófobos en una poliamina, pero ningún tipo individual de estos sustituyentes por sí solo, produce transfectantes eficaces con una alta relación señal a ruido. Los derivados de poliamina, usos, métodos, kits e hidroxialquil-alquil-poliaminas de la invención presentan estas propiedades ventajosas en numerosos tipos de células y son superiores a los transfectantes y métodos de transfección disponibles comercialmente.
Descripción detallada de la invención
El derivado de poliamina de esta invención tiene sustituyentes hidroxilados y sustituyentes hidrófobos en una poliamina, pudiendo comprender estos sustituyentes, independientemente uno de otro, uno, dos o tres heteroátomos seleccionados entre oxígeno, nitrógeno o azufre. La hidroxialquil-alquil-poliamina de la invención es un derivado de poliamina que tiene sustituyentes hidroxialquilo como dichos sustituyentes hidroxilados y sustituyentes alquilo como dichos sustituyentes hidrófobos en una poliamina.
El derivado de poliamina de la invención se puede obtener mediante métodos conocidos en la técnica. Un procedimiento posible es la derivación de una poliamina con un compuesto hidroxi halogenado que forma dicho sustituyente hidroxilado tras la sustitución nucleofílica del halógeno por un grupo amino de la poliamina, y con un compuesto hidrófobo halogenado que forma dicho sustituyente hidrófobo tras la sustitución nucleofílica del halógeno. por un grupo amino de la poliamina. La hidroxialquil-alquil-poliamina de la invención se puede obtener de manera análoga. Un procedimiento posible es la alquilación de una poliamina con un haloalcanol y con un haloalcano por sustitución nucleofílica. Los sustituyentes halo del alcanol y el alcano pueden ser átomos de cloro, bromo o yodo, preferiblemente son átomos de bromo. A continuación se proporcionan más detalles sobre la preparación de la hidroxialquil-alquil-poliamina.
Poliaminas
La poliamina que se puede usar como material de partida para producir la hidroxialquil-alquil-poliamina de la invención es un compuesto polimérico que tiene una pluralidad de átomos de nitrógeno que forman una pluralidad de grupos amino. Estos átomos de nitrógeno pueden cargarse en soluciones acuosas por protonación. La mayoría de las aminas alifáticas tienen un pK superior a 8 o 9, lo que significa que están sustancial o completamente cargadas en soluciones acuosas que tienen un pH de alrededor de 7.4, que es el pH fisiológico, o a valores de pH más bajos.
Las fracciones de amina que tienen un pK por debajo de 6, por ejemplo, piridinas o anilinas, son grupos amino menos preferidos de la poliamina. Los valores de pK de las diversas aminas están fácilmente disponibles, ya que se citan con frecuencia en los artículos respectivos de la Wikipedia en inglés que se encuentran en en.wikipedia.org o se pueden calcular utilizando software, por ejemplo Base de datos ACD/pKa (Advanced Chemistry Development, Ontario, Canadá).
Los átomos de nitrógeno plurales de las poliaminas pueden ser grupos amino primarios, secundarios, terciarios y/o cuaternarios, también pueden formar parte de sistemas de anillos. Los grupos amino primarios, secundarios, terciarios y/o cuaternarios pueden aparecer en la misma molécula de poliamina. Se prefieren los grupos amino primarios, secundarios y terciarios, ya que pueden alquilarse como se describe anteriormente. Las poliaminas pueden comprender además grupos de extremo (grupos terminales) que también pueden ser grupos amino; sin embargo, tales grupos de extremo también pueden ser iniciadores o grupos terminales de la reacción de polimerización que se usó para fabricar la poliamina.
En el caso de ciertas poliaminas lineales, los grupos amino internos pueden ser grupos amino secundarios; ejemplos de tales poliaminas son polialquileniminas. En otras poliaminas lineales, los grupos amino no forman parte del esqueleto del polímero sino de la cadena lateral o forman la cadena lateral por sí mismos. En el caso de poliaminas ramificadas, los grupos amino internos que forman puntos de ramificación son generalmente grupos amino terciarios, mientras que los grupos amino internos que no son puntos de ramificación son generalmente grupos amino secundarios. Las ramificaciones de dichos polímeros a menudo terminan en grupos amino primarios.
A continuación, se describen las poliaminas que pueden usarse para producir el derivado de poliamina de la invención. A continuación, se describen el derivado de poliamina y la hidroxialquil-alquil-poliamina de la invención.
En una primera realización general, los átomos de nitrógeno plurales de la poliamina utilizables para preparar el derivado de poliamina o la hidroxialquil-alquil-poliamina de la invención son parte del esqueleto polimérico de la poliamina. La poliamina puede ser una poliamina lineal que tenga la pluralidad de átomos de nitrógeno dentro de la cadena polimérica. Tal poliamina puede ser una polialquilenimina que comprende unidades plurales de fórmula (1):
(1) -[CH2-NR1-(CH2)x]-,
en donde x es un número entero de 1 a 10 y R1 es hidrógeno. En una realización, x puede ser un número entero de 1 a 5, preferiblemente 1 o 2 o 3. El valor de x puede ser igual o diferente entre diferentes grupos (CH2)x en la misma molécula de poliamina. Por ejemplo, x puede oscilar entre dos o tres valores diferentes de x a lo largo de la cadena polimérica de la poliamina, tal como entre valores de x de 2 y 3, entre valores de 2 y 4, o entre valores de 2 y 5. En las poliaminas de fórmula (1), esencialmente todos los grupos amino dentro de la cadena polimérica son grupos amino secundarios.
Si m es el número de unidades repetitivas de fórmula (1) en la polialquilenimina, m puede ser un número entero de 12 a 100000, preferiblemente de 12 a 20000, más preferiblemente de 20 a 10000, lo más preferiblemente de 20 a 5000.
Ejemplos de poliaminas que se convierten en la fracción de poliamina de dicho derivado de poliamina por sustitución nucleofílica, en particular por alquilación, son polialquileniminas, preferiblemente polietileniminas, polipropileniminas, polibutileniminas u oligoesperminas u homólogos de las mismas. La fracción de poliamina puede comprender de 12 a 20000 átomos de nitrógeno, más preferiblemente de 20 a 10000 átomos de nitrógeno por molécula de poliamina, o como se define anteriormente para m.
Alternativamente, la poliamina que puede convertirse en la fracción de poliamina de dicho derivado de poliamina por sustitución nucleofílica, especialmente por alquilación, puede ser una poliamina ramificada, preferiblemente una polialquilenimina ramificada. Dicha polialquilenimina ramificada se puede definir por tener unidades estructurales de cada una de las siguientes fórmulas (2) a (4):
-[CH2-NR1-(CH2)x]- (2)
-[CH2-NR2-(CH2)x]- (3)
-CH2-NR32 (4)
en las que
R1 y x son como se definen anteriormente;
R2 comprende unidades de fórmula (2) y/o de fórmula (3); y
R3 representa hidrógeno.
En la polialquilenimina ramificada, una cadena principal de la misma puede estar formada por unidades divalentes de fórmula (2) que comprenden grupos amino secundarios. Sin embargo, la polialquilenimina ramificada, en particular una de sus cadenas principales, comprende al menos 1 unidad divalente de fórmula (3) que comprende el nitrógeno terciario unido a R2 como punto de ramificación. Las cadenas poliméricas ramificadas comprenden al menos una unidad, generalmente múltiple, de fórmula (2), y pueden comprender además una o más unidades de fórmula (3), lo que conduce a una ramificación adicional. Así, la polialquilenimina ramificada puede ser un dendrímero o un polímero dendronizado. En muchos casos, estas polialquileniminas ramificadas comprenden los elementos estructurales (2), (3) y (4) en una secuencia aleatoria que conduce a estructuras irregulares o poliaminas aleatorias. El grupo monovalente de fórmula (4) define grupos terminales de la polialquilenimina que pueden estar presentes en una cadena principal así como en cadenas ramificadas. Múltiples estructuras de cada una de las fórmulas (2), (3) y (4) presentes en la polialquilenimina pueden ser iguales o diferentes en términos de x, R2 y R3.
El grado de ramificación en la polialquilenimina ramificada puede ser de 1 a 40 %, preferiblemente de 10 a 40 %, más preferiblemente de 15 a 30 %. El experto en la técnica sabe cómo cuantificar la ramificación de un polímero, por ejemplo mediante titulaciones de pH y cuantificación de los diferentes compartimentos de la curva de titulación o mediante mediciones de 1H RMN.
Una medición del grado de ramificación en una polialquilenimina ramificada es la proporción de grupos amino primarios, secundarios y terciarios. Mientras que una polialquilenimina lineal tiene exclusivamente grupos amino secundarios como grupos amino internos, las polialquileniminas ramificadas tienen grupos amino terciarios tales como los de fórmula (3), cuya cantidad aumenta con el aumento del grado de ramificación. La proporción molar de grupos amino primarios en la poliamina ramificada puede ser de 1 a 40 %, preferiblemente de 15 a 30 %. La proporción molar de grupos amino secundarios puede ser del 15 al 85 %, preferiblemente del 30 al 70 %. La proporción molar de grupos amino terciarios puede ser de 1 a 40 %, preferiblemente de 15 a 30 %.
Ejemplos de poliaminas ramificadas que pueden convertirse en la fracción de poliamina de dicho derivado de poliamina o dicha hidroxialquil-alquil-poliamina son polialquileniminas ramificadas, preferiblemente polietileniminas ramificadas, polipropileniminas ramificadas o polibutileniminas ramificadas. Las poliaminas ramificadas, tales como las polialquileniminas ramificadas, pueden tener entre 12 y 100000 átomos de nitrógeno, más preferiblemente entre 20 y 20000 átomos de nitrógeno por molécula de poliamina. En otras realizaciones, el número de átomos de nitrógeno en tales polímeros está entre 20 y 5000 átomos de nitrógeno por molécula de poliamina.
En la siguiente tabla 1 se enumeran ejemplos de poliaminas que tienen un esqueleto cargado en medio acuoso a pH neutro para uso en la producción del derivado de poliamina o la hidroxialquil-alquil-poliamina de la invención: Tabla 1
Figure imgf000008_0002
En la tabla 1, Mr significa peso molecular relativo en términos del peso molecular promedio numérico (Mn).
Otro ejemplo de poliamina ramificada es la polietilenima de la siguiente estructura:
Figure imgf000008_0001
siendo n un número entero de tal manera que el peso molecular promedio en número Mn es 10 000 y teniendo un Número CAS 9002-98-6. Está disponible comercialmente de Sigma-Aldrich, catálogo no. 408727. En los ejemplos se enumeran otras poliaminas ramificadas.
Las poliaminas también pueden formar ensamblajes multiméricos de oligómeros de poliamina. Un ejemplo de poliamina ramificada es la polietilenimina ramificada. Ejemplos de los ensamblajes multiméricos se describen en Gosselin et al. (2001) Bioconj Chem, 12(6):989-994; Lynn et al (2001) J Am Chem Soc 123 (33): 8155-8156; W02007/020060 de Gopfrich et al., o WO2007/120479 de Tanaka et al.
Al igual que con la primera realización general, los polímeros de la segunda realización general también pueden ser de tipo lineal, ramificado o dendrímero, también pueden ser ensamblajes multiméricos de oligómeros de poliamina.
Para lograr un alto rendimiento en la transfección, una poliamina tal como las descritas anteriormente se modifica tanto con fracciones hidroxilo como hidrófobas para obtener el derivado de poliamina de la invención.
Sustituyentes hidroxilados
Los sustituyentes hidroxilados comprenden un grupo hidroxi unido a través de un enlazador hidrófobo a grupos amino de la poliamina, dicho enlazador hidrófobo puede tener un coeficiente de partición logP de entre 2 y 20, preferiblemente entre 2 y 10, y más preferiblemente entre 3 y 6, determinado por un compuesto que se puede obtener a partir de dicho enlazador reemplazando los enlaces de dicho enlazador con el grupo hidroxi y el grupo amino de la poliamina por enlaces con átomos de hidrógeno. Los métodos para determinar el logP son conocidos por el experto en la técnica y comprenden la determinación experimental de la distribución de compuestos entre el agua y el 1-octanol, u obtener dichos valores de fuentes de referencia tales como Wikipedia, la versión en inglés, o calcular el logP usando un software tal como ACD/Labs 7.0 (Advanced Chemistry Development, Ontario, Canadá).
Un sustituyente hidroxilado puede comprender uno o dos grupos hidroxi, preferiblemente un grupo hidroxi. Los sustituyentes hidroxilados son fracciones que comprenden al menos 4 átomos de carbono. En algunos aspectos de la invención, los sustituyentes hidroxilados tienen de 4 a 40 átomos de carbono, preferiblemente de 6 a 20, más preferiblemente de 6 a 12 átomos de carbono. En un aspecto preferido, los sustituyentes hidroxilados son estructuras lineales que tienen de 4 a 20 átomos de carbono, preferiblemente entre 6 y 12.
Los enlazadores hidrófobos de dichos sustituyentes hidroxilados pueden comprender de 1 a 3, preferiblemente 1 o 2, heteroátomos seleccionados de O, N y S. Preferiblemente, los heteroátomos se seleccionan de O y S. En una realización, 1 o 2 heteroátomos seleccionados de O, N y S, preferiblemente O y S, pueden estar contenidos en el enlazador hidrófobo. Así, los sustituyentes hidroxilados pueden ser grupos hidroxihidrocarbilo, o pueden ser grupos hidroxiheterohidrocarbilo que comprenden de 1 a 3 heteroátomos seleccionados entre O, N y S, preferiblemente seleccionados entre O y S. Entre la pluralidad de sustituyentes hidroxilados de una molécula de dicha poliamina derivado, puede haber exclusivamente grupos hidroxihidrocarbilo, exclusivamente grupos hidroxiheterohidrocarbilo, o puede haber grupos hidroxihidrocarbilo y grupos hidroxiheterohidrocarbilo.
Cuando los sustituyentes hidroxilados son grupos hidroxihidrocarbilo, las fracciones de hidrocarbilo de los mismos pueden ser fracciones de hidrocarbilo alifáticos saturados, fracciones de hidrocarbilo alifáticos insaturados, fracciones de hidrocarbilo alicíclicos, fracciones de hidrocarbilo aromáticos, o fracciones que comprenden dos o más fracciones de la lista mencionada anteriormente.
Ejemplos de grupos hidroxihidrocarbilo son grupos hidroxialquilo, grupos hidroxialquenilo, grupos hidroxialquinilo, grupos hidroxicicloalquilo, grupos hidroxicicloalquenilo, grupos hidroxialquilcicloalquilo, grupos hidroxicicloalquilalquilo, grupos hidroxialquilcicloalquilalquilo, grupos hidroxiarilo, grupos hidroxialquilarilo, grupo hidroxiarilalquilo y grupos hidroxialquilarilalquilo. Ejemplos y definiciones de los grupos hidrocarbilo a los que se une el grupo hidroxi también se dan a continuación en el contexto de los sustituyentes hidrófobos. Se pueden combinar múltiples grupos hidrocarbilo diferentes. Sin embargo, se aplican los valores de logP y/o las definiciones del número de átomos de carbono dadas anteriormente.
Es posible reemplazar 1, 2 o 3, preferiblemente 1 o 2, de los átomos de carbono de las fracciones de hidrocarbilo de los sustituyentes hidroxilados por oxígeno, nitrógeno o azufre, formando así las fracciones de hidroxiheterohidrocarbilo. Se entiende que cualquier reemplazo formal de este tipo por un heteroátomo incluirá el ajuste de los átomos de hidrógeno unidos para ajustarse a la valencia del heteroátomo intercambiado. En realizaciones preferidas, dichas fracciones de hidroxiheterohidrocarbilo comprenden uno o más grupos funcionales seleccionados de - O-, -S-, -N(H)C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)N(H)-, -C(O)-, -C(O)-N(H)-, -N(H)-C(O)-O-, -O-C(O)-, o -S-S- en el enlazador hidrófobo.
En un aspecto de la invención, los enlazadores hidrófobos son o comprenden grupos alquileno tales como grupos alquileno lineales o ramificados, o los enlazadores son o comprenden grupos cicloalquileno. Los grupos alquileno pueden ser grupos n-alquileno o isoalquileno. Ejemplos de grupos alquileno son los grupos propileno, butileno, pentileno, hexileno, heptileno, octileno, nonileno, decileno, undecileno, dodecileno, tetradecileno o hexadecileno. Ejemplos de grupos cicloalquileno son los grupos ciclopentileno, ciclohexileno y cicloheptileno. Ejemplos de grupos alquilcicloalquilo son metilciclopentileno, etilciclopentileno, propilciclopentileno, butilciclopentileno, pentilciclopentileno, hexilciclopentileno, metilciclohexileno, etilciclohexileno, propilciclohexileno, butilciclohexileno, pentilciclohexileno y hexilciclohexileno. Uno o más de estos pueden combinarse en un enlazador hidrófobo.
Los sustituyentes hidroxilados pueden ser o comprender grupos hidroxialquilo o hidroxicicloalquilo y comprenden entre 4 y 20, preferiblemente entre 6 y 12 átomos de carbono. Tales sustituyentes hidroxilados pueden seleccionarse del grupo que consiste en grupos hidroxi-n-alquilo, grupos hidroxialquilo ramificados o grupos hidroxialquilo cíclicos y sus isómeros de constitución o conformación. En una realización preferida, los grupos hidroxialquilo son radicales de alcoholes seleccionados entre butanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol, undecanol, dodecanol, tetradecanol, hexadecanol, 2-ciclohexiletanol, 4-ciclohexilbutanol, 6-ciclohexilhexanol, 2- (2', 3' o 4' etilciclohexil)-etanol o 4-(2', 3' o 4' etilciclohexil)-butanol o 6-(2', 3' o 4' etilciclohexil)-hexanol.
En otro aspecto, los enlazadores hidrófobos son o comprenden grupos arileno y tienen entre 6 y 20, preferiblemente entre 6 y 12 átomos de carbono. Los grupos arilo que forman dichos grupos arileno incluyen grupos hidrocarbilo aromáticos (grupos arilo solo de carbono) y grupos heterohidrocarbilo aromáticos (grupos heteroarilo). Ejemplos de los primeros son fenilo, naftilo, antracenilo y fenantrilo. Los grupos heteroarilo que contienen nitrógeno preferiblemente tendrán un valor pK de <5 para evitar cargas catiónicas adicionales a pH neutro. Ejemplos de tales grupos heteroarilo que contienen nitrógeno son grupos indolilo, grupos pirazinilo, grupos piridazinilo, grupos pirimidinilo, grupos cinolinilo, grupos ftalazinilo y grupos purinilo.
Ejemplos de grupos alquilarilo son los grupos metilfenilo (toluilo), etilfenilo, 4-isopropilfenilo y xililo. Ejemplos de grupos arilalquilo (aralquilo) son los grupos bencilo, feniletilo y tritilo. Ejemplos de grupos alquilarilalquilo son los grupos metilbencilo y 4-isopropilbencilo.
Las fracciones de hidroxiarilalquilo pueden ser, por ejemplo, radicales derivados de o-, m- o p-cresol u o-, m- o petilfenol u homólogos de alquilo del mismo. Las fracciones de hidroxialquilarilalquilo pueden ser, por ejemplo, 2-(o-, m- o p-metilfenil)etanol.
Los múltiples sustituyentes hidroxilados presentes en el derivado de poliamina de la invención pueden ser iguales o diferentes. Por simplicidad, pueden ser iguales. El grupo hidroxi del sustituyente hidroxilado puede unirse a cualquier átomo de carbono del enlazador hidrófobo. Preferiblemente, el grupo hidroxilo se une a un átomo de carbono de la siguiente manera: si z es el número de átomos de carbono en la cadena de carbono más larga en el sustituyente hidroxilado (tal como el grupo hidroxialquilo) al átomo de carbono que se une a un átomo de nitrógeno de poliamina, el grupo hidroxilo está unido a un átomo de carbono en una posición que está a más de z/2 posiciones del nitrógeno de poliamina, si el átomo de carbono unido al nitrógeno de poliamina se cuenta como posición 1. Si el valor de z/2 no es un número entero, la definición anterior conduce a la posición definida por el siguiente número entero > z/2. En una realización, el grupo hidroxilo se une al átomo de carbono del enlazador hidrófobo que está más alejado (en términos de número de átomos de carbono) del átomo de nitrógeno de la poliamina al que pertenece el enlazador hidrófobo (una cadena de alquileno en el caso de grupos hidroxialquilo) está conectado. El grupo hidroxi puede estar unido al átomo de carbono que está más alejado del nitrógeno de poliamina dentro del sustituyente hidroxilado (o grupo hidroxialquilo), tal como al átomo de carbono terminal (posición omega) de dicho sustituyente (en el caso de un sustituyente hidroxilado lineal).
Los posibles grupos indicados anteriormente para los enlazadores hidrófobos pueden sustituirse siempre que se cumplan los valores de logP indicados anteriormente. Alternativamente, los posibles grupos indicados anteriormente para los enlazadores hidrófobos pueden sustituirse siempre que se cumplan los números de átomos de carbono y los números de posibles heteroátomos definidos anteriormente.
Sustituyentes hidrófobos
Los sustituyentes hidrófobos están unidos a grupos amino de la poliamina y pueden tener un logP de 1.5 a 20, preferiblemente de 2 a 15, más preferiblemente de 2.5 a 10, determinado para un compuesto obtenible a partir de dicho sustituyente hidrófobo reemplazando su enlace a un grupo amino de la poliamina por un enlace a un átomo de hidrógeno. Los métodos para determinar el logP son conocidos por el experto en la técnica y comprenden la determinación experimental de la distribución de compuestos entre el agua y las fases de 1-octanol, u obtener dichos valores de fuentes de referencia como Wikipedia, la versión en inglés, o calcular el logP usando software tal como ACD/Labs 7.0 (Advanced Chemistry Development, Ontario, Canadá).
Los sustituyentes hidrófobos comprenden al menos 2 átomos de carbono. En algunos aspectos de la invención, los sustituyentes hidrófobos tienen entre 3 y 40 átomos de carbono, preferiblemente entre 6 y 20 átomos de carbono. En aspectos preferidos, los sustituyentes hidrófobos son grupos alquilo lineales que tienen entre 6 y 40 átomos de carbono, en aspectos más preferidos el número de átomos de carbono está entre 6 y 20.
Los sustituyentes hidrófobos pueden comprender de 1 a 3, preferiblemente 1 o 2, heteroátomos, siempre que dichos sustituyentes hidrófobos comprendan 6 o más átomos de carbono. Los heteroátomos se seleccionan entre O y S. Así, los sustituyentes hidrófobos pueden ser grupos hidrocarbilo o grupos heterohidrocarbilo, comprendiendo estos últimos de 1 a 3 heteroátomos como se mencionó anteriormente. Entre la pluralidad de sustituyentes hidrófobos de una molécula de dicho derivado de poliamina, pueden existir exclusivamente grupos hidrocarbilo, exclusivamente grupos heterohidrocarbilo, o pueden existir grupos hidrocarbilo y grupos heterohidrocarbilo. En una realización, la pluralidad de sustituyentes hidrófobos son todos grupos hidrocarbilo. En otra realización, la pluralidad de sustituyentes hidrófobos son todos grupos heterohidrocarbilo.
Cuando los sustituyentes hidrófobos son grupos hidrocarbilo, pueden seleccionarse entre grupos alquilo, grupos alquenilo, grupos alquinilo, grupos cicloalquilo, grupos cicloalquenilo, grupos cicloalquilalquilo, grupos alquilcicloalquilo, grupos alquilcicloalquilalquilo, grupos arilo, grupos alquilarilo, grupos arilalquilo y grupos alquilarilalquilo y grupos que comprenden dos o más grupos de la lista anterior. Siempre que el sustituyente hidrófobo comprenda 6 o más átomos de carbono, es posible reemplazar 1, 2 o 3 de los átomos de carbono de dichos grupos hidrocarbilo por oxígeno o azufre, formando así sustituyentes heterohidrocarbilo.
En un aspecto de la invención, los sustituyentes hidrófobos son o comprenden grupos alquilo tales como grupos alquilo lineales o ramificados o grupos cicloalquilo. Los grupos alquilo pueden ser grupos n-alquilo o isoalquilo. Ejemplos de grupos alquilo son los grupos propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, undecilo, dodecilo, tetradecilo o hexadecilo. Ejemplos de grupos cicloalquilo son los grupos ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo.
Ejemplos de grupos alquenilo son los grupos propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo, heptenilo, octenilo, nonenilo, decenilo, undecenilo, dodecenilo, tetradecenilo y hexadecenilo. Ejemplos de grupos alquinilo son los grupos propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo, heptinilo, octinilo, noninilo, decinilo, undecilo, dodecinilo, tetradecilo y hexadecinilo.
Ejemplos de grupos cicloalquenilo grupos ciclopentenilo, ciclohexenilo y cicloheptenilo.
Los grupos cicloalquilalquilo son grupos en los que un grupo cicloalquilo está unido a un grupo alquileno correspondiente a un grupo alquilo. Ejemplos son ciclopentilmetilo, ciclopentiletilo, ciclohexilmetilo y ciclohexiletilo.
Los grupos alquilcicloalquilo son grupos en los que un grupo alquilo está unido a un grupo cicloalquileno correspondiente a un grupo cicloalquilo. Ejemplos de grupos alquilcicloalquilo son metilciclopentilo, etilciclopentilo, propilciclopentilo, butilciclopentilo, pentilciclopentilo, hexilciclopentilo, metilciclohexilo, etilciclohexilo, propilciclohexilo, butilciclohexilo, pentilciclohexilo y hexilciclohexilo.
Los grupos alquilcicloalquilalquilo son grupos en los que un grupo alquilo está unido a un grupo cicloalquilalquileno.
En otro aspecto de la invención, el sustituyente hidrófobo comprende grupos arilo y tiene entre 6 y 20 átomos de carbono. Los grupos arilo incluyen grupos hidrocarbilo aromáticos (grupos arilo solo de carbono) y grupos heterohidrocarbilo aromáticos (grupos heteroarilo). Ejemplos de los primeros son fenilo, naftilo y fenantrilo. Los grupos heteroarilo que contienen nitrógeno preferiblemente tienen un valor pK de <5 para evitar cargas catiónicas adicionales a pH neutro. Ejemplos de tales grupos heteroarilo que contienen nitrógeno son grupos indolilo, grupos pirazinilo, grupos piridazinilo, grupos pirimidinilo, grupos cinolinilo, grupos ftalazinilo y grupos purinilo. Los grupos heterohidrocarbilo que contienen oxígeno que forman grupos hidroxi tienen preferiblemente un pK > 12 para evitar cargas negativas a pH neutro.
Ejemplos de grupos alquilarilo son los grupos metilfenilo (toluilo), etilfenilo, 4-isopropilfenilo, metilindolilo y xililo. Ejemplos de grupos arilalquilo (aralquilo) son los grupos bencilo, feniletilo, indolilmetilo y tritilo. Ejemplos de grupos alquilarilalquilo son los grupos metilbencilo y 4-isopropilbencilo.
Derivados de poliamina
El derivado de poliamina de la invención puede ser un derivado de polialquilenimina lineal que comprende unidades de la siguiente fórmula (10):
-[CH2-NR10-(CH2)x]- (10)
en donde
x es un número entero de 1 a 10, en donde el valor de x puede ser igual o diferente entre diferentes grupos (CH2)x,
R10es hidrógeno,
el sustituyente hidroxilado que comprende un grupo hidroxilo unido a través de un enlazador hidrófobo (como se define anteriormente) al nitrógeno amínico al que R10 está unido, o
el sustituyente hidrófobo como se definió anteriormente,
cada uno de los cuales está presente en una molécula de dicha polialquilenimina entre diferentes presencias de R10.
El número de átomos de nitrógeno por molécula de dicha polialquilenimina lineal u otra fracción de poliamina del derivado de poliamina puede ser de 12 a 100000, preferiblemente de 12 a 20000, más preferiblemente de 20 a 10000 y lo más preferiblemente de 20 a 5000. Múltiples presencias de R10 puede ser el mismo de diferente.
El derivado de poliamina lineal que se definió anteriormente por medio de las unidades repetitivas de la cadena polimérica tiene grupos terminales que generalmente se forman en la producción de la poliamina subyacente. Por lo tanto, no existen limitaciones en la invención con respecto a los grupos finales. En el caso de las polietileniminas lineales, pueden existir grupos terminales hidroxietilo. Ejemplos de grupos finales son los de R8 definido a continuación.
Alternativamente, el derivado de poliamina de la invención es un derivado de polialquilenimina ramificado que comprende unidades de cada una de las fórmulas (11), (12) y (13):
-[CH2-NR10-(CH2)x]- (11)
-[CH2-NR11-(CH2)x]- (12)
y
-(CH2)y-NR102 (13)
en donde
R10 y x son como se definen anteriormente;
R11 comprende una o más unidades seleccionadas de las fórmulas (11), (12) y (13);
y es un número entero de 1 a 10, donde el valor de y puede ser igual o diferente entre diferentes grupos (CH2)y; y
donde el número de átomos de nitrógeno por molécula de dicha polialquilenimina lineal o ramificada está entre 12 y 100000.
El número de átomos de nitrógeno por molécula de dicho derivado de polialquilenimina ramificada puede ser como se define anteriormente para la polialquilenimina lineal. Ejemplos de grupos finales son los de R8 definido a continuación. El grado de ramificación en la polialquilenimina ramificada puede ser de 1 a 40 %, preferiblemente de 10 a 40 %, más preferiblemente de 15 a 30 %. El experto en la técnica sabe cómo cuantificar la ramificación de un polímero, por ejemplo a través de valoraciones de pH y cuantificación de los diferentes compartimentos de la curva de valoración o mediante análisis de 1H-RMN.
Las combinaciones de sustituyentes hidroxilados y sustituyentes hidrófobos en los derivados de poliamina se pueden caracterizar por su relación molar. Se encontró que los derivados de poliamina (tales como los derivados de polietilenimina) de la invención funcionan mejor si los sustituyentes hidroxilados y los sustituyentes hidrófobos tienen una relación molar de 10:1 a 0.1:1 (la relación O/A). En una realización preferida, la relación O/A de estos grupos es de 3:1 a 0.33:1.
Cuando se injerta sobre una poliamina, el grado de sustitución (DOS) es otra característica de relevancia. El DOS se define como el porcentaje molar de la suma de los sustituyentes hidroxilados y los sustituyentes hidrófobos por grupo amino de la poliamina. El DOS es al menos del 10 %, preferiblemente del 25 al 80 %, más preferiblemente del 30 al 60 %. Un experto en la técnica sabe cómo determinar el DOS de un derivado de poliamina. Esto se puede lograr mediante la medición de los átomos de nitrógeno residuales en un polímero, por ejemplo, utilizando la reacción de ninhidrina. Otra posibilidad es el uso de la espectroscopia 1H-RMN.
En algunos aspectos, la invención se practica con una combinación de un tipo específico de dicho sustituyente hidroxilado y un tipo específico de dichos sustituyentes hidrófobos por molécula de derivado de poliamina. En tales aspectos, la suma de átomos de carbono de un sustituyente hidroxilado más el de un sustituyente hidrófobo es de 10 a 30, preferiblemente esta suma es de 15 a 25.
En aspectos adicionales, se realizan combinaciones específicas entre el tipo de poliamina, la masa molecular de la poliamina, el tamaño del sustituyente hidroxilado y el tamaño del sustituyente hidrófobo.
En realizaciones preferidas, el derivado de poliamina tiene una fracción de polietilenimina lineal de 50 a 500 kDa (en términos de peso molecular promedio en número), el sustituyente hidroxilado es un grupo hidroxialquilo que tiene de 6 a 12 átomos de carbono y el sustituyente hidrófobo es una fracción de hidrocarbilo que tiene de 3 a 12 átomos de carbono y se selecciona de n-alquilos, alquilos cíclicos, preferiblemente de cicloalquilos como la fracción de ciclohexilo, o de arilos, preferiblemente de grupos que contienen arilo tal como un grupo fenilalquilo o alquilfenilalquilo.
En otras realizaciones preferidas, el derivado de poliamina tiene una fracción de polietilenimina ramificada de 0.5 a 2.5 kDa (en términos de peso molecular promedio en número), el sustituyente hidroxilado es un grupo hidroxialquilo que tiene de 6 a 12 átomos de carbono y el sustituyente hidrófobo es una fracción de hidrocarbilo que tiene de 3 a 12 átomos de carbono y se selecciona de n-alquilos o de arilos, preferiblemente de grupos que contienen arilo tales como fenilalquilo o alquilfenilalquilo.
En aún otras realizaciones preferidas, el derivado de poliamina tiene una fracción de polietilenimina ramificada de 50 a 100 kDa (en términos de peso molecular promedio en número), el sustituyente hidroxilado es un grupo hidroxialquilo que tiene de 6 a 12 átomos de carbono y el sustituyente hidrófobo es una fracción de hidrocarbilo que tiene de 3 a 12 átomos de carbono y puede seleccionarse de n-alquilos.
En todavía otras realizaciones preferidas, el derivado de poliamina tiene una fracción de polietilenimina ramificada de 50 a 100 kDa (en términos de peso molecular promedio en número), el sustituyente hidroxilado es un grupo hidroxialquilo que tiene 4 átomos de carbono y el sustituyente hidrófobo es una fracción de hidrocarbilo que tiene de 3 a 12 átomos de carbono y contiene un grupo arilo, preferiblemente de arilo que comprende una fracción de fenilalquilo o alquilfenilalquilo.
Hidroxialquil-alquil-poilaminas
La hidroxialquil-alquil-poliamina de la invención puede ser una hidroxialquil-alquil-polialquilenimina lineal que comprende, o consiste esencialmente en, unidades de fórmula (6):
-[CH2-NR6-(CH2)x]- (6),
en donde x es un número entero de 1 a 10, y en donde el valor de x puede ser igual o diferente entre diferentes grupos (CH2)x; R6 es hidrógeno, un grupo alquilo de fórmula CrH2r+1 o un grupo hidroxialquilo de fórmula CsH2sOH. Cada uno de estos grupos de R6 está presente en una molécula de dicha hidroxialquil-alquil-poliamina entre diferentes presencias de R6; r es un número entero de 2 a 40 y s es un número entero de 4 a 40. Las realizaciones preferidas para x son las definidas anteriormente en el contexto de la fórmula (1). El número r es preferiblemente de 4 a 20, más preferiblemente de 6 a 12. El número s es preferiblemente de 3 a 40, más preferiblemente de 5 a 20, e incluso más preferiblemente de 6 a 12.
El número de átomos de nitrógeno por molécula de dicha hidroxialquil-alquil-polialquilenimina lineal puede ser de 12 a 100000, preferiblemente de 12 a 20000, más preferiblemente de 20 a 10000, incluso más preferiblemente de 50 a 5000, y lo más preferiblemente de 200 al 2000.
La hidroxialquil-alquil-poliamina lineal que se definió anteriormente por medio de las unidades repetitivas de la cadena polimérica tiene grupos terminales que generalmente se forman en la producción de la poliamina subyacente. Por lo tanto, no existen limitaciones en la invención con respecto a los grupos finales. Ejemplos de grupos finales son los de R8 definido a continuación.
Alternativamente, dicha hidroxialquil-alquil-poliamina es una hidroxialquil-alquil-polialquilenimina ramificada. La hidroxialquil-alquil-polialquilenimina ramificada puede ser una que comprenda unidades estructurales de cada una de las fórmulas (7), (8) y (9):
-[CH2-NR6-(CH2)x ]- (7)
-[CH2-NR7-(CH2)x ]- (8)
-CH2-NR62 (9)
en donde
R6, x, r y s son como se definen anteriormente;
R7 comprende una o más estructuras seleccionadas de las fórmulas (7), (8) y (9);
y es un número entero de 1 a 10, preferiblemente de 2 a 10, más preferiblemente de 2 a 6, donde el valor de y puede ser igual o diferente entre diferentes presencias de grupos (CH2)y.
R7 puede ser un grupo de fórmula (9) o R7 comprende una o más unidades de fórmula (7) y/o (8). También es posible que R7 comprende una o más unidades de fórmula (7) y una o más unidades de fórmula (8). Como la hidroxialquilalquil-polialquilenimina es polimérica, una molécula de la misma generalmente comprende múltiples grupos R7 que difieren en estructura.
El número de átomos de nitrógeno por molécula de dicha hidroxialquil-alquil-polialquilenimina ramificada es de 12 a 100000, preferiblemente de 20 a 20000, más preferiblemente de 20 a 10000, aún más preferiblemente de 20 a 5000, y lo más preferiblemente de 100 a 2000.
El grado de ramificación en la polialquilenimina ramificada puede ser de 1 a 40 %, preferiblemente de 10 a 40 %, más preferiblemente de 15 a 30 %. El experto en la técnica sabe cómo cuantificar la ramificación de un polímero, por ejemplo mediante valoraciones de pH y cuantificación de los diferentes compartimentos de la curva de valoración.
Las relaciones molares de grupos hidroxialquilo y alquilo en la hidroxialquil-alquil-polialquilenimina descrita anteriormente pueden ser como se define a continuación. El grado de sustitución (DOS) también puede ser como se define a continuación.
En algunos aspectos, la invención se practica con combinaciones específicas de fracciones de hidroxialquilo y alquilo, cada una de las cuales está generalmente presente varias veces en la hidroxialquil-alquil-poliamina. En una realización preferida, un tipo de grupo hidroxialquilo se combina con un tipo de grupo alquilo y la suma de átomos de carbono en ambos fracciones está entre 10 y 30, en realizaciones más preferidas esta suma está entre 15 y 25.
En aspectos adicionales, se realizan combinaciones específicas entre un tipo de poliamina, masa molecular de poliamina, longitud de la fracción de hidroxialquilo y longitud de la fracción de alquilo. En una realización, la poliamina es una polietilenimina lineal de entre 2 y 30 kDa (en términos de peso molecular promedio numérico), el grupo hidroxialquilo tiene entre 5 y 9 átomos de carbono y el grupo alquilo tiene entre 6 y 16 átomos de carbono. En otra realización, la polietilenimina es un polímero ramificado de 10 kDa (Mn) y el grupo hidroxialquilo tiene 9 átomos de carbono y el grupo alquilo tiene 12 átomos de carbono.
Las combinaciones de grupos hidroxialquilo y alquilo en la hidroxialquil-alquil-poliamina se pueden caracterizar por su relación molar. Se encontró que las hidroxialquil-alquil-poliaminas (tales como las hidroxialquil-alquil-polietileniminas) de la invención funcionan mejor si las fracciones de hidroxialquilo y alquilo tienen una relación molar entre 6:1 y 0.33:1 (la relación O/A). En realizaciones preferidas, la relación O/A de estos grupos está entre 5:1 y 0.8:1. Más preferida es una relación O/A entre 5:1 y 1.5:1.
Cuando se injerta en un polímero, el grado de sustitución (DOS) es otra característica de interés. El DOS se define como el porcentaje molar de la suma de fracciones de hidroxialquilo y fracciones de alquilo por grupo amino de la poliamina. El DOS es al menos del 10 %, preferiblemente entre el 25 y el 80 %, más preferiblemente entre el 30 y el 60 %. Un experto en la técnica sabe cómo determinar el DOS de un derivado de poliamina. Esto se puede lograr mediante la medición de los átomos de nitrógeno residuales en un polímero, por ejemplo, utilizando la reacción de ninhidrina. Otra posibilidad es el uso de la espectroscopia 1H-RMN.
La siguiente tabla 3 enumera posibles realizaciones de poliaminas modificadas. Para obtener una lista de las abreviaturas de los nombres químicos, véanse los ejemplos 11 y 15.
Tabla 3
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Fabricación de derivados de poliamina
Los derivados de poliamina o la hidroxialquil-alquil-poliamina de la invención se pueden preparar mediante la modificación de cualquiera de las poliaminas descritas anteriormente con los sustituyentes hidroxilados y los sustituyentes hidrófobos descritos anteriormente. Tales métodos son bien conocidos en la técnica y se ilustran adicionalmente en los ejemplos. Por ejemplo, los sustituyentes hidroxilados y los sustituyentes hidrófobos se introducen mediante sus correspondientes compuestos halogenados derivando la poliamina en condiciones alcalinas. Se prefiere el bromo como átomo halo en estos compuestos. En una realización preferida, esto se logra mediante el uso de a,w-bromohidroxilos y bromoalcanos o bromoarilos como compuestos halo. Estas dos derivaciones se pueden realizar consecutivamente o en paralelo usando una mezcla del compuesto halohidroxilado y el compuesto hidrófobo halogenado. La relación de mezcla del compuesto halohidroxilado y el compuesto hidrófobo halogenado se elige adecuadamente para lograr la relación molar deseada de los sustituyentes hidroxilados y los sustituyentes hidrófobos en el derivado de poliamina que se va a preparar. En una aproximación, la relación molar de mezcla del compuesto halohidroxilado y el compuesto hidrófobo halogenado en la reacción de alquilación en paralelo corresponde a la relación molar de los sustituyentes hidroxilados y los sustituyentes hidrófobos en la poliamina modificada, dicha relación molar en el producto obtenido puede analizarse, por ejemplo por 1H-RMN. Pueden usarse desviaciones en la relación molar encontrada de la relación molar deseada para ajustar la relación de mezcla del compuesto halohidroxilado y el compuesto hidrófobo halogenado para obtener una poliamina modificada que tenga la relación molar deseada de sustituyentes hidroxilados y fracciones hidrófobas. Está claro para el experto en la técnica que el grado deseado de sustitución (DOS) puede lograrse y, si es necesario, ajustarse de manera similar utilizando cantidades molares relativas adecuadas del compuesto halohidroxilado y el compuesto hidrófobo halogenado, por un lado, para la cantidad de poliamina por otro lado. La reacción generalmente se lleva a cabo en un disolvente orgánico, preferiblemente un disolvente orgánico polar tal como alcoholes.
En otras realizaciones, la introducción de los sustituyentes hidroxilados y los sustituyentes hidrófobos se logra a través de la acilación utilizando los correspondientes ácidos grasos y w-hidroxiácidos o mediante la adición de Michael utilizando los respectivos derivados insaturados del sustituyente hidroxilado y el compuesto hidrófobo.
En el presente documento, las fórmulas estructurales se dan en forma no cargada o no ionizada. Sin embargo, está claro para el experto en la técnica que los átomos de nitrógeno de estas estructuras pueden protonarse, especialmente en soluciones acuosas. Por lo tanto, los compuestos definidos mediante cualquiera de estas fórmulas también comprenden los compuestos o iones en los que cualquiera de los átomos de nitrógeno está en un estado cargado.
Los derivados de poliaminas de la presente invención son diferentes a los materiales descritos en el estado de la técnica. Wakefield et al. (2005) Bioconj Chem 16(5):1204-1208 informe sobre copolímeros de aminoetilviniléter y alquilviniléteres que tienen grupos alquilo de uno a cuatro átomos de carbono. A diferencia de la presente invención, los polímeros de Wakefield no comprenden fracciones de hidroxilo, por lo que les falta un tipo esencial de grupo funcional en el polímero. Las poliaminas de la presente invención también son diferentes de las polietileniminas modificadas presentadas por van Vliet et al. (2008) en Chembiochem, 2008, 9, 1960-1967. Allí, las polietileniminas se modificaron sistemáticamente con fracciones de dodecilo, bencilo y metilo. Nuevamente, los grupos hidroxialquilo esenciales en los derivados de poliamina de la presente invención no se usan en van Vliet. Además, se produce una amplia formación de grupos amino cuaternizados mediante el uso de yoduro de metilo.
Uso de derivados de poliamina como transfectantes.
Las poliaminas modificadas tales como las hidroxialquil-alquil-poliaminas de la invención se usan para la transfección de polianiones en células. Por lo tanto, los derivados de poliamina también se denominan en este documento transfectantes de la invención. Los polianiones se pueden seleccionar del grupo de péptidos, proteínas y ácidos nucleicos. En ciertas realizaciones, los polianiones son proteínas seleccionadas de anticuerpos. En realizaciones específicas, los anticuerpos son de tipo IgG. En otras realizaciones se usan fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, Fab', fragmentos F(ab')2 enlazados por disulfuro o fragmentos F(ab')2 enlazados químicamente o fragmentos scFv. En una realización preferida, los polianiones son ácidos nucleicos.
Los ácidos nucleicos como se usan en este documento son polinucleótidos u oligonucleótidos, incluidos, sin limitación, ADN o ARN. Polinucleótido, como se usa aquí, se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser de ARN o ADN no modificado o de ARN o ADN modificado o de ADN/ARN mixto. Los polinucleótidos pueden ser de cadena simple o doble. Un plásmido es un ejemplo de un polinucleótido de doble cadena, un ARNm es un ejemplo de un polinucleótido de una sola cadena. Los oligonucleótidos, tal como se utilizan en el presente documento, se definen como moléculas con dos o más nucleótidos, a menudo más de tres, y normalmente más de diez y menos de cien, que pueden ser de ARN o ADN sin modificar o de ADN/ARN mixto o de ARN o ADN modificado. donde las modificaciones incluyen puentes de anillos tales como los que se encuentran en LNA (ácidos nucleicos bloqueados), diversas modificaciones en la posición 2' del nucleósido tal como 2'Me, 2'OMe, 2'MOE o 2'F o en donde se utilizan azúcares distintos de ribosas, tales como arabinosa en los nucleótidos 2'FANA, gliceroles en los ácidos nucleicos desbloqueados o estructuras hexitol. El tamaño de un oligonucleótido puede depender de muchos factores, incluido el uso final del oligonucleótido. Ejemplos típicos de oligonucleótidos son ARNip, inhibidores antisentido, miARN, ADNzimas y aptámeros. Esencialmente, todos los ácidos nucleicos que llevan cargas negativas en su esqueleto son compatibles para su uso con los transfectantes de la invención, esto incluye varios ácidos nucleicos modificados en el esqueleto tales como los que comprenden enlaces fosfotioato o enlaces fosfoditionato. Por el contrario, los ácidos nucleicos sin carga tales como los construidos a partir de metilfosfonatos o ácidos nucleicos peptídicos (PNA) son menos compatibles con los transfectantes de la invención.
Formación de complejos entre derivados de poliaminas y polianiones
Para transfectar un ácido nucleico u otro polianión, generalmente se realiza un complejo entre el ácido nucleico (u otro polianión) y el transfectante. La formación de complejos entre reactivos de transfección y polianiones es conocida por el experto en la técnica. En general, esto se puede lograr combinando una primera solución que comprende el transfectante y una segunda solución que comprende el polianión o ácido nucleico. Normalmente, el número de cargas catiónicas proporcionadas por el transfectante es mayor que el número de cargas negativas del polianión. Esta relación se conoce como relación N/P en la técnica, en donde N indica el número de cargas formales de nitrógeno en el transfectante y P el número de grupos fosfato en un ácido nucleico. En algunas realizaciones, la relación N/P para el uso de hidroxialquil-alquil-poliaminas en combinación con ácidos nucleicos está entre 2 y 20, en realizaciones preferidas dicha relación está entre 5 y 15 y en realizaciones incluso más preferidas, la relación N/P es 10
En otras realizaciones, la relación N/P está entre 2 y 6, más preferiblemente alrededor de 4. Dependiendo de la relación N/P, los complejos entre un ácido nucleico y un derivado de poliamina pueden tener diferentes cargas y diferentes tamaños de partículas. Los complejos que tienen un valor n /p de 10 o más tienen una carga superficial neutra o ligeramente positiva según lo determinado por las mediciones del potencial zeta. El tamaño de partícula de tales complejos está entre 200 y 1000 nm, en realizaciones preferidas entre 250 y 500 nm según lo determinado por dispersión de luz dinámica.
Los complejos que tienen un N/P de 6 o menos tienen una carga superficial neutra a negativa según lo determinado por las mediciones del potencial zeta. El tamaño de partícula de los complejos que tienen un N/P de 6 o menor está entre 50 y 500 nm, en realizaciones preferidas entre 100 y 200 nm según lo determinado por dispersión de luz dinámica.
Es bien conocido por el experto en la técnica que el tamaño de partícula y la carga superficial de una partícula son determinantes para la distribución de partículas en la circulación sistémica de un animal vertebrado, un mamífero o en humanos. Las partículas que tienen un tamaño de 150 nm o inferior pueden alcanzar el parénquima hepático desde el torrente sanguíneo mientras que las partículas grandes quedan excluidas. Por el contrario, los tumores, los sitios de inflamación o las células del estroma en el bazo pueden ser alcanzados por partículas más grandes de hasta 500 nm.
Generalmente se lleva a cabo la formación de complejos entre el transfectante de la invención y el polianión que se va a transfectar. La formación de complejos entre los polianiones, tales como el ácido nucleico, implica una interacción de carga con el transfectante. Tal interacción se logra en solución acuosa en un rango de pH entre 3 y 9 donde ambos asociados del complejo están ionizados. En algunas realizaciones el pH para la formación de complejos está entre 4 y 8 y en realizaciones preferidas dicho pH está entre 5 y 7. El pH de la solución formadora de complejo se ajusta mediante el uso de una o más sustancias tampón. En principio, se puede utilizar cualquier sustancia tampón que tenga un pK dentro del intervalo antes mencionado y que no sea tóxica para las células. En realizaciones preferidas, se utilizan los tampones a base de acetato, maleato, succinato, carbonatos, fosfatos, citrato, metiletilsulfonato (MES), Bis-Tris, Bis-Tris-propano, tris-(hidroximetil)aminometano, tricina o tampones de la serie Good tales como HEPES, TES, MOPS, BES, MOPSO, ACES, PIPES, ADA, HEPPS. Los tampones más preferidos son acetato, fosfatos, citrato o HEPES.
La solución en donde se produce la formación del complejo puede comprender otros ingredientes tales como sales o azúcares siempre que estas sustancias no compitan con la formación del complejo o sean tóxicas para las células. En realizaciones preferidas, la cantidad de sales se limita de modo que la fuerza iónica total de la solución esté por debajo de 0.2 mol/l, en realizaciones más preferidas, la fuerza iónica esté por debajo de 0.1 mol/l. Una sal bien tolerada por las células es el cloruro de sodio.
Para evitar el estrés osmótico durante la adición del complejo de transfección a las células, se pueden añadir azúcares a la solución formadora de complejo para ajustar la osmolaridad. En algunas realizaciones, la adición de azúcares está limitada para que la osmolaridad total de la solución añadida a las células esté entre 150 y 500 mosm/L, en realizaciones preferidas, la osmolaridad está entre 270 y 310 mosm/L. En realizaciones preferidas, se usan glucosa, sacarosa o trehalosa para ajustar la osmolaridad de la mezcla de transfección.
Sorprendentemente, se encontró que la mezcla de transfección también se puede preparar usando ciertos medios con composición desconocida. En muchos casos, la mezcla de transfección podría prepararse con medios de cultivo celular, tales como DMEM u Optimem (marca comercial de Life Technologies).
Los transfectantes de la presente invención pueden tener una solubilidad limitada en agua o soluciones tamponadas. La solubilidad es una función del pH y la ionización que lo acompaña de los derivados de poliamina de esta invención. Como regla general, estos compuestos tienen una mejor solubilidad en agua tras la acidificación, por ejemplo en medios que tienen un pH de 7 o menos. Por el contrario, los derivados de poliamina son fácilmente solubles en alcoholes como, por ejemplo, etanol, propanol, 1,2-dihidroxipropano o isopropanol (que también se denominan aquí colectivamente "alcohol de cadena corta") a un pH de 9 o superior. Dependiendo del pH, también es posible emplear mezclas de alcoholes de cadena corta con agua como disolvente, por ejemplo mezclas que tienen entre 33 y 100 % de etanol, propanol, 1,2-dihidroxipropano o isopropanol para formas menos ionizadas del transfectantes o mezclas que tienen entre 0 y 66 % de dichos alcoholes para formas más ionizadas de los transfectantes. En ciertas realizaciones, los transfectantes se almacenan como soluciones de reserva que contienen entre 20 y 200 mM (basado en átomos de nitrógeno en el transfectante) del transfectante en alcoholes inferiores. A continuación, pueden generarse concentraciones de trabajo de 0.1 mM a 5 mM del transfectante mediante la dilución de la reserva en una solución tampón acuosa. Típicamente, no es necesario eliminar los alcoholes más cortos de la mezcla de transfección y las células los toleran.
En una realización específica, los transfectantes se usan bajo el siguiente protocolo de transfección:
1) Los derivados de poliamina se suministran como solución 50 mM (basado en el contenido de nitrógeno) en etanol al 96 %.
2) Se prepara un tampón de transfección que comprende dihidrogenofosfato de sodio 10 mM e hidróxido de sodio 3 mM.
3) La poliamina modificada se diluye en tampón de transfección a una solución 1 mM.
4) el ARNip se diluye en tampón de transfección hasta ARNip 22 pM. Dado que la cantidad promedio de fosfatos en el ARNip es 45, la concentración total de fósforo es 1 mM
5) Las soluciones de trabajo de poliamina y ARNip se combinan en una relación de 10+1 que da como resultado una relación N/P de 10 y una concentración de ARNip en la mezcla de complejación de 2 pM.
6) Se añaden hasta 20 pl de la mezcla de transfección preparada en (5) por 100 pl de medio de células cultivadas.
En una realización alternativa, los transfectantes se utilizan con el siguiente protocolo general:
1) Los derivados de poliamina se suministran como solución 50 mM (basado en el peso del monómero) en etanol al 96 %.
2) Se prepara un tampón de transfección que comprende ácido cítrico 10 mM e hidróxido de sodio 19 mM.
3) La poliamina modificada se diluye en tampón de transfección hasta una solución 1.8 mM.
4) el ARNip se diluye en tampón de transfección a ARNip 4 pM.
5) Las soluciones de trabajo de poliamina y ARNip se combinan en una proporción de 1 1 que da como resultado una proporción N/P de 10 y una concentración de ARNip durante la complejación de 2 pM.
6) Se añaden hasta 20 pl de la mezcla de transfección preparada en (5) por 100 pl de medio de células cultivadas.
Los transfectantes que tienen un tamaño de partícula pequeño se pueden preparar usando el siguiente protocolo general 3:
1) El derivado de poliamina se suministra como solución 56 mM (basado en el contenido de nitrógeno) en 33 a 100 % de etanol, preferiblemente 70 % de etanol.
2) Se prepara un tampón de transfección que comprende dihidrogenofosfato de sodio 10 mM e hidróxido de sodio 3 mM.
3) el ARNip se diluye en tampón de transfección hasta 18 pM de ARNip. Dado que la cantidad promedio de fosfatos en el ARNip es 45, la concentración total de fósforo es 0.75 mM
4) La solución de ARNip se añade directamente a la poliamina modificada en una proporción de 20+1 que da como resultado una relación N/P de 4 y una concentración de ARNip en la mezcla de complejación de 17 pM.
5) Se añaden hasta 10 pl de la mezcla de transfección por cada 100 pl de medio de células cultivadas o administrado a animales.
Si bien la preparación de complejos de transfección a partir de dos soluciones a menudo se realiza, requiere la preparación por separado de las soluciones que contienen transfectante y ácido nucleico. Las soluciones deben estar limpias o estériles para su trabajo en cultivo celular; también pueden tener una vida útil limitada. Otra mejora es el uso de un transfectante seco que se reconstituye con tampón de transfección antes de su uso. Para ello, el transfectante se puede secar a partir de su solución en alcoholes de cadena corta. Un beneficio particular de dicho método es la provisión de alícuotas pequeñas y definidas de transfectante que tienen una vida útil muy larga. El transfectante seco se puede rehidratar con tampón de transfección. En algunas realizaciones, el transfectante seco también se puede rehidratar con una solución que ya contiene el ácido nucleico.
En otras realizaciones, el transfectante se proporciona en forma liofilizada. En un aspecto preferido de dicha realización, el transfectante se liofiliza a partir de una solución que comprende un sistema de tampón ajustado para producir un pH entre 5 y 7 y que además comprende un azúcar en una cantidad para producir una osmolaridad total de entre 100 y 500 mosm/l tras la reconstitución, por ejemplo sacarosa o trehalosa o glucosa 270 mM. En esta realización, el ácido nucleico se proporciona como una solución acuosa diluida y se usa directamente para la reconstitución del transfectante liofilizado, de modo que la hidratación y la formación de complejos se produzcan en un solo paso. A continuación, la mezcla de transfección resultante se puede añadir directamente a las células que se van a transfectar. En otra realización, el transfectante se liofiliza a partir de una solución que comprende además un azúcar en una cantidad para producir una osmolaridad de entre 100 y 500 mosm/l tras la reconstitución, por ejemplo sacarosa o trehalosa o glucosa 270 mM y el ácido nucleico se proporciona en un tampón de transfección que carece del azúcar. A continuación, el transfectante liofilizado se rehidrata con la solución de ácido nucleico que contiene los componentes del tampón, de modo que la rehidratación y la formación de complejos se produzcan simultáneamente y se reduzca el número de pasos de pipeteo.
Kits que comprenden transfectantes
Los transfectantes de esta invención se pueden comercializar en forma de kit, que opcionalmente comprende además un ARNip para reacciones de control.
En una primera realización, el kit contiene lo siguiente:
A) Una solución de transfectante en un alcohol de cadena corta, donde el alcohol puede ser etanol al 96 % y el transfectante puede tener una concentración de 50 mM (basado en los átomos de nitrógeno en el transfectante), B) Una solución tampón que tenga un pH entre 4 y 8 y una fuerza iónica inferior a 0.2, preferiblemente inferior a 0.1, C) Un manual con instrucciones completas, opcionalmente también un manual breve con instrucciones resumidas. En una segunda realización, tal kit comprende lo siguiente:
A) Una solución del transfectante como se describe en la primera realización, en donde la solución se divide en alícuotas. Preferiblemente, el número de alícuotas está entre 5 y 100, más preferiblemente el número de alícuotas está entre 6 y 20. Se prefiere además que cada alícuota contenga entre 10 y 1000 nmol de transfectante (basado en monómero),
B) Una solución tampón que tenga un pH entre 4 y 8 y una fuerza iónica inferior a 0.2, preferiblemente inferior a 0.1, C) Un manual con instrucciones completas, opcionalmente también un manual breve con instrucciones resumidas En una tercera realización, tal kit comprende lo siguiente:
A) Una solución del transfectante como se describe en la primera realización, en donde la solución se divide en alícuotas y en donde dichas alícuotas se disponen en una microplaca que tiene entre 6 y 1576 pocillos, preferiblemente 24, 96 o 384 pocillos, y donde cada alícuota contiene entre 10 y 1000 nmol de transfectante,
B) Una solución tampón que tenga un pH entre 4 y 8 y una fuerza iónica inferior a 0.2, preferiblemente inferior a 0.1, C) Un manual con instrucciones completas, opcionalmente también un manual breve con instrucciones resumidas En una cuarta realización, dicho kit comprende lo siguiente:
A) Un transfectante seco dividido en alícuotas. Preferiblemente, el número de alícuotas está entre 5 y 100, más preferiblemente el número de alícuotas está entre 6 y 20. Se prefiere además que cada alícuota contenga entre 10 y 1000 nmol de transfectante (basado en monómero),
B) Una solución tampón que tenga un pH entre 4 y 8 y una fuerza iónica inferior a 0.2, preferiblemente inferior a 0.1, C) Un manual con instrucciones completas, opcionalmente también un manual breve con instrucciones resumidas En una quinta realización, dicho kit comprende lo siguiente:
A) Un transfectante seco dividido en alícuotas, en el que dichas alícuotas se disponen en una microplaca que tiene entre 6 y 1576 pocillos, preferiblemente la microplaca tiene 24, 96 o 384 pocillos, y en el que cada alícuota contiene entre 10 y 1000 nmol de transfectante,
B) Una solución tampón que tenga un pH entre 4 y 8 y una fuerza iónica inferior a 0.2, preferiblemente inferior a 0.1, C) Un manual con instrucciones completas, opcionalmente también un manual breve con instrucciones resumidas En una sexta realización, dicho kit comprende lo siguiente:
A) Un transfectante liofilizado dividido en alícuotas. Preferiblemente, el número de alícuotas está entre 5 y 100, más preferiblemente el número de alícuotas está entre 6 y 20. Se prefiere además que cada alícuota contenga entre 10 y 1000 nmol de transfectante (basado en monómero),
B) Una solución tampón que tenga un pH entre 4 y 8 y una fuerza iónica inferior a 0.2, preferiblemente inferior a 0.1, C) Un manual con instrucciones completas, opcionalmente también un manual breve con instrucciones resumidas En una séptima realización, dicho kit comprende lo siguiente:
A) Un transfectante liofilizado dividido en alícuotas, en el que dichas alícuotas se disponen en una microplaca que tiene entre 6 y 1576 pocillos, preferiblemente 24, 96 o 384 pocillos, y en el que cada alícuota contiene entre 10 y 1000 nmol de transfectante,
B) Una solución tampón que tenga un pH entre 4 y 8 y una fuerza iónica inferior a 0.2, preferiblemente inferior a 0.1, C) un manual con instrucciones completas, opcionalmente también un manual breve con instrucciones resumidas En ciertos aspectos de la tercera, quinta y séptima realización, todos los pocillos de dicha microplaca contienen la misma cantidad de transfectante. En otros aspectos, los pocillos contienen diferentes cantidades de transfectante. Dichos diseños pueden implicar gradientes de los transfectantes en pocillos vecinos, lo que es útil durante la optimización de las relaciones N/P con los ácidos nucleicos. En aún otros aspectos, ciertos pocillos pueden estar vacíos, por ejemplo para la generación de diluciones seriadas a partir de una mezcla de complejación. Las Figuras 1 a 4 ilustran además tales diseños de cantidades dispuestas de transfectantes en el ejemplo de una placa de 96 pocillos. Complejos liofilizados de transfectante y ácido nucleico
En aún otras realizaciones, los complejos del derivado de poliamina de esta invención con uno o más ácidos nucleicos se forman, liofilizan y comercializan como un producto completo. Esta solución ofrece un grado de integración aún mayor en comparación con los productos comercializados actualmente. También brinda la oportunidad de centralizar el control de calidad del producto, incluida la formación de partículas en el sitio del fabricante. Otras ventajas de los complejos liofilizados son su larga estabilidad al almacenamiento y la ausencia de los alcoholes de cadena corta utilizados como disolvente de las poliaminas modificadas.
Los complejos liofilizados entre un derivado de poliamina y uno o más ácidos nucleicos son particularmente ventajosos para aplicaciones in vivo, incluida la investigación con animales o para uso terapéutico.
Los complejos liofilizados se pueden fabricar con cualquiera de los métodos generales 1 a 3 descritos anteriormente con la inclusión de un paso de liofilización y rehidratación después de la complejación.
En una realización específica, los complejos entre las poliaminas modificadas de la invención y uno o más ácidos nucleicos se preparan bajo el siguiente protocolo 4:
1) La poliamina modificada se suministra como una solución de 50 mM (basado en el contenido de nitrógeno) en 33 a 100 % de etanol
2) Se prepara un tampón de transfección que comprende dihidrogenofosfato de sodio 10 mM e hidróxido de sodio 3 mM.
3) La poliamina modificada se diluye en tampón de transfección a una solución 1 mM.
4) el ARNip se diluye en tampón de transfección hasta 22 pM de ARNip. Dado que la cantidad promedio de fosfatos en el ARNip es 45, la concentración total de fósforo es 1 mM
5) Las soluciones de trabajo de poliamina y ARNip se combinan en una relación de 10+1 que da como resultado una relación N/P de 10 y una concentración de ARNip en la mezcla de complejación de 2 pM.
6) Los complejos se dividen opcionalmente en alícuotas, se liofilizan, se sellan con un sello hermético y se almacenan.
7) Los complejos liofilizados se rehidratan con agua.
8) Se añaden hasta 20 pl del complejo rehidratado por 100 pl de medio de células cultivadas o se administran los complejos rehidratados a un animal o a un ser humano.
En una realización específica, los complejos entre las poliaminas modificadas de la invención y uno o más ácidos nucleicos se preparan bajo el siguiente protocolo 5:
1) La poliamina modificada se suministra como una solución de 56 mM (con base en el contenido de nitrógeno) en 33 a 100 % de etanol
2) Se prepara un tampón de transfección que comprende dihidrogenofosfato de sodio 10 mM e hidróxido de sodio 3 mM.
3) el ARNip se diluye en tampón de transfección hasta 18 pM de ARNip. Dado que la cantidad promedio de fosfatos en el ARNip es 45, la concentración total de fósforo es 0.75 mM
4) La solución de ARNip se añade directamente a la poliamina modificada en una relación de 20+1 que da como resultado una relación N/P de 4 y una concentración de ARNip en la mezcla de complejación de 17 pM.
5) Los complejos se dividen opcionalmente en alícuotas, se liofilizan, se sellan con un sello hermético y se almacenan.
6) Los complejos liofilizados se rehidratan con agua
7) Se añaden hasta 10 pl del complejo rehidratado por 100 pl de medio de células cultivadas o se administran los complejos rehidratados a un animal o a un ser humano.
La administración de ácidos nucleicos complejados a animales o seres humanos es conocida por los expertos en la técnica y los ácidos nucleicos complejados pueden administrarse por vía sistémica o tópica en las dosis requeridas para la indicación específica. Las cantidades de ácido nucleico administradas pueden variar entre 0.1 pg y 100 mg por kg de peso corporal y pueden administrarse una o varias veces o en regímenes de dosificación complejos o intermitentes, como una dosificación diaria, una dosificación cada dos días o 3 veces por semana, una vez una semana o una vez al mes o una combinación de tales regímenes.
Descripción de las figuras
Las Figuras 1-4 muestran diversos diseños para transfectantes dispuestos en microplacas. Los números en las microplacas esquemáticas indican una cantidad de transfectante en nmol (con base en nitrógeno) depositada en cada pocillo. Las figuras toman placas de 96 pocillos como ejemplo y colocan los transfectantes en ciertas filas verticales. Se entiende que pueden derivarse fácilmente diseños similares a partir de esta estructura general, por ejemplo donde los patrones se organizan horizontalmente, con pocillos más o menos vacíos, o con uso parcial de la placa.
Fig. 1 Cantidad de transfectante en nmol colocada en ciertos pocillos de una placa de 96 pocillos, distribución uniforme. Fig. 2 Cantidad de transfectante en nmol colocada en ciertos pocillos de una placa de 96 pocillos, para simplificar la optimización de la relación N/P.
Fig. 3 Cantidad de transfectante en nmol colocada en ciertos pocillos de una microplaca, incluidos pocillos vacíos para diluciones en serie de los complejos de transfección.
Fig. 4 Cantidad de transfectante en nmol colocada en ciertos pocilios de una microplaca, lo que facilita una optimización sencilla de la relación N/P y la dilución en serie de los complejos de transfección.
Ejemplos
La invención se ilustra ahora adicionalmente con los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1 - Modificación de poliaminas
La PEI lineal (base libre) que tiene una masa molecular promedio de 2 kDa o 25 kDa fue de Polysciences. La PEI ramificada (base libre) de 10 kDa de tamaño era de Aldrich. Los polímeros se disolvieron en etanol absoluto a una concentración de 250 mono-mM; es decir, la concentración de nitrógenos era de 250 mM. Propilbromuro, hexilbromuro, nonilbromuro y dodecilbromuro (todos de SIGMA) se disolvieron en etanol absoluto a 250 mM y 3-bromopropanol, 4-bromobutanol, 5-bromopentanol, 6-bromohexanol, 9-bromononaol y 12-bromododecanol se disolvieron en etanol absoluto a 500 mM . K2CO3 se usó como una solución 6 M en agua.
Para la modificación de 100 pmol de poliamina (con base en átomos de nitrógeno en el transfectante), se transfirieron con pipeta las siguientes soluciones por reacción:
- Solución de poliamina de 400 pl
- X pl del w-bromoalcohol
-Y pl del 1-bromoalcano
- etanol hasta 650 pl
-33 pl K2CO3
Todas las mezclas se sellaron y se incubaron durante 7 días a 60°C en un horno. Para las pruebas iniciales, se tomaron pequeñas alícuotas de la mezcla de reacción y se diluyeron 1:100 en 75 % de etanol/agua. Se transfirieron 42 pl de cada muestra diluida a una placa de 96 pocillos y se secaron.
Ejemplo 2 - Complejación con ARNip
Las poliaminas modificadas se hidrataron durante 20 min en 50 pl de tampón pH 4 (HAc 10 mM, NaH2PO4 10 mM, pH 4 con NaOH). Se añadieron 50 pl de un ARNip (2 pM en tampón pH 4) y después de 2-3 min la solución de polímero-ARNip se llevó a pH 7 utilizando 10 pl de NaOH 160 mM.
Ejemplo 3 - Cultivo de células
Las células HeLa se cultivaron en 100 pl de medio RPMI1640 (PAA Lab GmbH) complementado con FCS al 10 % (Sigma-Aldrich), solución 1x Pen/Strep (PAA lab GmbH) (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y se sembraron a una densidad de 4000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos. La densidad de células vivas se midió utilizando el contador Countess Cell (Invitrogen). Las células se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 °C y 5 % de CO2. 24 h después de la siembra, las células se suministraron con medio completo nuevo y se transfectaron el mismo día.
Ejemplo 4 - Transfección de células
Las células HeLa se transfectaron con los complejos de poliamina-ARNip transfiriendo 10 pl de material obtenido en el ejemplo 2 por pocillo. Esta adición da como resultado una concentración de ARNip de PLK-1 100 nM en el medio de cultivo celular. Las células se cultivaron durante tres días a 37 °C y 5 % de CO2 en una incubadora humidificada sin cambiar el medio de cultivo.
Ejemplo 5 - Tipo de ARNip
El ARNip utilizado aquí se direcciona al gen PLK-1, cuyo producto es un componente esencial en el ciclo celular. La subregulación de la proteína diana da como resultado la detención mitótica y la apoptosis. Por lo tanto, la transfección de células se controla mediante un ensayo de viabilidad celular. El ARNip dirigido a PLK-1 y un ARNip de control no relacionado utilizado en este documento fueron publicados por Haupenthal et al. (2007) Int J Cáncer, 121,206-210.
Ejemplo 6 - Ensayo de viabilidad
Se probó la viabilidad de las células después de tres días usando el ensayo Cell Titer Blue (CTB, Promega). Se descartó el medio y se suministró a las células medio completo fresco complementado con el reactivo CTB (5:1, vol/vol). 90-100 min después de la incubación a 37 °C y 5 % de CO2 en una incubadora humidificada, las muestras se transfirieron a una placa de fluorescencia negra y el cambio de color de las muestras se midió mediante un lector de fluorescencia a Ex560nm/Em590nm. La señal se normalizó al 100 % utilizando células no tratadas cultivadas en la misma placa de cultivo y al 0 % con pocillos en los que no se sembró ninguna célula.
Ejemplo 7 - Transfección con poliaminas modificadas
Las siguientes tablas muestran el % de células vivas en relación con un cultivo no tratado como medida para la subregulación de PLK-1 después de la transfección celular. Las mediciones que utilizan el ARNip no relacionado y no direccionado se realizaron en paralelo y la relación de ambos valores (PLK-1/control) se muestra aquí como la relación S/N. Las reacciones inespecíficas de los complejos de transfección se caracterizan por relaciones S/N alrededor de 1, las reacciones específicas tienen relaciones S/N sustancialmente por debajo de 1. Para una mejor legibilidad, se resaltaron los valores de S/N por debajo de 0.7. Los valores de DOS se calculan a partir de las relaciones molares de w-bromoalcohol y 1-bromoalcano utilizadas para la poliamina de acuerdo con el Ejemplo 1.
Tabla 4 - Transfección usando polietilenimina lineal modificada, 2kDa
PEI 2k, solo hidroxialquilación
PLK-1 S/N
DOS DOS
Tipo hidroxialquilo 30 % 60 % 100 % Tipo hidroxialquilo 30 % 60 % 100 %
C2 84 83 73 C2 1.0 1.0 1.0
C3 89 89 79 C3 1.0 1.0 1.0
C4 95 93 91 C4 1.1 1.1 1.0
C5 96 93 89 C5 1.0 1.0 1.0
C6 97 99 104 C6 1.0 1.0 1.0
C9 28 80 95 C9 1.0 0.9 1.0
PEI 2k, solo alquilación
PLK-1 S/N
DOS DOS
Tipo alquilo 15 % 30 % 50 % Tipo alquilo 15 % 30 % 50 %
C3 101 105 106 C3 1.0 1.0 1.0
C6 91 61 64 C6 1.0 0.9 0.9
C9 94 37 107 C9 1.0 0.8 1.0
C12 53 92 112 C12 1.0 0.9 1.0
PEI2k, hidroxialquilación y alquilación combinadas
Hidroxialquilo C9
Alquilo C3-C12
O/A 2.7
PLK-1 S/N
DOS DOS
Tipo alquilo 23 % 47 % 78 % Tipo alquilo 23 % 47 % 78 %
C3 25 24 21 C3 1.1 0.8 0.9
C6 24 20 44 C6 0.8 1.0 1.0
C9 25 20 83 C9 1.1 0 4 0.9
C12 38 58 78 C12 1.8 1.1 0.8
Tabla 5 - Transfección usando polietilenimina lineal modificada, 25kDa
PEI 25k, solo hidroxialquilación
PLK-1 S/N
DOS DOS
Hidroxi-alquilo 30 % 60 % 100 % Hidroxi-alquilo 30 % 60 % 100 %
C2 91 92 84 C2 1.0 1.0 1.0
C3 98 94 89 C3 1.1 1.2 1.0
PEI 25k, solo hidroxialquilación
PLK-1 S/N
DOS DOS
Hidroxi-alquilo 30 % 60 % 100 % Hidroxi-alquilo 30 % 60 % 100 %
C4 94 93 93 C4 1.0 1.0 1.0
C5 88 87 83 C5 1.0 1.1 1.0
C6 100 91 92 C6 1.1 1.0 1.0
C9 27 86 90 C9 1.0 1.1 1.0
PEI 25k, solo alquilación
PLK-1 S/N
DOS DOS
Alquilo 15 % 30 % 50 % Alquilo 15 % 30 % 50 %
C3 107 101 100 C3 1.1 1.0 1.0
C6 42 43 42 C6 1.0 1.1 1.1
C9 67 55 101 C9 1.0 1.0 1.0
C12 56 93 109 C12 0.9 1.0 1.0
PE125k, hidroxialquilación y alquilación combinadas
hidroxialquilo C5
alquilo C3-C12
O/A 0.8
PLK-1 S/N
DOS DOS
Alquilo 19 % 38 % 64 % Alquilo 19 % 38 % 64 %
C3 96 96 97 C3 1.1 1.1 1.1
C6 76 40 31 C6 1.2 1.4 04
C9 87 82 39 C9 1.0 08 05
C12 91 38 33 C12 1.0 0.5 0.7
Tabla 6 - Transfección usando polietilenimina ramificada modificada, 10kDa
PEI 10k ramificado, solo hidroxialquilación
PLK-1 S/N
DOS DOS
Hidroxi-alquilo
Hidroxi-alquilo 30 % 60 % 100 % 30 % 60 % 100 %
C2 81 83 85 C2 1.0 1.0 1.1
C3 81 83 84 C3 1.0 1.0 1.1
C4 82 82 85 C4 1.0 0.9 1.0
C5 88 89 88 C5 1.0 1.0 1.0
C6 77 75 84 C6 0.9 0.9 0.9
C9 27 46 57 C9 1.0 1.1 0.9
PEI 10k ramificado, solo alquilación
PLK-1 S/N
DOS DOS
Alquilo 15 % 30 % 50 % Alquilo 15 % 30 % 50 %
C3 88 88 90 C3 0.9 0.9 1.0
C6 42 32 29 C6 0.6 0.6 0.5
C9 38 37 102 C9 0.6 0.7 1.0
C12 57 103 103 C12 0.8 1.0 1.0
PEI 10k ramificado, hidroxialquilación y alquilación combinadas
Hidroxialquilo C9
Alquilo C3-C12
O/A 1.5
PLK-1 S/N
DOS DOS
Alquilo 21 % 42 % 71 % Alquilo 21 % 42 % 71 %
C3 36 26 32 C3 0.9 1.0 1.1
C6 29 31 83 C6 1.1 0 6 1.1
C9 31 34 66 C9 07 0 6 0.8
C12 29 15 74 C12 0.9 0 4 0.8
Las polietileniminas utilizadas en el presente documento son transfectantes inactivos en las condiciones del ensayo. Una única modificación con fracciones de alquilo o hidroxialquilo puede reducir la viabilidad celular; esto es típicamente el caso de las fracciones de alquilo o hidroxialquilo de cadena larga. Sin embargo, estos efectos son inespecíficos en todo el panel de prueba, como lo demuestran los valores de S/N que están alrededor de 1 en todos estos casos.
La modificación combinada con fracciones de hidroxialquilo y alquilo muestra una mayor actividad sobre las células, reduce la viabilidad celular en mayor medida. Lo que es más importante, los polímeros comodificados ahora median un efecto específico del ARNip codificante contra PLK-1 con relaciones S/N que con frecuencia están muy por debajo de 1.
Ejemplo 8 - eficiencia de transfección en diferentes tipos de células
Transfectante: La PEI ramificada se modificó con 9-bromononanol y dodecilbromuro como se describe en el ejemplo 1. La reacción se alimentó para lograr un grado de sustitución de aproximadamente el 45 %, la relación entre los modificadores fue de aproximadamente 3. La PEI modificada se purificó de la mezcla de reacción usando cromatografía de exclusión por tamaño.
Complejación: El transfectante purificado se proporcionó en una solución que contenía etanol al 30 % y NaOH 10 mM. Los polímeros se diluyeron en tampón D (citrato 10 mM, ajustado a pH 5.0 con NaOH) o tampón F (fosfato 10 mM, ajustado a pH 6.5 con NaOH) a una concentración de 4 mM. Para obtener una relación de NP de 10, se complejaron 150 |jl de los polímeros diluidos con 150 j l de una solución de ARNip 10 jM (Plk1 o control codificado) en tampón D o F. Se realizaron diluciones en serie de estos complejos en los tampones respectivos en una placa de 96 pocillos para obtener concentraciones de 500 nM a 2 nM en las células.
Transfección: Las células se transfectaron con los complejos de polímero-ARNip transfiriendo un volumen de 10 jl/pocillo desde la “placa de complejación” a la placa celular (columnas 1-10). Las células se cultivaron durante tres días a 37 °C y 5 % de CO2 en una incubadora humidificada sin cambiar el medio de cultivo.
Ensayo de viabilidad: Se analizó la viabilidad de las células después de tres días usando el ensayo Cell Titer Blue (CTB, Promega). Se descartó el medio y se suministró a las células medio completo fresco complementado con el reactivo CTB (120 jl, 5:1, vol/vol). Para las células NIH3T3, Jurkat y THP-1, el reactivo medio CTB se añadió directamente al medio celular, sin desecharlo. 90-100 min (240 min para células NIH3T3, Jurkat y THP-1) después de la incubación a 37 °C y 5 % de CO2 en una incubadora humidificada, las muestras se transfirieron a una placa de fluorescencia negra y el cambio de color de las muestras se midió mediante un lector de fluorescencia en Ex560nm/Em590nm.
Tabla 7 - Lista de tipos de células
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000025_0001
El rendimiento de la poliamina modificada se midió como EC50, la concentración de ARNip necesaria para una inhibición del crecimiento celular del 50 %. Paralelamente, se llevó a cabo la misma prueba usando un ARNip no relacionado y también se calculó el valor EC50. La relación señal-ruido se define entonces como la relación entre EC50 (control) y EC50 (PLK-1).
Tabla 8 - Transfección y relación señal a ruido para una poliamina modificada
Figure imgf000025_0002
Los datos demuestran una transfección muy eficiente del ARNip en diferentes tipos de células, incluido el crecimiento de células en suspensión. La reacción de transfección es muy bien tolerada por las células con pocos o casi ningún signo de toxicidad, indicado por relaciones señal a ruido de 4 o más.
Ejemplo 9: eficiencia de transfección y relación señal a ruido de reactivos comerciales
En el mismo experimento que se describe en el ejemplo 8, se probaron varios transfectantes comerciales en paralelo, los resultados de dicha prueba se enumeran en la tabla 9.
Transfectantes comerciales: Interferin (Polyplus, Francia), Ribocellin (BioCellChallenge, Alemania), TransIT-TKO (Mirus, EE. UU.), siPort NeoFX (Ambion/Life Technologies Corp.), Dharmafect (Dharmacon/ Thermo Fisher) y Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen/Life Technologies Corp.) fueron manipulados y complejados con Plk1 y ARNip scr de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron diluciones en serie en Optimem I (Gibco/Life Technologies) para obtener concentraciones de ARNip de 100 nM a 2 nM en las células.
Tabla 9 - Transfección y relación señal a ruido para reactivos comerciales
Figure imgf000025_0003
Aunque la transfección se pudo lograr en muchos casos, en particular con los reactivos Dharmafect y RNAiMAX, las relaciones señal a ruido son mucho más bajas a lo largo de la prueba.
Ejemplo 10 - Caracterización analítica
Transfectante: Se modificaron 5 mmol de PEI ramificada con 9-bromononanol y dodecilbromuro como se describe en el ejemplo 1, todos los demás reactivos se llevaron a escala. El grado de sustitución buscado fue de aproximadamente 45 %, la relación entre los modificadores de aproximadamente 1.5. La PEI modificada se purificó de la mezcla de reacción usando cromatografía de exclusión por tamaño en NaOH 10 mM, etanol al 96 %.
Análisis: Se mezcló 1 ml de la solución que contenía el analito con 0.5 ml de ácido metoxiacético 100 mM y 25 pl de NaOH 2N. La mezcla se secó al vacío, se disolvió en 700 pl de CD3OD y se analizó mediante 1H RMN. Señales: ácido metoxiacético 4.0 ppm; Esqueleto de bPEI 2.5-2.8 ppm, CH3 terminal de la fracción de alquilo 0.8 ppm y CH2-OH terminal del hidroxialquilo 3.2 ppm.
Tabla 10 - Análisis del espectro 1H-RMN
Figure imgf000026_0003
Ejemplo 11: Más derivados de poliamina
Las siguientes poliaminas se sometieron a la reacción de modificación descrita en el ejemplo 1:
Tabla 11: Poliaminas
Figure imgf000026_0001
Los polímeros se disolvieron en etanol absoluto a una concentración de 250 mono-mM; es decir, la concentración de nitrógeno era de 250 mM.
Los compuestos hidroxilo para la modificación de poliaminas se eligieron de la siguiente tabla 12 y se disolvieron en etanol absoluto a una concentración de 250 mM:
Tabla 12: Compuestos hidroxilados para la modificación de poliaminas.
Figure imgf000026_0002
Los compuestos hidrófobos para la modificación de las poliaminas se eligieron de la siguiente tabla 13 y además se disolvieron en etanol absoluto a una concentración de 250 mM:
Tabla 13: Compuestos hidrófobos para la modificación de poliaminas.
Figure imgf000027_0002
Para la modificación de 100 pmol de poliamina (con base en monómero), se transfirieron con pipeta las siguientes soluciones por reacción:
Solución de poliamina de 400 pl
- X pl del compuesto de hidroxilo bromado
-Y pl del compuesto de hidrocarburo bromado
- Etanol absoluto hasta 650 pl
-33 pl K2CO3
Las cantidades combinadas de X+Y se eligieron para un grado de sustitución de los grupos amino de la poliamina entre 0 y 100 % y X e Y se seleccionaron adicionalmente para complementarse entre sí y dar varias relaciones O/A entre 0 (solo sustituyentes hidrófobos) y el uso exclusivo del sustituyente hidroxilado, indicado como O/A=99 en las tablas siguientes.
Todas las mezclas se sellaron y se incubaron durante 7 días a 60°C en un horno. Luego, se agregaron 250 pl de NaOH 2N, las mezclas se sellaron nuevamente y se incubaron por otros 2 días a 60°C. Para las pruebas iniciales, se tomaron pequeñas alícuotas de la mezcla de reacción y se diluyeron 1:100 en 75 % de etanol/agua. Se transfirieron 42 pl de cada muestra diluida a una placa de 96 pocillos y se secaron.
Ejemplo 12: Transfección de ARNip utilizando poliaminas modificadas.
Las poliaminas modificadas del ejemplo 11 se complejaron con ARNip direccionado a PLK-1 y se probaron sus propiedades de transfección como se describe en los ejemplos 2 a 6 con la excepción del uso de tampón F (NaH2PO4 10 mM, sacarosa 225 mM, pH 7.2 (ajustado con NaOH)) para la complejación y transfección de ARNip. Los resultados de las reacciones de transfección se describen en la tabla 14.
Tabla 14: transfección de ARNip utilizando ciertas poliaminas en las que el grupo hidrófobo es un alquilo o arilo. Los números más bajos indican una transfección exitosa de las células y se resaltan para valores <=50.
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0001
Los datos de esta tabla 14 demuestran que muchas de las poliaminas modificadas son capaces de transfectar células con ARNip. El grupo hidrófobo se seleccionó de fracciones de alquilo alifático o cíclico o de diversos componentes de arilo y todos dieron como resultado la formación de vehículos activos independientemente de sus diferencias estructurales.
Los vehículos activos se formaron a partir de poliaminas que tenían pesos moleculares muy diferentes y arquitectura diferente (lineal o ramificada). También es evidente a partir de los datos que el hidroxilo y los componentes hidrófobos actúan sinérgicamente, mientras que las modificaciones individuales contribuyen poco, si es que lo hacen, a las propiedades del vehículo.
Ejemplo 13: Transfección de plásmidos
Cultivo de células: Las células HeLa se cultivaron en 100 pl de medio RPMI1640 (PAA Lab GmbH) complementado con FCS al 10 % (Sigma-Aldrich), solución 1x Pen/Strep (PAA lab GmbH) (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y se sembraron a 8000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos. Las células se cultivaron en una incubadora humidificada a 37 °C y 5 % de CO2. 24 h después de la siembra, las células se suministraron con medio completo nuevo y se transfectaron el mismo día.
Complejación: Las poliaminas se proporcionaron en placas de 96 pocillos, cada una de las cuales contenía polímero 3 mM en etanol al 70 %. Se proporcionó ADN de plásmido (pCMV-Luc) como solución madre de 0.011 pg/pl en tampón F (NaH2PO4 10 mM, sacarosa 225 mM, pH 7.2 (ajustado con NaOH)). Se complejaron 10 pl de poliaminas con 90 pl de plásmido-ADN mediante mezcla. 10-15 minutos después de la complejación, se usaron 10 pl de la mezcla para la transfección de células HeLa, lo que dio como resultado 100 ng de plásmido-ADN/pocillo.
Determinación de la expresión de luciferasa: Las células se prepararon para la cuantificación de luciferasa 24 horas después de la transfección. Por lo tanto, las placas de cultivo se equilibraron a temperatura ambiente durante aprox.
10 minutos. Después de desechar el medio, las células se lavaron una vez con PBS. Las células se sometieron a lisis utilizando 100 pl de 1xBeetle Lysis Juice (PJK GmbH, Alemania) y se prepararon para la medición de la luminiscencia 5 minutos después. La expresión de luciferasa se cuantificó utilizando un lector de placas de luminiscencia TECAN. Ejemplo 14: Resultados para la transfección de plásmidos
Las poliaminas modificadas del ejemplo 11 se acomplejaron con plásmido y se analizaron sus propiedades de transfección como se describe en el ejemplo 13.
Los resultados de las reacciones de transfección se describen en la tabla 15 para poliaminas modificadas en las que la fracción hidrófoba es un alquilo alifático o cíclico o un arilo o alquilarilo.
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Los datos de esta tabla 15 demuestran que muchas de las poliaminas hidrofobizadas hidroxiladas son capaces de transfectar un plásmido en células. El grupo hidrofílico se seleccionó de alquilo alifático o cíclico o diversas fracciones de arilo y todos dieron como resultado la formación de vehículos activos independientemente de sus diferencias estructurales.
Los vehículos activos se formaron a partir de poliaminas que tenían pesos moleculares muy diferentes, arquitectura diferente (lineal o ramificada). También es evidente a partir de los datos que los componentes hidroxilo e hidrófobo actúan sinérgicamente, mientras que las modificaciones individuales contribuyen poco a las propiedades del vehículo. Ejemplo 15: Síntesis de diversas oligoesperminas hidroxiladas e hidrofobizadas y homólogos de las mismas.
Partiendo del 1,4-diamino butano comercialmente disponible (1_) el intermedio central 21 se obtuvo en una síntesis de tres pasos.
Figure imgf000031_0001
Compuesto 2 es fácilmente accesible mediante la adición de acrilonitrilo al 1,4-diamino butano (1) en el paso a. Después de esto, se introdujeron dos grupos de protección boc en la molécula, lo que llevó al compuesto 3. El nitrilo 3 luego se redujo con hidrógeno en presencia de exceso de butilamina para dar 21
Esquema 2: La reacción de oligomerización
Para la formación de oligoesperminas, 21 se hizo reaccionar con 1,4-diclorobut-2-in en condiciones estándar de alquilación para dar el dímero 41, el trímero 42 y una serie de oligómeros más largos.
Figure imgf000031_0002
Desafortunadamente la fracción N-CH2-C=C no es estable y susceptible de escisión. Por tanto, el triple enlace de los compuestos 41, 42 o los oligómeros superiores se redujeron seguido de la eliminación de los grupos Boc.
Se llevaron a cabo reacciones análogas utilizando 1,5-diaminopentano o 1,6-diaminohexano como material de partida.
1, dando lugar a una serie de homólogos de oligoespermina o polialquileniminas en los que la variable x que indica el espacio entre los grupos de nitrógeno oscila entre 2 y 3, 2 y 4 o 2 y 5.
Además de la formación de los homólogos de oligoespermina, el tamaño de los sustituyentes hidrófobos se varió sistemáticamente entre butilo (como se ilustra en este ejemplo), etilo, hexilo y decilo, lo que produjo una matriz de polialquileniminas que tienen variaciones en sus grupos alquileno, sus sustituyentes hidrófobos y su grado de oligomerización.
Las oligoesperminas y sus homólogos (todas las polialquileniminas de este ejemplo) se desalinizaron usando Sephadex G25 y los oligómeros individuales se purificaron usando cromatografía de intercambio iónico en CM-Sepharose Fast Flow y SP-Sepharose Fast Flow. Las oligoesperminas eluyen de la columna de intercambio iónico según su grado de polimerización y se indican con números romanos del I al XII, donde los números más altos representan oligómeros más largos. El grado de polimerización se determinó con espectroscopia de masas y varió desde trímeros hasta aproximadamente eicosámeros.
Las fracciones que contenían los oligómeros separados se extrajeron del tampón utilizando diclorometano en condiciones básicas, se secaron al vacío y se disolvieron en etanol absoluto a una concentración de nitrógeno de 250 mM.
En un paso posterior, se derivaron muestras de 50 pmol de cada oligómero con 0, 10, 15, 20 o 25 pmol de los wbromoalcanoles O2, O4, O6, O9 u O12 siguiendo el protocolo general del ejemplo 11.
Ejemplo 16: Transfección de células utilizando hidroxilo-hidrocarburo-oligoesperminas
La prueba de transfección de las diversas oligoesperminas hidroxiladas e hidrofobizadas y sus respectivos homólogos se realizó utilizando el ARNip direccionado a PLK-1, las células HeLa y las condiciones y ensayos de cultivo celular descritos en los ejemplos 2 a 7. La siguiente tabla 16 es una lista de los resultados obtenidos utilizando las hidroxilohidrocarburos-oligoesperminas como transfectantes para ARNip.
Tabla 16: Inhibición de la viabilidad celular de las células HeLa tras la transfección de un ARNip citotóxico usando oligoesperminas hidrofobizadas hidroxiladas. Los numerales x indican las longitudes oscilantes de las unidades de alquileno de acuerdo con la fórmula (1), los numerales romanos para los oligómeros indican el grado de polimerización de los oligómeros. Los números de la tabla muestran la viabilidad celular restante, los números bajos indican una transfección eficiente.
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0002
Los datos de esta tabla 16 demuestran que muchas de las oligoesperminas hidrofobizadas hidroxiladas son capaces de transfectar células. Los vehículos activos se formaron a partir de oligoesperminas que tenían pesos moleculares muy diferentes y tenían una arquitectura molecular diferente a medida que variaba el espacio entre los átomos de nitrógeno. También es evidente a partir de los datos que los componentes hidroxilo e hidrófobo actúan sinérgicamente, ya que las oligoesperminas alquiladas muestran poca actividad en la transfección celular mientras que la introducción de las fracciones de hidroxilo conduce a estructuras portadoras activas.
Ejemplo 17: Partículas neutras y aniónicas de poliaminas modificadas y ácido nucleico: Se prepararon tampones que contenían sacarosa 280 mM, dihidrogenofosfato de sodio 10 mM e hidróxido de sodio 3 mM (pH 6.5) o hidróxido de sodio 7 mM (pH 7.2). Se prepararon soluciones madre del ARNip del ejemplo 5 en los tampones para obtener 10 veces las concentraciones enumeradas en la tabla 20.
La poliamina modificada del ejemplo 8 se proporcionó como una solución que tenía una concentración de poliamina modificada 56 mM (como mono-mM) en etanol al 96 %; se mezclaron rápidamente 50 pl de dicha solución de la poliamina modificada con 4.1 ml de cualquiera de los tampones. Se determinaron las formas coloidales y el tamaño de partícula y el potencial zeta de la fase dispersa utilizando un MALVERN Zetasizer 3000HSA.
Se mezclaron rápidamente 900 pl de las diversas soluciones de ARNip con las dispersiones de la poliamina modificada en tampón para obtener las relaciones N/P enumeradas en la tabla 17 y se registraron nuevamente el tamaño y el potencial zeta.
Tabla 17: Tamaño y potencial zeta de complejos entre una poliamina modificada y ARNip que tienen varias relaciones N/P.
Figure imgf000033_0001
Observaciones generales: las poliaminas modificadas se hacen a partir de partículas que tienen un tamaño de aproximadamente 500 nm y un potencial zeta casi neutro. La adición de pequeñas cantidades de ARNip que dan como resultado relaciones N/P de 20 o superiores no altera sustancialmente el tamaño o la carga superficial de las partículas. Sin embargo, la adición de grandes cantidades de ARNip condujo a la formación de partículas aniónicas de aproximadamente el mismo tamaño. Cantidades intermedias de ARNip (NP=9...15) conducen a un potencial zeta intermedio y a la formación de agregados. El comportamiento de los sistemas puede entenderse como la interacción de dos polielectrolitos de carga opuesta, donde la agregación ocurre bajo las condiciones de neutralización de carga como se describe en Endert et al. (2004) "Nanocapsules from liposomal templates", pp. 238-248 in Carrier Based Drug Delivery, Oxford University Press.
Ejemplo 18: Transfección con complejos aniónicos o neutros
Los complejos se produjeron a partir de una poliamina modificada y un ARNip direccionado a PLK-1 o un ARNip de control no direccionado como en el ejemplo 17. Las relaciones N/P fueron 3 y 20 y el pH del tampón fue 7.2. Los materiales resultantes se ajustaron a concentraciones iguales de ARNip y se probó su capacidad para transfectar células HeLa en las condiciones descritas en los ejemplos 2 a 7.
Los valores EC50 resultantes y las relaciones señal:ruido se enumeran en la tabla 18 a continuación.
Tabla 18: propiedades de transfección de complejos que tienen diferentes relaciones N/P.
Figure imgf000034_0001
Los datos demuestran que tanto los complejos neutros que tienen un N/P de 20 como los complejos aniónicos que tienen un N/P de 3 son transfectantes activos. El valor EC50 del complejo N/P=3 indica una actividad algo menor de los materiales aniónicos. Sin embargo, una inspección crítica de los datos debe tener en cuenta la presencia de algunos ARNip no complejados en estos complejos, ya que se demostró que la inversión de carga es completa en N/P de aproximadamente 6. La relación de señal-ruido de los complejos aniónicos parece ser incluso mayor que la de los materiales neutros.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Uso de un derivado de poliamina para la transfección in vitro de polianiones en células, comprendiendo dicha poliamina:
una fracción de poliamina seleccionado de polialquileniminas, que comprende una pluralidad de grupos amino; una pluralidad de sustituyentes hidroxilados que comprenden un grupo hidroxilo unido a través de un enlazador hidrófobo a grupos amino de dicha fracción de poliamina, en donde cada uno de dichos sustituyentes hidroxilados comprende de 4 a 40 átomos de carbono, y cada uno de dichos enlazadores hidrófobos puede comprender de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N y S, en donde dichos sustituyentes hidroxilados son grupos hidroxihidrocarbilo o grupos hidroxiheterohidrocarbilo; y
una pluralidad de sustituyentes hidrófobos unidos a grupos amino de dicha fracción de poliamina, en donde cada uno de dichos sustituyentes hidrófobos comprende al menos 2 átomos de carbono y puede comprender de 1 a 3 heteroátomos siempre que dicho sustituyente hidrófobo tenga al menos 6 átomos de carbono, en donde dichos sustituyentes hidrófobos son grupos hidrocarbilo o grupos heterohidrocarbilo, y dichos 1 a 3 heteroátomos se seleccionan de O y S.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde cada uno de dichos sustituyentes hidroxilados comprende de 4 a 20 átomos de carbono, y preferiblemente de 6 a 12 átomos de carbono, y/o en donde cada uno de dichos sustituyentes hidrófobos comprende de 3 a 40 átomos de carbono.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dichas polialquileniminas son polietileniminas, polipropileniminas, polibutileniminas u oligoesperminas, y en donde dicha fracción de poliamina comprende de 12 a 100000 átomos de nitrógeno, más preferiblemente de 20 a 5000 átomos de nitrógeno.
4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho derivado de poliamina es un derivado de polialquilenimina lineal que comprende unidades de la siguiente fórmula (10):
-[CH2-NR10-(CH2)x]- (10)
en donde
x es un número entero de 1 a 10, en donde el valor de x puede ser el mismo o diferente entre diferentes grupos (CH2)x, R10 es hidrógeno, un sustituyente hidroxilado que comprende un grupo hidroxilo unido a través de un enlazador hidrófobo al nitrógeno amínico al que R10 está unido, o un sustituyente hidrófobo, cada uno de los cuales está presente en dicho derivado de polialquilenimina entre diferentes presencias de R10,
o
en donde dicho derivado de poliamina es un derivado de polialquilenimina ramificado que comprende unidades de cada una de las fórmulas (11), (12) y (13):
-[CH2-NR10-(CH2)x]- (11)
-[CH2-NR11-(CH2)x]- (12)
y
-(CH2)y-NR102 (13)
donde
R10 y x son como se definen anteriormente;
R11 comprende una o más unidades seleccionadas de las fórmulas (11), (12) y (13);
y es un número entero de 1 a 10, donde el valor de y puede ser igual o diferente entre diferentes grupos (CH2)y; y donde el número de átomos de nitrógeno por molécula de dicha polialquilenimina lineal o ramificada es de 12 a 100000.
5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la relación molar de sustituyentes hidroxilados a sustituyentes hidrófobos en dicho derivado de poliamina está dentro del rango de 10:1 a 0.1:1, preferiblemente de 3:1 a 0.33:1.6
6. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, siendo dicho derivado de poliamina una hidroxialquil-alquil-poliamina, en donde dichos sustituyentes hidroxilados de dicho derivado de poliamina son grupos hidroxialquilo, y dichos sustituyentes hidrófobos de dicho derivado de poliamina son grupos alquilo.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dichas fracciones de hidroxialquilo de dicha hidroxialquil-alquilpoliamina son todas iguales y dichas fracciones de alquilo de dicha hidroxialquil-alquil-poliamina son todas iguales, y la suma de átomos de carbono en la fracción de hidroxialquilo y la fracción de alquilo es de 10 a 30, preferiblemente de 15 a 25.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde dicha hidroxialquil-alquil-poliamina es una hidroxialquilalquil-polialquilenimina lineal que comprende unidades de la siguiente fórmula (6):
-[CH2-NR6-(CH2)x]- (6)
en donde
x es un número entero de 1 a 10, en donde el valor de x puede ser el mismo o diferente entre diferentes grupos (CH2)x, R6 es hidrógeno, CrH2r+i o CsH2sOH, cada uno de los cuales está presente en dicha hidroxialquil-alquil-polialquilenimina entre diferentes presencias de R6,
r es un número entero de 2 a 40,
s es un número entero de 4 a 40;
o
en donde dicha hidroxialquil-alquil-poliamina es una hidroxialquil-alquil-polialquilenimina ramificada que comprende unidades de cada una de las fórmulas (7), (8) y (9):
-[CH2-NR6-(CH2)x]- (7)
-[CH2-NR7-(CH2)x]- (8)
y
-(CH2)y-NR62 (9)
en donde
R6, x, r y s son como se definen anteriormente;
R7 comprende una o más unidades seleccionadas de las fórmulas (7), (8) y (9);
y es un número entero de 1 a 10, en donde el valor de y puede ser igual o diferente entre diferentes grupos (CH2)y; y en donde el número de átomos de nitrógeno por molécula de dicha hidroxialquil-alquil-polialquilenimina lineal o ramificada está entre 12 y 100000.
9. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde al menos el 10 % en moles, preferiblemente entre el 25 y el 80 % en moles, más preferiblemente entre el 30 y el 60 % en moles de los grupos amino de dicho derivado de poliamina están sustituidos por dicho hidroxialquilo y dichos grupos alquilo (grado de sustitución).
10. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde los polianiones son ácidos nucleicos o proteínas.
11. Derivado de poliamina adecuado para la transfección de polianiones en células, comprendiendo dicha poliamina: una fracción de poliamina seleccionada de polialquileniminas, que comprende una pluralidad de grupos amino; una pluralidad de sustituyentes hidroxilados que comprenden un grupo hidroxilo unido mediante un enlace hidrófobo a grupos amino de dicha fracción de poliamina, en donde cada uno de dichos sustituyentes hidroxilados comprende de 4 a 40 átomos de carbono, preferiblemente de 4 a 20 átomos de carbono, y más preferiblemente de 6 a 12 átomos de carbono, y cada uno de dichos enlazadores hidrófobos puede comprender de 1 a 3 heteroátomos seleccionados de O, N y S, en donde dichos sustituyentes hidroxilados son grupos hidroxihidrocarbilo o grupos hidroxiheterohidrocarbilo; y
una pluralidad de sustituyentes hidrófobos unidos a grupos amino de dicha fracción de poliamina, en donde cada uno de dichos sustituyentes hidrófobos comprende al menos 2 átomos de carbono, preferiblemente de 3 a 40 átomos de carbono, y puede comprender de 1 a 3 heteroátomos siempre que dicho sustituyente hidrófobo tenga al menos 6 átomos de carbono, y dichos 1 a 3 heteroátomos se seleccionan de O y S.
12. El derivado de poliamina de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dichos sustituyentes hidroxilados son sustituyentes hidroxialquilo, y dichos sustituyentes hidrófobos se seleccionan de sustituyentes hidrocarburo que tienen preferiblemente de 6 a 40 átomos de carbono, en donde cada uno de dichos sustituyentes hidrófobos puede ser o puede comprender un grupo alquilo y/o o cada uno de dichos sustituyentes hidrófobos puede ser o puede comprender un grupo arilo.
13. El derivado de poliamina de acuerdo con la reivindicación 11, que es una hidroxialquil-alquil-poliamina como se define en la reivindicación 8.
14. Complejo de un ácido nucleico o una proteína con un derivado de poliamina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
15. Un kit que comprende:
(i) un derivado de poliamina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13,
(ii) una solución tampón que tiene un pH entre 4 y 8, y
(iii) opcionalmente un manual con instrucciones de uso;
en donde dicho derivado de poliamina se puede proporcionar como una solución y en donde el disolvente es un alcohol inferior seleccionado del grupo que consiste en etanol, propanol, 1,2-dihidroxipropano e isopropanol, o mezclas que comprenden agua y entre 33 y 100 % de dicho alcohol inferior; o
en donde dicho derivado de poliamina se puede proporcionar en forma seca, como en forma liofilizada.
16. Un recipiente que comprende múltiples compartimentos que contienen una composición liofilizada que comprende un transfectante,
en donde dicho transfectante es o comprende el derivado de poliamina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, notablemente dicho transfectante es o comprende la hidroxialquil-alquil-poliamina como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2722506B1 (fr) 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
DE19726186A1 (de) * 1997-06-20 1998-12-24 Boehringer Ingelheim Int Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
AU2001255260A1 (en) * 2000-04-07 2001-10-23 Baylor College Of Medicine Macroaggregated protein conjugates as oral genetic immunization delivery agents
AU2001263062A1 (en) * 2000-05-11 2001-11-20 The Procter And Gamble Company Highly concentrated fabric softener compositions and articles containing such compositions
US6902933B2 (en) * 2000-11-03 2005-06-07 Regents Of The University Of Michigan Surface transfection and expression procedure
US7601367B2 (en) 2002-05-28 2009-10-13 Mirus Bio Llc Compositions and processes using siRNA, amphipathic compounds and polycations
US7183263B2 (en) 2002-07-17 2007-02-27 University Of Utah Research Foundation Linear polyethylenimine-sterol conjugates for gene delivery
WO2007006700A1 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Janssen Pharmaceutica N.V. Modified poly(propylene-imine) dendrimers and their use as transfection agents for anionic bioactive factors
DE102005039154A1 (de) 2005-08-17 2007-03-01 GÖPFERICH, Achim, Prof. Dr. Bioabbaubare Polymere für den Transport von Nukleinsäuren in Zellen
US7700541B2 (en) 2006-04-06 2010-04-20 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
JP2009039523A (ja) 2007-07-18 2009-02-26 Shiseido Co Ltd メイクアップシミュレーションに利用する端末装置
CA2694610A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Polyplus Transfection Method for manufacturing linear polyethylenimine (pei) for transfection purpose and linear pei obtained with such method
US20090042825A1 (en) 2007-08-06 2009-02-12 Majed Matar Composition, method of preparation & application of concentrated formulations of condensed nucleic acids with a cationic lipopolymer
CN101952434B (zh) 2007-12-13 2016-11-16 聚加转染公司 使用合成的聚合物递送对基因沉默有活性的核酸的工具
WO2011120953A1 (en) * 2010-03-29 2011-10-06 Universite De Strasbourg Polymers for delivering molecules of interest

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