WO2007010080A2 - Nuevos dendrímeros carbosilanos, su preparación y sus usos - Google Patents

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Francisco De La Mata De La Mata
Rafael GÓMEZ RAMÍREZ
Juan Carlos Flores Serrano
Ernesto DE JESÚS ALCAÑIZ
Paula ORTEGA LÓPEZ
Mª Ángeles MUÑOZ FERNÁNDEZ
Jesús Francisco BERMEJO MARTÍN
Mª Jesús SERRAMÍA LOBERA
Gerónimo FERNÁNDEZ GÓMEZ-CHACÓN
Louis CHONCO JIMÉNEZ
Maria Isabel Clemente Mayoral
José Luis JIMÉNEZ FUENTES
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Definitions

  • the invention relates to three-dimensional molecules called dendrimers, specifically those of the carbosilane type with terminal residues containing primary, secondary, tertiary or quaternary ammo groups, the methods for their preparation and their use.
  • dendrimers specifically those of the carbosilane type with terminal residues containing primary, secondary, tertiary or quaternary ammo groups
  • its use as transport vehicles for nucleic acids and other molecules with pharmacological activity with a negative charge is noteworthy, since it allows increasing the half-life of these drugs and their bioavailability and decreasing the dose necessary to achieve desired biological effect
  • the prevention or treatment of diseases caused by microorganisms whose structure and / or life cycle interfere is another application of the dendrimers of the invention.
  • Dendrimers have received great attention in recent years due to their possible use in applications as varied as nanoscale catalysis, chemical sensors, unimolecular micelles, imitation of enzyme function, encapsulation of molecules, molecular recognition, diagnostic agents and also as vehicles for the transport of genes and drugs. Excellent reviews that include all these applications are published in the bibliography. [1 31 "38J One of the areas in which dendrimers have been most studied is Gene Therapy (introduction of genetic material into a cell for therapeutic purposes).
  • dendrimers containing phosphorus atoms [8J synthesized by Majoral et al. Until the twelfth generation.
  • the surface of the dendrimers has been functionalized with protonated or methylated tertiary amines and have been tested as transfection agents of the 3T3 cell luciferase gene.
  • Efficiency increases with increasing dendrimer generation until reaching a constant value between generations three and five.
  • these dendrimers have a better transfection efficiency in the presence of serum.
  • ODN oligonucleotides
  • antisense ODNs are short sequences (15-30 bases in length), synthetic DNA or analogs that are complementary (or antisense) to a target sequence (an RNA sequence or the DNA sequence complementary to that from which that RNA could transcribe); designed to interfere with a biological event, such as transcription, translation or splicing phenomena [11] .
  • RNA sequence or the DNA sequence complementary to that from which that RNA could transcribe designed to interfere with a biological event, such as transcription, translation or splicing phenomena [11] .
  • These molecules are designed to interact as complementary sequences of a target mRNA, preventing translation into proteins, by degrading the mRNA by RNAse activity or interfering with ribosome reading.
  • Antisense therapy This is called "antisense therapy.”
  • Antisense ODNs have been used in multiple fields since 1978 (antitumor therapy and infectious diseases especially), until today when, after a period of doubt, antisense ODNs have regained their role as a powerful tool in Molecular Biology, especially a from the FDA approval of Formivirsen ⁇ n ⁇ ODN antisense indicated in CMV eye infection in the context of HIV infection.
  • Another antisense ODN, GEM231 is postulated as a molecule with potential application against different neoplasms [13 l.
  • ODN ODN rich in non-methylated CpG sequences as immunomodulators. These sequences lead the immune response to a ThI profile, characterized by an increased secretion of Interferon, tumor necrosis factor, interleukin-2, and other factors that will increase the ability of the immune system to eliminate pathogens such as viruses and bacteria.
  • These ODNs interact with lymphocyte surface receptors such as those in the Toll-like receptor family. They are being investigated to enhance the immune response in immunodeficient and in the context of allergic diseases, characterized by a Th2 balance, in order to bring this profile to ThI [I6 l
  • ODN therapy One of the main problems of ODN therapy is to achieve adequate levels to achieve the therapeutic effect. It is necessary to administer large amounts of ODN to achieve the biological effect, because they have a high affinity to bind to plasma proteins, such as albumin ⁇ 17 I Binding to plasma proteins and other cell surface proteins is considered responsible. also of some of the toxic effects of ODN in vivo (activation of complement cascade, hemolysis, thrombocytopenia, etc.) [18] . It is therefore believed that the use of a transport vehicle that prevents such protein binding could result in obtaining higher levels of active ODN, further prolonging the half-life thereof, and decreasing its toxicity.
  • Plasma protein binding is by far the most important and determinant of drug distribution, since tissue protein binding is generally very small. This is due, among other things, to the fact that the plasma protein concentration is much higher than the interstitial of tissues, whose proteins also have very little mobility and less ability to bind substances, the latter property being particularly notable in the case of the albumin, a predominant protein in the plasma under normal conditions and to which mainly the acidic drugs (although also some basic ones) bind, while those alkaline are linked to the acidic glycoproteins.
  • ODNs in particular like many drugs of interest, are ammonium molecules (negatively charged), so the use of dendrimers with groups that facilitate their interaction and, especially, those that are cationic in nature.
  • Physiological pH is a very suitable option to guarantee the stability of the complex during transport. Therefore, the invention develops new dendrimers, specifically of the carbosilane type, and provides its use, among others, as transport vehicles, in the blood and / or other body fluids, of ODN and other anionic molecules of interest.
  • This is a new field because, so far, no study has been published concerning the use of water-soluble carbonate dendrimers as transport agents, although a report on the in vitro biocompatibility of carbosilane dendrimers constituted on poly (ethylene oxide). 1 ⁇
  • only three synthetic studies of cationic carbosilane dendrimers have been published to date / " , none of them coinciding with those provided by the invention.
  • dendrimers can act as transporters
  • an interesting group is the intended cytotoxic drugs to tumor cells [73> 74] .
  • dendrimers can be directed towards tumor cells by functionalizing them with folic acid, which is overexpressed in tumor cells, so those dendrimers would have preference for their entry by said cells over normal cells.
  • PAMAM dendrimers modified with folate on its surface have been used as transporters of boto isotopes in neutron capture therapies in cancer [75] .
  • PAMAM dendrimers conjugated with cis-platinum act as a macromolecular platinum transporter, an antitumor drug, which is released from the dendrimer-platinum complex in a controlled manner, leading to a greater accumulation of it in solid tumors, with less toxicity than Free cis-platinum [76 l] Another alternative for controlled release in the establishment of covalent bonds between the dendrimer and the drug by biodegradable bonds at physiological pH, as tested with dendrimers with primary surface amines and partially modified with l-bromoacetyl -5-fluoro-uracil to form a labile amide bond that is hydrolyzed in vitro a. Physiological pH, releasing in a controlled way 5- fluoro-uracil, a potent antitumor.
  • dendrimers Other substances of interest in whose transport dendrimers may be useful are those that become toxic after being irradiated, due to the in situ formation of small amounts of oxygen in the singlet state, which has deleterious physiological effects ⁇ .
  • Some articles about dendrimers carrying photosensitive drugs have been published, for example, with 5- aminolevulinic acid in the periphery, these dendrimers assuming promising agents in the treatment of keratinocyte tumors [70 l
  • dendrimers based on polyaryl ether carrying protoporphyrin as a photosensitizer [71 l
  • dendrimers could be interesting transporters are some drugs such as non-steroidal anti-inflammatory drugs, which have side effects such as gastrointestinal disturbances or nephrotoxicity that could be avoided when given transdermally, rather than by the routes Classic oral or parenteral.
  • drugs such as non-steroidal anti-inflammatory drugs, which have side effects such as gastrointestinal disturbances or nephrotoxicity that could be avoided when given transdermally, rather than by the routes Classic oral or parenteral.
  • the multivalence of the surface functional groups of dendrimers means that the great variety of molecules that they can carry encompasses even dendrimers with different functionalities: they are the tectodendrimers, which are being studied for their great potential in possible biomedical applications.
  • dendrimer structure cavities can also be used to house the molecules that are to be transported.
  • An example of utilization of dendrimer structure cavities is the so-called "dendritic box" [68] , in which a PPI dendrimer is surface modified with phenylalanine groups, which protect the outer shell making it denser.
  • a PPI dendrimer is surface modified with phenylalanine groups, which protect the outer shell making it denser.
  • molecules of different sizes are encapsulated inside.
  • the dendrimer can carry a different number of molecules depending on their size. When the dendrimer is treated with formic acid, the outer shell opens, allowing the release of the molecules housed inside.
  • dendrimers Another group of molecules for which dendrimers can suppose suitable transporters are low molecular weight molecules (such as peptides) against which it is desired to generate an immune response in a subject but which, due to their small size, are poorly immunogenic or induce a weak response after being injected into the individual to be treated.
  • This problem can be solved by increasing its molecular weight, either by polymerization or by coupling to a high molecular weight transporter (traditionally a protein).
  • Dendrimers that have a very defined structure and many functional groups capable of binding antigens at their periphery represent a good alternative for the manufacture of vaccines containing highly defined and highly reproducible immunogens. In this line, MAP dendrimers have been developed
  • multiple antigenic peptide '- 57 ' 38 - ', which are asymmetric wedge-shaped constructions formed by successive generations of plant residues. These dendrimers have a large number of primary amines that can be coupled to low molecular weight antigens, with the intention of increasing their immunogenicity, obviating the need for Use carrier proteins.
  • MAP structures containing Plasmodium falciparum peptide stimulators of T and B cells have been used to produce immune responses against this parasite [59] .
  • MAP structures are processed by antigen presenting cells in the same way as intracellular pathogen derived antigens (such as viruses), resulting in a potent immune response, including T cell production.
  • the dendrimers of the invention which have residues containing amino groups at the ends of their branches, may also have utility in vaccination, either because they are coupled with low molecular weight antigens taking advantage of amines present at residues of ends of their branches, or because said moieties containing at least one amino group themselves constitute low molecular weight antigens such as those of a peptide nature.
  • MAP structures have also been used to transport non-peptide antigens such as carbohydrates, haptens, etc., in the context of vaccines.
  • Carbohydrates in particular are a class of molecules important in biological recognition.
  • Glycodendrimers prepared by the union of mannose-isothiocyanate, sialic acid or lactose to the terminal amines of PAMAM dendrimers or dendrimers, have been used as antigens for vaccines [64> 65] .
  • glycodendrimers with the T-associated antigen beta Gal 1-3 alphaGalNAc disaccharide has also tested its ability to bind to lectin (carbohydrate binding protein) specific for galactose [66] , with the intention of using them in the detection of tumors that express T antigen receptors and to transport drugs to them.
  • lectin carbohydrate binding protein
  • Glycodendrimers can also be used to increase affinity for the lectins that bind to the carbohydrate they carry together [67 ⁇ , which may be of interest to use those glycosylated dendrimers as microbial anti-adhesins, toxin antagonists, or as anti-inflammatory, antiviral and anticancer drugs, since the interactions of ictine-carbohydrate have been described in numerous cases in the immune system (in the events that lead to cellular activation), in viral and bacterial infections, in relation to cancer and cell growth, etc.
  • glycosylated dendrimers can mimic natural glycoconjugates and interact efficiently with receptors natural carbohydrates, giving rise to characteristic effects of the interaction with them.
  • dendrimers have been shown to be able to inhibit the infection caused by different viruses, interfering both with the entry of the viras in the cells and in subsequent viral replication steps. That is the case, for example, of Herpes Simplex, whose infection is inhibited in vitro by the effect of modified polylysine dendrimers 130 ' 311 .
  • vaginal gels have been developed for the prevention of sexually transmitted diseases with dendrimer-based formulations, such as VivaGel TM (Starpharma), whose active ingredient is a functionalized polylysine dendrimer with naphthalenedisulfonate residues that appears to be effective in the prevention of HIV infection thanks to its ability to bind to the gpl20 glycoprotein of the virus surface.
  • dendrimer-based formulations such as VivaGel TM (Starpharma)
  • active ingredient is a functionalized polylysine dendrimer with naphthalenedisulfonate residues that appears to be effective in the prevention of HIV infection thanks to its ability to bind to the gpl20 glycoprotein of the virus surface.
  • antiviral dendrimers there is a preference for those who present on their surface groups that mimic those that are present on the cell surface and that, therefore, are capable of competing with cells for virus binding, also designed a dendrimer with groups surface amide that functions as an inhibitor of respiratory syncytial virus, it is believed that by the formation of hydrogen bonds between the peripheral groups of the dendrimer with the fusion protein of the virus, it is expected that dendrimers functionalized with other groups capable of forming hydrogen bridges with viral proteins involved in the interaction with the cell surface are also able to interfere with different viruses, inhibiting infection caused by them.
  • dendrimers have been used as antibacterials or to deconstruct the cell membranes of some fungi.
  • PPI poly (propyleneimine)
  • dendrimers with tertiary alkylammonium groups on their surface, which have demonstrated extensive bactericidal activity against both Gram positive bacteria and against ' 53 ' 54 - 'Gram negative bacteria.
  • PPI poly (propyleneimine)
  • the dendrimers of the invention also functionalized with moieties containing amino groups, represent an option to also be used to deconstruct cell membranes of bacteria or fungi.
  • dendrimers have properties that allow them to act as protein denaturants. Certain types of dendrimers act by decreasing the dielectric constant and the viscosity of the water and disrupting their regular structure by reorganizing the water molecules on the surface of the dendrimer. This leads to disadvantage of hydrophobic interactions, which is very destabilizing for most of the tertiary structures of proteins, causing their denaturation: it is the so-called "chaotropic" effect that denaturing agents such as urea or guanidinium chloride have.
  • a very interesting field in which it is intended to apply this denaturing capacity of proteins is the use to dissolve prion proteins, such as PrP Sc [20] .
  • Prion proteins are capable of adopting a pathogenic structure-conformation that causes fatal neuropathies called spongiform encephalopathies (Creutzfeldt-Jakob disease, "mad cow” disease, sheep scrapie, etc.). These proteins form aggregates that are located in the brains of affected individuals and are soluble only in solvents. containing both detergents and chaotropic agents (typically 6M guanidinium chloride). However, these aggregates can be solubilized by cationic dendrimers such as PPI and PAMAM: those of greater generation with greater number of surface amines are the most effective.
  • the new dendrimers of the invention also functionalized with residues containing amino groups, provide new compounds to be used both to dissolve prion aggregates and in the therapy of other diseases in whose development the formation of pathogenic protein aggregates also occurs, such as for example the aggregates of amyloid protein that appear in Alzheimer's disease 55 ' 5 .
  • dendrimers are synthetic polymers with good properties for use in biological applications: they respond predictably in solution, can be modified extensively to carry multiple ligands with biological activity, can cross biological barriers and are manufactured with few structural defects.
  • the invention describes new branched carbosilane dendrimers with terminal residues at the ends of their branches containing primary, secondary, tertiary or quaternary amino groups that respond to any one of the formulas:
  • AIq 1 , AIq 2 , AIq 3 ,, AIq 1 represent alkylene moieties of 2 to 4 carbons which are chosen independently from each other according to the length of the branches in each generation;
  • R 1, R 2, R 3, R 1 "1, R 1 represent moieties which are chosen independently from each other from methyl and phenyl;
  • X represents a moiety that contains at least one primary, secondary, tertiary or quaternary amino group; p is an integer that varies between 1 and 3; m, n, .... ; z are integers that vary independently between 1 and 3
  • radicals R 1, R 2, R 3, R 1 "1, R 1 are all identical and correspond to methyl moieties.
  • residues AIq 1 , AIq 2 , AIq 3 , ..., AIq 1 are selected from ethylene and propylene.
  • said moieties are all the same and correspond to propylene moieties.
  • the integers m, n, ..., z are equal to each other and have the value 2.
  • R 3 , R 1 "3 , R 1 are all equal and correspond to methyl moieties; residues AIq 1 , AIq 2 , AIq 3 , ..., AIq 'are equal to each other and correspond to propylene moieties and integers m , n, ..., j are equal to each other and have the value 2.
  • X represents any residue that contains a primary, secondary, tertiary or quaternary amine.
  • those residues in which X represents or -OCH 2 CH 2 N (CH 3 ) 2 , -OCH2- (C6H3) -3.5- (OCH2CH 2 N ((CH3) 2) 2 are preferred, or -OCH 2 CH 2 N (CH3) CH 2 CH 2 N (CH3) 2, or a group -CH 2 CH 2 (CH 2 ) and NH2 in which "e 'is an integer ranging from 0 to 2, preferring in that case to take the value
  • X represents the quaternized forms of the above moieties -OCH 2 CH 2 N + (CH 3 ) 3 r, -OCH 2 -
  • R 1 represents a methyl or phenyl moiety
  • R 1 represents a methyl or phenyl moiety.
  • b) obtain a carbosilane dendrimer with terminal residues with primary, secondary or tertiary amino groups following one of the following routes: bl) cause the alcoholysis of Si-Cl terminal bonds of a carbosilane dendrimer obtained in step a5) by reacting it with an alcohol - primary, secondary or tertiary amino in the presence of an excess of a base; b2) previously obtain a carbosilane dendrimer with Si-H terminal bonds to which the residues containing at least one primary, secondary or tertiary amino group are subsequently attached, by passing it through the steps of: i) obtaining a derivative with Si-terminal bonds H of a precursor carbosilane dendrimer of any generation by reacting the corresponding carbosilane dendrimer with Si-Cl bonds with a reagent capable of yielding hydride groups, so that part or all of the Cl atoms
  • R 3 , R 2 , ..., R 1 moieties are all the same and correspond to methyl moieties.
  • the indices n, m, ..., j corresponding to the reagents of the general formula HSi (R 2 ) 3-n Cl n are preferably chosen between 1 and 2.
  • the number of branches formed in each generation is always the same and equal to 2, for which the reagent HSi (R 2 ) 3-n Cl n ,, when used to create a precursor that gives rise to a dendrimer of a new generation, it would be in all cases HSi (R 2 ) 2 Cl, preferably HSi (CHs) 2 Cl, which corresponds to a value of "n" of 1.
  • HSi (CHs) 2 Cl to create a precursor of a new generation.
  • Reagent HSi (R 2 ) 3- ⁇ Cl n when used to give rise to a carbosilane dendrimer with Si-Cl terminal bonds from which to obtain a carbosilane dendrimer of the invention with amino groups in the branches, it is preferred that the value of "n" is chosen between 1 and 2, therefore, HSi (CHs) 2 Cl and HSi (CH 3 ) Cl 2 can be used as desired so that the number of terminal groups present per branch is 1 or 2, respectively.
  • the alcohol amine used to obtain the carbosilane dendrimers of the invention from the corresponding derivatives with Si-Cl end bonds is chosen from N, N-dimethylethanolamine (CH 2 OH-CH 2 -N ( CH 3 ) I), 2 - [(2-dimethylaminoethyl) methyl] amrno ethanol (CH 2 OH-CH 2 -N (CH 3 ) -CH 2 -CH 2 -N (CH 3 ) 2 ) or 3.5- bis (dimethylaminoethoxy) benzylalcohol (CH 2 OH- (C 6 Hs) - (O-CH 2 -CH 2 -N (CH 3 ) 2 ) 2 ).
  • the carbosilane dendrimer with Si-Cl bonds is treated with the corresponding stoichiometric amount of the alcohol-amine chosen, in diethyl ether and in the presence of an excess of triethylamine, so that each of the bonds Si-Cl becomes an Si-O link by which the residue corresponding to the alcohol-amine used is attached.
  • the carbosilane dendrimer obtained from any one of the above alcohol amines is subsequently quaternized by treating it with CH 3 I in diethyl ether.
  • the carbosilane dendrimer with terminal residues -CH 2 -CH 2 -CH 2 -NH 2 obtained by reaction with the allylamine is quaternizes by adding HCl in diethyl ether.
  • carbosilane dendrimers with Si-H bonds at their ends with which compounds containing at least one primary, secondary or tertiary amino group are reacted and possessing a carbon-carbon double bond in a endpoint are obtained in step b2) i) using LiAlH 4 as the reagent capable of yielding hydride groups that allows converting part or all of the Si-Cl bonds into Si-H bonds, although it is included within the scope of the method of invention the use of analogous reagents among which NaH or NaBH 4 may be mentioned.
  • the binding of compounds containing at least one primary, secondary or tertiary amino group at the end where they possess a carbon-carbon double bond is carried out using the Karstedt catalyst to catalyze the reaction, although it remains included within the scope of the method of the invention the use of other hydrosilylation catalysts that allow to carry out the desired union such as the Spiers catalyst 61 '62] .
  • the invention relates to pharmaceutical compositions containing the carbosilane dendrimers of the invention.
  • the composition contains at least one carbosilane dendrimer of the invention together with at least one other molecule, ammonium or polyanionic.
  • the polyanionic molecule is an oligodeoxyribonucleotide (ODN) or a double stranded DNA molecule.
  • the polyanionic molecule is a single-stranded or double-stranded RNA molecule, which preferably contains complementary regions associated with each other that allow said RNA to be used as interference RNA (RNAi).
  • ODN oligodeoxyribonucleotide
  • RNAi interference RNA
  • the anionic molecule is a drug that is prone to be associated with plasma proteins or cell membranes that are in contact with it or are likely to be degraded by any of these proteins.
  • the carbosilane dendrimer is present in the invention as an active substance capable of interfering with the life cycle of pathogenic microorganisms.
  • the pathogen It is a virus, which can be HIV.
  • the pathogenic microorganism is a bacterium or fungus whose membrane or cell wall is susceptible to being altered by said dendrimer.
  • the carbosilane dendrimer is present in the invention as an active substance capable of interfering with the formation or facilitating the dissolution of protein aggregates involved in the development of pathological processes such as encephalopathies caused by prions or degenerative processes such as disease Alzheimer's
  • a carbosilane dendrimer of the invention present in a pharmaceutical composition has a peptide or an antigenic moiety attached thereto and is intended to trigger an immune response that prevents or protects the individual from whom supply against a disease caused by an organism in which said peptide or antigenic moiety is present.
  • the dendrimers of the invention and the compositions containing them can be administered by common routes of administration, iontophoresis, transdermal route, injection or inhalation. They are also suitable for forming films for the coating of prosthetic structures or STENT meshes so that from them the controlled release of at least one dendrimer of the invention or at least one substance present in the same composition as said dendrimer occurs.
  • carbosilane dendrimers are used for fixing ammonium or polyanionic molecules to surfaces.
  • the molecules would be nucleic acid sequences and the surfaces to which they are fixed, the bases used for the microchips to which nucleotide sequences are fixed.
  • the invention relates to the use of the carbosilane dendrimers of the invention as carriers of anionic substances in the blood that protect said substances from their interaction with plasma proteins or cell membranes that are in contact with him and they are able to bind to such anionic substances or to degrade them.
  • a particular case of this would be one in which the substance with an anionic character at the pH of the blood would be a drug.
  • the invention relates to the use of carbosilane dendrimers of the invention as drugs to reduce or eliminate the symptoms of a disease caused by a microorganism with whose life cycle the dendrimer of the invention is capable of interfering.
  • the invention relates to the use of carbosilane dendrimers of the invention as transfection vehicles of anionic or polyanionic molecules to which they are attached.
  • the polyanionic molecule is an oligodeoxyribonucleotide (ODN) or a single-stranded or double-stranded RNA molecule, which preferably contains complementary regions associated with each other that allow said RNA to be used as interfering RNA ( RNAi).
  • ODN oligodeoxyribonucleotide
  • RNAi interfering RNA
  • the cells to be transfected are cells of the nervous system or cell lines derived therefrom.
  • Figure 1 shows the structure of several carbosilane dendrimers of the invention with the un quaternized amino moieties synthesized in examples 7, 11, 2, 5 in Figure la and those synthesized in examples 13 and 14 in Figure Ib.
  • Figure 2 shows the structure of several carbosilane dendrimers of the invention with the quaternized amino moieties, those synthesized in examples 22, 26, 19 and 27 in Figure 2a and those synthesized in examples 28 and 29 in Figure 2b.
  • Figure 3 shows the complex formation electrophoresis gels between an ODN and the IM8 dendrimers (with GF in the gel a and with different ODN in the gel b), C1NH4 (c), NN and Phe (d) and IMl 6 ( gel e, which also contains samples of IM8).
  • Figure 4 shows electrophoresis gels of complexes formed between an ODN and the Phe, C1NH4 (gel A), NN (gel B) and IM8 e FM16 (gel C) dendrimers at different pH values.
  • Figure 5 shows the evolution of dendrimer complexes of the invention and the PPT ODN when remaining in aqueous solution 0, 6 or 24 hours.
  • Figure 6 shows an electrophoresis gel of samples of dendrimer complexes and the ODN TAR in the presence of albumin and SDS. The left part is a staining of the proteins with Paragon blue and the right part a staining photograph of the DNA samples with ethidium bromide.
  • Figure 7 shows the evolution of dendrimer samples of the invention and a
  • ODN when incubated in the presence of complete medium for 40 minutes (40 min), 4 hours (4H) and 17 hours (17 H).
  • Figure 8 shows an electrophoresis gel of dendrimer and ODN samples in the presence of human serum.
  • the left part shows a photo taken with ultraviolet light from DNA samples and the right part shows a staining of the proteins of that gel with Paragon blue.
  • Figure 9a shows ethidium bromide staining of electrophoresis gels corresponding to mixtures of dendrimers and ODN after 0 hours (OH), 4 hours (4H) and 24 hours (24H).
  • Figure 9b shows the protein staining of the gel corresponding to 4 hours whose staining with ethidium bromide is shown in Figure 9a.
  • Figure 10 shows an electrophoresis gel of complex samples between the Nf-kappaB-luc plasmid and the IM8 dendrimer.
  • Figure 11 shows an electrophoresis gel of complex formation tests between an RNAi and a dendrimer (IM8) of the invention.
  • Figure 12 shows a graph with the results of mitochondrial activity for concentrations 1, 5, 10, 20 and 100 ⁇ M after incubation of cells with the dendrimers IM 8, IM 16, C1NH4, NN, Phe and SF, which have their corresponding bar for each concentration placed in the position it occupies in the previous enumeration.
  • Figure 13 shows a graph with the results of hemoglobin release after incubation of red blood cells with the IM8, IMl 6, NN, Phe and S dendrimers, at concentrations of 1, 5, 10 and 20 ⁇ M.
  • Each bar corresponds to a dendrimer, placed in the order corresponding to the previous enumeration and each group of bars corresponds to a concentration, ordered in increasing order.
  • Figure 14 shows a graph with the mortality percentages of cells incubated with different dendriters and dendrimers of the invention and stained with Tripan Blue.
  • Figure 15 shows the results of a flow cytometry test in which the percentages of cells with size and complexity corresponding to cells in apoptosis-necrosis with living cells were compared.
  • the X represents the size and the Y axis the complexity, the cloud of dark cells corresponding to cells in apoptosis-necrosis.
  • Part A corresponds to CMSP cells treated with CBS dendrimers and part B to CMSP cells treated with PAMAM type dendrimers.
  • Figure 16 shows the representation of the percentages of living and apoptosis cells obtained after the flow cytometry tests obtained in CMSP cells treated with CMS dendrimers (A) or with a PAMAM type dendrimer (B).
  • Figure 17 shows stains with the vital DAPI dye of cells incubated with: 1: Control; 2: 0DN + IM8; 3.ODN + IM16; 4: ODN + SF; 5: ODN; 6: IM8; 7: IM16; 8: SF.
  • Figure 18 shows photos taken after 72 hours of incubation of cells with IM8-ODN, at 0, 30, 60, 90, 120 and 150 seconds.
  • Figure 19 shows a graph with the results obtained in the scintillation counter in a lymphoproliferative assay stimulating the cells with different CBS dendrimers, with PHA and with a control (C).
  • Figure 20 shows the cellular location of an ODN with which CMSP was transfected after: A: 1 hours; B: 3 hours; C: 24 hours.
  • Figure 21 shows the analysis of the fluorescence present in a cell that has been transfected with an ODN.
  • Figure 21 A the fluorescence values that are obtained at each point along a line that represents an average cut in XY are shown in ordinates, the graph corresponding to the blue fluorescence, the intermediate to the green and the one corresponding to the graph. lower than the red one.
  • a similar fluorescence analysis is shown in Figure 21 B by taking a region of interest (ROI) drawn around the nucleus in which the blue fluorescence (upper graph) and the green fluorescence (lower graph) are analyzed.
  • ROI region of interest
  • Figure 22 shows the fluorescence pattern obtained after transfection with PPT or dendriplejos of the invention.
  • 1 Control
  • 2 PPT
  • 3 PPT + IM8
  • 4 PPT + NN
  • 5 PPT + Phe
  • 6 PPT + IM16.
  • Figure 23 shows the fluorescence pattern obtained after transfection with a C1NH4 dendriter and PPT.
  • Figure 24 shows the fluorescence hystrogam in a mid-plane in XY of a cell treated with PPT + NN, in which the upper graph shows in ordinates the intensity of green fluorescence that is found along the plane, the graph intermediate is an analogous analysis corresponding to the red fluorescence and the graph below shows an analogous analysis corresponding to the blue fluorescence.
  • Figure 25 shows the graph obtained by calculating the number of DNA copies of HIV as a function of the number of cells with different concentrations of NN dendrimer before and after infection.
  • Figure 26a shows the pattern of bands obtained by electrophoresis in acrylamide / bisacrylamide gel micromolar concentrations ( ⁇ M) of the NN dendrimer shown on the streets.
  • Figure 26b shows the pattern of bands obtained by electrophoresis samples of NN dendrimer incubated without any drug (Ctrl) or samples of said dendrimer incubated with methotrexate in a ratio of 1/8 dendrimer / drug molecules (lanes marked "1" ), 1/4 (streets marked as
  • Figure 26c shows the pattern of bands obtained by electrophoresis samples of the NN dendrimer incubated without any drug (Ctrl) or samples of said dendrimer incubated with different heparin units: 1 OU (streets marked “1"), 1 U ( streets marked “2”), 0.5 U (streets marked “3”) or 0.1 U (streets marked "4").
  • Figure 26d shows the pattern of bands obtained by electrophoresis samples of the NN dendrimer incubated without any drug (Ctrl) or samples of said dendrimer incubated with insulin in a ratio of 1/3 dendrimer / drug molecules (lanes marked “1” ), 1 / 1.5 (streets marked “2"), 4/1 (streets marked “3”) or 10/1 (streets marked "4").
  • Figure 27a shows the pattern of bands obtained by electrophoresis in acrylamide / bisacrylamide gel micromolar concentrations ( ⁇ M) of the NNl 6 dendrimer shown on the streets.
  • Figure 27b shows the pattern of bands obtained by electrophoresis samples of NN 16 dendrimer incubated without any drug (Ctrl) or samples of said dendrimer incubated with methotrexate in a ratio of molecules dendrimer / drug 1/16 (streets marked "1"), 1/8 (streets marked "2"), 1/4 (streets marked "3") or 1/2 (streets marked "4" ).
  • Figure 27c shows the pattern of bands obtained by electrophoresis samples of NN16 dendrimer incubated without any drug (Ctrl) or samples of said dendrimer incubated with different heparin units: 1OU (streets marked "1"), 1 U ( streets marked '2'), 0.5 U (streets marked '3') or 0.1 U
  • Figure 27d shows the pattern of bands obtained by electrophoresis samples of NN16 dendrimer incubated without any drug (Ctrl) or samples of said dendrimer incubated with insulin in a ratio of 1/3 dendrimer / drug molecules (lanes marked as * ' l "), 1 / 1.5 (streets marked" 2 "),
  • Figure 28a shows the pattern of bands obtained by electrophoresis in acrylamide / bisacrylamide gel micromolar concentrations ( ⁇ M) of the IMI 6 dendrimer shown on the streets.
  • Figure 28b shows the pattern of bands obtained by electrophoresis samples of IM 16 dendrimer incubated without any drug (Ctrl) or samples of said dendrimer incubated with methotrexate in a ratio of 1/16 dendrimer / drug molecules (lanes marked “1 "), 1/8 (streets marked” 2 "), 1/4 (streets marked” 3 ”) or 1/2 (streets marked” 4 ").
  • Figure 28c shows the pattern of bands obtained by electrophoresis samples of IM 16 dendrimer incubated without any drug (Ctrl) or samples of said dendrimer incubated with different heparin units: 1 OU (streets marked as
  • Figure 28d shows the pattern of bands obtained by electrophoresis samples of IM 16 dendrimer incubated without any drug (Ctrl) or samples of said dendrimer incubated with insulin in a ratio of dendrimer / drug molecules
  • Figure 29 shows the pattern of bands obtained by electrophoresis samples of IM 16 dendrimer incubated without any drug (lanes marked as “ : D”) or incubated with insulin (streets marked “C") in which the pH was taken to the numerical value indicated on the streets.
  • Figure 30 shows bar graphs in which, in ordinates, the proliferation factor value is shown, referring to the control (“C-") obtained by incubating U87-MG cells (upper graph, marked “A”) or SK-N-MC cells (bottom graph, marked “B”) with the compounds indicated under each bar, at the indicated concentrations.
  • C- negative control, corresponding to samples incubated only with culture medium without additional compounds.
  • Figure 31 shows bar graphs in which, in ordinates, the value of the viability factor is shown, calculated as both by one with respect to the control ('' C- "), obtained by performing MTT tests on U87 cells -MG incubated with the compounds indicated under the bars, at the indicated concentrations and volumes, for times of 24 hours (24H) (upper chart, marked “A"), 3 days (3D) (intermediate chart, marked as "B") or 7 days (7D) (bottom chart, marked as '' C ").
  • Dextr Dextran
  • Spfect Superfect.
  • Figure 32 shows a bar graph in which, in ordinates, the value of the cytotoxicity factor is shown, expressed as both by one with respect to the control ("C-"), obtained after quantification of lactate dehydrogenase (LDH ) in the culture supernatant of U87-MG cells incubated for 24 hours (24H) with the compounds indicated under the bars, at the indicated concentrations and volumes.
  • C- lactate dehydrogenase
  • Figure 33 shows bar graphs in which, in ordinates, the value of both is shown by one with respect to the control ("C") corresponding to the results obtained when performing in MTT tests (upper graph, marked as “A ”) or quantification of lactate dehydrogenase (LDH) in the culture supernatant (bottom graph, marked” B ”) in SK-N-MC cells incubated for 24 hours (24H) with the compounds indicated below the bars, in the concentrations and volumes indicated.
  • Dextr Dextran
  • Spfect Superfect.
  • FIG. 34a shows the graphs obtained in a flow cytometer when analyzing U87-MG cells incubated with the fluorescein-labeled anti-rev oligonucleotide (Oligo-FITC) in the absence of dendrimer (graph marked "Ctrl", control) or with complexes formed between the oligonucleotide and the NN dendrimer in proportions that gave rise to the load-to-load + ratios indicated on each graph: 1: 1, 1: 2, 1: 4 and 1: 8.
  • Figure 34b shows the graphs obtained in a flow cytometer when analyzing U87-MG cells incubated with the fluorescein-labeled anti-rev oligonucleotide (Oligo-FITC) in the absence of dendrimer (graph marked "Ctrl", control) or with complexes formed between the oligonucleotide and the NNl 6 dendrimer in proportions that gave rise to the load / load + ratios indicated on each graph: 1: 1, 1: 2, 1: 4 and 1: 8.
  • Oligo-FITC fluorescein-labeled anti-rev oligonucleotide
  • Figure 35 shows the graphs obtained in a flow cytometer when analyzing SK-N-MC cells incubated with the fluorescein-labeled anti-rev oligonucleotide (Oligo-FITC) in the absence of dendrimer (graph marked “Ctrl", control) or with complexes formed between the oligonucleotide and the NN 16 dendrimer in proportions that gave rise to the load / load + ratios indicated on each graph: 1: 1, 1: 2, 1: 4 and 1: 8.
  • Oligo-FITC fluorescein-labeled anti-rev oligonucleotide
  • the invention describes new branched carbosilane dendrimers with primary, secondary, tertiary or quaternary amino groups at the ends of the branches that respond to the formulas: (R 1 J 3 - P i S i - (Al q 1 - S i -Xp) 4 , in the case of the first generation;
  • AIq 1 , AIq 2 , AIq,, AIq 1 represent alkylene moieties of 2 to 4 carbons which are chosen independently from each other according to the length of the branches in each generation;
  • R 1, R, R, R 1 "1, R represent methyl radicals or phenyl
  • X represents a moiety that contains a primary, secondary, tertiary or quaternary amino group
  • p is an integer that varies between 1 and 3
  • m, n, ...., z are integers that vary independently between 1 and 3.
  • the dendrimers corresponding to that embodiment of the invention can also be represented by the general formula iG- (X p ) m , where: i: indicates the number of the dendrimer generation
  • X indicates the nature of the functional groups located on the periphery of the dendrimer p: indicates the number of functional groups in each branch m: indicates the number of terminal functional groups in the dendrimer G: represents the carbosilane skeleton of the dendrimer which, according to the generation, would correspond to the following formulas:
  • X represents any residue that contains a primary, secondary, tertiary or quaternary amine.
  • dendrimer refers to a three-dimensional macromolecule of arborescent construction.
  • the term "generation” refers to the number of iterative stages that are necessary for the preparation of the dendrimer.
  • carbosilane dendrimer refers to a dendritic molecule with a carbosilane skeleton.
  • the term "antigenic moiety” refers to a moiety that is attached to a molecule and that is capable of triggering an immune response in an individual to whom the molecule that carries that moiety is attached.
  • the term “peptide” refers to a linear chain of two or more amino acids that are joined by forming an amide bond between a carboxyl group of an amino acid and an amino group of the adjacent amino acid. .
  • the invention also relates to a process for the preparation of dendrimers of the invention.
  • organosilane dendrimers of different generations can be prepared with high yields using well-known reactions, through divergent procedures / 25 ' 42 ' 43 ' 44 ' 43 ' 46 ' - 1
  • These dendrimers have a high versatility that gives them several advantages over others derivatives: i) it is possible to modify the length of the branches using vinyl or allylic Grignard derivatives in the metathesis step; ii) it is possible to vary the number of branches of each generation by changing for example HSiCl 3 to HSiCH 3 Cl 2 ( iii) it is possible to incorporate a wide variety of functional groups to the periphery of the dendrimer.
  • carbosilane dendrimers have a high chemical inertia, which is very useful for the additional purpose of this invention to use them as vehicles for the transport of anionic molecules (such as ODN and various ammonium drugs) in the blood, their protection against the interaction with plasma proteins and their entry into a cell to exert their action.
  • anionic molecules such as ODN and various ammonium drugs
  • the first step in the synthesis of these derivatives is the preparation of precursor dendrimers containing Si-Cl or Si-H terminal bonds.
  • the synthesis of these dendrimers has already been published ⁇ 5 ' 42 ' 4 " 44 ' 45 ' 46 ' 1 and is carried out with high yields.
  • dendrimers have grown up to a third generation, but the methodology for obtaining dendrimers of higher generations is analogous, whereby said dendrimers of higher generations and their preparation process are also included in the scope of the invention, in the case of the preferred embodiment of the invention.
  • the second step consists in the union of different amino groups to the surface of these dendrimers using the known reactivity of the Si-Cl and Si-H bonds.
  • two alternative synthetic routes can be followed, depending on the nature of the terminal group present in the carbosilane dendrimer.
  • Examples 44 and 45 detail the synthesis and characterization of dendrimers 31 (IG- [YES ((CH 2 ) 2 C 6 H 3 (OMe) (O (CH 2 ) 2 NMe 2 ))] 4) and 32 (2G-
  • Quaternization of dendrimers with terminal groups -NH 2 , 13-15 could be carried out by adding HCl (IM solution in Et 2 O) in diethyl ether as solvent (Scheme 6).
  • Examples 1 to 30 below describe the synthesis of carbosilane dendrimers with amino terminal groups that start from precursor dendrimers (IG-Cl 4 , IG-Cl 8 , IG-H 4 , 2G-Cl 8 , 2G-Cl 16 , IG-H 8 , 3G-Cl 4 , IG-Cl 8 , IG-H 4 ,) previously synthesized following the known procedures indicated in Scheme 1.
  • precursor dendrimers IG-Cl 4 , IG-Cl 8 , IG-H 4 , 2G-Cl 8 , 2G-Cl 16 , IG-H 8 , 3G-Cl 4 , IG-Cl 8 , IG-H 4 ,
  • skeletons from which the carbosilane dendrimers of the invention are formed, with amino terminal groups, reacting them with compounds that give rise to the ligands that become the ends of the branches of the dendrimers.
  • the first generation dendrimer 2 was prepared following a procedure similar to that described for 1, starting from 1 G-CIg (0.54 g, 0.87 mmol), N, N-dimethylethanolamine (0.7 mL, 6.94 mmol ) and NEt 3 (1.0 ml, 7.2 mmol). In this way 2 was obtained as a colorless oil. (0.75 g, 80%).
  • the second generation dendrimer 4 was prepared following a procedure similar to that described for 1, starting from 2G-Cl 16 (0.48 g, 0.30 mmoi), N 5 N-dimethylethanolamine (0.48 ml, 4.77 mmol ) and NEt 3 (0.7 ml, 5.02 mmol). In this way 3 was obtained as a colorless oil (0.66 g, 90%).
  • the third generation dendrimer 5 was prepared following a procedure similar to that described for I 5 starting from 3G-Cl] 6 (0.20 g, 0.06 mmol), N 5 N-dimethylethanolamine (0.10 ml, 0.99 mmol) and NEt 3 (0.16 mL, 1.14 mmol). In this way 5 was obtained as a pale yellow oil (0.18 g, 74%).
  • Example 6. Synthesis of 3G-fSi (OCH 2 CH 2 NMe 2 ) 2 li ⁇ (6).
  • the third generation dendrimer 6 was prepared following a procedure similar to that described for 1, starting with 3G-Cl 32 (0.19 g, 0.05 mmol), N 5 N-dimethylethanolamine (0.17 mL, 1.68 mmol ) and NEt 3 (0.24 ml, 1.79 mmol). In this way 6 was obtained as a pale yellow oil (0.20 g, 72%).
  • the third generation dendrimer 9 was prepared following a procedure similar to that described for 7, starting from 3G-Ch 6 (0.072g, 0.022 mmol); NEt 3 (0.060 mi, 0.43 mmol) and 3.5- (OCH 2 CH 2 NMe 2 ) 2 - (C 6 H 3 ) -CH 2 OH (0.101 g, 0.358 mmol). In this way 9 was obtained as a pale yellow oil (0.110 g; 69%).
  • SiCH 2 CH 2 CH 2 If they show signals in the range 21.3-17.4 ppm. The complete assignment of these signals was done with the help of HMQC experiments. Finally, the fragments -SiMe 2 - and -SiMe- are easily distinguishable in all derivatives and generations. Si NMR spectra are equally in accordance with the proposed formulation, although in these spectra the innermost silicon atoms are only observed in first generation dendrimers.
  • the second generation dendrimer 14 was prepared following a procedure similar to that described for 13, starting from 2G-H 8 (0.42 g, 0.36 mmol), allylamine (2 mL, 26.7 mmol), THI ImI and two drops of the Karstedt catalyst. In this way 14 was obtained as a colorless oil (0.32 g, 55%).
  • the structure of this dendrimer is depicted in Figure Ib.
  • the third generation dendrimer 15 was prepared following a procedure similar to that described for 13, starting from 3G-H 16 (0.100 g, 0.037 mmol), allylamine (2 mL, 26.7 mmol), THI ImI and two drops of the Karstedt catalyst . In this way 15 was obtained as a colorless oil (0.085g, 64%).
  • the first generation dendrimer 17 was prepared following a procedure similar to that described for 16, starting from 2 (0.17 g, 0.16 mmol) and 0.80 ml of a 2M solution in MeI ether (1.6 mmol) . In this way 17 was obtained as a white solid (0.29 g, 86%).
  • Example 18 Synthesis of 2 G-fS i (OCH 2 CH 2 NMe Alh (18 ⁇
  • the second generation dendrimer 18 was prepared following a procedure similar to that described for 16, starting from 3 (0.25 g, 0.13 mmol ) and 0.6 ml of a 2M solution in MeI ether (1.2 mmol), thus compound 18 was obtained as a white solid (0.35 g, 87%).
  • the second generation dendrimer 19 was prepared following a procedure similar to that described for 16, starting from 4 (0.10 g, 0.04 mmol) and 0.5 ml of a 2M solution in MeI ether (1.0 mmol). In this way compound 19 was obtained as a white solid (0.17 g, 87%).
  • Example 20 - Synthesis of 3G-FSi (OCH 2 CH 2 NMe / DIi n ⁇ 20)
  • the third generation dendrimer 20 was prepared following a procedure similar to that described for 16, starting from 5 (0.12 g, 0.03 mmol ) and 0.4 ml of a 2M solution in MeI ether (0.8 mmol). In this way, compound 20 was obtained as a white solid (0.16 g, 83%).
  • Example 3 generation dendrimer 21 was prepared following a procedure similar to that described for 16, starting from 6 (0.060 g, 0.012 mmol) and 0.2 ml of a 2M solution in MeI ether (0.4 mmol).
  • the IH-NMR spectrum shows wide signals and indicates that approximately 90% of the terminal amino groups have been quaternized, so that compound 21 is not isolated pure.
  • the first generation dendrimer 22 was prepared following a procedure similar to that described for 16, starting from 7 (0.1 g, 0.06 mmol) and 0.35 ml of a 2M solution in MeI ether (0.7 mmol) . In this way compound 22 was obtained as a white solid (0.14 g, 90%).
  • Example 23 - Synthesis of 2G-FSJrOCH 2 - (CAHj) -SJ- (OCH 2 CH 2 NMe 1 + T) 2 ) Ij (23)
  • the second generation dendrimer 23 was prepared following a procedure similar to that described for 16, starting from 8 (0.08 g, 0.023 mmol) and 0.20 ml of a 2M solution in MeI ether (0.4 mmol). In this way, compound 23 was obtained as a white solid (0.11 g, 85%).
  • Example 24 - Synthesis of 3G-fSir ⁇ CH2-rC ⁇ H 1 V3,5-r ⁇ CH 2 CH 2 NMe. + I ' ) 2 ) lij (24)
  • the third generation dendrimer 24 was prepared following a procedure similar to that described for 16, starting from 9 (0.084 g, 0.012 mmol) and 0.25 ml of a 2M solution in MeI ether (0.5 mmol). In this way, compound 24 was obtained as a white solid (0.08Og, 72%).
  • Example 25 Identification of lG- ⁇ Si (O (CH 2 ) 2 N ⁇ YYCH 2 ) 2 NMe / m4 (25)
  • the first generation dendrimer 25 was prepared following a procedure similar to that described for 16, starting from 10 (0.043 g, 0.047 mmol) and 0.094 ml of a 2M solution in MeI ether (0.188 mmol). In this way the compound was obtained
  • Example 26 - Identification of 2G-rSi ⁇ O (CH7) 7N (Me) ⁇ CH 2 ) 2 NMejT) lj f26)
  • the second generation dendrimer 26 was prepared following a procedure similar to that described for 16, starting from 11 (0.19 g , 0.08 mmol) and 0.34 ml of a 2M solution in MeI ether (0.68 mmol). In this way compound 26 was obtained as a pale yellow solid. This compound is not isolated pure, with mixtures due to a non-selective quaternization process in which both nitrogen atoms can participate, although compound 26 is the major component of this mixture.
  • the third generation dendrimer 27 was prepared following a procedure similar to that described for 16, starting from 20 (0.084 g, 0.017 mmol) and 0.13 ml of a 2M solution in MeI ether ( 0.27 mmol.) In this way compound 27 was obtained as a pale yellow solid. This compound is not isolated pure, with mixtures due to a non-selective quaternization process in which both nitrogen atoms can participate, if Well, compound 27 is the major component of this mixture.
  • the 1 H and ⁇ C NMR spectra of the 16-27 dendrimers have identical resonance patterns for the carbosilane skeleton to those of their precursors 1-12, although an increase in signal broadening is observed with increasing generation.
  • the outer groups SiOCH 2 CH 2 NMe S + I " give rise to two wide multiples centered at 3.94 (for dendrimers 16, 18 and 20) or 4.12 (for dendrimers 17, 19 and 21) assignable to the methylene protons of the groups -OCH 2 -, and 3.45 (for dendrimers 16, 18 and 20) or 3.56 (for dendrimers 17, 19 and 21) that are assigned to the protons of the fragment -CH 2 N-.
  • Quaternization of the amine groups produces a low-field displacement of 0.3-0.4 ppm in the signal of -OCH 2 -, while the methylene protons of the -CH 2 N- groups move by approximately 1 ppm.
  • the second generation dendrimer 29 was prepared following a procedure similar to that described for 28, starting from 14 (0.09 g, 0.05 mmol) and 0.6 ml of an IM solution in HCl ether (0.06 mmol) . In this way compound 29 was obtained as a pale yellow solid (0.06g; 55%).
  • the structure of this dendrimer is depicted in Figure 2b.
  • the third generation dendrimer 30 was prepared following a procedure similar to that described for 28, starting from 15 (0.060 g, 0.018 mmol), and 0.30 ml of an IM solution in HCl ether (0.30 mmol). obtained 30 as a pale yellow solid (0.054g, 78%).
  • one of the aspects of the invention is pharmaceutical compositions that contain at least one dendrimer of the invention, either together with another substance (s) of an anionic nature and of pharmaceutical interest to the (s) accompanying as a vehicle to facilitate its transport in the bloodstream to the target cells in which it has to exert its effect, protecting it (s) from the interaction with proteins of the plasma to which it could be bound or that could affect its stability, either as an active substance capable of interacting with the life cycle of a microorganism causing a disease whose effects are intended to be prevented, reduced or eliminated by one or more of a dendrimer of the invention.
  • the anionic molecule (s) at which one or more dendrimers of the invention serve as a transport vehicle is an oligodeoxynucleotide (ODN), preferably an antisense ODN, or a double-stranded DNA molecule of greater length or an interfering RNA.
  • ODN oligodeoxynucleotide
  • aspects of the invention are also the use of some dendrimer of the invention or of compositions containing them to prevent or treat diseases, caused by pathogens or by gene failure.
  • the last two, Superfect and G4 are commercial PAMAM dendrimers that were used for comparison with respect to the carbosilane dendrimer of the invention.
  • All carbosilane dendrimer of the invention are soluble in water at the concentration used for the starting solutions (2 mg / ml) by slight stirring, without heating being necessary.
  • oligonucleotide sequences used were antisense (complementary) sequences directed against different HIV RNAs.
  • the length varied from 15 to 28 bases, being phosphorothioate in nature.
  • the specific ODNs used and their sequences are shown below in Table 1.
  • GF refers to the anti-gag ODN fluoresceinated at the 5 'end
  • RF refers to the anti-Rev ODN fluoresceinated at the 5' end.
  • both the gels and the cells were based on the relationship between the number of positive and negative charges in said complex.
  • the complex formed has an excess of positive charge to facilitate its binding to the cell membrane glycoproteins, negatively charged, thus initiating the endocytosis process.
  • an excess of positive charge was added to ensure the formation of the dendrimer-DNA complex. Therefore, the complexes between the CBS dendrimers and the different nucleic acids were formed in excess of the number of positive charges (contributed by the CBS) versus negative charges (contributed by the ODN).
  • IM8 - Figure 3a. Complex formation between IM8 and ODN GF.
  • the electrophoresis samples were as follows: Street 1: 100 bp ladder
  • Lane 4: 4 ⁇ l GF + 45.2 ⁇ l IM8 + 50.8 ⁇ l RPMI (+/-) 20 / l
  • Lane 6 4 ⁇ l GF + 96 RPMI Calle 7: 4.52 ⁇ l IM8 + 95.48 ⁇ l RPMI Calle 8: 9 , 03 ⁇ l IM8 + 90.97 ⁇ l RPMI Street 9: 45.2 ⁇ l IM8 + 54.8 ⁇ l RPMI
  • Lane 1 lOObp ladder
  • Lane 2 RF: 4.5 ⁇ l + 56 ⁇ l RPMI
  • Lane 3 RF: 4.5 ⁇ l + 5.3 ⁇ l IM8 + 50 ⁇ l RPMI
  • Lane 6 PPT-TFO 2.5 ⁇ l + 58 ⁇ l RPMI
  • Lane 7 PPT-TFO 2.5 ⁇ l + 2.8 ⁇ l IM8 + 55 ⁇ l RPMI
  • Lane 8 TAR 2.6 ⁇ l + 57 ⁇ l RPMI
  • Lane 9 TAR 2.6 ⁇ l + 3 ⁇ l IM8 + 55 ⁇ l RPMI
  • C1NH4 is able to retain DNA also with all the load ratios evaluated.
  • IM16 - Figure 3e Complex formation between the PPT ODN, the IM8 and IM 16 dendrimers and the corresponding monomer from which the dendrimer was formed.
  • the electrophoresis samples were as follows: Street 1: 100 bp ladder Street 2: PPT 2.57 ⁇ l + 3 ⁇ l IM8 + 54 ⁇ l RPMI Street 3: PPT 2.57 ⁇ l + 2.35 ⁇ l IM 16 + 55 ⁇ l RPMI
  • Lane 4 PPT 2.57 ⁇ l + 1.8 ⁇ l monomer + 55 ⁇ l RPMI
  • Lane 5 PPT 2.57 ⁇ l + 57 ⁇ l RPMI
  • the CBS tested 2nd generation was capable of retaining the migration of the DNA toward the positive pole, this being a reflection of the formation of an electrostatic between CBS and ODN in all cases: the small generation of the CBS tested is not an obstacle therefore to retain DNA. Dendrimers without DNA, meanwhile, emit a weak signal, almost negligible.
  • the synthesis process of the CBS used in this work begins from an initial nucleus of common structure, which is ended functionalizing in the periphery mediate t and the use of different functional groups , which are the ones that contribute the positive charge to the dendrimer and determine the differences between them, being the dendrimeric nucleus of apolar nature.
  • Lane 2 Control with RPMI medium without dendrimer or oligonucleotide
  • Lane 3 PPT 2.57 ⁇ l + 3 ⁇ l IM8 + 54 ⁇ l
  • Lane 4 PPT 2.57 ⁇ l + 2.35 ⁇ l IM 16 + 55 ⁇ l RPMI
  • Example 32 Stability of dendriplejos at different pH Stability studies of the complexes at different pHs were performed, to determine how the pH changes would affect the complex, since there are different anatomical, tissue or cellular locations in which the pH is acidified or basify. Examples are the acidic environment of the stomach, the basic of pancreatic secretions to the small intestine, or at the cellular level, the endosomal-lysosome compartment, where it is changed from a physiological pH (7.35-7.45) to an acidic pH around a 4. It was interesting to know in what pH range the DNA complex could be maintained with the different CBS used. The complexes were formed following the usual procedure and excess volumes of different solutions were added at different pHs.
  • Example 33 Stability of dendripleios in aqueous solution as a function of time
  • Plasma protein binding is one of the obstacles that ODN therapies face. This union decreases the bioavailability of ODN, making a larger dose necessary to be able to exert the desired biological effect.
  • it is intended to analyze the influence of the presence of proteins in the medium on the stability of the complex, and whether it could somehow protect the ODN from plasma protein binding.
  • Lane 0 100 bp ladder Street 1: 2.60 ⁇ l TAR + 3.47 ⁇ l NN + 25 ⁇ l RPMI
  • Lane 2 2.60 ⁇ l TAR + 3.47 ⁇ l NN + 25 ⁇ l RPMI + 30 ⁇ PBS-BSA 2%
  • Lane 3 2.60 ⁇ l TAR + 3.47 ⁇ l NN + 25 ⁇ l RPMI + 30 ⁇ l PBS-BSA 5%
  • 4 2.60 ⁇ l TAR + 3.47 ⁇ l NN + 25 ⁇ l RPMI + 30 ⁇ l PBS-BSA 10% lane
  • 5 2.60 ⁇ l TAR + 3.47 ⁇ l NN + 25 ⁇ l RPMI + 30 ⁇ l SDS 0.5% lane
  • 6 2.60 ⁇ l TAR + 3.47 ⁇ l NN + 25 ⁇ l RPMI + 30 ⁇ l SDS 1%
  • Lane 7 2.60 ⁇ l TAR + 3.47 ⁇ l NN + 25 ⁇ l RPMI + 30 ⁇ l SDS 2%
  • Calle 8 2.60 ⁇ l TAR + 3.47 ⁇ l NN + 25 ⁇ l RPMI + 30 ⁇ l Medium Complete
  • 9 2.60 ⁇ l TAR + 27 ⁇ l RPMI + 30 ⁇ l PBS-BSA 10%
  • Lane 10 2.60 ⁇ l TAR + 27 ⁇ l RPMI
  • SDS dark bands appear midway between the free ODN and the well: they are complexes of the Paragon blue with the bromophenol blue present in the loading buffer.
  • the ODN forms complexes with albumin, to which corresponds a band in the gel stained with ethidium bromide that has been marked surrounding it.
  • albumin should not be sequestering ODN from the dendrimer-DNA complex because, if not, migraine at the height of the circle.
  • SDS ammonium detergent
  • Example 35 Stability of the NN-ODN dendriplejo in the presence of serum
  • TAR 2.59 ⁇ L + NN 0.8 or ⁇ L + 57 ⁇ L RPMI (+/-) 0 , 5 O
  • samples 1, 2 and 3 were added 100 ⁇ l of complete medium. From each of the samples, 45 ⁇ l aliquots were taken after 40 minutes, 4 hours and 17 hours and subjected to agarose gel electrophoresis. The samples were loaded on the gel following the order of their numbering from left to right, having previously placed a 100 bp ladder marker. At the last point (17 hours), only the 2/1 ratio complex was tested against the ODN without NN. The results are shown in Figure 7, in which a date appears on each of the wells corresponding to samples with TAR + NN in 2/1 ratio.
  • the complex and the ODN behave as if the medium used for the mixtures contains only RPMI, does not form complexes with the plasma proteins, and the NN releases the ODN at 5 p.m.
  • the electrophoresis gels obtained after waiting 20 minutes for a good interaction of the ODN with the whey proteins before loading the samples in the gel, are shown in Figure 8.
  • the part to be shown is the photograph obtained with UV light of the appearance of bands by staining with ethidium bromide and part b shows the same gel treated with Paragon blue ®.
  • the location of the corresponding bands the ODN in part a at the same height as the protein bands in part b demonstrates the binding of ODN to human serum proteins.
  • Figure 9a Figure 9b shows the staining with Paragon blue of the gel corresponding to the 4-hour samples.
  • the protein gels are observed, (of which the one corresponding to the 4-hour samples has been shown as an example, although the results were similar in the gels of 0 and 24 hours), they run towards the positive pole, (spot which separates from the well); but it is interesting to observe in the BE gel that the proteins form a complex with the ODN when it is alone, without dendrimer Proteins run at the same height in all circumstances of the experiment, regardless of the presence of the dendrimer (which fails to retain the protein in the well, does not complex with the protein).
  • siRNA small interfering RNA
  • the following anti-CD4 siRNA was used: 5'-GAUCAAGAGACUCCUCAGUdGdA-3 '(SEQ ID NO: 6) supplied by Ambion, Inc.
  • the gel used was a matrix gel, a gel made with a mixture of agarose and acrylamide linear at 25 or 50%, obtained after heating and subsequent marking of the samples with Ethidium Bromide. In this case, a 50% matrix, 0.7% agarose and 50% TAE 2X gel was used.
  • the samples subjected to electrophoresis were the following:
  • Toxicity tests The toxicity of the different dendrimers was studied by 5 different but complementary procedures, which provided data on cellular functionality, membrane permeability and cell appearance.
  • membrane integrity trypan blue stains
  • apoptosis annexin-V-PE and DAPI
  • necrosis 7-AAD
  • MTT reagent evaluates mitochondrial activity
  • evaluation of cell size and complexity by flow cytometry in vivo microscopy to evaluate cell mobility.
  • IM8 IMl 6, C1NH4, NN, Phe dendrimers and the commercial controls SF (Superfect) and G4 were evaluated. Different quantities were taken from each of them so that the final concentrations with which the cells were incubated were 1 ⁇ M, 5 ⁇ M, 10 ⁇ M, 20 ⁇ M and 100 ⁇ M.
  • CMSP peripheral blood mononuclear cells
  • Blood came from adult donors or umbilical cord donors from healthy neonates. Said blood was diluted Vi with PBS and centrifuged in a Ficoll gradient. After said centrifugation, the CMSP halo was recovered and two subsequent wash-centrifugation cycles were carried out. The resulting CMSPs were resuspended in complete culture medium with 10% STF, antibiotics and glutamine.
  • a mitochondrial activity curve dependent on dendrimer concentration was performed at 48 hours. This technique was used to show deleterious intracellular effects on the interior of cells. This is a colorimetric assay based on the selective ability of viable cells to reduce 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenylene tetrazolium bromide in formazan insoluble crystals. After 48 hours of incubation of the CMSP with different concentrations of dendrimers in 96-well plate (100,000 / well), the supernatant containing dendrimer was removed and replaced by 200 ⁇ l of a culture medium without serum or phenol red (Optimem).
  • the CMSPs were seeded in total human plasma fibronectin (Sigma®) at a concentration of 5-10 ⁇ g / ml, with which during the 48-hour incubation were fixed to the bottom of the well.
  • 20 ⁇ l of filtered MTT was added to achieve sterility (Thiazolyl Blue, Sigma®) in PBS pH 7.4 at a concentration of 5 mg / ml to achieve a final well concentration of 0.5 mg MTT / ml.
  • Formazan crystals were observed under phase contrast microscopy and subsequently dissolved with 200 ⁇ l of dimethylsulfoxide (DMSO).
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • the plate was stirred at 700 rpm in an Eppendorf ® stirrer-heater to ensure the correct dissolution of said crystals.
  • Formazan concentration ([A]) was determined by spectrophotometry using a plate reader at a wavelength of 570 nm with a reference of 690 nm. The spectrophotometer was calibrated to zero using Optimem without cells.
  • the MTT tests show that the cells that showed the highest mitochondrial viability after being treated with increasing concentrations of CBS or SF were those treated with CBS IM 16, CBS NN and CBS Phe. However, if the data are taken together with these tests with visual observation, it follows that while IM 16 induced the formation of cell aggregates, NN and Phe do not, the latter being the most biocompatible for lymphocytes .
  • the red blood cells were obtained after being separated from the CMSPs by the same Ficoll gradient cited in the previous Example. They were diluted in PBS until they can be viewed individually. The cells were re-suspended in 500 ⁇ l of PBS and seeded in a 24-well plate (300,000 / well). As a positive control, cells treated with 0.2% Triton X-100 were used. Negative control: PBS (white). The red blood cells were incubated with different concentrations of dendrimer.
  • the presence of hemagglutination, cell number and hemoglobin release at the time was evaluated by collecting 100 ⁇ l of supernatant and measuring absorbances by spectrophotometry using a plate reader at a wavelength of 550 nm and 690 nm as a reference.
  • IMl 6 induces less hemolysis and leaves a greater number of cells in the well than IM8, (according to what was observed for MTT in lymphocytes), but induces agglutination. All induce hemagglutination except NN.
  • PAMAM G4 induces agglutination and conformational changes in red blood cells, but not hemolysis. The hemaghitination order from highest to lowest is:
  • the well in which the cells looked better, also presenting almost negligible hemolysis was that of the NN dendrimer. If the toxicity results on lymphocytes and red blood cells are taken together, the dendrimer that demonstrated better biocompatibility profiles was the NN.
  • Example 40 Toxicity of the QDN + dendrimer complexes compared to the dendrimer alone.
  • the toxicity of other dendrimers such as PAMAMs is modified (decreased) when they form complexes with DNA.
  • the following experiments aim to know what happens to CBS dendrimers in terms of toxicity when they bind to ODN.
  • a complex formation volume of 60 ⁇ l was used in all assays, using RPMI serum-free medium with phenol red as the medium support.
  • the added corresponding amounts of ODN or dendrimer to reach the load ratio (+/-) 2, the positive charge being contributed by the dendrimer and the negative charge by the ODN.
  • the 160 ⁇ l were then added to the seeded cells in 340 ⁇ l, completing a final volume of 500 ⁇ l.
  • the cells were incubated either with said complexes, either with a mixture of equal volume containing the ODN without CBS, either with a mixture containing dendrimer alone, or with a mixture containing only RPMI + complete medium that was used as a negative control.
  • the cells and / or the supernatant were then collected for analysis in flow cytometry, confocal microscopy or cell DNA extraction.
  • the cells were treated for subsequent image acquisition in the conventional or confocal fluorescence microscope.
  • the cells were glued to glass slides with wells 30 mm in diameter by Poly-L-lysine, (PLL) (Sigma®).
  • PLL Poly-L-lysine
  • the slides were pre-incubated with 30 ⁇ l of PLL for 2 hours in an incubator at 37 C and 5% CO2. After this incubation, the excess PLL was washed with PBS.
  • the cells from each treatment that were to be glued on the PLL were washed twice with PBS and labeled for 1 minute with 0.8% trypan blue (Sigma®) to subsequently show viable cells.
  • a primary antibody anti-CD45 IgGl 5 K of mouse anti-human (BD (D) was used first, 30 .mu.l of antibody to each well were added at a dilution of 1 ug / ml, it was incubated for 30 minutes and then excess was washed with PBS, then a secondary goat anti-mouse IgG-IgM antibody (heavy and light chains) conjugated in Texas-Red (Jackson ImmunoResearch®), 30 ⁇ l / well at 1/130 dilution of the mother (concentration of the mother 1.4 mg / ml.) It was incubated with the cells for another 30 minutes and subsequently washed with PBS.
  • BD mouse anti-human
  • the cell nuclei were stained by using DAPI (Vysys ®) 10 ⁇ l / well for 10 minutes, then washed twice with PBS The incubations with antibodies and DAPI were carried out at room temperature The antibodies were diluted on the same day of use to avoid degradation over time and centrifuged at 12000 rpm previously at its use to decrease l in the presence of aggregates. The dilution of each antibody was carried out in blocking medium to reduce unspecific dizziness (PBS with 1% bovine serum albumin). Finally, the preparation was assembled by using a special means for fluorescence (DAKO Cytomation Fluorescent Mounting Medium) with antifading (intended to protect the sample against deterioration caused by lasers).
  • DAPI Cysys ® 10 ⁇ l / well for 10 minutes
  • Leica TCS SP2 confocal microscope using different excitation lines; 405, 488 and 514 nm and using the objective for differential optical contrast microscopy of the confocal. After image capture, it was analyzed using Leica® software.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • All work with the glass was done by arranging it on a non-stick surface (sterilized metallic paper) in a sterile Petri dish and in a laminar flow cabinet. Finally, they proceeded to the inclusion of the glass in the chamber for in vivo microscopy confocal, in which the cells remained at 37 0 C with 5% atmosphere. Before starting any experiment in vivo, the cells were allowed to recover from manipulation for 30 minutes in the chamber. After this period, the cells were treated differently:
  • sequential time shots (every 30 ", 1 ' or 2 ' ) of the cells were made by choosing a cut in the middle plane of the cells, including the nucleus. After acquisition, the cells were assembled. images to obtain images of the process.
  • This technique evaluates the permeability of the cell membrane to trypan blue (better known by its English name Tripán Blue, abbreviated TB). Live cells exclude this staining.
  • n 100 cells per count
  • the highest mortality rates corresponded to PAMAMs, both complexing with ODNs and alone.
  • the CBS did not show an increased percentage of TB-positive cells with respect to the control of untreated cells, barely showing differences when the cells were treated with CBS-ODN or with CBS alone.
  • the percentages of cells with size and complexity corresponding to cells in apoptosis-necrosis were compared with living cells. For this, an evaluation of size (FW) and complexity (SD) was performed by flow cytometry. To do this, a region was drawn around the cells with FW and SD corresponding to cells in apoptosis-necrosis and another around the cells with FW and
  • Part A shows a CMSP type cell population treated with CBS dendrimers and part B a population treated with a type dendrimer PAMAM
  • the dark cell cloud corresponds to cells in apoptosis necrosis. Gray represents the living cells.
  • the numerical percentages corresponding to each of the cell types were obtained, obtaining the values shown in Table 7.
  • FIG. 17 shows the results obtained with the following samples: 1: Control; 2: 0DN + IM8; 3: ODN + IM16; 4: ODN + SF; 5: ODN; 6: IM8; 7: IM16; 8: SF
  • the concentrations of dendrimers use in complex formation proved to be quite biocompatible, the cells showing similar viability when treated with CBS-ODN complexes than when they were treated with CBS alone.
  • a lymphoproliferative assay was performed. The experiment was prepared in triplicate on a 96-well flat bottom plate (100,000 cells per well in 200 ⁇ l of complete human AB medium with antibiotics, glutamine and 10% AB serum). The experiment had a negative proliferation control well (untreated cells), a well treated with a dose of usual use (2 ⁇ M) of each dendrimer to be tested, another with a higher dose bordering on cytotoxicity (5 ⁇ M) and another Positive proliferation control treated with 1 ⁇ g / mL phytohemagglutinin.
  • the CMSP were stimulated with phytohemagglutinin at a dose between 1-2 ⁇ g / ml and with interleukin-2 (IL-2) at a dose of 100 Ul / ml, the cell concentration being between 3 and 5 million / mi.
  • IL-2 interleukin-2
  • the cells were resuspended at a concentration of between 300,000-500,000 cells per 340 ⁇ l.
  • IL-2 was added to maintain cell activation during the course of the experiment at a dose of 50 Ul / ml calculated based on the 500 ⁇ l that they would constitute the final volume.
  • the fluorescence pattern was diffuse, without formation of aggregates.
  • Transfection tests were performed using the PPT ODN to form dendrites with different dendrimers of the invention. Specifically, they were used to transfect the following samples: 1: Control; 2: PPT; 3: PPT + IM8; 4: PPT + NN; 5: PPT + Phe; PPT + FM16.
  • ODN without CBS that is, diffuse, nuclear and cytoplasmic.
  • CBS dendrimers with the exception of C1NH4, do not interfere in any way with the distribution of ODN in the cell.
  • the dendrimers of the invention would be suitable for the preparation of compositions of medications (parenteral or oral) or interference devices (vaginal gels, antiseptics) for the prevention and / or treatment of biological agents such as the HIV virus or other viruses such as hepatitis C or other biological agents such as prions.
  • compositions of medications parenteral or oral
  • interference devices vaginal gels, antiseptics
  • biological agents such as the HIV virus or other viruses such as hepatitis C or other biological agents such as prions.
  • Example 43 HIV inhibition assays - Virus preparation
  • MT-2 cells human T lymphocytes immortalized with human lymphocytotropic virus type I
  • 2OxIO 6 MT-2 was washed twice with RPMI 1640 medium supplemented with 10% STF and transferred to 25 ml conical tubes at a concentration of 2x10 6 cells / ml in RPMI medium with 10% STF.
  • the strain of HIVNL4.3 virus was added at a concentration of 1 particle per cell (1 MOI).
  • MT-2 and the virus were cultured during at least 2 hours at the 37 0 C, stirring the culture every 15-30 minutes.
  • cultures (virus cells) were washed twice to remove virus that had not been integrated into the cell genome. The cells were transferred and grown in 25 cm bottles in the same culture medium.
  • the HIVNL4.3 viral isolate established laboratory viral strain, was titrated in the MT-2 cell line. 2x10 4 MT-2 cells were cultured with complete medium in plates
  • 96 wells and 40 ⁇ l of the viral preparation was added at different concentrations for which the corresponding dilutions are made. All of them were put in octuplicate and kept at 37 ° C under CO 2 atmosphere for one week.
  • Spearman-Karber I30 which is used to quantify the number of virus particles per ml of medium in a culture in which serial dilutions of the virus concentrate are seeded by octuplicate.
  • CMSPs were stimulated for 48 hours with 2 ⁇ g / ml of PHA and 100 IU of IL-2, to cause polyclonal activation; at 24 hours the cells were washed with
  • HIVNL4.3 per cell calculated in RPMI medium with 10% FCS for 4 hours at 37 0 C in a humidified atmosphere of 5% CO 2. After this time the cells of the culture were collected and washed three times to remove the virus adhered to the cell surface, they were again deposited in 24-well plate in RPMI medium with 10% STF and
  • the number of virus copies was adjusted the percentage of living cells to be able to make comparisons between different concentrations of dendrimers.
  • dendrimers did not induce significant mortality at the concentrations used (quantified by FW and SD in flow cytometry). Therefore, the following adjustment was made: number of HIV / 10 6 DNA copies of cells per
  • % live cells obtaining the following graph shown in Figure 25, in which the pre or post prefixes refer to the administration of 1, 3 or 5 ⁇ M of NN before or after infection and the bar marked " C "corresponds to the control.
  • the CBS dendrimers tested have a good biocompatibility for CMSPs at the doses used to vehicle ODN.
  • the dendrimer that turns out to have a better biocompatibility profile is the CBS-NN.
  • the NN dendrimer shows a good ability to prevent infection of lymphocytes by the HIV virus which, together with the good biocompatibility shown, indicates that it can be used for the prevention and / or treatment of disorders caused by biological agents such as it HIV or other viruses such as hepatitis C, including other biological agents such as prions.
  • CBS Phe and C1NH4 show a good ability to efficiently and endlessly fix nucleic acids, so they can be suitable for the generation of RNA or DNA microchips or other devices that require fixation to a nucleic acid surface already that, in addition, by the form of DNA fixation (electrostatic with the phosphate groups of the DNA), the CBS described herein leave the nucleotide sequence exposed to the interaction with complementary sequences of other nucleic acids.
  • the second generation dendrimer 34 was prepared following a procedure similar to that described for 33, starting from 32 (0.38 g, 0.13 rmol) and 0.07 ml of a 2M solution in MeI ether (1.04 mmol) . In this way compound 34 was obtained as a white solid (0.45 g, 85%).
  • the dendrimer 35 which has all the nitrogen atoms of its structure quaternized, was prepared from the first generation dendrimer 25 (0.24 g, 0.24 mmol) and 1.2 ml of MeI (2.4 mmol) in diethyl ether as solvent. In this way dendrimer 35 was obtained as a white solid insoluble in diethyl ether (0.49 g, 95%).
  • the second generation dendrimer 36 was prepared following a procedure similar to that described for 35, starting from 26 (0.11 g, 0.04 mmol) and 0.06 ml of MeI (0.91 mmol). In this way compound 36 was obtained as a white solid (0.18 g, 86%).
  • the dendrimers chosen to perform the tests were:
  • the drug is added at different concentrations to obtain the chosen (+) and (-) load ratios, also determining the amount of drug molecules present in the mixture. Incubation of such mixtures is at 37 0 C for 1 hour to give time to form the more thermodynamically stable complex, even the need more time for training. Each complex is done in duplicate.
  • the NN dendrimer was dissolved in distilled H 2 O at an initial concentration of
  • concentrations of 100 ⁇ M, 10 ⁇ M and 1 ⁇ M were chosen as the concentration that allowed to visualize the dendrimer in the gel after staining and detect possible delays of the band obtained when subjected to electrophoresis not in free form, but by forming complexes with a drug.
  • Dendrimer-methotrexate mixtures that responded to the characteristics shown in Table 9 were prepared and incubated:
  • the heparin used in the assay is presented in aqueous solution, at 10 mg / ml (1000 U). Not having its molecular weight, or the number of negative charges, although it is known that there are several, the union with the dendrimer was performed by heparin units. Thus, dendrimer-heparin mixtures were prepared and incubated that responded to the characteristics shown in Table 10 below.
  • the insulin used in the test is presented in aqueous solution, at a concentration of 3.5 mg / ml (100 U).
  • aqueous solution at a concentration of 3.5 mg / ml (100 U).
  • the union with the dendrimer was designed by calculating it by insulin units, thinking that it can be useful in order to compare the results with the doses of free insulin used in the clinic.
  • dendrimer-insulin mixtures were prepared and incubated that responded to the characteristics shown in Table 11 below. Table 11.- Characteristics of the NN-insulin dendrimer mixtures
  • the NN16 dendrimer was dissolved in distilled H 2 O at an initial concentration of 434 ⁇ M and, from this, dilutions were made to obtain concentrations of 100 ⁇ M, 10 ⁇ M and 1 ⁇ M.
  • the previous electrophoresis performed with aliquots of the solutions corresponding to each of these concentrations, to which the gel shown in Fig.
  • Dendrimer-methotrexate mixtures were prepared and incubated that responded to the characteristics shown in Table 12: Table 12.- Characteristics of NN16-methotrexate dendrimer mixtures
  • the heparin used in the assay is presented in aqueous solution, at 10 mg / ml (1000 U). Not having its molecular weight, or the number of negative charges, although it is known that there are several, the union with the dendrimer was performed by heparin units. Thus, dendrimer-heparin mixtures were prepared and incubated which responded to the characteristics shown in Table 13 below.
  • the insulin used in the assay is presented in aqueous solution, at a concentration of 3.5 mg / ml (100 U).
  • the union with the dendrimer was designed by calculating it by insulin units, thinking that it can be useful in order to compare the results with the doses of free insulin used in the clinic.
  • dendrimer-insulin mixtures were prepared and incubated that responded to the characteristics shown in Table 14 below.
  • the IM 16 dendrimer was dissolved in distilled H 2 O at an initial concentration of 442 ⁇ M and, from this, dilutions were made to obtain concentrations of 100 ⁇ M, 10 ⁇ M and 1 ⁇ M. Previous electrophoresis performed with aliquots of the solutions corresponding to each of these concentrations, to which the gel shown in Fig. 28a corresponds, showed that the dendrimer was in all of them in good condition.
  • Dendrimer-methotrexate mixtures that responded to the characteristics shown in Table 15 were prepared and incubated:
  • the heparin used in the assay is presented in aqueous solution, at 10 mg / ml (1000 U). By not having its molecular weight, or the number of negative charges, although it is known that there are several, the union with the dendrimer it was performed by heparin units. Thus, dendrimer-heparin mixtures were prepared and incubated that responded to the characteristics shown in Table 16 below.
  • the insulin used in the assay is presented in aqueous solution, at a concentration of 3.5 mg / ml (100 U).
  • aqueous solution at a concentration of 3.5 mg / ml (100 U).
  • the union with the dendrimer was designed by calculating it by insulin units, thinking that it can be useful in order to compare the results with the doses of free insulin used in the clinic.
  • dendrimer-insulin mixtures were prepared and incubated that responded to the characteristics shown in Table 17 below. Table 17.- Characteristics of IMlo-insulin dendrimer mixtures
  • Insulin was selected for testing, adding 0.5 units (0.5 U) to each reaction mixture.
  • Buffer solutions
  • Solutions prepared with different salts of phosphoric acid were chosen as buffer solutions. For this, solutions were made 0.2 M of each of the species H 2 PO 4 Na, Na 2 HPO 4 and Na PO 4 S1 from which each of the desired pH buffer solutions prepared, all 0.1 M, mixing the volumes of said solutions indicated in Table 18 below and completing with H 2 O up to 100 ml.
  • the assays described in Examples 50 to 53 support the usefulness of dendrimers as transporters of drugs with a negative charge in the blood and that, in addition, the binding is reversible, the release of the drug being possible inside the drug. cell at acidic pH that is reached in the entry endosome. Transfection of cells derived from the nervous system with oligonucleotides transported by dendrimers
  • SK-N-MC nerveroblastoma: ATCC HTBlO
  • U87-MG astroglioma: ICLC HTL 00013
  • the tests were performed with the NN (2G- [Si (O (CH 2 ) 2 N (Me) (CH 2 ) 2 NMe 3 + r)] s (26)) and NN16 C2G- [Si (O (CH) 2 ) 2 N + (Me) 2 (CH 2 ) 2 NMe 3 + 2r)] g (36)).
  • Transfection assays were performed with the anti-rev RF ODN (SEQ ID NO: 2).
  • the culture medium was DMEM + 10% fetal bovine serum.
  • cell proliferation was measured by the CellTiter 96 Aqueous One Solution Ceil Proliferation Assay kit from Promega, which allows quantifying cell proliferation from the evaluation of cellular reducing capacity, determined from of the colorimetric change produced by the bioreduction of MTS (3- (4,5-dimethylthizol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium in combination with the coupling reagent of PES electrons (phenazine ethosulfate)
  • the absorbance value obtained 490 nm for the negative control was given the value of 1 and was used to refer to it the rest of the absorbances obtained.
  • Fig. 30, marked “A” shows a graph with the results obtained in U87-MG cells. It is observed how the bars corresponding to the samples incubated with the dendrimers indicate a proliferation of the cells in them very similar to that of the negative control (C-), so it can be said that the NN and NN 16 dendrimers neither induce proliferation nor cause cell death after incubating them for three days with the U87-MG cell line.
  • Fig. 30 shows a graph with the results obtained in SK-N-MC cells. It can be seen that both the NN and NN16 dendrimer are toxic to the cell line SK-N-MC at a concentration of 10 ⁇ M In contrast, concentrations of 1 ⁇ M and 5 ⁇ M do not produce toxicity or cell proliferation.
  • Example 55 Study of the toxicity of dendrimers in U-87-MG cells - Tests with MTT A test was conducted with U-87-MG cells, in which the effect of dendrimers on the viability of these lines at different lines was studied time. For this, 15000 (24-hour incubations), 7000 (3-day incubations) or 1500 (7-day incubations) cells were plated in 96-well plates. The cells were incubated with different concentrations (1 ⁇ M, 5 ⁇ M and 10 ⁇ M) or of the NN dendrimer or NN16 dendrimer, for 24 hours, 3 days and 7 days.
  • Fig. 31 shows the results obtained with U87-MG cells.
  • the graph at the top, marked "A” corresponds to the values obtained after 24 hours of incubation;
  • the graph located in the intermediate zone, marked as '"B * ' corresponds to the values obtained after 3 days of incubation;
  • the graph located at the bottom, marked” C " corresponds to the values obtained after 7 days of incubation
  • the cells treated with dextran, both at 24 hours and after 3 and 7 days had viability values equal to or greater than 0.8.
  • the Superfect commercial dendrimer after 24 hours of incubation, results in a similar viability of the cells in any of the concentrations, equal to 0.7. This value is reduced after three days even at the lowest dose (1.25 ⁇ l), reaching a value of up to 0.4. After 7 days of incubation with Superfect, the cells are dead at any of the three doses used.
  • the Polyfect dendrimer presented less toxicity than Superfect at any of the three doses tested.
  • NN and NNl 6 the viability obtained at 24 hours was similar to each other and is in a range between 0.6 and 0.75 with respect to the negative control.
  • Cellular viability at 3 days in the case of the NN dendrimer, decreases as the concentration increases from 0.95, to a concentration of 1 ⁇ M, to values of 0.5 to 10 ⁇ M.
  • the NN 16 dendrimer it presents values close to 0.8 at any of the three concentrations studied.
  • the U87-MG present viability close to or greater than that of the negative control except in the case of NN 16 at a concentration of 10 ⁇ M, whose viability is 0.7.
  • Another way to assess the cellular toxicity that dendrimers can induce is by quantifying the concentration of LDH in the cell culture supernatant, which is considered a direct measure of the cytotoxicity of a particular compound or molecule and gives an idea of damage that the cells have suffered at the membrane level. Therefore, a viability test similar to that of MTT determination was performed on U87-MG cells, although in this case the viability was determined by measuring the concentration of LDH in the cell culture supernatant after 24 hours of incubation in culture medium to which dextran, the Superfect or Polyfect commercial dendrimers, the dendrimers of the invention NN or NNl 6, DMSO or Triton X-IOO had been added.
  • Example 56 Toxicity studies of dendrimers in SK-N-MC cells Similar tests to those described in Example 55 for U87-MG cells were performed on SK-N-MC cells (evaluation of cell viability by tests performed with MTT and by quantification of LDH in the cell supernatant): the cells were incubated with the same compounds at the same concentrations, although in this case the MTT measurements were only made after 24 hours of incubation.
  • Example 55 the absorbance values obtained in the MTT test were referenced to the negative control, obtaining the results shown in the upper part of Fig. 33 (A).
  • Example 57 Transfection of U87-MG and SK-N-MC cells mediated by dendrimers 100,000 cells / well of the corresponding cell line were plated on a 24-well plate with 500 ⁇ l of medium.
  • Dendriplejos was fo ⁇ naroB with the NN and NN16 dendrimers and the fluoresceinated anti-rev antisense oligonucleotide in a total volume of 75 ⁇ l of serum-free medium, in which the anti-rev oligonucleotide was mixed at a 250 nM concentration and the corresponding dendrimer in different proportions, so that different ratios load / load + were obtained: 1: 1, 1: 2, 1: 4 and 1: 8. The mixture was incubated for half an hour at room temperature and subsequently added to the corresponding well to incubate the cells with the dendriplejos.
  • the cells were detached from the well, washed twice with PBS, incubated for 1 minute with acid glycine to remove any debris debris that may have stuck on the cell membrane, and a final wash was performed. with PBS. Finally, the cells were resuspended in 500 ⁇ l of PBS and the amount of fluoresceinated oligonucleotide inside the cell was quantified by a flow cytometer.
  • Figs. 34a and 34b show the results obtained with the U87-MG cell line.
  • the graphs correspond to the results obtained with cells incubated with the oligonucleotide without dendrimer (Ctrl) or with complexes formed with one of the dendrimers and the anti-rev oligonucleotide in proportions that gave rise to the load-to-load + ratios indicated on each graph: 1: 1, 1: 2, 1: 4 and 1: 8.
  • Fig. 34a corresponds to the tests carried out with the NN dendrimer
  • Fig. 34b corresponds to the tests carried out with the NNl 6 dendrimer.
  • the graphs show that the incubation of U87-MG cells with complexes formed with a greater amount of dendrimer leads to an increase in transfection, from 19% obtained in the case of the incubation of the cells only with the oligonucleotide (Ctrl) up to 95% when incubated with the formed dendriplejo with the NN dendrimer with a load-to-load ratio + 1: 8 and 97.8% in the case of the dendriplejo formed with the NN 16 dendrimer equally with a load-to-load ratio + 1: 8.
  • Fig. 35 shows the results obtained with the SK-N-MC cell line with the NNl 6 dendrimer. In this case, the maximum transfection occurs with dendriplejos formed with a load-to-load ratio + 1: 4 (82.3% ).
  • the described trials support the usefulness of the carbosilane dendrimers of the invention as vehicles for increasing the transfection of polyanionic molecules such as oligonucleotides, either oligodeoxyribonucleotides (ODN) or interfering RNA (RNAi).
  • polyanionic molecules such as oligonucleotides, either oligodeoxyribonucleotides (ODN) or interfering RNA (RNAi).

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Abstract

Nuevos dendrímeros carbosilanos, su preparación y sus usos. Los dendrímeros de la invención poseen en extremos de sus ramificaciones grupos amino primarios, secundarios, terciarios o cuaternarios. Entre sus posibles usos está la utilización como vehículos de transporte en la sangre de moléculas con carga aniónica como las moléculas de ácidos nucleicos, entre ellas los ODN y los ARNi, y otros fármacos amónicos con los que tengan capacidad para interaccionar, protegiéndolos de la interacción con proteínas del plasma y/o aumentando su tasa de penetración en células diana. En los casos en que la unión es perdurable, los dendrímeros de la invención pueden utilizarse para fijar moléculas amónicas a superficies. Sus usos incluyen también su administración como principios activos para la prevención o el tratamiento de enfermedades producidas por microorganismos con cuya estructura y/o ciclo vital interfieran.

Description

NUEVOS DENDRÍMEROS CARBOSILANOS, SU PREPARACIÓN Y SUS USOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a las moléculas tridimensionales denominadas dendrímeros, concretamente a los de tipo carbosilano con restos terminales que contienen grupos ammo primarios, secundarios, terciarios o cuaternarios, a los procedimientos para su preparación y a su uso. Entre los campos en los que es posible su uso destaca su utilización como vehículos de transporte para ácidos nucleicos y otras moléculas con actividad farmacológica con carga negativa, al permitir aumentar la vida media de dichos fármacos y su biodisponibilidad y disminuir la dosis necesaria para conseguir el efecto biológico deseado. La prevención o el tratamiento de enfermedades producidas por microorganismos con cuya estructura y/o ciclo vital interfieran es otra de las aplicaciones de los dendrímeros de la invención.
ANTECEDENTES
Los dendrímeros han recibido gran atención en los últimos años debido a su posible utilización en aplicaciones tan variadas como catálisis a nanoescala, sensores químicos, micelas unimoleculares, imitación de la función de las enzimas, encapsulación de moléculas, reconocimiento molecular, agentes de diagnóstico y también como vehículos para el transporte de genes y fármacos. Revisiones excelentes que incluyen todas estas aplicaciones se encuentran publicadas en la bibliografía. [1 31"38J Una de las áreas en los que los dendrímeros han sido más estudiados es la Terapia Génica (introducción de material genético en una célula con finalidad terapéutica). Hasta ahora, los vectores para transporte de ácidos nucleicos más utilizados han sido los virales. Sin embargo, la utilización de vectores virales se ha asociado a la aparición de algunos problemas como efectos inmunológicos adversos, síndromes linfoproliferativos relacionados con la desregulación de oncogenes en el genoma humano[2], etc. Para intentar resolver estos problemas se han desarrollado otros tipos de vehículos no virales como liposomas catiónicos, polímeros y también, como se ha dicho, dendrímeros. Cada uno de estos sistemas catiónicos forman complejos electrostáticos con los ácidos nucleicos que se denominan, respectivamente, lipoplejos, poliplejos o dendriplejos. La utilización de lipo somas como agentes de transfección se describió inicialmente en 1987. ^ El método más utilizado para el reparto de genes ha sido la encapsulación en lípidos catiónicos, hasta el punto, de que algunos de estos derivados como Cytofectin™ o Lypofectin™ se encuentran disponibles comercialmente. Estos derivados, no obstante, también han mostrado efectos secundarios como reacciones inflamatorias del pulmón y problemas como la falta de transfección en presencia de suero. f4]
En cuanto a los polímeros degradables convencionales, su uso como agentes de transporte presenta como principal inconveniente su inestabilidad termodinámica, que hace que las especies activas tengan una vida media muy corta in vivo. [5]
La mayor ventaja de los dendrímeros sobre el resto de vehículos no virales, reside en una estructura uniforme y en la posibilidad de modificar de una manera versátil el esqueleto y superficie de los mismos, Io que permite una caracterización precisa del complejo (ácido nucleico/vector) y una investigación sistemática del proceso de transfección. La primera publicación que describió el uso de moléculas dendríticas como agentes de transfección apareció en 1993 describiendo el uso de los dendrímeros denominados PAMAMI6] (poliamidoamina) y desde entonces una gran cantidad de estudios han sido realizados. [7'39'40] La utilización de estos dendrímeros como agentes de transporte, se basa en el hecho de que a pH fisiológico algunos de los grupos terminales se protonan dando al dendrímero PAMAM una carga neta positiva, aunque también quedan presentes algunos grupos amina sin protonar. Con estos dendrímeros se han conseguido buenos resultados de transfección, especialmente con dendrímeros de sexta y séptima generación, sin embargo, la eficiencia de este proceso se puede aumentar en dos o tres órdenes de magnitud cuando se utilizan dendrímeros PAMAM activados mediante tratamiento térmico, como es el caso de Superfect™ o Polyfect™.
Otra clase de agentes potenciales de transfección son los dendrímeros que contienen átomos de fósforo, [8J sintetizados por Majoral y colaboradores hasta la duodécima generación. En este caso, la superficie de los dendrímeros se ha funcionalizado con aminas terciarias protonadas o metiladas y se han ensayado como agentes de transfección del gen de la luciferasa de células 3T3. La eficiencia aumenta al aumentar la generación del dendrímero hasta alcanzar un valor constante entre las generaciones tres y cinco. Además cabe destacar que estos dendrímeros presentan una mejor eficiencia de la transfección en presencia de suero.
Finalmente, se han estudiado otras macromoléculas, como los dendrímeros poli(propilenimina) (PPI)'9' o poli(lisina)'10'41-' como sistemas para el transporte de ADN u oligodesoxinucleótidos (ODN). Por ejemplo, dendrímeros de bajas generaciones de PPI han mostrado una cierta capacidad para la transfección in vitro con baja toxicidad, aunque generaciones más altas no han podido utilizarse debido al aumento de su toxicidad.
Por su parte, los oligonucleótidos (ODN) son investigados en aplicaciones médicas en distintos campos. Así, por ejemplo, los ODN antisentido son secuencias cortas (15-30 bases de longitud), sintéticas de ADN o análogos que son complementarias (o antisentido) a una secuencia diana (una secuencia de ARN o la secuencia de ADN complementaria a aquella desde la que ese ARN podría transcribirse); diseñadas para interferir con un hecho biológico, tal como la transcripción, la traducción o los fenómenos de corte y empalme [11]. Estas moléculas están diseñadas para interactuar como secuencias complementarias de un ARNm diana, impidiendo la traducción a proteínas, mediante la degradación del ARNm por la actividad de la RNAsa o interfiriendo con la lectura por el ribosoma. Esto se denomina "terapia antisentido". Los ODNs antisentido se han venido utilizando en múltiples campos desde 1978 (terapia antitumoral y enfermedades infecciosas sobre todo), hasta hoy cuando, tras un periodo de duda, los ODN antisentido han recuperado su papel como una potente herramienta en Biología Molecular, sobre todo a partir de la aprobación por la FDA americana de Formivirsen ιn\ ODN antisentido indicado en la infección ocular por CMV en el contexto de infección por el VIH. Otro ODN antisentido, GEM231, se postula como una molécula con potencial aplicación contra diferentes neoplasias [13l Este abordaje se está investigando también por su posible utilización en mareajes isotópicos de tumores utilizando la Tomografía de Emisión de Positrones ^14\ Existe, además, un tipo de ODNs antisentido que se postula que podrían actuar a nivel del ADN celular: son los ODNs formadores de triple hélice, algunos de ellos diseñados para su aplicación dentro del campo del VIH [l3].
Otro campo totalmente distinto es el de la aplicación de ODN ricos en secuencias no metiladas CpG como inmunomoduladores. Estas secuencias conducen la respuesta inmune hacia un perfil ThI, caracterizado por una secreción aumentada de Interferón, Factor de necrosis tumoral, interleuquina-2, y otros factores que aumentarán la capacidad del sistema inmune para eliminar patógenos como virus y bacterias. Estos ODN interaccionan con receptores de la superficie de los linfocitos como los de la familia Toll-like receptor. Están siendo investigados para potenciar la respuesta inmune en inmunodeficientes y en el contexto de enfermedades alérgicas, caracterizadas por un balance Th2, con el fin de llevar este perfil a ThI [I6l
Uno de los principales problemas de la terapia con ODN es la de conseguir unos niveles adecuados para lograr el efecto terapéutico. Es necesario administrar grandes cantidades de ODN para lograr el efecto biológico, debido a que éstos presentan gran afinidad a unirse a proteínas del plasma, tales como albúmina ^17I La unión a proteínas del plasma y otras proteínas de la superficie celular se considera la responsable también de algunos de los efectos tóxicos de los ODN in vivo (activación de la cascada del complemento, hemolisis, trombocitopenia, etc) [18]. Se cree por ello que la utilización de un vehículo transportador que previniera dicha unión a proteínas podría traducirse en la obtención de unos mayores niveles de ODN activo, prolongar además la vida media del mismo, y disminuir su toxicidad.
El problema de la interacción con proteínas y su unión a ellas se presenta también en muchas otras sustancias utilizadas como fármacos, pues las proteínas en general (y las plasmáticas en particular: albúmina, glucoproteínas, lipoproteínas) exhiben grupos funcionales potencialmente capaces de interactuar con sustancias presentes en el medio, incluyendo fármacos administrados. Esta unión es determinante para la distribución de dichos fármacos, toda vez que la fracción unida del fármaco, por no tener capacidad de ser transferida, no forma parte del equilibrio vascular-tisular ("reservorio"), no se metaboliza, no es excretada y no ejerce efecto (a menos que el mismo esté determinado por la unión mencionada).
La unión a las proteínas plasmáticas (UPP) es, con mucho, la más importante y determinante de la distribución de fármacos, ya que la unión a proteínas tisulares es, generalmente, muy reducida. Esto se debe, entre otras cosas, al hecho de que la concentración plasmática de proteínas es mucho mayor que la intersticial de los tejidos, cuyas proteínas, además, tienen muy poca movilidad y menor capacidad de ligar sustancias, propiedad esta última que es particularmente notable en el caso de la albúmina, proteína predominante en el plasma en condiciones normales y a la que se unen principalmente los fármacos ácidos (aunque también algunos básicos), mientras que a las glicoproteínas acidas se unen aquellos alcalinos.
Fármacos Ácidos Fármacos Básicos (Albúmina) (Albúmina - Il glicoproteína acida)
Aspirina Clordiazepóxido
Furosemida Diazepam
Penicilina Lidocaína
Fenitoína Quinina
Tolbutamida Amitriptilina
Warfarina
Como la estructura de la albúmina desde el punto de vista de la unión de fármacos es bastante compleja, se pueden definir en ella dos puntos o locus de unión principales:
Figure imgf000007_0001
Por tanto, el problema de la unión a proteínas del plasma no afecta solamente a los ODNs5 sino también a casi todos los fármacos de uso común. Muchos de estos problemas podría obviarse también mediante el uso de un transportador. Parece claro que el vehículo a desarrollar para este fin ha de presentar una serie de características, tales como, ser: - No tóxico - No inmunogénico (salvo si se pretenden utilizar en vacunación)
- Biocompatible
- Tener grupos funcionales adecuados para permitir la fijación química.
- Limitada acumulación corporal - Mantener la actividad del fármaco/ODN hasta llegar al sitio de acción
Además, parece obvio que el vehículo a desarrollar debería liberar a tiempo el ODN o el fármaco que transportara, para que éste pudiera llevar a cabo su actuación. En este aspecto, el desarrollo de vehículos que permitieran la liberación controlada del ODN o de determinados fármacos sería muy deseable, con el fin de lograr unos niveles mantenidos de sustancia activa en el organismo y la obtención del efecto de forma gradual. Por todas estas razones, la utilización de dendrímeros aparece como una posibilidad que cumple con los requerimientos deseados, al poder actuar como vehículos de las sustancias activas que las protegerían de la degradación por enzimas del plasma y de la interacción con otras proteínas a las que podrían unirse, incrementando sus niveles en sangre y permitiendo una actividad más elevada y/o prolongada. Los ODN en concreto, como muchos fármacos de interés, son moléculas amónicas (con carga negativa), por Io que la utilización como vehículos de las mismas de dendrímeros con grupos que facilitan su interacción y, especialmente, de los que son de naturaleza catiónica a pH fisiológico supone una opción muy adecuada para garantizar la estabilidad del complejo durante su transporte. Por todo ello, la invención desarrolla nuevos dendrímeros, concretamente del tipo carbosilano., y proporciona su uso, entre otros, como vehículos transportadores, en la sangre y/o en otros fluidos corporales, de ODN y otras moléculas aniónicas de interés. Esto supone un campo nuevo pues, hasta el momento, no se ha publicado ningún estudio concerniente al uso de dendrímeros con estructura carbosílano solubles en agua como agentes de transporte, aunque sí se ha publicado un informe sobre la biocompatibilidad in vitro de dendrímeros carbosilano constituidos sobre poli(óxido de etileno). 1^ Además, únicamente tres estudios sintéticos de dendrímeros carbosilano catiónicos han sido publicados hasta la fecha/ " , ninguno de ellos coincidentes con los que proporciona la invención.
Entre los fármacos para los que los dendrímeros pueden actuar como transportadores, un grupo interesante lo constituyen los fármacos citotóxicos destinados a las célula tumorales[73>74]. Cuando se busca este objetivo, los dendrímeros pueden direccionarse hacia las células tumorales funcionalizándolos con ácido fólico, que está sobreexpresado en las células tumorales, por lo que esos dendrímeros tendrían preferencia para su entrada por dichas células respecto a las células normales. Recientemente, dendrímeros PAMAM modificados con folato en su superficie han sido utilizados como transportadores de isótopos de boto en terapias de captura de neutrones en cáncer[75]. Además, los dendrímeros PAMAM conjugados con cis-platino actúan como transportador macromolecular de platino, un fármaco antitumoral, que se libera del complejo dendrímero-platino de forma controlado, dando lugar a una mayor acumulación del mismo en tumores sólidos, con menor toxicidad que el cis-platino libre[76l Otra alternativa para la liberación controlada en el establecimiento de uniones covalentes entre el dendrímero y el fármaco mediante enlaces biodegradables a pH fisiológico, como se ha probado con dendrímeros con aminas primarias en superficie y modificados parcialmente con l-bromoacetil-5-fluoro-uracilo para formar una unión amida lábil que se hidroliza in vitro a. pH fisiológico, liberando de forma controlada 5- fluoro-uracilo, un potente antitumoral.
Otras sustancias de interés en cuyo transporte pueden ser de utilidad los dendrímeros son aquellas que se convierten en tóxicas tras ser irradiadas, debido a la formación in situ de pequeñas cantidades de oxígeno en estado singlete, el cual tiene efectos fisiológicos deletéreos^. Se han publicado algunos artículos acerca de dendrímeros portadores de fármacos fotosensibles, por ejemplo, con ácido 5- aminolevulínico en la periferia, suponiendo estos dendrímeros agentes prometedores en el tratamiento de tumores de queratinocitos[70l Como candidatos para el tratamiento de tumores sólidos se han evaluado dendrímeros basados en poliariléter portando protoporfirina como fotosensibilizador[71l
Un grupo adicional de fármacos para los que los dendrímeros podrían suponer interesantes transportadores lo constituyen algunos fármacos como los antiinflamatorios no esteroideos, que presentan efectos secundarios tales como alteraciones gastrointestinales o nefrotoxicidad que podrían evitarse al ser suministrados por vía transdérmica, en lugar de por las vías clásicas oral o parenteral. Los datos que indican que la presencia de dendrímeros, unidos a los fármacos a administrar, induce alteraciones en la piel que aumentan su permeabilidad[72], los convierten en buenos candidatos para ser utilizados en la administración transdérmica de fármacos.
La multivalencia de los grupos funcionales de superficie de los dendrímeros hace que la gran variedad de moléculas que pueden transportar abarque incluso dendrímeros con distintas funcionalidades: son los tectodendrímeros, que están siendo estudiados por su gran potencialidad en posibles aplicaciones biomédicas.
La potencialidad de los dendrímeros para el transporte de fármacos se basa no sólo en aprovechar las posibles interacciones con una superficie externa dendrimérica multivalente, sino en que las cavidades de la estructura del dendrímero pueden ser utilizadas también para alojar las moléculas que se desee transportar. Un ejemplo de aprovechamiento de cavidades de estructuras dendriméricas es la llamada "caja dendrítica"[68], en la que un dendrímero PPI es modificado en superficie con grupos fenilalanino, que protegen el armazón externo haciéndolo más denso. Durante el proceso de crecimiento del dendrímero, se encapsulan en su interior moléculas de diferente tamaño. El dendrímero puede portar distinto número de moléculas según el tamaño de éstas. Cuando el dendrímero se trata con ácido fórmico, el armazón externo se abre, permitiendo la liberación de las moléculas hospedadas en su interior.
Otro grupo de moléculas para las que los dendrímeros pueden suponer transportadores adecuados son las moléculas de bajo peso molecular (como los péptidos) contra los que se desea generar una respuesta inmune en un sujeto pero que, por su pequeño tamaño, son poco inmunogénicas o inducen una respuesta débil tras ser inyectadas al individuo que se desea tratar. Este problema puede solucionarse incrementando su peso molecular, bien mediante polimerización o mediante su acoplamiento a un transportador de alto peso molecular (tradicionalmente una proteína). Los dendrímeros que poseen una estructura muy definida y muchos grupos funcionales capaces de unir antígenos en su periferia representan una buena alternativa para la fabricación de vacunas que contengan inmunógenos muy definidos y altamente reproducibles. En esta línea, se han desarrollado los dendrímeros MAP (del inglés
"múltiple antigenic peptide")'-57'38-', que son construcciones asimétricas en forma de cuña formadas por sucesivas generaciones de residuos de usina. Estos dendrímeros presentan un gran número de aminas primarias que pueden ser acopladas a antígenos de bajo peso molecular, con la intención de aumentar su inmunogenicidad, obviando la necesidad de utilizar proteínas transportadoras. Estructuras MAP que contenían péptidos de Plasmodium falciparum estimuladores de células T y B han sido utilizadas para producir respuestas inmunes contra este parásito [59]. Además, se ha demostrado que las estructuras MAP son procesadas por las células presentadoras de antígenos de la misma forma que los antígenos derivados de patógenos intracelulares (como por ejemplo, virus), dando lugar a una potente respuesta inmune, incluyendo la producción de células T citotóxicas'-60-'. Los dendrímeros de la invención, que presentan en extremos de sus ramificaciones restos que contienen grupos amino, pueden tener también utilidad en vacunación, bien porque se les acoplen antígenos de bajo peso molecular aprovechando aminas presentes en restos de extremos de sus ramificaciones, o bien porque dichos restos que contienen al menos un grupo amino constituyan ellos mismos antígenos de bajo peso molecular como pueden ser los de naturaleza peptídica.
Las estructuras MAP han sido utilizadas también para transportar antígenos no peptídicos como hidratos de carbono, haptenos, etc., en el contexto de vacunas. Los hidratos de carbono en particular son una clase de moléculas importantes en el reconocimiento biológico. Los glicodendrímeros, preparados mediante la unión manosa-isotiocianato, ácido siálico o lactosa a las aminas terminales de dendrímeros PAMAM o a dendrímeros de usina, han sido utilizados como antígenos para vacunas [64>65]. En glicodendrímeros con el antígeno T-asociado beta Gal 1-3 alfaGalNAc disacárido se ha ensayado también su capacidad de unión a la lectina (proteína de unión a hidratos de carbono) específica para la galactosa[66], con la intención de utilizarlos en la detección de tumores que expresen receptores de antígenos T y para vehiculizar fármacos hacia los mismos. Los glicodendrímeros pueden utilizarse, además, para aumentar la afinidad por las lectinas que se unen al hidrato de carbono que lleven unido[67^, lo que puede tener interés para utilizar esos dendrímeros glicosilados como anti-adhesinas microbianas, antagonistas de toxinas, o bien como fármacos antiinflamatorios, antivirales y anticancerosos, pues las interacciones íectina-hidrato de carbono han sido descritas en numerosos casos en el sistema inmune (en los eventos que llevan a activación celular), en infecciones virales y bacterianas, en relación con el cáncer y el crecimiento celular, etc. En resumen, los dendrímeros glicosilados pueden mimetizar los glicoconjugados naturales e interactuar eficientemente con los receptores naturales de los hidratos de carbono, dando lugar a efectos característicos de la interacción con los mismos.
Además de la posiblidad de aprovechar sus propiedades para utilizarlos como transportadores, otro campo relacionado también con los ácidos nucleicos al que se le está prestando mucha atención en la actualidad es el de la fabricación de microchips que contengan conjuntos ordenados de secuencias de ADN o ARN. A la hora de fabricar estos microchips, los dendrímeros están surgiendo como una de las alternativas para recubrir superficies de vidrio y aprovechar su capacidad de interacción con los ácidos nucleicos para fijar dichas moléculas a la superficie de los microchips[63]. La perdurabilidad de la unión entre secuencias de nucleótidos y dendrímeros de la invención los hace adecuados para utilizar su capacidad de fijar ácidos nucleicos con el fin de servir de base para la fabricación de estos microchips de ADN o ARN.
Finalmente, existe también una necesidad de encontrar métodos alternativos para luchar contra distintos patógenos, interfiriendo en su ciclo vital, campo en el cual los dendrímeros están demostrando ser una interesante alternativa. Algunos dendrímeros previamente descritos han demostrado ser capaces de inhibir la infección causada por distintos virus, interfiriendo tanto con Ia entrada del viras en las células como en pasos posteriores de replicación viral. Ese es el caso por ejemplo del Herpes Simplex, cuya infección se ve inhibida in vitro por efecto de dendrímeros de polilisina modificados130'311. También se ha conseguido inhibir la replicación del VIH, tanto a nivel de la entrada celular como en pasos posteriores, en este caso mediante la utilización de dendrímeros PAMAM modificados covalentemente, que demostraron ser capaces de interferir con la retrotranscriptasa y la integrasa del virus[19' D2]. Aprovechando estas propiedades, se han desarrollado geles vaginales para la prevención de enfermedades de transmisión sexual con formulaciones basadas en dendrímeros, como es el caso de VivaGel™ (Starpharma), cuyo ingrediente activo es un dendrímero de polilisina funcionalizado con restos naftalendisulfonato que parece ser efectivo en la prevención de la infección del VIH gracias a su capacidad de unirse a la glicoproteína gpl20 de la superficie del virus. Aunque en el diseño de dendrímeros antivirales se tiene preferencia por aquellos que presentan en su superficie grupos que mimetizan los que se encuentran presentes en la superficie celular y que, por ello, son capaces de competir con las células por la unión al virus, se ha diseñado también un dendrímero con grupos amida de superficie que funciona como inhibidor del virus respiratorio sincitial, se cree que por la formación de puentes de hidrógeno entre los grupos periféricos del dendrímero con la proteína de fusión del virus, por lo que es de esperar que dendrímeros funcionalizados con otros grupos capaces de formar puentes de hidrógeno con proteínas virales implicadas en la interacción con la superficie celular sean capaces también de interferir con distintos virus, inhibiendo la infección provocada por ellos.
En otros casos, los dendrímeros han sido utilizados como antibacterianos o para desestructurar las membranas celulares de algunos hongos. Cuando se diseñan para esta finalidad, se tiene preferencia por los dendrímeros con grupos catiónicos en su superficie, tales como aminas o grupos tetraalquilamonio, que facilitan la adherencia de los dendrímeros a la membrana bacteriana, causando la lisis de la bacteria. Tal es el caso de los dendrímeros de poli(propilenimina) (PPI) con grupos alquilamonio terciarios en su superficie, que han demostrado una amplia actividad bactericida tanto contra bacterias Gram positivas como contra bacterias Gram negativas'53'54-'. Estos dendrímeros presentan una mayor capacidad bactericida que otros polímeros hiperramificados. Los dendrímeros de la invención, funcionalizados también con restos que contienen grupos amino, representan una opción para ser utilizados igualmente para desestructurar membranas celulares de bacterias u hongos.
También se ha comunicado que los dendrímeros presentan propiedades que les permiten actuar como desnaturalizantes de proteínas. Ciertos tipos de dendrímeros actúan disminuyendo la constante dieléctrica y la viscosidad del agua y desordenando su estructura regular mediante la reorganización de las moléculas de agua en la superficie del dendrímero. Esto lleva a desfavorecer las interacciones hidrófobas, lo cual es muy desestabilizador para la mayoría de las estructuras terciarias de las proteínas, provocando su desnaturalización: es el llamado efecto "caotrópico" que presentan agentes desnaturalizantes como la urea o el cloruro de guanidinio. Un campo muy interesante en el que se pretende aplicar esta capacidad desnaturalizante de proteínas es el uso para disolver proteínas priónicas, tales como PrPSc [20]. Las proteínas priónicas son capaces de adoptar una estructura-conformación patógena que causa neuropatías mortales llamadas encefalopatías espongiformes (enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, mal de las "vacas locas", scrapie ovino, etc.). Estas proteínas forman agregados que se localizan en los cerebros de los individuos afectados y son solubles sólo en disolventes que contienen tanto detergentes como agentes caotrópicos (típicamente cloruro de guanidinio 6M). Sin embargo, estos agregados pueden ser solubilizados por dendrímeros catiónicos como los de PPI y los PAMAM: los de mayor generación con mayor número de aminas en superficie son los más eficaces. Por ello, los nuevos dendrímeros de la invención, funcionalizados también con restos que contienen grupos amino, proporcionan nuevos compuestos que utilizar tanto para disolver agregados priónicos como en la terapia de otras enfermedades en cuyo desarrollo se produce también la formación de agregados proteicos patogénicos, como por ejemplo los agregados de proteína amiloide que aparecen en la enfermedad de Alzheimer55'5 . En resumen, los dendrímeros son polímeros sintéticos con buenas propiedades para su uso en aplicaciones biológicas: responden de forma predecible en solución, pueden ser modificados ampliamente para portar múltiples ligandos con actividad biológica, pueden atravesar barreras biológicas y son fabricados con pocos defectos estructurales. Por ello, se está estudiando su aplicación en distintas estrategias preventivas y terapéuticas entre las que se incluye su uso para el transporte de distintos fármacos, la transfección de moléculas oligonucleotídicas o polinucleotídicas, el diseño de vacunas, la administración como fármacos antibacterianos, antifúngicos, antivirales o incluso el alivio de los síntomas de enfermedades de distinta etiología en cuyo desarrollo está implicada la formación de agregados proteicos como puedan ser los originados por priones o los depósitos de proteína amiloide característicos de la enfermedad de Alzheimer. Los dendrímeros de la presente invención suponen interesantes alternativas para estas áreas de la Biomedicina.
DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA INVENCIÓN
La invención describe nuevos dendrímeros carbosilano ramificados con restos terminales en extremos de sus ramificaciones que contienen grupos amino primarios, secundarios, terciarios o cuaternarios que responde a una cualquiera de las fórmulas:
(R1J 3-P ¡
S i - ( Al q1 - S i - Xp ) 4 , en el caso de ser de primera generación; ( R1 J 3-IH ( R2 ) 3-p
! I
Si- (AIq1^Si- (Alq2-Sx-Xp) m) 4, en el caso de ser de segunda generación;
Figure imgf000015_0001
[ I I
Si- (RIq1Sx- (Alq2-Si- (Alq3-Si-Xp) n) J 4 , en el caso de ser de tercera generación; o a las fórmulas análogas correspondientes en el caso de generaciones superiores, en las que la fórmula correspondiente a cada generación i resultaría de sustituir Xp en la fórmula correspondiente a la generación anterior por un nuevo bloque del tipo:
(R1 J 3-P 1
Al qx- Si -Xp pasando el grupo unido al mismo átomo de silicio que este bloque sustitutorio de estar representado por
Figure imgf000015_0002
fórmulas en las que:
AIq1, AIq2, AIq3, , AIq1 representan restos alquileno de 2 a 4 carbonos que se eligen independientemente unos de otros según la longitud de las ramificaciones en cada generación;
R1, R2, R3, R1"1, R1 representan restos que se eligen independientemente unos de otros entre metilo y fenilo;
X representa un resto que contiene al menos un grupo amino primario, secundario, terciario o cuaternario; p es un número entero que varía entre 1 y 3; m, n,....; z son números enteros que varían independientemente entre 1 y 3
En una realización preferida de la invención, los restos R1, R2, R3, R1"1, R1 son todos iguales y corresponden a restos metilo.
En otra realización preferida de la invención, los restos AIq1, AIq2, AIq3,..., AIq1 se seleccionan entre etileno y propileno. En otra realización más preferida de la invención, dichos restos son todos iguales y corresponden a restos propileno. En otra de las realizaciones preferidas de la invención, los números enteros m, n, ..., z son iguales entre sí y tienen el valor 2.
En la realización que más se prefiere de la invención, los restos R1, R2,
R3, R1"3, R1 son todos iguales y corresponden a restos metilo; los restos AIq1, AIq2, AIq3,..., AIq' son iguales entre sí y corresponden a restos propileno y los números enteros m, n, ..., j son iguales entre sí y tienen el valor 2.
X representa cualquier resto que contenga una amina primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria. De entre ellos, se prefieren aquellos restos en los que X representa o bien -OCH2CH2N(CH3)2, -OCH2-(C6H3)-3,5-(OCH2CH2N((CH3)2)2, o -OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, o bien un grupo -CH2CH2(CH2)eNH2 en el que "e ' es un número entero que oscila entre 0 y 2, prefiriéndose en ese caso que tome el valor
1. También son realizaciones preferidas de la invención aquéllas en las que X representa las formas cuaternizadas de los restos anteriores -OCH2CH2N+(CH3 )3r, -OCH2-
(C6H3)-3J5-COCH2CH2N+(CH3)3)r)2, -OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N+(CH3)3r o -CH2CH2CH2-N+H3Cl".
Cuando X representa -OCH2CH2N(CHa)25 -OCH2-(C6H3)-3,5- (OCH2CH2N(CH3)2)2, o -OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2, o bien sus formas cuaternizadas -OCH2CH2N+(CH3)Sr, -OCH2-(C6H3)-3,5-(OCH2CH2N+(CH3)3)r)2, -OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N+(CH3)3r, se prefiere especialmente que todas las ramificaciones posean restos terminales que contengan grupos amino y que el índice "p" tome los valores 1 ó 2 , con lo que cada ramificación terminaría, respectivamente, en único resto terminal o en dos restos terminales. Cuando X representa -CH2CH2CH2NH2 o su forma cuateraizada -CH2CH2CH2-N+H3Cl", se prefiere especialmente que todas las ramificaciones posean restos terminales que contengan grupos amino y que "p" tome el valor 1, con lo que cada ramificación terminaría con un único resto amino.
También están incluidos dentro del alcance de la invención los casos en los que X represente un resto antigénico que contenga al menos un grupo amino. Un caso particular del anterior sería aquél en el que el resto antigénico es un péptido. La invención se refiere también a un procedimiento de preparación de dichos dendrímeros carbosüano, procedimiento que comprende las etapas de: a) obtener un esqueleto de dendrímero carbosilano siguiendo los pasos de: al) obtener un dendrfmero carbosilano básico de partida de fórmula: Si [ ( CH2 J aCH=CH2 ] 4 donde a varía entre 0 y 2, según la longitud que se desee para las ramificaciones, haciendo reaccionar SiCl4 con BrMg(CH2)aCH=CH2; al) obtener un dendrímero carbosilano de primera generación precursor de un dendrímero de una generación superior haciendo reaccionar el dendrímero carbosilano básico de partida de al) con HSi(R])3-mClm, de forma que se obtenga un dendrímero de fórmula: (R1J 3-M i
Si- [ (CH2 ) aCHCH2-S:L-Clm] 4 donde m varía entre 1 y 3 y equivale al número de ramificaciones que se pueden conseguir en la siguiente generación o el número de grupos funcionales terminales por los que pueden sustituirse los grupos Cl;
R1 representa un resto metilo o fenilo; a3) opcionalmente, obtener un dendrímero carbosilano de segunda generación precursor de un dendrímero de una generación superior sometiendo el derivado con enlaces terminales Si-Cl obtenido en la etapa al) a la repetición de las etapas al) y al), es decir, i) obteniendo nuevas ramificaciones haciendo reaccionar el derivado correspondiente con enlaces terminales Si-Cl con
BrMg(CH2)bCH=CH2, donde "b" varía entre 0 y 2, según la longitud que se desee para esas ramificaciones, y puede ser igual o diferente al índice "a"'; ii) haciendo reaccionar el esqueleto de dendrímero carbosilano de la nueva generación obtenido en i) con HSi(R2)3-nCln, donde "n" varía entre 1 y 3 y puede ser igual o diferente al índice "m" de la generación anterior y R2 representa un resto metilo o fenilo; a4) opcionalmente, obtener dendrímero s carbosilanos de sucesivas generaciones precursores de dendrímero s de generaciones superiores sometiendo el derivado con enlaces terminales Si-Cl correspondiente a la generación anterior a la que se busca a la repetición de la etapa a3) i) utilizando un reactivo BrMg(CH2)cCH=CH2 y la repetición de la etapa a3) ii) utilizando un reactivo HSi(R3)3-zClz, reactivos en los que"c" varía entre 0 y 2 y "z"' varía entre 1 y 3; a5) obtener el esqueleto de dendrímero carbosilano final al que van a añadírsele en la etapa b) restos que contienen al menos un grupo amino utilizando en la etapa a2), a3) o en la repetición i-1 de la etapa a4), según sea el dendrímero de primera, de segunda o de una generación i, respectivamente, un reactivo HSifR^.pClp, donde "p" varía entre 1 y 3 y
R1 representa un resto metilo o fenilo. b) obtener un dendrímero carbosilano con restos terminales con grupos aminos primarios, secundarios o terciarios siguiendo una de las siguientes vías: bl) provocar la alcoholisis de enlaces terminales Si-Cl de un dendrímero carbosilano obtenido en la etapa a5) haciéndolo reaccionar con una alcohol-amina primaria, secundaria o terciaria en presencia de un exceso de una base; b2) obtener previamente un dendrímero carbosilano con enlaces terminales Si-H al que posteriormente se unen los restos que contienen al menos un grupo amino primario, secundario o terciario, haciéndolo pasar por las etapas de: i) obtener un derivado con enlaces terminales Si-H de un dendrímero carbosilano precursor de una generación cualquiera haciendo reaccionar el correspondiente dendrímero carbosilano con enlaces Si- Cl con un reactivo capaz de ceder grupos hidruro, de manera que parte o la totalidad de los átomos de Cl queden sustituidos por átomos de H; ii) hacer reaccionar el dendrímero carbosilano con enlaces Si-H, en presencia de un catalizador de hidrosililación, con un compuesto que contiene un grupo amino primario, secundario o terciario y que posee un doble enlace carbono-carbono en un extremo, de forma que el compuesto quede unido al dendrímero por el extremo en el que se encontraba el doble enlace; c) opcionalmente, obtener un dendrímero carbosilano con restos terminales con grupos amino cuaternizados mediante Ia reacción de un dendrímero obtenido en la etapa b) con un reactivo A-HaI, en el que A representa hidrógeno, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono o arilo y HaI representa Cl, Br, L En una realización preferida del procedimiento de la invención, los índices a, b, ..., k correspondientes a los reactivos BrMg(CH2)aCH=CH2, BrMg(CH2)bCH=CH2, ,
BrMg(CH2)^CH=CH2 son iguales entre sí y tienen el valor 0, por lo que el reactivo utilizado es el derivado vinílico BrMg-CH=CH2 y las ramificaciones tienen una longitud de 2 carbonos. '
En otra realización preferida del procedimiento de la invención, los índices a, b, ..., k correspondientes a los reactivos BrMg(CH2)aCH=CH2, BrMg(CH2)bCH=CH2, ,
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son iguales entre sí y tienen el valor 1, por lo que el reactivo utilizado es el derivado alílico BrMg-CH2-CH=CH2 y las ramificaciones tienen una longitud de 3 carbonos.
En otra realización preferida del procedimiento de la invención, los restos R3, R2, ..., R1 son todos iguales y corresponden a restos metilo.
En otra realización preferida de la invención, los índices n, m, ..., j correspondientes a los reactivos de fórmula general HSi(R2)3-nCln, se eligen preferiblemente entre 1 y 2. En una realización particular de la anterior, el número de ramificaciones formadas en cada generación es siempre la misma e igual a 2, para lo cual el reactivo HSi(R2)3-nCln,, cuando se utiliza para crear un precursor que dé lugar a un dendrímero de una nueva generación, sería en todos los casos HSi(R2)2Cl, preferiblemente, HSi(CHs)2Cl, lo que corresponde a un valor de "n" de 1.
En la realización que más se prefiere de la invención, los restos R1, R2, ..., R1 son todos iguales y corresponden a restos metilo, mientras que los índices a, b, ..., k correspondientes a los reactivos BrMg(CH2)aCH=CH2, BrMg(CH2)b CH=CH2,
BrMg(CH2)JcCH=CH2 son iguales entre sí y tienen el valor I5 por lo que las ramas de los dendrímeros carbosilanos tendrían una longitud de 3 carbonos, y las ramificaciones creadas en cada nueva generación serían 2, para lo cual se utilizaría siempre
HSi(CHs)2Cl para crear un precursor de una nueva generación. En cambio, cuando el reactivo HSi(R2)3-πCln se utiliza para dar lugar a un dendrímero carbosilano con enlaces terminales Si-Cl a partir del cual obtener un dendrímero carbosilano de la invención con grupos amino en las ramificaciones, se prefiere que el valor de "n" se elija entre 1 y 2, pudiendo utilizarse, por tanto, HSi(CHs)2Cl como HSi(CH3)Cl2 según se desee que el número de grupos terminales presentes por rama sea 1 ó 2, respectivamente.
En una realización de la invención, la alcohol-amina utilizada para obtener los dendrímeros carbosilano de la invención a partir de los correspondientes derivados con enlaces terminales Si-Cl se elige entre N,N-dimetiletanolamina (CH2OH-CH2-N(CH3)I), 2-[(2-dimetilaminoetil)metil]amrno etanol (CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2) o 3,5-bis(dimetilaminoetoxi)bencilalcohol (CH2OH-(C6Hs)-(O-CH2-CH2- N(CH3)2)2). En una realización preferida de la anterior, el dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl se trata con la correspondiente cantidad estequiométrica de la alcohol-amina elegida, en éter dietílico y en presencia de un exceso de trietilamina, de manera que cada uno de los enlaces Si-Cl pase a ser un enlace Si-O por el que queda unido el resto correspondiente a la alcohol-amina utilizada. En otra realización de la invención, el dendrímero carbosilano obtenido a partir de una cualquiera de las alcohol-aminas anteriores se cuaterniza posteriormente tratándolo con CH3I en éter dietílico.
En otra realización de la invención, el compuesto que contiene un grupo amino primario, secundario o terciario, que posee un doble enlace carbono-carbono en un extremo y que se hace reaccionar con un dendrímero carbosilano con enlaces Si-H es una alquilenamina primaria de fórmula CH2=CH-(CH2VNH2, en la que el índice '"e" varía entre 0 y 2. En una realización preferida de Ia anterior, la alquilenamina primaria es aquella en la que el índice "e" vale 1, es decir, Ia alilamina, CH2=CH-CH2-NH2. En otra realización de la invención, el dendrímero carbosilano con restos terminales -CH2-CH2-CH2-NH2 obtenido por reacción con la alilamina se cuaterniza por adición de HCl en éter dietílico.
En otra realización de la invención, el compuesto que contiene un grupo amino primario, secundario o terciario, que posee un doble enlace carbono-carbono en un extremo y que se hace reaccionar con un dendrímero carbosilano con enlaces Si-H es un compuesto que comprende un resto alquenilo en un extremo (CH2=CH-(CH2)e-, en donde "e" varía de nuevo entre 0 y 2) y un grupo amino (primario, secundario o terciario) en otro extremo diferente, comprendiendo el compuesto adicionalmente algún resto -R3- entre el resto alquinilo CH2=CH-(CH2)e y el grupo amino. En una realización preferida de ésta, el compuesto utilizado es 4-alil-2-metoxi-l-(N,N-dimetilaminoetoxi) benceno, (CH2=CH-CH2)C6H3(OMe)(O(CH2^NMe2).
En realizaciones preferidas del método de la invención, los dendrímeros carbosilano con enlaces Si-H en sus extremos con los que se hacen reaccionar compuestos que contienen al menos un grupo amino primario, secundario o terciario y que poseen un doble enlace carbono-carbono en un extremo se obtienen en la etapa b2)i) utilizando LiAlH4 como el reactivo capaz de ceder grupos hidruro que permite convertir parte o la totalidad de los enlaces Si-Cl en enlaces Si-H, aunque queda incluida dentro del alcance del método de la invención la utilización de reactivos análogos entre los que se puede citar NaH o NaBH4. En dichas realizaciones preferidas, la unión de compuestos que contienen al menos un grupo amino primario, secundario o terciario por el extremo en el que poseen un doble enlace carbono -carbono se lleva a cabo utilizando el catalizador de Karstedt para catalizar la reacción, aunque queda incluida dentro del alcance del método de la invención la utilización de otros catalizadores de hidrosililación que permitan llevar a cabo la unión deseada como puede ser el catalizador de Spiersí61'62].
En otro aspecto adicional, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen los dendrímeros carbosilano de la invención. En una realización de la invención, la composición contiene al menos un dendrímero carbosilano de la invención junto con al menos otra molécula, amónica o polianiónica. En una realización particular de la anterior, la molécula polianiónica es un oligodesoxirribunucleótido (ODN) o una molécula de ADN de doble cadena. En otra realización particular de la anterior, la molécula polianiónica es una molécula de ARN, monocatenaria o bicatenaria, que preferiblemente contiene regiones complementarias asociadas entre sí que permiten que dicho ARN pueda ser utilizado como ARN de interferencia (ARNi). En otra realización más, la molécula aniónica es un fármaco con tendencia a asociarse con las proteínas del plasma o de las membranas de las células que estén en contacto con él o susceptible de ser degradada por cualquiera de estas proteínas. En una realización distinta de las anteriores, el dendrímero carbosilano está presente en la invención como sustancia activa con capacidad de interferir en el ciclo vital de microorganismos patógenos. En una realización particular de ésta, el patógeno es un virus, que puede ser el VIH. En otra realización particular, el microorganismo patógeno es una bacteria u hongo cuya membrana o pared celular es susceptible de ser alterada por dicho dendrímero.
En otra realización adicional, el dendrímero carbosilano está presente en la invención como sustancia activa con capacidad de interferir en la formación o facilitar la disolución de agregados proteicos implicados en el desarrollo de procesos patológicos tales como las encefalopatías provocadas por priones o procesos degenerativos como la enfermedad de Alzheimer.
En otra realización más, distinta de las anteriores, un dendrímero carbosilano de la invención presente en una composición farmacéutica lleva unido a él un péptido o un resto antígénico cualquiera y está destinado a desencadenar una respuesta inmune que prevenga o proteja al individuo al que se le suministre frente a una enfermedad provocada por un organismo en el que esté presente dicho péptido o resto antigénico.
Los dendrímeros de la invención y las composiciones que los contienen pueden administrarse por vías de administración comunes, la iontoforesis, la vía transdérmica, la inyección o la inhalación. También son adecuados para formar películas para el recubrimiento de estructuras protésicas o mallas STENT para que desde las mismas se produzca la liberación controlada de al menos un dendrímero de la invención o de al menos una sustancia presente en la misma composición que dicho dendrímero. En otro aspecto de la invención, los dendrímeros carbosilanos se utilizan para la fijación de moléculas de carácter amónico o polianiónico a superficies. En una realización de la invención, las moléculas serían secuencias de ácidos nucleicos y las superficies a las que se fijan, las bases utilizadas para los microchips a los que se fijan secuencias de nucleóticos. En un aspecto adicional más, la invención se refiere al uso de los dendrímeros carbosilano de la invención como vehículos transportadores de sustancias aniónicas en la sangre que protegen a dichas sustancias de su interacción con proteínas del plasma o de las membranas de las células que están en contacto con él y que son capaces de unirse a dichas sustancias aniónicas o de degradarlas. Un caso particular de éste sería aquel en el que la sustancia con carácter aniónico al pH de la sangre sería un fármaco.
En un aspecto adicional más, la invención se refiere al uso de los dendrímeros carbosilano de la invención como fármacos para aminorar o eliminar los síntomas de una enfermedad causada por un microorganismo con cuyo ciclo vital el dendrímero de la invención es capaz de interferir.
En otro aspecto adicional, la invención se refiere al uso de los dendrímeros carbosilano de la invención como vehículos de transfección de moléculas de carácter aniónico o polianiónico a las que se encuentren unidos. Un caso particular de éste sería aquél en el que la molécula polianiónica es un oligodesoxirribonucleótido (ODN) o una molécula de ARN, monocatenaria o bicatenaria, que preferiblemente contiene regiones complementarias asociadas entre sí que permiten que dicho ARN pueda ser utilizado como ARN de interferencia (ARNi). Se prefiere especialmente que las células a transfectar sean células del sistema nervioso o de líneas celulares derivadas del mismo.
La invención se describirá ahora con más detalle con referencia a las siguientes figuras y los ejemplos expuestos en la sección de la descripción detallada de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra la estructura de varios dendrímeros carbosilano de la invención con los restos amino sin cuaternizar los sintetizados en los ejemplos 7, 11, 2, 5 en la Figura la y los sintetizados en los ejemplos 13 y 14 en la Figura Ib.
La Figura 2 muestra la estructura de varios dendrímeros carbosilano de la invención con los restos amino cuaternizados, los sintetizados en los ejemplos 22, 26, 19 y 27 en la Figura 2a y los sintetizados en los ejemplos 28 y 29 en la Figura 2b.
La Figura 3 muestra los geles de electroforesis de formación de complejos entre un ODN y los dendrímeros IM8 (con GF en el gel a y con distintos ODN en el gel b), C1NH4 (c), NN y Phe (d) e IMl 6 (gel e, que también contiene muestras de IM8).
La Figura 4 muestra geles de electroforesis de complejos formados entre un ODN y los dendrímeros Phe, C1NH4 (gel A), NN (gel B) e IM8 e FM16 (gel C) a distintos valores de pH. La Figura 5 muestra la evolución de complejos de dendrímeros de la invención y el ODN PPT al permanecer en disolución acuosa 0, 6 ó 24 horas. La Figura 6 muestra un gel de electroforesis de muestras de complejos de dendrímeros y el ODN TAR en presencia de albúmina y SDS. La parte de la izquierda es una tinción de las proteínas con azul Paragón y la parte derecha una fotografía de la tinción de las muestras de ADN con bromuro de etidio. La Figura 7 muestra la evolución de muestras de dendrímeros de la invención y un
ODN al ser incubadas en presencia de medio completo durante 40 minutos (40 min), 4 horas (4H) y 17 horas (17 H).
La Figura 8 muestra un gel de electroforesis de muestras de dendrímeros y ODN en presencia de suero humano. La parte izquierda muestra un foto obtenida con luz ultravioleta de muestras con ADN y la parte derecha muestra una tinción de las proteínas de ese gel con azul Paragón.
La Figura 9a muestra la tinción con bromuro de etidio de geles de electroforesis correspondientes a mezclas de dendrímeros y ODN tras 0 horas (OH), 4 horas (4H) y 24 horas (24H). La Figura 9b muestra la tinción de proteínas del gel correspondiente a 4 horas cuya tinción con bromuro de etidio se muestra en la Figura 9a.
La Figura 10 muestra un gel de electroforesis de muestras de complejos entre el plásmido Nf-kappaB-luc y el dendrímero IM8.
La Figura 11 muestra un gel de electroforesis de pruebas de formación de complejos entre un ARNi y un dendrímero (IM8) de la invención.
La Figura 12 muestra un gráfico con los resultados de actividad mitocondrial para concentraciones 1, 5, 10, 20 y 100 μM tras la incubación de células con los dendrímeros IM 8, IM 16, C1NH4, NN, Phe y SF, que tienen su correspondiente barra para cada concentración colocada en el puesto que ocupa en la enumeración anterior. La Figura 13 muestra un gráfico con los resultados de liberación de hemoglobina tras la incubación de hematíes con los dendrímeros IM8, IMl 6, NN, Phe y S, a concentraciones de 1, 5, 10 y 20 μM. Cada barra corresponde a un dendrímero, colocadas en el orden correspondiente a la enumeración anterior y cada grupo de barras corresponde a un concentración, ordenadas en orden creciente. La Figura 14 muestra un gráfico con los porcentajes de mortalidad de células incubadas con distintos dendriplejos y dendrímeros de la invención y teñidas con Azul Tripan. La Figura 15 muestra los resultados de una prueba de citometría de flujo en la que se comparaban los porcentajes de células con tamaño y complejidad correspondientes a células en apopto sis-necrosis con células vivas. En el X se representa el tamaño y en el eje Y la complejidad, correspondiendo la nube de células oscuras a células en apoptosis- necrosis. La parte A corresponde a células CMSP tratadas con dendrímeros CBS y la parte B a células CMSP tratadas con dendrímeros tipo PAMAM.
La Figura 16 muestra la representación de los porcentajes de células vivas y en apoptosis obtenidos tras las pruebas de citometría de flujo obtenidos en células CMSP tratadas con dendrímeros CMS (A) o con un dendrímero tipo PAMAM (B). La Figura 17 muestra las tinciones con el colorante vital DAPI de células incubadas con: 1: Control; 2: 0DN+IM8; 3.ODN+IM16; 4: ODN+SF; 5:ODN; 6: IM8; 7:IM16; 8:SF.
La Figura 18 muestra fotos tomadas tras 72 horas de incubación de células con IM8-ODN, a 0, 30, 60, 90, 120 y 150 segundos. La Figura 19 muestra un gráfico con los resultados obtenidos en el contador de centelleo en un ensayo linfoproliferativo estimulando las células con distintos dendrímeros CBS, con PHA y con un control (C).
La Figura 20 muestra la localización celular de un ODN con el que se transfectaron CMSP tras: A: 1 horas; B: 3 horas; C: 24 horas. La Figura 21 muestra el análisis de la fluorescencia presente en una célula que ha sido transfectada con un ODN. En la Figura 21 A se muestran en ordenadas los valores de fluoresencencia que se van obteniendo en cada punto a lo largo de una línea que representa un corte medio en XY, correspondiendo el gráfico superior a la fluorescenia azul, el intermedio a la verde y el inferior a la roja. En la Figura 21 B se muestra un análisis similar de la fluorescencia tomando una región de interés (ROI) dibujada alrededor del núcleo en el que se analizan la fluorescencia azul (gráfico superior) y la fluorescencia verde (gráfico inferior).
La Figura 22 muestra el patrón de fluorescencia obtenido tras la transfección con PPT o dendriplejos de la invención. 1: Control; 2: PPT; 3: PPT+IM8; 4: PPT+NN; 5: PPT+Phe; 6: PPT+IM16.
La Figura 23 muestra el patrón de fluorescencia obtenida tras la transfección con un dendriplejo de C1NH4 y PPT. La Figura 24 muestra el hístrogama de la fluorescencia en un plano medio en XY de una célula tratada con PPT+NN, en el que la gráfica superior muestra en ordenadas la intensidad de fluorescencia verde que se va encontrando a lo largo del plano, la gráfica intermedia es un análisis análogo correspondiente a la fluorescencia roja y la gráfica inferior muestra un análisis análogo correspondiente a la fluorescencia azul.
La Figura 25 muestra el gráfico obtenido calculando el número de copias de ADN del VIH en función del número de células con distintas concentraciones de dendrímero NN antes y después de la infección.
La Figura 26a muestra el patrón de bandas obtenido al someter a electroforesis en gel de acrilamida/bisacrilamida las concentraciones micromolares (μM) del dendrímero NN que se muestran sobre las calles.
La Figura 26b muestra el patrón de bandas obtenido al someter a electroforesis muestras del dendrímero NN incubadas sin ningún fármaco (Ctrl) o muestras de dicho dendrímero incubadas con metotrexato en una relación de moléculas dendrímero/fármaco 1/8 (calles marcadas como "1"), 1/4 (calles marcadas como
"2"), 1/2 (calles marcadas como "3") o 1/1 (calles marcadas como "4"').
La Figura 26c muestra el patrón de bandas obtenido al someter a electroforesis muestras del dendrímero NN incubadas sin ningún fármaco (Ctrl) o muestras de dicho dendrímero incubadas con diferentes unidades de heparina: 1 OU (calles marcadas como "1"), 1 U (calles marcadas como "2"), 0,5 U (calles marcadas como "3") o 0,1 U (calles marcadas como "4").
La Figura 26d muestra el patrón de bandas obtenido al someter a electroforesis muestras del dendrímero NN incubadas sin ningún fármaco (Ctrl) o muestras de dicho dendrímero incubadas con insulina en una relación de moléculas dendrímero/fármaco 1/3 (calles marcadas como "1"), 1/1,5 (calles marcadas como "2"), 4/1 (calles marcadas como "3") o 10/1 (calles marcadas como "4").
La Figura 27a muestra el patrón de bandas obtenido al someter a electroforesis en gel de acrilamida/bisacrilamida las concentraciones micromolares (μM) del dendrímero NNl 6 que se muestran sobre las calles. La Figura 27b muestra el patrón de bandas obtenido al someter a electroforesis muestras del dendrímero NN 16 incubadas sin ningún fármaco (Ctrl) o muestras de dicho dendrímero incubadas con metotrexato en una relación de moléculas dendrímero/fármaco 1/16 (calles marcadas como "1"), 1/8 (calles marcadas como "2"), 1/4 (calles marcadas como "3") o 1/2 (calles marcadas como ''4").
La Figura 27c muestra el patrón de bandas obtenido al someter a electroforesis muestras del dendrímero NN 16 incubadas sin ningún fármaco (Ctrl) o muestras de dicho dendrímero incubadas con diferentes unidades de heparina: 1OU (calles marcadas como "1"), 1 U (calles marcadas como '"2"), 0,5 U (calles marcadas como '"3") o 0,1 U
(calles marcadas como "4").
La Figura 27d muestra el patrón de bandas obtenido al someter a electroforesis muestras del dendrímero NN 16 incubadas sin ningún fármaco (Ctrl) o muestras de dicho dendrímero incubadas con insulina en una relación de moléculas dendrímero/fármaco 1/3 (calles marcadas como *'l"), 1/1,5 (calles marcadas como "2"),
4/1 (calles marcadas como "3") o 10/1 (calles marcadas como "4").
La Figura 28a muestra el patrón de bandas obtenido al someter a electroforesis en gel de acrilamida/bisacrilamida las concentraciones micromolares (μM) del dendrímero IMl 6 que se muestran sobre las calles.
La Figura 28b muestra el patrón de bandas obtenido al someter a electroforesis muestras del dendrímero IM 16 incubadas sin ningún fármaco (Ctrl) o muestras de dicho dendrímero incubadas con metotrexato en una relación de moléculas dendrímero/fármaco 1/16 (calles marcadas como "1"), 1/8 (calles marcadas como "2"), 1/4 (calles marcadas como "3") o 1/2 (calles marcadas como "4").
La Figura 28c muestra el patrón de bandas obtenido al someter a electroforesis muestras del dendrímero IM 16 incubadas sin ningún fármaco (Ctrl) o muestras de dicho dendrímero incubadas con diferentes unidades de heparina: 1 OU (calles marcadas como
•'1"), 1 U (calles marcadas como "2"), 0,5 U (calles marcadas como "3") o 0,1 U (calles marcadas como "4").
La Figura 28d muestra el patrón de bandas obtenido al someter a electroforesis muestras del dendrímero IM 16 incubadas sin ningún fármaco (Ctrl) o muestras de dicho dendrímero incubadas con insulina en una relación de moléculas dendrímero/fármaco
1/3 (calles marcadas como "F"), 1/1,5 (calles marcadas como "2"), 4/1 (calles marcadas como "3") o 10/1 (calles marcadas como "4").
La Figura 29 muestra el patrón de bandas obtenido al someter a electroforesis muestras del dendrímero IM 16 incubadas sin ningún fármaco (calles marcadas como ":D") o incubadas con insulina (calles marcadas como "C") en las que el pH se llevó hasta el valor numérco indicado sobre las calles. Cada una de las dos fotografías que aparecen en la Figura, a la derecha y a la izquierda, corresponde a un gel diferente, obtenido en las mismas condiciones de electroforesis. La Figura 30 muestra gráficos de barras en los que, en ordenadas, se muestra el valor del factor de proliferación, referido al control ("C-") obtenido al incubar células U87-MG (gráfico superior, marcado como "A") o células SK-N-MC (gráfico inferior, marcado como '"B") con los compuestos que se indican bajo cada barra, a las concentraciones indicadas. C-: control negativo, correspondiente a muestras incubadas sólo con medio de cultivo sin compuestos adicionales.
La Figura 31 muestra gráficos de barras en los que, en ordenadas, se muestra el valor del factor de viabilidad, calculado como tanto por uno con respecto al del control (''C-"), obtenido al realizar ensayos con MTT en células U87-MG incubadas con los compuestos que se indican bajo las barras, en las concentraciones y volúmenes señalados, durante tiempos de 24 horas (24H) (gráfico superior, marcado como "A"), 3 días (3D) (gráfico intermedio, marcado como "B" ) o 7 días (7D) (gráfico inferior, marcado como ''C"). Dextr: Dextrano; Spfect: Superfect.
La Figura 32 muestra un gráfico de barras en el que, en ordenadas, se muestra el valor del factor de citotoxicidad, expresado como tanto por uno con respecto al del control ("C-"), obtenido tras la cuantificación de lactato deshidrogenasa (LDH) en el sobrenadante de cultivo de células U87-MG incubadas durante 24 horas (24H) con los compuestos que se indican bajo las barras, en las concentraciones y volúmenes señalados. Dextr: Dextrano; Spfect: Superfect. DMEM: valor correspondiente al medio de cultivo sin células. La Figura 33 muestra gráficos de barras en los que, en ordenadas, se muestra el valor del tanto por uno con respecto al control ("C") correspondiente a los resultados obtenidos al realizar en ensayos con MTT (gráfico superior, marcado como "A") o de cuantificación de lactato deshidrogenasa (LDH) en el sobrenadante de cultivo (gráfico inferior, marcado como "B") en células SK-N-MC incubadas durante 24 horas (24H) con los compuestos que se indican bajo las barras, en las concentraciones y volúmenes señalados. Dextr: Dextrano; Spfect: Superfect. DMEM: valor correspondiente al medio de cultivo sin células La Figura 34a muestra los gráficos obtenidos en un citómetro de flujo al analizar células U87-MG incubadas con el oligonucleótido anti-rev marcado con fluoresceína (Oligo-FITC) en ausencia de dendrímero (gráfico marcado como "Ctrl", control) o con complejos formados entre el oligonucleótido y el dendrímero NN en proporciones que daban lugar a las relaciones carga-/carga+ indicadas sobre cada gráfico: 1 :1, 1 :2, 1:4 y 1 :8.
La Figura 34b muestra los gráficos obtenidos en un citómetro de flujo al analizar células U87-MG incubadas con el oligonucleótido anti-rev marcado con fluoresceína (Oligo-FITC) en ausencia de dendrímero (gráfico marcado como "Ctrl", control) o con complejos formados entre el oligonucleótido y el dendrímero NNl 6 en proporciones que daban lugar a las relaciones carga-/carga+ indicadas sobre cada gráfico: 1 :1, 1:2, 1 :4 y 1:8.
La Figura 35 muestra los gráficos obtenidos en un citómetro de flujo al analizar células SK-N-MC incubadas con el oligonucleótido anti-rev marcado con fluoresceína (Oligo-FITC) en ausencia de dendrímero (gráfico marcado como "Ctrl", control) o con complejos formados entre el oligonucleótido y el dendrímero NN 16 en proporciones que daban lugar a las relaciones carga-/carga+ indicadas sobre cada gráfico: 1:1, 1:2, l:4 y l :8.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención describe nuevos dendrímeros carbosilano ramificados con grupos amino primarios, secundarios, terciarios o cuaternarios en los extremos de las ramificaciones que responden a las fórmulas: (R1J 3-P i S i - ( Al q1- S i -Xp ) 4 , en el caso de los de primera generación;
( R1J 3-Ia (R2 ) 3-p i í
Si- (AIq1--Si- (Alq2-Si-Xp) m) 4 , en el caso de los de segunda generación; ( R1 ) 3-» ( R2 ) 3-n (R3 J 3-P
; I I
Si- (AIq^Si- (Alq2-Si- (Alq3-Si-Xp) n) m) 4, en el caso de los de tercera generación; y a las fórmulas análogas correspondientes en el caso de generaciones superiores, en las que la fórmula correspondiente a cada generación i resultaría de sustituir Xp en la fórmula correspondiente a la generación anterior por un nuevo bloque del tipo:
(R1 J 3-P i (AIq^-Si-Xp) 2 pasando el grupo unido al mismo átomo de silicio que este bloque sustitutorio de estar representado por (R1"1^ a estar representado por (R1^)3-Z, fórmulas en las que:
AIq1, AIq2, AIq , ,AIq1 representan restos alquileno de 2 a 4 carbonos que se eligen independientemente unos de otros según la longitud de las ramificaciones en cada generación;
R1, R , R , , R1"1, R! representan restos metilo o fenilo;
X representa un resto que contiene un grupo amino primario, secundario, terciario o cuaternario; p es un número entero que varía entre 1 y 3; m, n,...., z son números enteros que varían independientemente entre 1 y 3.
En la realización que más se prefiere de la invención, los restos R1, R2, R3,.. ,
R1'1, R1 son todos iguales y corresponden a restos metilo; los restos AIq1, AIq2, AIq3,..., AIq1 son iguales entre sí y corresponden a restos propileno y los números enteros m, n, ..., j son iguales entre sí y tienen el valor 2. En esas condiciones, los dendrímeros que corresponden a esa realización de la invención también se pueden representar mediante la fórmula general iG-(Xp)m, donde: i: indica el número de la generación del dendrímero
X: indica la naturaleza de los grupos funcionales situados en la periferia del dendrímero p: indica el número de grupos funcionales en cada rama m: indica el número de grupos funcionales terminales en el dendrímero G: representa el esqueleto carbosilano del dendrímero que, según la generación, correspondería a las fórmulas siguientes:
Figure imgf000031_0001
esqueletos en los que los extremos finales SiMe3 (Me=CH3) quedaría convertidos en SiMe2X en la fórmula general del dendrímero en el caso de que "p" fuera igual a 1 y en SiMeX2 en el caso de que "p" fuera igual a 2.
X representa cualquier resto que contenga una amina primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria..
Tal como se utiliza en la invención, el término dendrímero se refiere a una macromolécula tridimensional de construcción arborescente.
El término "generación" se refiere al número de etapas iterativas que son necesarias para la preparación del dendrímero.
El término ''dendrímero carbosilano" se refiere a una molécula dendrítica con un esqueleto carbosilano. El término "hidrosililación" se refiere a la adición de enlaces Si-H a dobles enlaces C=C.
Tal como se utiliza en la invención, el término "resto antigénico" se refiere a un resto que está unido a una molécula y que es capaz de desencadenar una respuesta inmune en un individuo al que se le suministra la molécula que lleva unido ese resto. Tal como se utiliza en la invención, el término "péptido" se refiere a una cadena lineal de dos o más aminoácidos que se van uniendo mediante la formación de un enlace tipo amido entre un grupo carboxilo de un aminoácido y un grupo amino del aminoácido contiguo. TaI corno se ha indicado previamente, la invención se refiere también a un procedimiento para la preparación de los dendrímeros de la invención. Estos dendrímeros organosilano de generaciones diferentes se pueden preparar con rendimientos elevados usando reacciones bien conocidas, a través de procedimientos divergentes/25'42'43'44'43'46'-1 Estos dendrímeros presentan una alta versatilidad que les confiere varias ventajas sobre otros derivados: i) es posible modificar la longitud de las ramas utilizando en el paso de metátesis derivados de Grignard vinílicos o alílicos; ii) es posible variar el número de ramificaciones de cada generación cambiando por ejemplo HSiCl3 por HSiCH3Cl2( iii) es posible incorporar una gran variedad de grupos funcionales a la periferia del dendrímero. Además, los dendrímeros carbosilano presentan una gran inercia química, lo que es muy útil para el propósito adicional de esta invención de utilizarlos como vehículos para el transporte de moléculas aniónicas (como los ODN y distintos fármacos amónicos) en la sangre, su protección frente a la interacción con proteínas del plasma y su entrada en una célula para ejercer su acción. Como se ha comentado, en una realización preferida de la invención las ramas de las distintas generaciones son todas iguales y son el resultado de la utilización del derivado alílico BrMg-CH2-CH=CH2, mientras que las ramificaciones obtenidas en cada generación son también las mismas en todos los casos e iguales a 2 por utilización de HSiCH3Cl2 En esas condiciones, el procedimiento de síntesis divergente utilizado para ir generando los distintos dendrímeros carbosilano precursores, podría esquematizarse, hasta la segunda generación, de la siguiente manera
K ac so*pl ramiento Núcleo
Figure imgf000032_0001
central
Figure imgf000032_0002
Dendrimera
^generación Dendrúircro
21 generación
Síntesis divergente
Una vez obtenido el esqueleto correspondiente al dendrímero precursor de la generación deseada, se procedería a obtener derivados con enlaces terminales Si-Cl o Si-H a partir de los cuales obtener los dendrímeros carbosilano con restos terminales que contienen grupos amino de la invención. El proceso detallado sería el siguiente: Obtenciόn de dendrímeros carbosilano con grupos amino terminales
El primer paso en la síntesis de estos derivados es la preparación de dendrímeros precursores que contienen enlaces terminales Si-Cl o Si-H. La síntesis de estos dendrímeros ha sido ya publicada^5'42'4" 44'45'46'1 y se lleva a cabo con elevados rendimientos. En los ejemplos que se exponen más adelante en la presente memoria, se han crecido los dendrímeros hasta una tercera generación, pero la metodología para obtener dendrímeros de generaciones superiores es análoga, por lo que dichos dendrímeros de generaciones superiores y su procedimiento de preparación se incluyen igualmente en el alcance de la invención. En el caso de la realización preferida de la invención, en la que las ramificaciones de cada generación son de igual tamaño y corresponden a cadenas de 3 carbonos y en la que se forman dos nuevas ramas en cada generación, dejando un metilo unido al átomo de Si en la cuarta valencia que quedaría por saturar, el esquema de reacciones que conduciría a la obtención de los distintos dendrímeros carbosilano precursores con enlaces terminales Si-Cl y Si-H vendría representado por el Esquema 1 :
Figure imgf000034_0001
Esquema 1
EI segundo paso consiste en la unión de diferentes grupos amino a la superficie de estos dendrímeros usando la reactividad conocida de los enlaces Si-Cl y Si-H. Con este fín se pueden seguir dos rutas sintéticas alternativas, dependiendo de la naturaleza del grupo terminal presente en el dendrímero carbosilano.
1. Ruta de la aícoholisis de enlaces Si-Cl. En este procedimiento se han empleado diferentes alcohol-aminas en presencia de una base como trietilamina añadida para retirar el cloruro de hidrógeno que se desprende en esta reacción. El término "alcohol- amina" se refiere a diferentes aminas que contienen una funcionalidad alcohólica, similares a los ejemplos que se describen mediante las siguientes fórmula:
Figure imgf000035_0001
N,N-dimetiletanolamina 2-[(2-(dimetilaminoetil)metil]amino etanol
Figure imgf000035_0002
3,5-Bis(Dimetilaminoetoxi)bencilalcohol
En Ia presente invención, se prefiere la utilización de estas tres aminas, pero el procedimiento de la invención permite funcionalizar la periferia de un dendrímero con cualquier otra amina que tenga una funcionalidad alcohólica susceptible de llevar a cabo el proceso de aícoholisis que aquí se describe, la funcionalización con cualquiera de esas aminas y los dendrímeros carbosilano con funciones amino obtenidos se incluyen también en el alcance de la invención. El tratamiento de los dendrímeros carbosilano que contienen enlaces terminales
Si-Cl con la cantidad estequiométrica de N,N-dimetiletanolamina en éter dietílico y en presencia de un exceso de trietilamina conduce a la formación de los dendrímeros carbosilano con grupos amino terminales. De manera general, esta etapa se reproduce en el Esquema 2:
Figure imgf000036_0001
X= Me, Cl
X- Me, O'
Esquema 2
La utilización de este esquema de reacción dio lugar a los compuestos IG- [Si(OCH2CH2NMe2)J4 (1), lG-[Si(OCH2CH2NMe2)2]4 (2), 2G-[Si(OCH2CH2NMe2)J8 (3), 2G-[Si(OCH2CH2NMe2^]8 (4), 3G-[Si(OCH2CH2NMe2)J16 (5), 3G- [Si(OCH2CH2NMe2)2J16 (6), cuyo proceso de síntesis se explica con mayor detalle en los ejemplos 1-6 que aparecen descritos posteriormente.
La sustitución de N,N-dimetiIetanolamina por otros derivados alcohol amina como 3,5-(OCH2CH2NMe2)HC6H3)CH2OH ó Me2NCH2CH2N(Me)CH2CH2OH conduce en una reacción similar a la descrita arriba a la preparación de los dendrímeros. Esta reacción se reproduce en el Esquema 3:
Figure imgf000036_0003
Figure imgf000036_0004
Figure imgf000036_0002
Esquema 3
La utilización de este esquema de reacción dio lugar a los compuestos IG- [Si(OCH2-(C6H3)-3,5-(OCH2CH2NMe2)2)]4 (7), 2G-[Si(OCH2-(C6H3)-3,5-
(OCH2CH2NMe2)2)]8 (8), 3G-[Si(OCH2-(C6H3)-3,5-(OCH2CH2NMe2)2)J16 (9), IG- [Si(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe2)J4 (1O)3 2 G- [Si(OCH2CH2N(Me) CH2CH2NMe2)I8 (11), 3G-[Si(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe2)J16 (12), cuyo proceso de síntesis se explica con mayor detalle en los ejemplos 1-6 que aparecen descritos posteriormente. Cuaternización con MeI
Los intentos realizados para cuaternizar los grupos amino terminales de los dendrímeros 1-12 con la cantidad estequiométrica o un pequeño exceso de HCl no condujeron al resultado esperado, debido a la hidrólisis paulatina de los enlaces Si-O. Sin embargo, el tratamiento de estos dendrímeros con un exceso de MeI en éter dietílico produce de un modo cuantitativo la cuaternización de los grupos amino en unas pocas horas, causando la precipitación de las sales yodadas de los cationes amonio como sólidos higroscópicos de color blanco en altos rendimientos. Esta reacción se presenta en el Esquema 4:
Figure imgf000037_0001
Esquema 4
De esta manera se han aislado y caracterizado los dendrímeros que se relacionan a continuación IG-[Si(OCH2CH2NMe3 +F)J4 (16), IG-[Si(OCH2CH2NMe3 +F)2J4 (17), 2G- [Si(OCH2CH2NMe3 +F)J8 (18), 2G-[Si(OCH2CH2NMe3 +Il2Js (19), 3G- [Si(OCH2CH2NMe3 +F)]Ie (20), 3G-[Si(OCH2CH2NMe3 +F)2Ji6 (21), IG-[Si(OCH2- (C6H3)-3,5-(OCH2CH2NMe3 +r)2)]4 (22), 2G-[Si(OCH2-(C6H3)-355-(OCH2CH2NMe3 +F )2)]g (23), 3G-[Si(OCH2-(C6H3)-3,5-(OCH2CH2NMe3 +F)2)J16 (24), IG- [Si(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +F)J4 (25), 2G-[Si(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +F )J8 (26), 3G-[Si(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +F)J16 (27).
Su proceso de síntesis y de caracterización se detalla posteriormente en los Ejemplos 16 a 27 que aparecen descritos posteriormente. Los datos allí aportados muestran que para algunos de los dendrímeros de tercera generación, concretamente 21,
24 y 27, la cuaternización de los grupos dimetilamino no es completa: sólo en tomo al 90% de los grupos terminales de estos complejos han sido cuaternizados. Esto es así incluso en presencia de un exceso de MeI y dejando la reacción durante mayores períodos de tiempo.
En el caso de los dendrímeros 10 y 11, de primera y segunda generación respectivamente, la adición de un exceso de MeI sobre la cantidad estequiométrica necesaria para la cuaternización de todos los átomos de nitrógeno presentes en las macromoléculas, conduce a la formación de los dendrímeros 35 (IG-
[Si(O(CH2)2N+(Me)2(CH2)2NMe3 +2r)]4 y 36 (2G-[Si(O(CH2)2N+(Me)2(CH2)2NMe3 +2r
)]g), cuyo proceso de síntesis y caracterización se describe, respectivamente, en los Ejemplos 48 y 49.
2. Ruta de hidrosililación de enlaces terminales Si-H
El tratamiento de los dendrímeros carbosilano que contienen enlaces terminales Si-H con alilamina (CH2=CH-CH2-NH2) en presencia del catalizador de Karstedt[28] conduce a la formación de los dendrímeros carbosilano con grupos amino terminales IG-[SiCH2CH2CH2NH2I4 (13), 2G-[SiCH2CH2CH2NH2J8 (14), 3G- [SiCH2CH2CH2NH2]i6 (15) con rendimientos prácticamente cuantitativos. La reacción por la que se obtienen se muestra en el Esquema 5:
Figure imgf000038_0001
Esquema 5 Estos dendrímeros son térmicamente estables y solubles en disolventes orgánicos.
Su caracterización y pureza ha sido verificada por análisis elemental (H, C, N), espectroscopia de RMN (1H, 13C y 29Si) y espectrometría de masas (electroespray o MALDI-TOF MS). Su síntesis y caracterización se detallan en los Ejemplos 13 a 15 que aparecen descritos posteriormente. Este procedimiento es igualmente aplicable para la síntesis de dendrímeros carbosilano que posean en los extremos de sus ramificaciones otros restos terminales diferentes que contengan también grupos amino, sustituyendo en la reacción la alilamina por otro compuesto que contenga un grupo amino y que contenga también un carbono terminal que forme un doble enlace con un carbono contiguo, de tal manera que uno de los extremos de dicho compuesto presente un resto terminal CH2=CH- que dará lugar a que el compuesto quede unido al esqueleto del dendrímero mediante un grupo - CH2-. Dicho compuesto puede ser simplemente una alquilenamina, por ejemplo primaria, de fórmula CH2=CH-(CH2VNH2, en la que el índice "e" varía entre 0 y 2 (correspondiendo el caso en el que e=l concretamente a la alilamina), o compuestos más complejos, que comprenden igualmente un resto alquenilo en un extremo (CH2=CH-(CH2V) Y u11 grupo amino (primario, secundario, terciario o cuaternario) en otro extremo diferente, comprendiendo el compuesto adicionalmente algún resto -Ra- entre el resto alquenilo CH2=CH-(CH2V y el grupo amino. En los Ejemplos 44 y 45 se detalla la síntesis y caracterización de los dendrímeros 31 (IG- [SÍ((CH2)2C6H3(OMe)(O(CH2)2NMe2))]4) y 32 (2G-
[Si((CH2)2C6H3(OMe)(O(CH2)2NMe2))]8) que contienen en los extremos de sus ramificaciones restos derivados de uno de tales compuestos, concretamente del producto no comercial (CH2=CH-CH2)C6H3 (OMe) { O (CH2)2NMe2}, cuya síntesis previa describe en el Ejemplo 44.
Cuaternización con HCl
La cuaternización de los dendrímeros con grupos terminales -NH2, 13-15, sí pudo ser realizada por adición de HCl (disolución IM en Et2O) en éter dietílico como disolvente (Esquema 6).
Figure imgf000039_0001
Esquema 6
+f
Los derivados iónicos IG-[SiCH2CH2CH2NH3 CF]4 (28), 2G-
[SiCH2CH2CH2NH3 +Cr]8 (29), 3G-[SiCH2CH2CH2NH3 +Cr]16 (30) se obtuvieron siguiendo el mencionado Esquema 6 de reacción. Dichos compuestos precipitan como sólidos de color blanco y se purifican fácilmente por eliminación a vacío del disolvente y el exceso de HCl utilizado en la reacción. Estos dendrímeros son térmicamente estables y solubles en DMSO, MeOH y H2O. Su caracterización y pureza ha sido verificada, al igual que en los dendrímeros descritos anteriormente, por análisis elemental (H, C, N), espectroscopia de RMN (1H, 13C y 29Si) y espectrometría de masas (electroespray o MALDI-TOF MS).
Cuaternización con MeI
La cuatemización de los dendrímeros 31 y 32, con grupos terminales -NMe2, se llevó a cabo siguiendo el Esquema 4, en el que, en el caso de los dendrímeros 31 y 32, R correspondería al resto -[(QHb)2 C6H3 (OMe)(O (CH2)INMe2)]. Los dendrímeros 31 y 32, por tanto, fueron tratados con yoduro de metilo (abreviado IMe o MeI) en éter dietílico (Et2O), tal como se describe en los Ejemplos 46 y 47, obteniéndose así los dendrímeros 33 y 34.
Ejemplos de síntesis de dendrímeros carbosttano con grupos omino terminales
Debe entenderse que los ejemplos que se dan a continuación son sólo una ilustración del objetivo de esta invención y no suponen en modo alguno una limitación.
Los valores de las integrales de las señales en los espectros de RMN-1H de los dendrímeros que se describen representan sólo la cuarta parte del número total de átomos de hidrógeno.
En los Ejemplos 1 a 30 que aparecen a continuación se describe la síntesis de dendrímeros carbosilano con grupos amino terminales que parten de dendrímeros precursores (IG-Cl4, IG-Cl8, IG-H4, 2G-Cl8, 2G-Cl16, IG-H8, 3G-Cl4, IG-Cl8, IG-H4,) sintetizados previamente siguiendo los procedimientos ya conocidos que se indican en el Esquema 1. Como se ha comentado, dichos dendrímeros precursores sirven como
"esqueletos"' a partir de los cuales se forman los dendrímeros carbosilanos de la invención, con grupos amino terminales, haciéndolos reaccionar con compuestos que dan lugar a los ligandos que se convierten en los extremos de las ramificaciones de los dendrímeros. Los compuestos utilizados para la síntesis de los dendrímeros que se describen en los Ejemplos 1 a 30 fueron: alilamina (CH2=CH-CH2-NH2) (adquirida a
Sigma Aldrich), N,N-dietiletanolamina (CH2OH-CH2-N(CH3)2) (adquirida a Sigma
Aldrich) o 2-[(2-(dimetilaminoetil)metil]amino etanol (CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2- N(CHs)2) (adquirida a Sigma Aldrich) o 3,5-bis(dimetilaminoetoxi)bencilalcohoí (CH2OH-(C6H3)-(O-CH2-CH2- N(CH3)2)2), compuesto este último que no se adquirió a ninguna casa comercial y que fue necesario sintetizar previamente, tal como se describe en el Ejemplo 7. Los detalles de las reacciones en las que se utilizaron estos compuestos para dar lugar a dendrímeros carbosilano de la invención, así como la cuaternizacíón de los mismos para dar lugar a dendrímeros de la invención adicionales, se describen a continuación en los Ejemplos 1 a 30.
Ejemplos 1 a 12:
- Ejemplo 1 : Síntesis de IG-FSJiOCH2CH2NMe2)Ij (1)
A una disolución del dendrímero IG-Cl4 (0,85 g, 1,49 mmol) en éter (50 mi), se añadió un ligero exceso de NEt3 (0,86 mi, 6,2 mmol) y N,N-dimetiletanolamma (0,6 mi, 5,97 mmol) . La mezcla de reacción se mantuvo con agitación constante durante 1 h a temperatura ambiente, después se eliminó a vacío el exceso de NEt3 y el disolvente dando lugar a un residuo que se extrajo con éter (30 mi). La suspensión resultante, se filtró con celite para eliminar la sal de amonio NEt3 -HCl generada en la reacción y el filtrado se llevó a sequedad dando lugar al compuesto 1 como un aceite amarillo pálido. (0,98 g, 84%). 1H-RMN (CDCl3): δ 3,64 (2H, t, CH2O), 2,40 (2H5 1, CH2N), 2,22 (6H, s, NMe2),
1,31 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO)5 0,60 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,53 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,067 (6H, s, OSiMe2), 13C(1H)-RMN (CDCl3): δ . 61,5 (CH2N), 60,8 (CH2O), 46,1 (NMe2), 21,3 (SiCH2CH2CH2SiO), 18,1, 17,4 (SiCH2CH2CH2SiO), - 1,7 (OSiMe2). 29Si(1Hj-RMN (CDCl3): δ 0,49 (G0-Si), 17,62 (GrSi). Análisis elemental de C36H88N4O4Si5: Cale,: C, 55,33; H, 11,35; N, 7,17. Obten,: C, 55,16; H, 11,22; N, 7,06.
- Ejemplo 2: Síntesis de lG-rSiíOCH2CH2NMe7)2l4 (2).
El dendrímero de primera generación 2 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 1, partiendo de 1 G-CIg (0,54 g, 0,87 mmol), N,N- dimetiletanolamina (0,7 mi, 6,94 mmol) y NEt3 (1,0 mi, 7,2 mmol). De esta forma se obtuvo 2 como un aceite incoloro. (0,75 g, 80%). 1H-RMN (CDCl3): δ 3,74 (4H, t, CH3O), 2,43 (4H, t, CH2N)5 2,23 (12H, s, NMe2), 1,31 (2H, m, SiCH2CJJ2CH2SiO), 0,63 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,52 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,09 (3H, s, OSiMe), 13C{ 1H)-RMN (CDCl3): δ 61,4 (CH2N), 60,7 (CH2O), 46,2 (NMe2), 18,7 (SiCH2CH2CH2SiO), 17,7, 17,2 (SiCH2CH2CH2SiO), - 4,4 (OSiMe). 29Si(1Hj-RMN (CDCl3): δ 0,47 (G0-Si), -3,65 (G1-Si), Análisis elemental de C48H116N8O8Si5: Cale,: C, 53,68; H, 10,89; N, 10,43. Obten,: C, 53,54; H, 11,33; N, 10,06. MALDΪ-TOFF-MS: m/z 1095,8 [M + H]+ (Cale, 1095,8 ).
- Ejemplo 3: Síntesis de 2G-rSi(OCH?CH?KMe?.)1« (3) El dendrímero de segunda generación 3 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 1, partiendo de 2G-Cl8 (0,27 g, 0,18 mmol), N,N- dimetiletanolamina (0,15 mi, 1,47 mmol) y NEt3 (0,25 mi, 1,79 mmol). De esta forma se obtuvo 3 como un aceite incoloro (0,31 g, 90%).
1H-RMN (CDCl3): δ 3,64 (4H, t, CH2O), 2,41 (4H, t, CH2N), 2,23 (12H, s, NMe2), 1,30 (6H5 m, SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si solapados), 0,65 (4H, m,
SiCH2CH2CH2SiO), 0,53 (8H5 m, resto de CH2Si), 0,07 (12H, s, OSiMe2), -0,09 (3H, s,
SiMe). 13C(1H)-RMN (CDCl3): δ 61,5 (CH2N), 60,8 (CH2O), 46,1 (NMe2), 21,1
(SiCH2CH2CH2SiO), 18,6-17,9 (resto de grupos -CH2-), -1,9 (OSiMe2), -4,9 (SiMe),
29Si(1H)-RMN (CDCl3): δ 0,93 (G1-Si), 17,6 (G2-Si), G0-Si no se observa. Análisis elemental de C88H212N8O8Si13. Cale: C5 56,35; H, 11,39; N5 5,97. Obten,: C5 55,98; H5
11,20; N, 5,78.
- Ejemplo 4: Síntesis de 2G-FSi(OCH2CH2NMe2VIg (4).
EI dendrímero de segunda generación 4 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 1, partiendo de 2G-Cl16 (0,48 g, 0,30 mmoí), N5N- dimetiletanolamina (0,48 mi, 4,77 mmol) y NEt3 (0,7 mi, 5,02 mmol). De esta forma se obtuvo 3 como un aceite incoloro (0,66 g, 90%).
1H-RMN (CDCl3): δ 3,75 (8H, t, CH2O), 2,44 (8H, t, CH2N), 2,24 (24H5 s,
NMe2), 1,34 (6H, m, SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si solapados), 0,64 (4H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,51 (8Η, m, resto de CH2Si), 0,09 (6H, s, OSiMe), -0,10 (3H, s,
SiMe). 13C(1H)-RMN (CDCl3): δ. 61,4 (CH2N), 60,7 (CH2O), 46,2 (NMe2), 18,6
(SiCH2CH2CH2SiO), 17,7-17,0 (resto de grupos -CH2-), -4,4 (OSiMe), -4,8 (SiMe). 29Si(1H)-RMN (CDCl3): δ 0,9 (G1-Si); -3,5 (G2-Si); G0-Si no se observa. Análisis elemental de C112H268N16O16Si13: Cale: C, 54,67; H, 10,98; N, 9,1 1. Obten,: C, 54,20; H 10,37; N 9,59.
- Ejemplo 5: Síntesis de 3G-[SJiOCH7CH7NMe2)IIn (5).
El dendrímero de tercera generación 5 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para I5 partiendo de 3G-Cl]6 (0,20 g, 0,06 mmol), N5N- dimetiletanolamina (0,10 mi, 0,99 mmol) y NEt3 (0.16 mi, 1,14 mmol). De esta forma se obtuvo 5 como un aceite amarillo pálido (0,18 g, 74%). 1H-RMN (CDCI3): δ 3,65 (8H, t, CH2O), 2,42 (8H, t, CH2N), 2,24 (24H, s,
NMe2), 1,23 (14H, m, SiCH2CTf2CH2SiO y SiCH2CZi2CH2Si solapados), 0,64 (8H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,53 (20H, m, resto de CH2Si), 0,068 (24H, s, OSiMe2), -0,10 (9H, S5 SiMe). 13C(1H)-RMN (CDCl3): δ. 61,5 (CH2N), 60,8 (CH2O), 46,1 (NMe2), 21,1 (SiCH2CH2CH2SiO), 18,6-17,9 (resto de grupos -CH2-), -1,82 (OSiMe2), -4,8 (SiMe), 29Si(1H)- RMN (CDCl3): δ 0,95 (G2-Si); 17,95 (G3-Si) G0-Si y G1-Si no se observan. Análisis elemental de C198H460N16O16Si29. Cale: C, 56,74; H, 11,41; N, 5,51. Exp. %: C, 56,17; H, 11,28; N, 5,34.
- Ejemplo 6.- Síntesis de 3G-fSi(OCH2CH2NMe2)2liή (6). El dendrímero de tercera generación 6 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 1, partiendo de 3G-Cl32 (0,19 g, 0,05 mmol), N5N- dimetiletanolamina (0,17 mi, 1,68 mmol) y NEt3 (0,24 mi, 1,79 mmol). De esta forma se obtuvo 6 como un aceite amarillo pálido (0,20 g, 72%).
1H-RMN (CDCl3): δ 3,75 (16H, t, CH2O), 2,44 (16H, t, CH2N), 2,24 (48H, s, NMe2), 1,32 (14H, m, SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si solapados), 0,66 (8H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,53 (20Η, m, resto de SiCH2), 0,07 (12H5 s, OSiMe)5 -0,10 (18H, s, SiMe). 13C( 1H)-RMN (CDCl3): δ 61,4 (CH2N), 60,7 (CH3O), 46,1 (NMe2), 18,4-17,4 (resto de grupos -CH2-), -4,7 (OSiMe2), -5,2 (SiMe). Análisis elemental de C240H572N32O32Si29. Cale: C, 55,08; H, 1 1,02; N, 8,56. Obten.: C, 56,11 ; H, 1 1,89; N, 8,13. - Ejemplo 7.- Síntesis de lG-rSi(OCH2-(C¿H3y3,5-(OCH?CH?NMe?)?)i4 (D 7.1. Síntesis de 3,5-(OCH2CH2NMe2V(C6HQ-CH2OH
Con el fin de sintetizar los dendrímeros 7, 8 y 9 (dendrímeros de partida, a su vez, para obtener los dendrímeros 22, 23 y 24), fue necesario sintetizar previamente el compuesto que después iba a ser utilizado como ligando, 3,5-(OCH2CH2NMe2^-
(C6H3)-CH2. Para ello, a una disolución de 3,5-dihidroxibencilalcohol (1,47 g, 10,39 mmol) en acetona como disolvente, se le añadieron 2 equivalentes del clorohidrato de 2- cloro-N,N dimetilaminoetano (2,98 g, 20,78 mmol), 4,5 equivalentes de K2CO3 (6,43 g,
46,75 mmol), éter corona 18-Corona-6 (0,54 g, 2 mmol) y una punta de espátula de KI. La reacción se mantuvo a reflujo durante 48 L Tras la eliminación del disolvente a vacío, se realizó una extracción en CH2CI2/H2O (2 x 50 mi). La fase orgánica se secó con MgSO4 durante 1 h. Posteriormente se filtró y se eliminó el disolvente a vacío, obteniéndose un aceite amarillo pálido que se lavó con hexano (2 x 10 mi) para eliminar el éter corona 18-Corona-6. Así se obtuvo el compuesto buscado como un aceite amarillo pálido (1,53 g, 50%).
RMN-1H (CDCl3):. δ 6,48 (2H, m, C6H2), 6,36 (IH, m, C6H3), 4,57 (2H, s, CiJ2OH)5 3,99 (4H, t, CH2O-C6H3), 2,65 (4H, t, CH2N), 2,60 (IH, s, CH2OH ), 2,28 (12Η, s, NMe2). RMN-13C(1Hi (CDCl3): δ 159,9 (C6H3, Cφso unido a OCH2CH2NMe2), 143,8 (C6H3, Cipso unido a CH2OH), 105,1 y 100,6 (C6H3), 65,8 (CH2O-C6H3), 64,9 (CH2OH), 58,2 (CH2N), 45,8 (NMe2). Análisis elemental de C15H26N2O3. Cale. %: C, 63,80; H, 9,28; N, 9,92. Exp. %: C, 63,50; H, 9,17; N, 9,83.
Este compuesto se utilizó para la síntesis de los dendrímeros 7, 8 y 9, que se describe a continuación.
7.2. Síntesis del dendrímero 7
A una disolución del dendríraero IG-Cl4 (0,11 g, 0,19 mmol) en éter (30 mi), se añadió un ligero exceso de NEt3 (0,12 mi, 0,87 mmol) y 3, 5 -(OCH2CH2NMe2MC6H3)- CH2OH (0,22 g, 0,378 mmol) . La mezcla de reacción se mantuvo con agitación constante durante 1 h a temperatura ambiente, después se eliminó a vacío el exceso de NEt3 y el disolvente dando lugar a un residuo que se extrajo con éter (2 x20 mi). La suspensión resultante, se filtró con celite para eliminar la sal de amonio NEt3-HCl generada en la reacción y el filtrado se llevó a sequedad dando lugar al compuesto 7 como un aceite amarillo pálido (0,23 g, 80%).
1H-RMN (CDCl3): δ. 6,45 (2H, m, C6H3); 6,36 (IH, m, C6H3); 4,56 (2H, s,
CH2OSi); 3,99 (4H, t, CiZ2O-C6H3); 2,66 (4H, t, CH2N); 2,28 (12H, s, NMe2); 1,33 (2H, m, SiCH2CiZ2CH2SiO); 0,68 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO); 0,55 (2H, m,
SiCH2CH2CH2SiO); 0,08 (6H, s, SiMe2). 13C( 1H)-RMN (CDCl3): δ 159,8 (C6H3, Cipso unido a OCH2CH2NMe2); 143,2 (C6H3, CφS0 unido a CH2OSi); 104,9 y 100,2 (C6H3);
65,9 (CH2O-C6H3); 64,6 (CH2OSi); 58,2 (CH2N); 45,8 (NMe2), 21,2
(SiCH2CH2CH2SiO); 17,9, 17,2 (SiCH2CH2CH2SiO); -1,89 (SiMe2). Análisis elemental de C80Hi48N8O12Si5. Cale: C, 61,81; H, 9,60; N, 7,21. Obten.: C, 62,10; H, 9,82; N,
7,3-
- Ejemplo 8.- Síntesis de 2G-rSiíOCH2-ÍC¿H3)-3,5-ÍOCH?CH?NMe9)7)1s (S) El dendrímero de segunda generación 8 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 7, partiendo de 2G-Cl8 (0,27g, 0, 19 mmol) ; NEt3 (0,22 mL, 1 ,62 mmol) y 3,5-(OCH2CH2NMe2)2-(C6H3)-CH2OH (0,43 g5 1,52 mmol). De esta forma se obtuvo 8 como un aceite amarillo pálido (0,54 g; 82%).
1H-RMN(CDCl3): δ 6,45 (4H, m, C6H3); 6,36 (2H, m, C6H3); 4,56 (4H, s,
CH2OSi); 3,99 (8H, t, CH2O-C6H3); 2,67 (8H, t, CH2N); 2,29 (24H, s, NMe2); 1,33 (6H, m, SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si)5 0,69 (4H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,55 (8Η, m, CH2 unidos a Si), 0,09 (12Η, s, OSiMe2), -0,09 (3H, s, SiMe). 13C(1H)-
RMN(CDCl3): δ 159,0 (C6H3, Cipso unido a OCH2CH2NMe2); 143,3 (C6H3, Cips0 unido a
CH2OSi); 104,8 y 100,1 (C6H3); 65,9 (CH2O-C6H3); 64,6 (CH2OSi); 58,3 (CH2NMe2);
45,9 (NMe2), 21,2 (SiCH2CH2CH2SiO); 17,9, 17,2 (SiCH2CH2CH2SiO y señales solapadas de SiCH2CH2CH2Si); -1,7 (OSiMe2), -4,9 (SiMe). 29Si(1H)-RMN (CDCl3): δ
0,93 (Gi-Si), 18,7 (G2-Si), Go-Si no se observa. Análisis elemental de
Cn6H332Ni6O24SiI3. Cale: C, 61,78; H, 9,78; N, 6,55. Obten.: C, 62,51; H, 9,90; N,
6,75.
- Ejemplo 9.- Síntesis de 3G-fSi(OCH2-fCgHj)-3.5-í OCH2CH2NMe2VHu, (9)
El dendrímero de tercera generación 9 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 7, partiendo de 3G-Ch6 (0,072g, 0,022 mmol) ; NEt3 (0,060 mi, 0,43 mmol) y 3,5-(OCH2CH2NMe2)2-(C6H3)-CH2OH (0,101 g, 0,358 mmol). De esta forma se obtuvo 9 como un aceite amarillo pálido (0,110 g; 69%).
1H-RMN(CDCl3): δ 6,46 (8H, m, C6H3); 6,35 (4H, m, C6H3); 4,56 (8H, s,
CH2OSi); 3,97 (16H, t, CH2O-C6H3); 2,67 (16H; t, CH2N); 2,28 (48H, S3 NMe2); 1,33 (14H, m, SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si), 0,69 (8H, m, SiCH2CH2CH2SiO),
0,55 (18Η, m, CH2 unidos a Si), 0,09 (24H, s, OSiMe2), -0,09 (9H, s, SiMe). 13C(3H)-
RMN(CDCl3): D 160,0 (C6H3, Cφso unido a OCH2CH2NMe2); 143,2 (C6H3, Cipso unido a CH2OSi); 104,3 y 100,8 (C6H3); 65,9 (CH2O-C6H3); 64,6 (CH2OSi); 58,3 (CH2NMe2);
45,8 (NMe2), 21,1 (SiCH2CH2CH2SiO); 17,8, 17,2 (SiCH2CH2CH2SiO y señales solapadas de SiCH2CH2CH2Si); -1,8 (OSiMe2), -4,9 (SiMe). Análisis elemental de
C368H700N32O48Si29. Cale: C, 61,76; H, 9,86; N, 6,26. Obten.: C, 62,43; H, 9,90; N,
6,80.
- Ejemplo 10.- Síntesis de 1 G-FSi(Of CHz)2NÍMe)fCH?)?NMe?)l4 (10) A una disolución del dendrímero IG-CU (0,3 Ig, 0,54 mmol) en éter (30 mi), se añadió un ligero exceso de NEt3 (0,5 mi, 3,58 mmol) y 2-{[2- dimetilamino)etil]metilamino}etanol (0,35 mi, 2,19 mmol) . La mezcla de reacción se mantuvo con agitación constante durante 12 h a temperatura ambiente, después se eliminó a vacío el exceso de NEt3 y el disolvente dando lugar a un residuo que se extrajo con éter (2 x20 mL). La suspensión resultante, se filtró con celite para eliminar la sal de amonio NEt3-HCl generada en la reacción y el filtrado se llevó a sequedad dando lugar al compuesto 10 como un aceite incoloro (0,3 g, 57%).
1H-RMN (CDCl3): δ 3,64 (2H, t, CH2O), 2,51 (4H, m, CH2N(Me)), 2,35 (2Η, t, CH2N(Me)2), 2,26 (3Η, s, NMe), 2,19 (6H, s, NMe2), 1,29 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,62 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO)5 0,59 (2Η, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,05 (6H, s, SiMe2). 13C(1H)-RMN (CDCl3): δ 60,8 (CH2O), 59,9 y 56,2 (CH2N(Me)CH2), 57,5 (CH2N(Me)2), 45,9 (NMe2), 43,3 (NMe)5 21,2 (SiCH2CH2CH2SiO), 17,8 (SiCH2CH2CH2SiO), 17,2 (SiCH2CH2CH2SiO), -2,0 (SiMe2). 29Si(1H)-RMN (CDCl3): δ 0,49 (G0-Si), 17,59 (Gi-Si). Análisis elemental de C48H1I6N8O4Si5. Cale: C, 57,09; H, 11,58; N, 11,10. Obten.: C, 57,60; H, 11,72; N, 11,20. - Ejemplo 11.- Síntesis de 2G-[SJf Oí CH2^Nf Me)(CH?)?NMe2)1s fll) El dendrímero de tercera generación 11 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 10, partiendo de 2G-CIg (1,12 g, 0,77 mmol), NEt3 (1 mi, 7,17 mmol) y 2-{[2-dimetilamino)etil]metilamino}etanol (1 mi, 6,16 mmol). De esta forma se obtuvo 11 como un aceite amarillo pálido (1.3 g, 72%).
1H-RMN (CDCl3): δ 3,65 (4H, t, CH2O), 2,51 (8H, m, CH2N(Me)), 2,30 (4H, t,
CH2N(Me)3), 2,26 (6Η, s, NMe), 2,20 (12H, s, NMe2), 1,31 (6H, m, SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si), 0,63 (4H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,59 (8Η, m, SiCH2), 0,06 (12H, s, SiMe2), -0,10 ( 3H, s, SiMe). 13C(1H)-RMN (CDCl3): δ 60,8 (CH2O), 59,9 y 56,2 (CH2N(Me)CH2), 57,5 (CH2N(Me)2), 45,9 (NMe2), 43,3 (NMe)5 21,2 (CH2SiO), 18,7-
17,9 (SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si), -1,79 (OSiMe2), -4,8 (SiMe). 29Si(1H)-
RMN (CDCi3): δ 0,38 (G0-Si), 0,93 (Gi-Si), 17,58 (G2-Si). Análisis elemental de
Cn2H226Ni6O8SiI3. CaIc: C, 57,67; H, 11,58; N, 9,61. Obten.: C, 57,20; H, 11,40; N,
9,52
- Ejemplo 12. Síntesis de 3 G- \ Si( OÍCH?)?Nf Me)(CHg)2NMe, )lTfi (12) El dendrímero de tercera generación 12 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 10, partiendo de 3G-Cl16 (0,49 g, 0.152 mmol), NEt3 (0,40 mi, 2,86 mmol) y 2-{[2-Dimetilamino)etil]metilamino}etanol (0,39 mi, 2,43 mmol) De esta forma se obtuvo 12 como un aceite amarillo pálido (0,51 g, 67%).
1H-RMN (CDCl3): δ 3,65 (8H, t, CH2O), 2,51 (16Η, m, CH2N(Me)), 2,36 (8Η, t, - CH2N(Me)2), 2,26 (12Η, s, NMe), 2,21 (24H, s, NMe2), 1,30 (14H, m, SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si), 0,63 (8H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,53 (18Η, m, SiCH2), 0,06 (24H, s, SiMe2), -0,10 ( 9H, S5 SiMe). 13C(1H)-RMN (CDCl3): δ 60,8 (CH2O), 60,0 y 56,2 (CH2N(Me)CH2), 57,4 (CH2N(Me)2), 45,9 (NMe2), 43,3 (NMe), 21,1 (CH2SiO), 18,7-17,8 (SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2SiSi), -1,9 (OSiMe2), -4,8 (SiMe). 29Si(IH)-RMN (CDCl3): δ 0,93 ( G1-Si y G2-Si), 17,58 (G3-Si). Análisis elemental de C240H572N32O16Si29. Cale: C, 57,91; H, 11,58; N, 9,0 Obten.: C, 57,32; H, 11,38; N, 8,72. Estos dendrímeros, se obtienen como productos aceitosos de color marrón claro en altos rendimientos. Todos ellos son solubles en disolventes orgánicos comunes e insolubles en agua.
Los datos espectroscópicos y analíticos de los derivados 1-12 son consistentes con las estructuras propuestas que se muestran en la Figura la. Así, las señales correspondientes al esqueleto carbosilano en los espectros de RMN-1H de los dendrímeros anteriores presentan desplazamientos químicos casi idénticos para los núcleos análogos en las diferentes generaciones, aunque las señales se van haciendo más anchas y desestructuradas al ir aumentando la generación del dendrímero. Estas características se han atribuido a dos factores principalmente: la estructura tipo polímero de estos derivados, que confiere a los núcleos en las diferentes generaciones diferencias muy ligeras en su entorno químico y la restricción de la movilidad de los protones respectivos en las capas más externas al aumentar la generación. 2^
Estos espectros muestran tres grupos de señales que se asignan a los grupos metileno. En las ramas SiCH2CH2CH2Si, los grupos metileno centrales se observan a
1,30 ppm, mientras que los grupos metileno unidos directamente a los átomos de silicio se localizan a 0,61 y 0,51 ppm. Se asignó la señal centrada a 0,61 ppm a los grupos
CH2SiO-, mientras que la señal centrada a 0,51 ppm se atribuye al resto de grupos metileno, basándose en el aumento de la intensidad de la integral de esta última señal al ir aumentando la generación del dendrímero y en experimentos ID 1H-TOCSY y
NOESY. En los espectros de RMN de 13C los grupos metileno de las ramas interiores
SiCH2CH2CH2Si presentan señales en el rango 21,3-17,4 ppm. La asignación completa de estas señales se hizo con la ayuda de experimentos HMQC. Finalmente los fragmentos -SiMe2- y -SiMe- son fácilmente distinguibles en todos los derivados y generaciones. Los espectros de RMN de Si están igualmente de acuerdo con la formulación propuesta, si bien en estos espectros los átomos de silicio más internos solamente son observados en los dendrímeros de primera generación.
Respecto a la caracterización de los grupos terminales de estos dendrímeros, aquí se describe a modo de ejemplo la caracterización de estos grupos en los derivados 1-6. La caracterización en el resto de compuestos se ha hecho de una manera similar y los datos relativos a cada uno de ellos se encuentran reflejados en la parte experimental de este trabajo. En los dendrímeros 1-6, para el fragmento externo -OCH2CH2NMe2 se observa un tríplete localizado a 3,64 (para los dendrímeros 1, 3 y 5) y 3,74 (para los dendrímeros 2, 4 y 6) que se asigna a los grupos -OCH2- y otro triplete centrado a 2,43 ppm en todos los casos correspondiente a los grupos -CH2N-. El desplazamiento a campo bajo observado en la señal correspondiente a los grupos -OCH2- en los dendrímeros 2, 4 y 6 es consistente con la presencia de dos átomos de oxígeno unidos al átomo de silicio en estos derivados, aunque este efecto es imperceptible para los grupos -CH2N-. Los grupos metilo unidos a nitrógeno aparecen en todos los casos a 2,23 y 46,1 ppm en RMN de 1H y 13C respectivamente. La caracterización de estos compuestos se completó con espectrometría de masas
(electro espray o MALDI-TOF MS) usando 1,8,9-trihidroxiantraceno (ditranol) como matriz. Sin embargo, los picos moleculares no pudieron ser observados para las segundas y terceras generaciones, hecho que también ha sido descrito para otros muchos dendrímeros de peso molecular elevado. ^27'46"49'
Ejemplos 13 a 15,-
Ejemplo 13.- Síntesis de IG-FSJiCH2^NH2I4 (13)
A una disolución del dendrímero IG-H4 (0,54 g, 1,23 mmol) en la mínima cantidad de THF (1 mi) se le añadió alilamina (1,5 mi, 19,99 mmol) y dos gotas del catalizador de Karstedt (3-3,5% Pt). La mezcla de reacción se calentó a 120 0C en una ampolla de vació durante 4h, la mezcla de reacción se llevó a sequedad para eliminar el disolvente y el exceso de allilamina, el residuo resultante se disolvió en CH2Cl2 y se filtró con celite y carbón activo. La disolución obtenida se llevó a sequedad por eliminación del disolvente a vacío, dando lugar al compuesto 13 como un aceite incoloro (0,90 g; 83%). La estructura de este dendrímero se representa en la Figura Ib.
1H-RMN (CDCl3): δ 2,63 (2H, t, CH2N), 1,34 (4H, m, SiCH2CH2CH2N y SiCH2CH2CH2Si), 1,13 (2H, s, NH2), 0,54 - 0,44 (8H, m, CH2 unidos a Si), -0,06 (6H, s, SiMe2), 13C(1H)-RMN (CDCl3): δ 45,7 (CH2N)5 28,3 (SiCH2CH2CH2N), 20,2, 18,6, 17,6, (SiCH2CH2CH2Si) ,12,4 (SiCH2CH2CH2N), -3,3 (SiMe2). 29Si(1H)-RMN (CDCl3): 6 0,50 (G0-Si), 1,96 (G1-Si). Análisis elemental de C32Hg0N4Si5. Calc.rC, 58,14; H, 12,21; N, 8,48. Obten.: C, 57,63; H, 12,27; N, 8,78. Electrospray MS: m/z z=l 661.25 urna [M+H]+ .(Cale. 661,52 urna). Ejemplo 14.- Síntesis de 2G-FSiíCH^NH?]s (14)
El dendrímero de segunda generación 14 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 13, partiendo de 2G-H8 (0,42 g, 0,36 mmol), alilamina (2 mi, 26,7 mmol), ImI de THF y dos gotas del catalizador de Karstedt. De esta forma se obtuvo 14 como un aceite incoloro (0,32 g, 55%). La estructura de este dendrímero se representa en la Figura Ib.
1H-RMN (CDCl3): δ 2,63 (4H, t, CH2N), 1,41-1,28 (6H, m, SiCH2CJf2CH2Si y
SiCH2CiZ2CH2N), 0,54-0,44 (2OH, m, CH2 unidos a Si), -0,06 (12H, s, SiMe2), -0,10 (3H, s, SiMe)5 13C(1Hi-RMN (CDCl3): δ 45,7 (CH2N), 28,4 (SiCH2CH2CH2N), 20,2,
18,6, 17,6, (SiCH2CH2CH2Si), 12,5 (SiCH2CH2CH2N), -3,1 (SiMe2), -4,8 (SiMe).
29Si{3H}-RMN (CDCl3): δ 0,92 (GrSi); 2,00 (G2-Si). Análisis elemental de
C80Hi96N8SiI3. Cale: C, 58,75; H, 12,08; N, 6,85. Obten.: C, 58,16; H, 11,95; N, 6,58.
Electrospray MS: m/z z=l no se observa, para z=2 (m/z +1) 818,44 urna [M+H]+ .(Calc. Z=2 818,8 urna).
Ejemplo 15.- Síntesis de 3 G-FSi(CH7KNH?! i fi (15)
El dendrímero de tercera generación 15 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 13, partiendo de 3G-H16 (0,100 g, 0,037 mmol), alilamina (2 mí, 26.7 mmol), ImI de THF y dos gotas del catalizador de Karstedt. De esta forma se obtuvo 15 como un aceite incoloro (0,085g, 64%).
1H-RMN (CDCl3): δ 2,63 (8H, t, CiZ2N), 1,41-1,28 (22H, m, SiCH2CH2CH2Si y SiCH2CH2CH2N), 0,54-0,44 (36H, m, CH2 unidos a Si), -0,06 (24Η, s, SiMe2), -0,10 (9H, s, SiMe), 13C(1H)-RMN (CDCl3): δ 45,7 (CH2N), 28,4 (SiCH2CH2CH2N), 20,2, 18,6, 17,6, (Si SiCH2CH2CH2Si), 12,5 (SiCH2CH2CH2N)5 -3,1 (SiMe2), -4,8 (SiMe). 29Si(1H)-RMN (CDCl3): δ 0,92 (Gl-Si y G2-SÍ); 2,00 (G3-SÍ). Análisis elemental de Ci76H428Ni6Si29. Cale: C, 58,98; H, 12,04; N, 6,25. Obten.: C, 58,06; H, 11,84; N, 6,48.
Ejemplos 16 a 27.-
Ejemplo 16.- Síntesis de IG-[SJfOCH2CH2NMe /DJ4 (16)
Sobre una disolución de 1 (0,12 g, 0,15 mmol) en éter (10 mi) se añadieron 0,4 mi de una disolución 2M en éter de MeI (0,8 mmol). La mezcla de reacción se mantuvo con agitación constante durante 48h a temperatura ambiente, después, se llevó a sequedad para eliminar el exceso de MeI. El residuo resultante se lavó con Et2O (2 x 5 mi) y se secó a vacío para obtener el compuesto 16 como un sólido de color blanco (0,2O g, 96%). 1H-RMN (DMSO): δ 3,94 (2H9 m, CH2O), 3,43 (2H, m, CH2N), 3,09 (9H, s,
NMe3 +), 1,29 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,66 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,56 (2H, m, CH2Si)3 0,11 (6H, s5 OSiMe2). 13C(1H)-RMN (DMSO): δ 65,8 (CH2N), 55,8 (CH2O)5 52,6 (NMe3 +), 19,7 (SiCH2CH2CH2SiO), 16,9, 16,1 (SiCH2CH2CH2SiO), -2,6 (OSiMe2). Análisis elemental de C40H100N4O4Si5I4. Cale: C, 35,61; H, 7,47; N, 4,15. Obten.: C, 36,67; H, 7,65; N, 4,42.
Ejemplo 17.- Síntesis de lG-rSi(OCH?CH?NMe J+H2Ii ft7)
El dendrímero de primera generación 17 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 16, partiendo de 2 (0,17 g, 0,16 mmol) y 0,80 mi de una disolución 2M en éter de MeI (1,6 mmol). De esta forma se obtuvo 17 como un sólido de color blanco (0,29 g, 86%).
1H-RMN(DMSO): δ 4,12 (4H, m, CH2O), 3,54 (4H, m, CH2N), 3,17 (18H, s,
NMe3 +), 1,29 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,75 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO)5 0,54 (2Η, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,20 (3H5 s, OSiMe). I3C{ 1H)-RMN (DMSO): δ 65,8 (CH2N), 56,0 (CH2O), 52,7 (NMe3 +), 17,3 (SiCH2CH2CH2SiO), 16,5, 15,9 (SiCH2CH2CH2SiO)5
-5,3 (OSiMe). Análisis elemental de C56H140N8O8Si5I8. Cale: C, 30,44; H, 6,39; N,
5,07. Obten.: C, 31,47; H, 6,47; N, 5,19.
Ejemplo 18.- Síntesis de 2 G- fS i (OCH2CH2NMe Alh (18Ϊ El dendrímero de segunda generación 18 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 16, partiendo de 3 (0,25 g, 0,13 mmol) y 0,6 mi de una disolución 2M en éter de MeI (1,2 mmol). De esta forma se obtuvo el compuesto 18 como un sólido de color blanco (0,35 g, 87%).
1H-RMN(DMSO): δ 3,96 (4H, m, CH2O), 3,45 (4H, m, CH2N), 3,11 (18H, s, NMe3 +), 1,29 (6H, m, SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si), 0,65 (4H, m,
SiCH2CH2CH2SiO), 0,52 (8Η, m, resto de SiCH2), 0,11 (12H, s, OSiMe2), -0,10 (3H, s, SiMe). 13C(1H)-RMN(DMSO): δ 65,7 (CH2N), 55,9 (CH2O), 52,6 (NMe3^), 19,7, 17,5, 16,9 y señales solapadas (resto de grupos -CH2-), -2,5 (OSiMe2), -5,3 (SiMe). Análisis elemental de C96H236N8O8Si13I8. Cale: C, 38,29; H, 7,9; N, 3,72. Obten.: C, 38,87; H, 8,32; N, 3,79.
Ejemplo 19.- Síntesis de 2G-FSi(OCH7CHcNMe V1TVU Ü9>
El dendrímero de segunda generación 19 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 16, partiendo de 4 (0,10 g, 0,04 mmol) y 0,5 mi de una disolución 2M en éter de MeI (1.0 mmol). De esta forma se obtuvo el compuesto 19 como un sólido de color blanco (0,17 g, 87%). 1H-RMN (DMSO): δ (ppm) 4,13 (8H, m, CH2O), 3,56 (8H, m, CH2N), 3,19 (36H, s, NMe3 +), 1,28 (6H, m, SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si), 0,72 (4H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,55 (8Η, m, resto de SiCH2), 0,21 (6H, s, OSiMe), -0,08 (3H, s, SiMe). 13C(1H)- RMN (DMSO): δ 65,7 (CH2N), 56,0 (CH2O), 52,7 (NMe3 +), 19,2, 17,2, 16,4 y señales solapadas (resto de grupos -CH2-), -5,2 (OSiMe)5 -5,6 (SiMe). Análisis elemental de C128H316N16O16Si33I16. Cale: C, 32,49; H, 6,73; N, 4,74. Obten.: C, 33,32; H, 7,03; N, 4,72.
Ejemplo 20.- Síntesis de 3G-FSi(OCH2CH2NMe /DIin Í20) El dendrímero de tercera generación 20 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 16, partiendo de 5 (0,12 g, 0,03 mmol) y 0,4 mi de una disolución 2M en éter de MeI (0,8 mmol). De esta forma se obtuvo el compuesto 20 como un sólido de color blanco (0,16 g, 83 %).
1H-RMN (DMSO): δ 3,96 (8H, m, CH2O), 3,47 (8H, m, CH2N), 3,13 (36H, s, NMe3 +), 1,28 (14H, m, SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si), 0,65 (8H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,52 (20Η. m, resto de SiCH2), 0,10 (24H, s, OSiMe2), -0,08 (9H, s, SiMe). 13C(1H)- RMN(DMSO): δ 65,8 (CH2N)5 55,9 (CH2O), 52,6 (NMe3 +), 19,7, 17,2, 16,0 y señales solapadas (resto de grupos -CH2-), -2,7 (OSiMe2), -5,5 (SiMe). Análisis elemental de C96H236N8O8SiI3Ig. Cale: C, 39,43; H, 8,08; N, 3,54. Obten.: C, 39,19; H, 8,19; N, 3,68. Ejemplo
Figure imgf000053_0001
El dendrímero de tercera generación 21 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 16, partiendo de 6 (0,060 g, 0,012 mmol) y 0,2 mi de una disolución 2M en éter de MeI (0.4 mmol). El espectro de IH-RMN presenta señales anchas e indica que aproximadamente el 90% de los grupos amino terminales ha sido cuaternizado, por lo que el compuesto 21 no se aisla puro.
1H-RMN (DMSO): δ 4,16 (16H5 m, OCH2), 3,60 (16H, m, CH2N), 3,22 (72H, s, NMe3 +I"), 1,27 (14H, m, SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si), 0,52 (26H, m, SiCH2CH2CH2SiO y resto de grupos -CH2-), 0,07 (24H, s ancho, SiMe2), la señal correspondiente a SiMe no se observa porque aparece solapada con la señal anterior.
Figure imgf000053_0002
El dendrímero de primera generación 22 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 16, partiendo de 7 (0,1 g, 0,06 mmol) y 0,35 mi de una disolución 2M en éter de MeI (0,7 mmol). De esta forma se obtuvo el compuesto 22 como un sólido de color blanco (0,14 g, 90%).
1H-RMN (DMSO): δ 6,55 (3H, m, C6H3); 4,58 (2H, s, CH2OSi); 4,42 (4H, t,
CH2O-C6H3); 3,77 (4H, t, CH2N); 3,18 (18H, s, NMe3 +); 1,35 (2H, m,
SiCH2CH2CH2SiO), 0,70 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,57 (2Η, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,08 (6H, s, SiMe2). 13C(1HJ-RMN (DMSO): δ 157,8 (C6H3, Cipso unido a OCH2CH2NMe2); 143,2 (C6H3, C£pso unido a CH2OSi); 104,9 y 99,6 (C6H3);
63,5 (CH2NMe2); 63,0 (CH2OSi); 61,3 (CH2O-C6H3); 52,7 C^Me3), 19,9
(SiCH2CH2CH2SiO); 16,9, 16,1 (SiCH2CH2CH2SiO ); -2,4 (SiMe2). Análisis elemental de C88H172I8N8O12Si5. Cale: C, 39,29; H, 6,44; N, 4,17. Obten.: C, 38,90; H, 6,24; N, 4,09.
Ejemplo 23.- Síntesis de 2G-FSJrOCH2-(CAHj)-SJ-(OCH2CH2NMe1 +T)2)Ij (23) El dendrímero de segunda generación 23 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 16, partiendo de 8 (0,08 g, 0,023 mmol) y 0,20 mi de una disolución 2M en éter de MeI (0.4 mmol). De esta forma se obtuvo el compuesto 23 como un sólido de color blanco (0,11 g, 85%). 1H-RMN (DMSO): δ 6,58 (6H, m, C6H3); 4,58 (4H, s, CJf2OSi); 4,44 (8H, t,
CH2O-C6H3); 3,79 (8H, t, CH2N); 3,20 (30H5 s, NMe3^); 1,33 (6H, m,
SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH3Si), 0,67(4H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,54 (8H, m,
CH2 unidos a Si), 0,07 (12Η, s, OSiMe2), -0,07 (3H, s, SiMe). 13C(1H)-RMN (DMSO): δ 157,9(C6H35C1PS0 unido a OCH2CH2NMe2); 143,2 (C6H3, Cipso unido a CH2OSi); 105,2 y 99,6 (C6H3); 63,5 (CH2NMe2); 63,0 (CH2OSi); 61,4 (CH2O-C6H3); 52,7 (NMe3 +),
19,8 (SiCH2CH2CH2SiO); 17,5, 16,8 (SiCH2CH2CH2SiO y señales solapadas de y
SiCH2CH2CH2Si ); -2,4 (OSiMe2); -5,5 (SiMe). Análisis elemental de
C192H380IIeN16O24Si]3. Cale: C, 40,51 ; H, 6,73; N, 3,94. Obten.: C, 41,20; H, 7,02; N, 4,10.
Ejemplo 24.- Síntesis de 3G-fSirθCH2-rCήH1V3,5-rθCH2CH2NMe.+I')2)lij (24) El dendrímero de tercera generación 24 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 16, partiendo de 9 (0,084 g, 0,012 mmol) y 0,25 mi de una disolución 2M en éter de MeI (0,5 mmol). De esta forma se obtuvo el compuesto 24 como un sólido de color blanco (0,08Og, 72%).
1H-RMN (DMSO): δ 6,57 (12H, m, C6H3); 4.58 (8H, s, CH2OSi); 4.44 (16H, t,
CH2O-C6H3); 3.78 (16H, t, CH2N); 2,28 (72H, s, NMe3 +); 1,33 (14H5 m,
SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si), 0,69 (8H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,55 (18Η, m, CH2 unidos a Si), 0,08 (24H, s, OSiMe2), -0,08 (9H, s, SiMe). 13C(1HJ-
RMN(CDCl3): δ 158,0 (C6H3, Cipso unido a OCH2CH2NMe2); 143,2 (C6H3, C!pso unido a
CH2OSi); 104,9 y 100,12 (C6H3); 63,4 (CH2O-C6H3); 63 (CH2OSi); 61,4 (CH2NMe2);
52,7 (NMe3 + 3), 19.9 (SiCH2CH2CH2SiO); 17,5, 16,8 (SiCH2CH2CH2SiO y señales solapadas de SiCH2CH2CH2Si); -2,3 (OSiMe2), -5,5 (SiMe). Análisis elemental de C384H748I16N32O48Si29. Cale: C, 48,92; H5 8; N, 4,75. Obten.: C, 47,60; H, 7,02; N, 4,35.
Ejemplo 25.- Identificación de lG-ÍSi(O(CH2)2NÍMeYCH2)2NMe/m4 (25)
El dendrímero de primera generación 25 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 16, partiendo de 10 (0,043 g, 0,047 mmoles) y 0,094 mi de una disolución 2M en éter de MeI (0,188 mmoles). De esta forma se obtuvo el compuesto
25 como un sólido de color blanco. Este compuesto no se aisla puro, observándose mezclas debidas a un proceso de cuaternización no selectivo en el que pueden participar ambos átomos de nitrógeno, si bien, el compuesto 25 es el componente mayoritario de esta mezcla.
1H-RMN (DMSO): δ 3,98 (2H, m, OCH2CH2N(Me)CH2CiZ2NMe3 +F), 3,60 (2H, t, OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I"), 3,42 (2H, m, OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I"), 3,11 (9H, s, NMe3 +I"), 2,76 (2H, m, OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I"), 2,21 (3H, s,
NMe), 1,30 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,61 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,53 (2Η, m,
SiCH2CH2CH2SiO), 0,04 (6H, s, SiMe2). 13C(1H)-RMN (CDCl3): δ 64,8
(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I"), 61,0 (OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +F), 59,5
(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I"), 58,3 (OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +F), 52,2 (NMe3 +I"), 41,3 (NMe), 20,0 (SiCH2CH2CH2SiO), 16,9 y 16,1 (SiCH2CH2CH2SiO), -
2,5 (SiMe2).
Ejemplo 26.- Identificación de 2G-rSiíO(CH7)7N(Me)ÍCH2)2NMejT)lj f26) El dendrímero de segunda generación 26 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 16, partiendo de 11 (0,19 g, 0,08 mmol) y 0,34 mi de una disolución 2M en éter de MeI (0,68 mmol). De esta forma se obtuvo el compuesto 26 como un sólido de color amarillo pálido. Este compuesto no se aisla puro, observándose mezclas debidas a un proceso de cuaternización no selectivo en el que pueden participar ambos átomos de nitrógeno, si bien, el compuesto 26 es el componente mayoritario de esta mezcla.
1H-RMN (DMSO): δ 4,02 (4H, m, OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +F), 3,60 (4Η, t, OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3T)5 3,42 (4H, m, OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +F),
3,11 (18H, s, NMe3 +F), 2,76 (4H, m, OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +F), 2,21 (6H, s,
NMe), 1,30 (4H5 m, SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si), 0,59 (4H, m, SiCH2CH2CH2SiO)5 0,51 (8Η, m, resto de grupos -CH2-), 0,03 (12H, s, SiMe2), -0,11
(3H, s, SiMe). 13C(3Hj-RMN (CDCl3): δ 64,9 (OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +F), 61,0
(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +F), 59,6 (OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +F), 58,3
(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +F), 52,3 (NMe3T), 41,3 (NMe), 20,0-16,8 (grupos -
CH2- del esqueleto carbosilano), - 2,5 (SiMe2), -5,5 (SiMe). Ejemplo 27.- Identificación de 3 G- rSiíOf CH2)2NfMe)fCH2)2NMe.+I")]1ή (27) El dendrímero de tercera generación 27 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 16, partiendo de 20 (0,084 g, 0,017 mmol) y 0,13 mi de una disolución 2M en éter de MeI (0,27 mmol). De esta forma se obtuvo el compuesto 27 como un sólido de color amarillo pálido. Este compuesto no se aisla puro, observándose mezclas debidas a un proceso de cuaternización no selectivo en el que pueden participar ambos átomos de nitrógeno, si bien, el compuesto 27 es el componente mayoritario de esta mezcla.
1H-RMN (DMSO): 5 3,99 (8H, m, OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I"), 3,60 (8H, t, OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +T), 3,44 (8H, m, OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I"),
3,12 (36H, s, NMe3 +I'), 2,76 (8H, m, OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I"), 2,22 (12H, s,
NMe), 1,28 (14H, m, SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si), 0,51 (26H, m,
SiCH2CH2CH2Si O y resto de grupos -CH2-), 0,03 (24Η, s, SiMe2), -0,11 (9H, s, SiMe).
13C{ 1Hf-RMN (CDCl3): δ 64,9 (OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +F), 61,0 (OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I"), 59,6 (OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I"), 58,3
(OCH2CH2N(Me)CH2CH2NMe3 +I"), 52,3 (NMe3 +I"), 41,3 (NMe), 20,0-16,8 (grupos -
CH2- del esqueleto carbosilano), - 2,5 (SiMe2), -5,5 (SiMe).
En el caso de los dendrímeros de tercera generación 21, 24 y 27 la cuaternización de los grupos dimetilamino no es completa como demuestran los espectros de RMN de 1H, a partir de los cuales se puede estimar de una forma aproximada que sólo en torno al 90% de los grupos dimetilamino terminales en estos complejos han sido cuaternizados, incluso en presencia de exceso de MeI y dejando Ia reacción durante mayores periodos de tiempo. Todos estos derivados iónicos son insolubles en los disolventes orgánicos habituales, pero solubles en DMSO, MeOH y H2O.
Los datos espectroscópícos y analíticos de los derivados 16-27 son consistentes con las estructuras propuestas que se muestran en la Figura 2a. Las señales que aparecen en los espectros de RMN de 1H de estos derivados, realizados en DMSO como disolvente a temperatura ambiente, son más anchas que las de sus precursores en disolventes orgánicos comunes. Este hecho ha sido descrito previamente para otros dendrímeros carbosilano solubles en agua y se ha explicado como un efecto de ensanchamiento dipolar como consecuencia de la disminución de la movilidad en agua de estos dendrímeros predominantemente hidrofóbicos.
Los espectros de RMN de 1H y ι C de los dendrímeros 16-27 presentan para el esqueleto carbosilano patrones de resonancia idénticos a los de sus precursores 1-12, aunque se observa un aumento en el ensanchamiento de las señales al aumentar la generación.
Al igual que en los dendrímeros con grupos amino terminales, para estos derivados, aquí se describe detalladamente la asignación de las señales de los grupos exteriores sólo para los derivados 16-21, habiéndose realizado la asignación en el resto de derivados de una forma similar.
Los grupos exteriores SiOCH2CH2NMeS +I", dan lugar a dos multipletes anchos centrados en 3,94 (para los dendrímeros 16, 18 y 20) ó 4,12 (para los dendrímeros 17, 19 y 21) asignable a los protones metilénicos de los grupos -OCH2-, y 3.45 (para los dendrímeros 16, 18 y 20) ó 3.56 (para los dendrímeros 17, 19 y 21) que se asignan a los protones del fragmento -CH2N-. La cuaternización de los grupos amina produce un desplazamiento a campo bajo de 0.3-0.4 ppm en la señal de -OCH2-, mientras que los protones metileno de los grupos -CH2N- se desplazan en 1 ppm aproximadamente. Los grupos metilo directamente unidos a nitrógeno dan señales en RMN de 1H y 13C centradas a 3.18 y 52.6 ppm respectivamente, lo que supone un desplazamiento a campo bajo respecto de las señales observadas en los dendrímeros terminados en grupos amina 1-6. Estas variaciones están de acuerdo con la presencia de una carga positiva sobre el átomo de nitrógeno en los dendrímeros terminados en grupos amonio 16-21.
Ejemplos 28 a 30,- Ejemplo 28.- Síntesis de G1[Si(CH2^NH1 +CrL1 (28)
A una disolución del compuesto 13 (0,17 g, 0,26 mmol) en 40ml de Et2O se le añadieron 1,2 mi (1,2 mmol) de una disolución IM de HCl en Et2O. La reacción se mantuvo a temperatura ambiente y con agitación constante durante 2h tras las cuales se observa la aparición de un precipitado de color blanco. El disolvente y el exceso de HCl es eliminado a vacío y de esta forma se obtuvo 28 como un sólido blanco con un rendimiento cuantitativo. La estructura de este dendrímero se representa en la Figura 2b. 1H-RMN (D2O): δ 2,74 (2H,t, CH2N), 1,45 (2H, m, SiCH2CH2CH2N), 1,19 (2H, m, SiCH2CJf2CH2Si), 0,38 (6H, t, CH2Si), -0,19 (6H, s, SiMe2). 13C(1HJ-RMN (D2O): δ 42,0 (CH2N), 21,3 (SiCH2CH2CH2N), 18,8, 18,0, 16,6 (SiCH2CH2CH2Si), 11,2
(SiCH2CH2CH2N), -4,4 (SiMe2). Análisis elemental de C32H84N4Cl4Si5. Cale: C, 47,61; H, 10,49; N3 6,94. Obten.: C, 48,57; H, 10,46; N, 6,82.
Ejemplo 29.- Síntesis de 2G-rSi(CH2)1Mfr+CnR (29)
El dendrímero de segunda generación 29 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 28, partiendo de 14 (0,09 g, 0,05 mmol) y 0,6 mi de una disolución IM en éter de HCl (0,06 mmol). De esta forma se obtuvo el compuesto 29 como un sólido de color amarillo pálido (0,06g; 55%). La estructura de este dendrímero se representa en la Figura 2b.
1H-RMN (D2O): δ 2,74 (2H, t, CH2N), 1,47 (2H5 m, SiCH2CJZ2CH2N), 1,16 (4H5 m, SiCH2CJJ2CH2Si), 0,38 (16H, t, CH2Si), -0,19 (6H, s, SiMe2). -0,22 (3H, s, SiMe). 13C(3H)-RMN (D2O): δ 42,0 (CH2N), 21,8 (SiCH2CH2CH2N), 2,5-17,0 (SiCH2CH2CH2Si), 12,01 (SiCH2CH2CH2N), 3,23 (SiMe2), -4,2 (SiMe2). Análisis elemental de C80H204N8Cl8Si13. Cale: C, 49,86; H, 10,67; N, 5,81. Obten.: C, 49,79; H5 10,18; N, 5,76.
Ejemplo
Figure imgf000058_0001
El dendrímero de tercera generación 30 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 28, partiendo de 15 (0,060 g, 0,018 mmol), y 0,30 mi de una disolución IM en éter de HCl (0,30mmol) De esta forma se obtuvo 30 como un solido de color amarillo pálido (0,054g, 78%). 1H-RMN (D2O): δ 2,74 (8H, t, CJJ2N), 1 ,45 (8H5 m, SiCH2CH2CH2N), 1.20 (14H, m, SiCH2CJJ2CH2Si) 0.39 (36H, m, CH2 unidos a Si), -0,19 (24H, s5 SiMe2), -0,10 (9H, s, SiMe), 13C(1Hj-RMN (CDCl3): δ 42,0 (CH2N), 21,3 (SiCH2CH2CH2N), 18,9, 17,9, 16,5, (SiCH2CH2CH2Si), 11,3 (SiCH2CH2CH2N), -4,4 (SiMe2), -4,8 (SiMe). Análisis elemental de C176H444Nj6Si29. Cale: C, 55,44; H, 11,74; N5 5,88. Obten.: C, 56,16; H, 11,98; N, 6,01. Estudios de biocompatibilidad de los nuevos dendrímeros, caracterización de la unión a polianiones y proteínas plasmáticas y comportamiento biológico de los dendriplejos
Como se ha señalado anteriormente, uno de los aspectos de la invención lo constituyen composiciones farmacéuticas que contienen al menos un dendrímero de la invención, bien junto a otra(s) sustancia(s) de carácter aniónico y de interés farmacéutico a la(s) que acompaña como vehículo para facilitar su transporte en la corriente sanguínea hasta las células dianas en las que ha(n) de ejercer su efecto, protegiéndola(s) de la interacción con proteínas del plasma a las que podría quedar unido o que podrían afectar a su estabilidad, bien como sustancia activa con capacidad de interaccionar con el ciclo vital de un microorganismo causante de una enfermedad cuyos efectos se pretenden prevenir, reducir o eliminar mediante uno o más de un dendrímero de la invención. En una de las realizaciones preferidas de ese aspecto de la invención, la(s) molécula(s) de carácter aniónico a la(s) que uno o más dendrímeros de la invención sirven de vehículo de transporte es un oligodesoxinucleótido (ODN), preferiblemente un ODN antisentido, o bien una molécula de ADN bicatenario de longitud superior o de un ARN de interferencia. También son aspectos de la invención el uso de algún dendrímero de la invención o de composiciones que los contegan para prevenir o tratar enfermedades, provocadas por agentes patógenos o por fallo de genes.
Por todo ello, se decidió ensayar la biocompatibilidad de los nuevos dendrímeros propuestos, caracterizar su unión a polianiones y proteínas plasmáticas y analizar el comportamiento biológico de los complejos tipo dendriplejo formados entre los dendrímeros de la invención y los polianiones elegidos. Los dendrímeros que se seleccionaron para realizar estas pruebas fueron:
Dendrímeros:
IM8: IM16:
2G-[Si(OCH2CH2NMe S +F)J8 (18) 2G-[Si(OCH2CH2NMe 3 +r)2]8 (19) Pm= 3011 g/mol Pm= 4731,59 g/mol 8 cargas positivas 16 cargas positivas
Figure imgf000060_0001
Phe:
2G-[Si(OCH2-(C6H3)-3J5-(OCH2CH2NMe3 +I")2)]g (23) Pm= 5692,80 g/mol 16 cargas positivas
Figure imgf000060_0002
NN: C1NH4:
2G-[Si(O(CH2)2N(Me)(CH2)2NMe3 +r)]8 (26) 2G-[Si(CH2)3NH3 +Cr]g (29) Pm= 3468,08 g/mol Pm=I 927,6 g/mol 8 cargas positivas 8 cargas positivas
Figure imgf000061_0001
SF (Superfect (dendrímero PAMAM activado, Qiagen, Crawley, GB) 140 grupos aminos terminales PM= 35,000
Figure imgf000061_0002
G4: (dendrímero PAMAM de 4a generación; Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) 140 grupos amino terminales PM= 14,215 Los dos últimos, Superfect y G4, son dendrimeros PAMAM comerciales que se utilizaron a título comparativo con respecto a los dendrimeros carbosilano de Ia invención.
Propiedades físico-químicas de los CBS: Solubilidad en agua
Todos los dendrimeros carbosilano de la invención son solubles en agua a la concentración utilizada para las disoluciones de partida (2 mg/ml) mediante una ligera agitación, sin ser necesario calentamiento.
Para realizar los experimentos, todos los CBS utilizados se resuspendieron a esa concentración de partida ( 2 μg/μl = 2 mg/ml).
Ejemplo 31 : Formación de complejos entre los CBS y ODN
QDN utilizados
Las secuencias oligonucleotídicas utilizadas eran secuencias antisentido (complementarias) dirigidas contra diferentes ARN del VIH. La longitud variaba desde 15 a 28 bases, siendo de naturaleza fosforotioato. Los ODN concretos utilizados y sus secuencias se muestran a continuación en Ia Tabla 1.
Tabla 1.- ODN utilizados
Figure imgf000062_0001
Varios de los ODN se utilizaron fluoresceinados en el extremo 5'. Esto se indica añadiendo la letra F a su notación. Así, "GF" hace referencia al ODN anti-gag fluoresceinado en el extremo 5', mientras que "RF" hace referencia al ODN anti-Rev fluoresceinado en el extremo 5'.
Todos los ODN utilizados se resuspendieron a una concentración de 1 μg/μl.
- Visualización de los complejos en geles de agarosa
Se conocía el uso de geles de agarosa para el estudio de la formación de complejos entre los dendrímeros de tipo PAMAM y ADN plasmídico o en forma de
ODN mediante el mareaje isotópico de los mismos. Basándose en este tipo de aproximaciones, se intentó desarrollar geles que permitieran estudiar esta propiedad sin la utilización a ser posible de isótopos radiactivos.
Se ensayaron diferentes concentraciones de agarosa para evidenciar la migración del ODN y de los dendriplejos, teniendo en cuenta el pequeño tamaño de los ODN utilizados. Finalmente, se optó por una concentración de agarosa del 3% en TAE Ix como la mejor. Se comparó la migración de los ODNs no fluoresceinados frente a la de los fluoresceinados, migrando los dos a la misma altura pero aumentando estos últimos la señal percibida de forma considerable. Utilizándolos, se evitó así el mareaje isotópico del ODN. Para la elaboración de estos geles se fabricó un doble pocilio, para permitir volúmenes de carga de 60 μl, de los que 50 μl eran volumen de mezcla de las muestras en RPMI y 10 μl tampón de carga con glicerol. Como marcador de tamaño se utilizó una escalera de 100 pares de bases (Gibco BRL®).
Formación de complejos
Para la formación de los complejos en todos los ensayos realizados, tanto sobre geles como sobre células se tomó como base la relación entre el número de cargas positivas y negativas en dicho complejo. Según han publicado diferentes autores en estudios con dendrímeros PAMAM, es necesario que el complejo formado presente un exceso de carga positiva para facilitar su unión a las glicoproteínas de la membrana celular, cargadas de forma negativa, iniciándose así el proceso de endocitosis. Así mismo, se añadía un exceso de carga positiva para asegurar la formación del complejo dendrímero-ADN. Por ello, los complejos entre los dendrímeros CBS y los diferentes ácidos nucleicos se formaron en exceso de número de cargas positivas (aportadas por el CBS) frente a negativas (aportadas por el ODN). No obstante, se probaron diferentes ratios de carga, haciendo los cálculos en base al número de cargas del dendrímero (fijas) y el número de cargas negativas del ODN (fijas también). El ratio 2/1 de cargas positivas / negativas se fijó como el suficiente en todos los dendrímeros para formar los complejos con una carga total resultante positiva, aunque en algunos experimentos se aportó un balance de igual número de cargas negativas que positivas o de exceso de cargas negativas.
Para el SF se utilizó el ratio de carga propuesto por el fabricante y para el G4 PAMAM se utilizó un exceso molar de 100 a 1 en favor del dendrímero tipo PAMAM5 según lo propuesto por Sato et al (Clin Cáncer Res 2001 Nov;7(l l):3606-12). En todos los ensayos se utilizó un volumen de formación de complejo de 60 μl5 utilizando como soporte medio sin suero RPMI con rojo fenol.
Electroforesis de los complejos formados
Se realizaron ensayos de formación de complejos con los dendrímeros de la invención IM8, ClNH4, NN, Phe e IMl 6.
Los resultados de las electroforesis efectuadas con las muestras resultantes de la mezcla de distintos ODN y los diferentes dendrímeros se muestran en la Figura 3. Las muestras cargadas en los diferentes geles que aparecen en ellas son las siguientes:
IM8: - Figura 3a. Formación de complejos entre el IM8 y el ODN GF. Las muestras sometidas a electroforesis fueron las siguientes: Calle 1 : escalera de 100 pb
Calle 2: 4 μl GF+ 4,52 μl IM8+ 91,48 μl RPMI (+/-)=2/l Calle 3: 4 μl GF+ 9,03 μl IM8+ 86,97 μl RPMI (+/-)=4/l Calle 4: 4 μl GF+ 45,2 μl IM8+ 50,8 μl RPMI (+/-)=20/l
Calle 5: 4 μl GF+ 90,4 μl IM8+ 5,6 μl RPMI (+/-)=40/l Calle 6: 4 μl GF+ 96 RPMI Calle 7: 4,52 μl IM8+ 95,48 μl RPMI Calle 8: 9,03 μl IM8+ 90,97 μl RPMI Calle 9: 45,2 μl IM8+ 54,8 μl RPMI
Calle 10: 90,4 μl IM8+ 9,6 μl RPMI Los resultados de la electroforesis muestran que el IM8 es capaz de retener el ADN. Cuanta mayor relación de carga, más migra el complejo hacia el polo negativo, hasta llegar a un límite en el cual por más que se aumente la carga positiva (la cantidad de dendrímero) ya no migra más arriba (probablemente ya todas las moléculas de ADN están formando complejo con el CBS-IM8 o bien porque el tamaño del poro del gel no se lo permite).
- Figura 3b: Electroforesis de muestras con IM8 y ODNs de distintos tamaños (relación de carga 2/1). Las muestras sometidas a electroforesis fueron las siguientes:
Calle 1 : escalera lOObp Calle 2: RF: 4,5 μl+ 56 μl RPMI
Calle 3: RF: 4,5 μl+ 5,3 μl IM8+ 50 μl RPMI
Calle 4: PPT 3 μl+ 57 μl RPMI
Calle 5: PPT 3 μl+ 3,4 μl IM8+ 54 μl RPMI
Calle 6: PPT-TFO 2,5 μl + 58 μl RPMI Calle 7: PPT-TFO 2,5 μl + 2,8 μl IM8+ 55 μl RPMI
Calle 8: TAR 2,6 μl + 57 μl RPMI
Calle 9: TAR 2,6 μl + 3 μl IM8 + 55 μl RPMI
Los resultados de la electroforesis muestran que el IM8 fue capaz de retener la migración de todos los ODN. Esto supone un primer indicio de que la longitud de los ODNs no es determinante para la formación del complejo.
C1NH4
- Figura 3c. Formación de complejos entre el ClNH4 y el ODN RF. Las muestras sometidas a electroforesis fueron las siguientes: Calle 1 : Control de RPMI
Calle 2: RF 4,5μl + 3,3 μl C1NH4 + 52 μl RPMI (+/-)= 2
Calle 3: RF 4,5μl + 55 μl RPMI
Calle 4: RF 2,25μl + 3,3 μl C1NH4 + 55 μl RPMI (+/-)= 4
Calle 5: RF 2,25μl + 58 μl RPMI Calle 6: RF 1 ,28μl + 3,3 μl C1NH4 + 56 μl RPMI (+/-)= 7
Calle 7: RF l,28μl + 58 μl RPMI
Calle 8: 3,3 μl C1NH4 + 57 μl RPMI Calle 9: Escalera 100 pb
Según los resultados obtenidos, el C1NH4 es capaz de retener el ADN también con todas las relaciones de carga evaluados.
NN y Phe
- Figura 3d, Formación de complejos entre el ODN RF y los dendrímeros NN o Phe. Las muestras sometidas a electroforesis fueron las siguientes:
Calle 1 : 4,5 μl RF + 6 μl G2 NN + 50 μl RPMI (+/-)= 2
Calle 2: 4,5 μl RF + 21 μl G2 NN + 35 μl RPMI (+/-)= 7 Calle 3 : 1 ,3 μl RF + 6 μl G2 NN + 53 μl RPMI (+/-)= 7
Calle 4: 2,25 μl RF + 3 μl G2 NN + 55 μl RPMI (+/-)= 2
Calle 5: 2,25 μl RF + 10,5 μl G2 NN + 48 μl RPMI (+/-)= 7
Calle 6: 0,64 μl RF + 3 μl G2 NN + 56 μl RPMI (+/-)= 7
Calle 7: 2,25 μl RF + 57 μl RPMI Calle 8: 4,5 μl RF + 5 μl G2 Phe + 55 μl RPMI (+/-)= 2
Calle 9: 4,5 μl RF + 17,5 μl G2 Phe + 38 μl RPMI (+/-)= 7
Calle 10: 1,3 μl RF + 5 μl G2 Phe + 54 μl RPMI (+/-)= 7
Calle 11 : 2,25 μl RF + 2,5 μl G2 Phe + 55 μl RPMI (+/-)= 2
Calle 12: 2,25 μl RF + 8,75 μl G2 Phe + 50 μl RPMI (+/-)= 7 Calle 13: 0,64 μl RF + 2,5 μl G2 Phe + 57 μl RPMI (+/-)= 7
Los resultados de esta electroforesis demuestran también que tanto el NN como el Phe son capaces de formar complejos también con los ODN.
IM16 - Figura 3e. Formación de complejos entre el ODN PPT, los dendrímeros IM8 e IM 16 y el correspondiente monómero a partir del cual se formó el dendrímero. Las muestras sometidas a electroforesis fueron las siguientes: Calle 1 : Escalera de 100 pb Calle 2: PPT 2,57 μl + 3 μl IM8 + 54 μl RPMI Calle 3: PPT 2,57 μl + 2,35 μl IM 16 + 55 μl RPMI
Calle 4: PPT 2,57 μl + 1,8 μl monómero + 55 μl RPMI Calle 5: PPT 2,57 μl + 57 μl RPMI En la calle en la que se corrió la muestra que contenía el ODN y el dendrímero IMl 6, éste último fue también capaz de retener al ADN
Por tanto, los CBS ensayados de 2a generación fueron capaces de retener la migración del ADN hacia el polo positivo, siendo esto un reflejo de la formación de un complejo electrostático entre los CBS y los ODN en todos los casos: la pequeña generación de los CBS ensayados no es obstáculo por tanto para retener el ADN. Los dendrímeros sin ADN, por su parte, emiten una señal débil, casi inapreciable.
- Estudio de la integridad del dendrímero en el complejo formado El proceso de síntesis de los CBS utilizados en este trabajo, empieza a partir de un núcleo inicial de estructura común, que se termina funcionalizando en la periferia mediante el uso de diferentes grupos funcionales, que son los que aportan la carga positiva al dendrímero y determinan las diferencias entre ellos, siendo el núcleo dendrimérico de naturaleza apolar. Dado que algunas de las uniones de los grupos funcionales utilizados al núcleo dendrimérico podrían ser inestables en disolución acuosa, se realizaron ensayos para determinar si la retención del ADN en los geles de agarosa y por tanto la formación de complejos entre los CBS y el ADN podría ser debida a la estructura dendrimérica total conservada o por contra, eran los grupos funcionales terminales desprendidos del resto del núcleo dendrimérico los responsables de la retención del ADN. Para ello, se realizaron geles en los cuales se compararon complejos formados entre los ODNs y los CBS íntegros y los formados supuestamente entre los ODNs y los grupos funcionales terminales con los cuales se había funcionalizado el esqueleto carbosilano, en este caso dimetiletanolamina cuaternizada. Como se ha comentado antes, esas moléculas cargadas positivamente, que se encuentran unidas al dendrímero como grupos funcionales terminales, son las que confieren al dendrímero su carga. Como control, se compararon las mezclas de ODN-dendrímeros, ODN-monómeros y ODN solos. El gel correspondiente se muestra en la Figura 3e, a la que ya se ha hecho referencia anteriormente, en la que las muestras comparadas y sometidas a electroforesis son las siguientes: Callel : Escalera de 100 pb
Calle 2: Control con medio RPMI sin dendrímero ni oligonucleótido Calle 3: PPT 2,57 μl + 3 μl IM8 + 54 μl RPMI Calle 4: PPT 2,57 μl + 2,35 μl IM 16 + 55 μl RPMI
Calle 5: PPT 2,57 μl + 1,8 μl monómero + 55 μl RPMI
Calle 6: PPT 2,57 μl + 57 μl RPMI
El resultado de este ensayo muestra claramente que es necesaria la estructura dendrimérica completa para retener el ADN, no siendo capaces los monómero s, a pesar de su carga positiva, de retener el ADN. Por tanto, a estas concentraciones, la estructura dendrimérica se mantendría íntegra.
Ejemplo 32: Estabilidad de los dendriplejos a distintos pH Se realizaron estudios de estabilidad de los complejos a diferentes pHs, para determinar como afectarían los cambios de pH al complejo, dado que existen distintas localizaciones anatómicas, tisulares o celulares en las cuales el pH se acidifica o basifica. Ejemplos son el ambiente ácido del estómago, el básico de las secreciones pancreáticas al intestino delgado, o a nivel celular, el compartimento endosoma- lisosoma, donde se cambia de un pH fisiológico (7,35-7,45) a un pH ácido en torno a 4. Interesaba saber por tanto en qué rango de pH podría mantenerse el complejo del ADN con los distintos CBS utilizados. Se formaron los complejos siguiendo el procedimiento habitual y se les añadieron volúmenes en exceso de distintas soluciones a distintos pHs. Por ello, para cada uno de los dendrímeros Phe, ClNH4, NN, IM8 e IMl 6 se prepararon, según lo expuesto en el Ejemplo 31, 7 disoluciones de dendriplejos formados con PPT, en una relación de carga 2/1 y con los siguientes pHs: 2,8; 2,7; 4,7; 5,7; 6,4; 7,4; 8:
Los resultados obtenidos se muestran en los geles de eíectroforesis que aparecen en la Figura 4, en los que la altura de la banda de migración normal del ODN se muestra con flechas en la parte inferior de los geles. Las muestras se cargaron de izquierda a derecha siguiendo un orden de pH crecientes. En los pocilios señalados con una X, no se cargó muestra alguna.
De acuerdo con los resultados obtenidos, mientras que los complejos formados entre los dendrímeros ClNH4 y Phe y el ODN son estables a todos los pH ensayados, los complejos formados entre el NN y el ODN eran lábiles a pH ácido (menor que 5,7), como lo demuestra la aparición de señal en la zona de migración del ODN en los pocilios señalados con flechas en el gel correspondiente a la Figura 4b. En el caso de IM8 e IMl 6, ocurría algo similar: los complejos IM8-0DN se disocian a pH<4,7; los formados con IMl 6 se disocian a pH<5,7. A pH básicos, sin embargo, todos los complejos eran estables, al no aparecer señal en las calles correspondientes a pH 7,4 y pH 8. Esto quiere decir, que en un ambiente ácido (estómago, endosoma-lisosoma) el complejo entre CBS NN, CBS IM8 y CBS IMló con el ODN irá liberando este último progresivamente. Este hecho sería bueno para aquellas aplicaciones que requirieran de la liberación controlada del ODN pH-dependiente. También quiere decir, que si el dendrímero todavía estuviera en el interior de la célula unido al ODN, cuando ingresara en el compartimento endosoma-lisosoma se rompería. En cambio, en ambiente básico (jugos intestino delgado) se mantendría estable.
Ejemplo 33: Estabilidad de los dendripleios en disolución acuosa en función del tiempo
Se prepararon distintas muestras en disolución acuosa de dendriplejos formados entre el ODN PPT y los dendrímeros IM8, IMl 6 y NN a una relación de carga 2/1 según lo expuesto en el Ejemplo 31 y se realizaron electroforesis transcurridos tiempos distintos desde la preparación de las muestras, concretamente 0 horas, 6 horas y 24 horas. Durante esos tiempos, los dendriplejos se mantuvieron en condiciones que remedan las fisiológicas: 370C, en atmósfera a 5% de CO2. Los resultados se muestran en la Figura 5, en la que el gel de la Figura 5a corresponde a la muestra de 0 horas, el de la Figura 5b a las muestras transcurridas 6 horas y el de la Figura 5c a las muestras transcurridas 24 horas. En los tres casos, a, b y c, las muestras aparecen en las calles siguiendo este orden:
Calle 1: Escalera de 100 pb. Calle 2: IM8 + PPT
Calle 3: IM16 + PPT Calle 4: NN + PPT Calle 5: PPT
Los geles muestran que hay una liberación gradual con el tiempo del ODN desde los dendriplejos formados con cualquiera de los tres dendrímeros considerados. Esto es un buen indicio para su uso en liberación retardada de polianiones. Eiemplo 34: Estabilidad de los dendriplejos en presencia de proteínas y detergentes
La unión a proteínas plasmáticas es uno de los obstáculos con los que se enfrentan las terapias con ODNs. Dicha unión disminuye la biodisponibilidad del ODN, haciendo necesaria una mayor dosis para poder ejercer el efecto biológico que se desea. En este apartado, se pretende analizar la influencia de la presencia de proteínas en el medio sobre la estabilidad del complejo, y si éste podría de alguna forma proteger al ODN de la unión a proteínas del plasma. Estos estudios se realizaron con el CBS NN y analizando el comportamiento de los dendriplejos formados en presencia de albúmina de suero bovino (BSA) y del detergente amónico PBS. Se realizaron los cálculos necesarios para poner una relación de dendrimero/ODN de 2/1 y se prepararon las siguientes muestras, con el objeto de exponer los dendriplejos a la presencia de distintas concentraciones de albúmina sérica bovina, medio completo con suero de ternera fetal o medio humano completo AB. Las distintas mezclas obtenidas se testaron para migración del ADN y de proteína sobre un mismo gel de agarosa al 3% con bromuro de etidio en su composición. Primero se tomaba fotografía del gel expuesto a luz ultravioleta y posteriormente se teñía con una solución de colorante azul Paragón al 0,5% (sal disódica de ácido 8-amino-7-(3- nitrofenilazo)-2-(fenazilo)-l-nañol-3,6-disulfónico, Beckman Coulter ®) durante 20 minutos (colorante para evidenciar la presencia de proteínas) y se desteñía finalmente el gel con lavados con acético glacial al 10%, tomándose una fotografía con cámara digital posteriormente. Los resultados se muestran en la Figura 6, en la que la parte a corresponde a la tinción con azul Paragón y la parte b corresponde a la fotografía del gel tomada con luz ultravioleta. El orden en el que aparecen las muestras es el siguiente:
Calle 0: Escalera de 100 pb Calle 1 : 2,60 μl TAR + 3,47 μl NN + 25 μl RPMI
Callel 2: 2,60 μl TAR + 3,47 μl NN + 25 μl RPMI + 30 μϊ PBS-BSA 2% Calle 3: 2,60 μl TAR + 3,47 μl NN + 25 μl RPMI + 30 μl PBS-BSA 5% Calle 4: 2,60 μl TAR + 3,47 μl NN + 25 μl RPMI + 30 μl PBS-BSA 10% Calle 5: 2,60 μl TAR + 3,47 μl NN + 25 μl RPMI + 30 μl SDS 0.5 % Calle 6: 2,60 μl TAR + 3,47 μl NN + 25 μl RPMI + 30 μl SDS 1%
Calle 7: 2,60 μl TAR + 3,47 μl NN + 25 μl RPMI + 30 μl SDS 2% Calle 8: 2,60 μl TAR + 3,47 μl NN + 25 μl RPMI + 30 μl Medio Completo Calle 9: 2,60 μl TAR + 27 μl RPMI + 30 μl PBS-BSA 10% Calle 10: 2,60 μl TAR + 27 μl RPMI
Se observa, en primer lugar que en todos los pocilios (menos en los tratados con
SDS) aparecen unas bandas oscuras a medio camino entre el ODN libre y el pocilio: son complejos del azul Paragon con el azul de bromofenol presente en el tampón de carga.
Además, en todas las calles en las que está presente la albúmina aparece una mancha correspondiente a su tinción,
De acuerdo con los resultados que se muestran en los geles, pueden extraerse las siguientes conclusiones: a) El ODN forma complejos con la albúmina, a los que corresponde una banda en el gel teñido con bromuro de etidio que se ha marcado rodeándola. b) Las concentraciones crecientes de albúmina no son capaces de disociar el complejo (2,3,4). Además, la albúmina no debe estar secuestrando ODN desde el complejo dendrímero-ADN porque, si no, migraña a la altura del círculo. c) El complejo se disocia en la presencia de un detergente amónico (SDS) a todas las concentraciones ensayadas.
Ejemplo 35: Estabilidad del dendriplejo NN-ODN en presencia de suero
Con la intención de ver la estabilidad de los dendriplejos en presencia de suero en función del tiempo, se realizó un ensayo en el que a las muestras se les añadía medio completo que contenía suero de ternera fetal (STF) al 10%. Se prepararon las siguientes muestras con TAR como ODN: 1. TAR 2,59 μL + NN 3,47 μL + 54 μL RPMI (+/-)=2/l
2. TAR 2,59 μL + NN 1 ,73 μL + 55 μL RPMI(+/-)-l/l 3. TAR 2,59 μL + NN 0,8ó μL + 57 μL RPMI(+/-)=0,5 O
Figure imgf000071_0001
4. TAR 2,59 μL + 54 μL RPMI
Tal como se ha señalado, a los 20' de su preparación a las muestras 1, 2 y 3 se les añadió 100 μl de medio completo. De cada una de las muestras se tomaron alícuotas de 45 μl pasados 40 minutos, 4 horas y 17 horas y se sometieron a la electroforesis en gel de agarosa. Las muestras se cargaron en el gel siguiendo el orden de su numeración de izquierda a derecha, habiendo situado previamente un marcador de escalera de 100 pb. En el último punto (17 horas), sólo se ensayó el complejo de relación 2/1 frente al ODN sin NN. Los resultados se muestran en la Figura 7, en la que aparece una fecha sobre cada uno de los pocilios correspondientes a muestras con TAR+NN en relación 2/1.
De los datos mencionados anteriormente, se pueden extraer las siguientes observaciones: a) A los 40 min, se aprecia que solamente la relación 2/1 de carga es capaz de retener por completo el ODN, no siendo capaz la relación 1/1 ni por supuesto la 0,5/1. b) A las 17 h el dendrímero NN libera al ODN que migra hacia el ánodo. c) No hay interferencia de las proteínas del medio completo con la estabilidad del complejo. Por otra parte, el ODN liberado migra al mismo nivel que el ODN solo, lo que indica que el ODN no forma complejos con ninguna de las proteínas existentes en el medio (10% de suero de ternera fetal, Antibiótico y L-Glutamina).
En definitiva, en presencia de STF al 10%, el complejo y el ODN se comportan como si el medio utilizado para las mezclas contuviera solo RPMI, no forma complejos con las proteínas del plasma, y el NN libera al ODN a las 17 h.
A continuación se comprobó cómo se comportarán complejo y ODN en presencia de suero humano. Para ello se realizaron estudios con suero humano AB.
En primer lugar, se comprobó el comportamiento del ODN sin dendrímero en presencia de suero humano. Para ello se sometieron a electroforesis muestras con la siguiente composición:
Calle 0: Escalera de 100 pb Calle 1: Control (Suero AB)
Calle 2. 2,6 μL TAR + 17 μL RPMI + 40 μL Suero AB Calle 3. 2,6 μL TAR + 37 μL RPMI + 20 μL Suero AB
Calle 4. 2,6 μL TAR + 47 μL RPMI + 10 μL Suero AB Calle 5. 2,6 μL TAR + 57 μL RPMI
Los geles de electroforesis, obtenidos tras esperar 20 minutos para una buena interacción del ODN con las proteínas del suero antes de cargar las muestras en el gel, se muestran en la Figura 8. En ella, la parte a muestra Ia fotografía obtenida con luz UV de la aparición de bandas por tinción con bromuro de etidio y la parte b muestra el mismo gel tratado con azul Paragón ®. La localización de las bandas correspondientes al ODN en la parte a a la misma altura que las bandas de proteínas en la parte b demuestra la unión del ODN a las proteínas del suero humano.
En segundo lugar, se comprobó el efecto de la presencia de las proteínas del suero humano sobre el dendríplejo ODN-NN. Se pretendió comprobar si el dendrímero protegería al ODN de la unión a proteínas; para ello se incubaron dendriplejos, ODN y dendrímero s sin ADN con 3 concentraciones de suero humano AB: a los 20 minutos de realizarse las mezclas del ODN, el dendrímero y el RPMI sin suero se añadieron a las mezclas 100 μL de RPMI bien puro, bien con un 5% de suero AB, un 10% o un 20%. Se realizaron electroforesis a las 0 horas, 4 horas y 24 horas de la mezcla de dendrímeros y ODN, cargando las muestras de la siguiente manera: 0 horas
...20' => 100 uL RPMI
Calle 1. 2,43 μL PPT-TFO + 3,25 μL NN + 54 μL RPMI PURO Calle 2. 2,43 μL PPT-TFO + 3,25 μL NN + 54 μL RPMI 5% Calle 3. 2,43 μL PPT-TFO + 3 ,25 μL NN + 54 μL RPMI 10%
Calle 4. 2,43 μL PPT-TFO + 3,25 μL NN + 54 μL RPMI 20% Calle 5. 2,43 μL PPT-TFO + 57 μL RPMI 5%
Calle 6. 2,43 μL PPT-TFO + 57 μL RPMI 10%
Calle 7. 2,43 μL PPT-TFO + 57 μL RPMI 20% Calle 8. 2,43 μL PPT-TFO + 57 μL RPMI PURO
4 horas:
...20' => 100 uL RPMI
Calle 1. Control (60 μL RPMI) 20% Calle 2. 2,43 μL PPT-TFO + 3,25 μL NN + 54 μL RPMI PURO
Calle 3. 2,43 μL PPT-TFO + 3,25 μL NN + 54 μL RPMI 5%
Calle 4. 2,43 μL PPT-TFO + 3,25 μL NN + 54 μL RPMI 10%
Calle 5. 2,43 μL PPT-TFO + 3,25 μL NN + 54 μL RPMI 20%
Calle 6. 2,43 μL PPT-TFO + 57 μL RPMI 5% Calle 7. 2,43 μL PPT-TFO + 57 μL RPMI 10%
Calle 8. 2,43 μL PPT-TFO + 57 μL RPMI 20%
Calle 9. 2,43 μL PPT-TFO + 57 μL RPMI PURO Calle 10. 3,25 μL NN + 57 μL RPMI 5%
Calle 11. 3,25 μL NN + 57 μL RPMI 10%
Calle 12. 3,25 μL NN + 57 μL RPMI 20%
24 horas
...20r => 100 μL RPMI
Calle 1. Control (60 μL RPMI) 20%
Calle 2. 2,43 μL PPT-TFO + 3,25 μL NN + 54 μL RPMI PURO Calle 3. 2,43 μL PPT-TFO + 3,25 μL NN + 54 μL RPMI 5% Calle 4. 2,43 μL PPT-TFO + 3,25 μL NN + 54 μL RPMI 10%
Calle 5. 2,43 μL PPT-TFO + 3,25 μL NN + 54 μL RPMI 20% Calle 6. 2,43 μL PPT-TFO + 57 μL RPMI 5%
Calle 7. 2,43 μL PPT-TFO + 57 μL RPMI 10%
Calle 8. 2,43 μL PPT-TFO + 57 μL RPMI 20% Calle 9. 2,43 μL PPT-TFO + 57 μL RPMI PURO
Calle 10. 3 ,25 μL NN + 57 μL RPMI 5%
Calle 11. 3,25 μL NN + 57 μL RPMI 10%
Calle 12. 3,25 μL NN + 57 μL RPMI 20%
Los resultados de fotografiar los geles bajo luz ultravioleta se muestran en la
Figura 9a. La Figura 9b, por su parte, muestra la tinción con azul Paragon del gel correspondiente a las muestras de 4 horas.
Los resultados muestran que el dendriplejo NN+PPT-TFO sin suero se comporta como habitualmente, libera el ODN a las 24 h. A las 0 y 4 h: el NN+PPT-TFO en presencia de suero da un patrón de electroforesis distinto al PPT-TFO en presencia de suero. Éste último da una señal alargada y difusa, mientras que el dendriplejo deja el ODN en el pocilio (excepto cuando el suero está al 20%, que se produce un ligero escape de ODN y se une a proteínas). Si se observan los geles de proteínas, (de los que se ha mostrado como ejemplo el correspondiente a las muestras de 4 horas, aunque los resultados eran similares en los geles de 0 y 24 horas), éstas corren hacia el polo positivo, (mancha que se separa del pocilio); pero es interesante observar en el gel de BE que las proteínas forman un complejo con el ODN cuando éste está solo, sin dendrímero. Las proteínas corren a la misma altura en todas las circunstancias del experimento, independientemente de la presencia del dendrímero (que no consigue retener a la proteína en el pocilio, no forma complejo con la proteína). La presencia de proteína no consigue retirar ODN del complejo ODN-dendrímero; a las 24 h, el complejo empieza a liberar ODN, pero éste no migra hasta abajo como el control de ODN sin suero, sino que inmediatamente es retenido en su migración por las proteínas, dando la misma señal alargada y difusa que el ODN sin NN con suero.
Parece, por tanto, que hay una ventana de entre 4 y 24 h en las cuales el dendrímero protegería al ODN de la unión a proteínas. Pasado este tiempo lo libera. Esto daría tiempo al ODN unido al dendrímero a pasar del espacio endovascular el extravascular, con la certeza de que más tarde el dendrímero liberaría el ODN de forma controlada en el tiempo, dándole oportunidad de ejercer su acción. La proteína mayoritaria del suero es la albúmina, la cual presenta 2 dominios negativos que le dan una carga total negativa, pero presenta también un dominio positivo, el cual se une al ODN. Los sitios hidrofóbicos del CBS probablemente no interaccionan con los sitios hidrofóbicos de la albúmina. Dicha interacción es necesaria para lograr una unión estable entre dendrímero y proteína, por eso no forman complejos; sin embargo la unión electrostática entre dendrímero y ODN protege al último de Ia unión con el sitio positivo de la albúmina.
Ejemplo 36: Capacidad de formar complejos con ADN de gran tamaño
Se realizaron pruebas preliminares con plásmidos con el CBS IM8, siendo éste capaz de formar complejos con el plásmido utilizado, el Nf-kappaB-luc. De manera similar a experimentos anteriores, se realizó una electroforesis con distintas muestras, colocando en el pocilio anterior a ellas un marcador tipo escalera que mide hasta 5000 pb. Las muestras fueron las siguientes:
Calle 1 : 1 μl p + 0,58 μl IM8 (+/-)= 2/1 + 28 μl RPMI Calle 2. 1 μl p + 1 ,74 μl IM8 (+/-)= 6/1 + 28 μl RPMI Calle 3. 1 μl p + 2,9 μl IM8 (+/-)= 10/1 + 27 μl RPMI Calle 4. 1 μl p + 29 μl IM8 (+/-)= 100/1+ 0 μl RPMI
CaIIe S. 1 μl p (0,43 μg p ) Calle 6. 2 μl p donde p=plásmido.
La fotografía de la electroforesis se muestra en la Figura 10. En ella se demuestra que la relación de cargas A (+/-)= 6/1 ya consigue retener la migración del ADN.
Ejemplo 37. Capacidad de formar complejos con ARNip
También se realizaron ensayos preeliminares para evaluar la capacidad de retención de ARN de interferencia pequeños (ARNip). Con este fin se utilizó el siguiente ARNip anti-CD4: 5'-GAUCAAGAGACUCCUCAGUdGdA-3' (SEQ ID NO:6) suministrado por Ambion, Inc. El gel empleado fue un gel mátrix, un gel elaborado con una mezcla de agarosa y acrilamida lineal al 25 o 50%, obtenido tras calentamiento y mareaje posterior de las muestras con Bromuro de Etidio. En este caso concretamente se utilizó un gel 50% mátrix, 0,7% agarosa y 50% TAE 2X. Las muestras sometidas a electroforesis fueron las siguientes:
Calle 1: RPMI
Calle 2: 1 μl ARNip + 1,58 μl IM8 + 48 μl RPMI (+/-)= 2 Calle 3: 1 μl ARNip + 4,74 μl IM8 + 44 μl RPMI (+/-)= 6 Calle 4: 1 μl ARNip + 49 μl RPMI La fotografía del gel de electroforesis, mostrada en la Figura 11 , demuestra de nuevo que es positiva la formación de complejos.
Pruebas de toxicidad La toxicidad de los distintos dendrímeros se estudió por 5 procedimientos diferentes pero complementarios, que aportaban datos sobre funcionalidad celular, permeabilidad de membrana y aspecto de las células
Se utilizaron distintas técnicas con el fin de evaluar la viabilidad en diferentes aspectos: integridad de membrana (tinciones con azul tripán), apoptosis (mareajes con anexina-V-PE y DAPI), necrosis (mareajes con 7-AAD), reactivo MTT (evalúa la actividad mitocondriaí), evaluación del tamaño y complejidad de las células por citometría de flujo, microscopía in vivo para evaluar movilidad celular. Estas técnicas fueron aplicadas para el estudio de la toxicidad de ODN, dendrímeros y dendriplejos en células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Adicionalmente, se evaluó la toxicidad de los dendrímeros sobre hematíes mediante un ensayo de hemolisis.
Ejemplo 38: Pruebas sobre CMSP
- Dendrímeros ensayados
Se evaluó la toxicidad de los dendrímeros IM8, IMl 6, C1NH4, NN, Phe y los controles comerciales SF (Superfect) y G4. De cada uno de ellos se tomaron distintas cantidades de manera que las concentraciones finales con las que se incubaran las células fueran de 1 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM y 100 μM.
- Obtención de células mononucleares de sangre periférica (CMSP)
La sangre procedió de donantes adultos o de cordón umbilical de neonatos sanos. Dicha sangre se diluyó Vi con PBS y se procedió a su centrifugación en gradiente de Ficoll. Tras dicha centrifugación se recuperó el halo de CMSP y se procedió a dos ciclos de lavado-centrifugación posteriores. Las CMSP resultantes se resuspendieron en medio de cultivo completo con un 10% de STF, antibióticos y glutamina.
- Incubación con las células A un volumen de 60 μl de RPMI con el correspondiente dendrímero ensayado se le añadieron 100 μl de medio completo al 10% de suero de ternera fetal, antibióticos y glutamina. Los 160 μl se añadían entonces a las células sembradas en 340 μl, completando un volumen final de 500 μl. Las células se incubaron de esta manera durante 48 horas y posteriormente se procedió a valorar el efecto de la incubación con los dendrímeros mediante su examen visual y mediante la valoración de la actividad mitocondrial.
- Resultados del examen visual
Las observaciones obtenidas del examen visual se muestran a continuación en la Tabla 2. Tabla 2: Resultados del examen visual de CMSP incubadas con dendrímeros
Figure imgf000078_0001
De la observación visual se desprende que los dendrímeros menos tóxicos para los linfocitos fueron el CBS NN y el Phe, siendo los más tóxicos los dos dendrímeros PAMAM ensayados.
- Actividad mitocondriaí: MTT
Se realizó una curva de actividad mitocondriaí dependiente de la concentración de dendrímero a las 48 horas. Esta técnica se utilizó para evidenciar efectos deletéreos intracelulares sobre el interior de las células. Se trata de un ensayo colorimétrico basado en la capacidad selectiva de las células viables para reducir el bromuro de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-diphenií tetrazolio en cristales insolubles de formazán. Tras 48 horas de incubación de las CMSP con diferentes concentraciones de dendrímeros en placa de 96 pocilios (100.000 / pocilio), el sobrenadante que contenía dendrímero se retiró y fue sustituido por 200 μl de un medio de cultivo sin suero ni rojo fenol (Optimem). Para evitar la pérdida de células en este paso ni posteriormente de cristales de formazán, se había realizado una modificación del protocolo, sembrándose las CMSP en fibronectina total de plasma humano (Sigma®) a una concentración de 5-10 μgr /mi, con lo que durante la incubación de 48 horas se fijaron al fondo del pocilio. Además de los 200 μl de Optimem se añadieron 20 μl de MTT filtrado para conseguir su esterilidad (Azul de Tiazolil, Sigma®) en PBS pH 7.4 a una concentración de 5 mg/ml para conseguir una concentración final en pocilio de 0.5 mg MTT/ml. Después de 4 horas de incubación a 370C con atmósfera al 5% de CO2, se procedió a la centrifugación de la placa a 2000 rpm y a la posterior retirada del sobrenadante con el exceso MTT que no había reaccionado. Los cristales de formazán fueron observados al microscopio de contraste de fase y disueltos posteriormente con 200 μl de dimetilsulfóxido (DMSO). La placa se agitó a 700 rpm en una agitador-calentador Eppendorf ® para asegurar la correcta disolución de dichos cristales. La concentración de formazán ([A]) fue determinada por espectrofotometría utilizando un lector de placas a una longitud de onda de 570 nm con una referencia de 690 nm. El espectrofotómetro fue calibrado a cero utilizando Optimem sin células. La viabilidad celular relativa (%) respecto del control (células sin tratar), basada en la actividad mitocondrial, fue calculada en base a esta fórmula: [A] test / [A] control x 100. Cada concentración de dendrímero fue ensayada por triplicado, siguiendo las directivas de la ATCC. Los resultados obtenidos se muestran a continuación en la Tabla 3.
Tabla 3. Viabilidad celular tras la incubación con dendrímeros según el MTT
Figure imgf000079_0001
De los ensayos con MTT se desprende que las células que mostraron mayor viabilidad mitocondrial tras ser tratadas con concentraciones crecientes de CBS o SF fueron las tratadas con CBS IM 16, CBS NN y CBS Phe. Sin embargo, si se toman los datos en conjunto de estos ensayos con los de la observación visual, se deduce que mientras que IM 16 inducía la formación de agregados celulares, NN y Phe no lo hacen, resultando ser estos últimos los más biocompatibles para linfocitos.
Ejemplo 39. Pruebas sobre hematíes
Se realizó examen visual para detectar la presencia / ausencia de hemaglutinación y cuantifícación de la liberación de hemoglobina (ensayo de hemolisis) mediante espectrofotometría. De los dendrímeros del Ejemplo 38 anterior se excluyó el C1NH4, por haber resultado el más tóxico para linfocitos, y se compararon los resultados con los obtenidos para un dendrímero tipo PAMAM de generación 4.
Los hematíes se obtuvieron tras ser separados de las CMSP mediante el mismo gradiente de Ficoll citado en el Ejemplo anterior. Los mismos se diluyeron en PBS hasta poder visualizarlos de forma individualizada. Las células se re suspendieron en 500 μl de PBS y se sembraron en placa de 24 pocilios (300.000 / pocilio). Como control positivo se usaron células tratadas con Tritón X-100 al 0,2%. Control negativo: PBS (blanco). Los hematíes fueron incubados con distintas concentraciones de dendrímero. Se evaluó la presencia de hemaglutinación, número de células y liberación de hemoglobina a la hora mediante la recogida de 100 μl de sobrenadante y medición de absorbancias por espectrofotometría utilizando un lector de placas a una longitud de onda de 550 nm y 690 nm como referencia.
- Examen visual
Las observaciones resultantes del examen visual se muestran a continuación en la Tabla 4. Tabla 4. Examen visual de hematíes incubados con dendrímeros
Figure imgf000081_0001
Ag=aglutinación
- Cuantificación de la liberación de hemoglobina tras 1 hora 100% de hemolisis en el control de Tritón X-100 (las células tratadas con Tritón estaban todas muertas y rotas). 7% de hemolisis en el control negativo de células no tratadas. Cada pocilio se expresa como el porcentaje respecto a la D.O (densidad óptica) del Tritón X-100, que se considera el 100%; además a ese porcentaje se le resta el 7% del control. De esa manera se obtuvieron los resultados que se muestran a continuación en la Tabla 5: Tabla 5.- Porcentaje de liberación de hemoglobina tras la incubación con dendrímeros
Figure imgf000081_0002
A 5 μM el NN y el Phe sobrepasan sólo ligeramente el 10% de toxicidad, que es lo que se consideró como punto de corte para eritro-toxicidad. Lo que ocurre es que el
Phe induce hemaglutinación y el NN no. Como dato curioso, el IMl 6 induce menos hemolisis y deja mayor número de células en el pocilio que el IM8, (concuerda con lo observado para MTT en linfocitos), pero induce aglutinación. Todos inducen hemaglutinación excepto el NN. El PAMAM G4 induce aglutinación y cambios conformacionales en los hematíes, pero no hemolisis. El orden de hemaghitinación de mayor a menor es:
G4>Phe>IMl 6>IM8>NN
En conjunto, el pocilio en el que mejor aspecto tenían las células presentando además hemolisis casi despreciable fue el del dendrímero NN. Si se toman los resultados de toxicidad sobre linfocitos y hematíes juntos, el dendrímero que demostró mejores perfiles de biocompatibilidad fue el NN.
Ejemplo 40. Toxicidad de los complejos QDN + dendrímero en comparación con el dendrímero solo. La toxicidad de otros dendrímeros como los PAMAM se modifica (disminuye) cuando forman complejos con ADN. Los siguientes experimentos pretenden conocer qué ocurre con los dendrímeros CBS en cuanto a toxicidad cuando se unen a los ODN.
El tiempo de evaluación esta vez fue de 72 horas. Las toxicidad se evaluó sobre CMSP5 obtenidas de la forma descrita en el Ejemplo 38. En todos los casos se utilizó una relación de cargas: (+/-)=2/l
Las concentraciones de los dendrímeros usadas en estos experimentos para lograr la dosis 2/1 de carga (+/-) fueron: IM8: 2,96 μg= 3,93 μM IMl 6: 2,35 μg = 1,99 μM C1NH4: 1,92 μg = 3,98 μM
Phe: 2,8 μg = 1,96 μM NN: 3,42 μg = 3,94 μM SF: 0,68 μM G4: 100 μM El ODN utilizado fue el PPT, de la siguiente manera:
[ODN PPT] en el complejo con los CBS: 2,57 (0,88 μM) [ODN PPT] en el complejo con SF: 0,34 μM [ODN PPT] en el complejo con G4: lμM
- Formación de complejos
En todos los ensayos se utilizó un volumen de formación de complejo de 60 μl, utilizando como soporte medio sin suero RPMI con rojo fenol. Se añadieron las cantidades correspondientes de ODN o dendrímero para alcanzar la relación de carga (+/-)=2, siendo la carga positiva aportada por el dendrímero y la negativa por el ODN. Los cálculos de realizaron en base al número de cargas del dendrímero (fijas) y el número de cargas negativas del ODN (fijas igualmente). Una vez añadido el ODN y el CBS en el RPMI se esperaba un tiempo de 20 minutos para asegurar la formación de los complejos.
En el caso del SF, los complejos se formaron siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Incubación con las células
Transcurrido el tiempo necesario para asegurar la formación de complejos, a los
60 μl de RPMI con el ODN y el dendrímero se les añadía 100 μl de medio completo al
10% de STF, antibióticos y glutamina. Los 160 μl se añadían entonces a las células sembradas en 340 μl, completando un volumen final de 500 μl. Las células se incubaban bien con dichos complejos, bien con una mezcla de igual volumen que contenía el ODN sin CBS, bien con una mezcla que contenía dendrímero solo, o con una mezcla que contenía solamente RPMI + medio completo que se usaba como control negativo. Las células y/o el sobrenadante se recogían después para su análisis en citometría de flujo, microscopía confocal o extracción de ADN celular.
- Inmunofluorescencia y microscopía confocal
Después de las incubaciones con las mezclas conteniendo ODNs fluoresceinados, dendriplejos, dendrímeros o RPMI, las células eran tratadas para la posterior adquisición de imágenes en el microscopio de fluorescencia convencional o confocal. Las células se pegaron a portas de cristal con pocilios de 30 mm de diámetro mediante Poli-L-lisina, (PLL) (Sigma®). Para ello, los portas se preincubaron con 30 μl de PLL durante 2 horas en incubador a 37 C y 5% de CO2. Tras esta incubación, el exceso de PLL se lavaba con PBS. Las células procedentes de cada tratamiento que iban a ser pegadas en la PLL se lavaban 2 veces con PBS y se marcaban durante 1 minuto con azul tripán (Sigma®) al 0,8% para evidenciar posteriormente las células viables. Se volvían a lavar 2 veces con PBS. En ese momento se añadían las células al pocilio (100.000 / pocilio), disponiéndose sobre la PLL durante 1 hora en incubador a 37 0C y 5% de CO2. Después de esta hora, se lavaba el exceso de volumen con PBS y se trataban las células con paraformaíehido (PFA) al 3% preparado recientemente (dentro de las 2 semanas de su uso) durante 10 minutos. Tras estos 10 minutos, se lavó el exceso de PFA con PBS y se procedió al mareaje de las células con anticuerpos marcados con fluorocromos y DAPI. Se teñía en primer lugar la membrana celular y luego el núcleo. Se realizó una titulación previa de los anticuerpos utilizados para determinar las mejores concentraciones de uso para nuestros ensayos. Se utilizó en primer lugar un anticuerpo primario anti-CD45 IgGl5K de ratón anti-humano (BD(D); se añadían 30 μl de anticuerpo a cada pocilio, a una dilución de 1 μg/ml; se incubaba 30 minutos y posteriormente se lavaba el exceso con PBS. Después se utilizaba un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón anti IgG-IgM (cadenas pesadas y ligeras) conjugado en Texas-Red (Jackson ImmunoResearch®), 30 μl / pocilio a una dilución 1/130 de la madre (concentración de la madre 1,4 mg/ml). Se incubaba con las células durante otros 30 minutos y se lavaba posteriormente con PBS. Finalmente, se tiñieron los núcleos celulares mediante el uso de DAPI (Vysys ®) 10 μl / pocilio durante 10 minutos, lavándose posteriormente 2 veces con PBS. Las incubaciones con anticuerpos y DAPI se realizaban a temperatura ambiente. Los anticuerpos se diluían el mismo día de uso para evitar su degradación con el paso del tiempo y se centrifugaban a 12000 rpm previamente a su uso para disminuir la presencia de agregados. La dilución de cada anticuerpo se realizaba en medio de bloqueo para disminuir el mareaje inespecífico (PBS con Albúmina sérica bovina al 1%). Finalmente, se procedía al montaje de la preparación mediante el uso de un medio especial para fluorescencia (DAKO Cytomation Fluorescent Mounting Médium®) con antifading (destinado a proteger la muestra frente al deterioro causado por los láseres). Se procedía entonces a la observación y captura de imágenes mediante un microscopio confocal Leica TCS SP2 utilizando distintas líneas de excitación; 405, 488 y 514 nm y utilizando el objetivo para microscopía de contraste diferencial óptica del confocal. Tras la captura de imágenes se procedía a su análisis utilizando el software de Leica®.
Microscopía Confocal in vivo. Con el fin de examinar la viabilidad celular tras los diferentes tratamientos con ODNs, dendriplejos y dendrímeros a los que se sometían las CMSP, y de estudiar fenómenos tales como la captación de ODN fluoresceinado por parte de las mismas o evaluar el movimiento de las células transfectadas, se utilizaron técnicas de microscopía confocal in vivo. Para ello, se sembraban cristales de 2,5 cms con fϊbronectina total de plasma humano (Sigma®) a una concentración de uso de 5-10 μgr /mi incubándose con la fibronectina durante 1 hora a 37 0C. Tras lavar el exceso de fibronectina en el cristal con PBS, se sembraban las CMSP lavadas previamente con PBS y se incubaban a 37 0C con atmósfera al 5% de CO2 durante 30 minutos. El exceso de células no pegadas se eliminaba mediante lavados con PBS. Todo el trabajo con el cristal se realizaba disponiendo éste sobre una superficie no adherente (papel metálico esterilizado) en una placa Petri estéril y en cabina de flujo laminar. Finalmente, se procedía a la inclusión del cristal en la cámara para microscopía in vivo del confocal, en la cual las células permanecían a 37 0C con atmósfera al 5%. Antes de comenzar cualquier experimento in vivo, se dejaba a las células recuperarse de la manipulación durante 30 minutos en la cámara. Tras este periodo, se procedía al tratamiento de las células de distinta manera:
1. Adicción del ODN fluoresceinado o los dendriplejos con ODN fluoresceinado y evaluación de la internalización de las células de los mismos.
2. Evaluación de la capacidad de movimiento de las células tras distintos desafíos con dendrímeros, dendriplejos u ODNs .
Para ello, se realizaron tomas secuenciales en el tiempo (cada 30", 1 ' ó 2') de las células eligiendo un corte en el plano medio de las mismas, que incluyera el núcleo. Tras la adquisición, se procedía al montaje de las imágenes para la obtención de imágenes del proceso.
- Tinciones con Azul Tripán
Esta técnica evalúa la permeabilidad de la membrana celular al azul tripán (más conocido por su denominación en inglés Tripán Blue, abreviado TB). Las células vivas excluyen esta tinción.
Para realizarla, se preparó una solución con azul tripán (Sigma) al 0,8% y se trató el pellet celular obtenido tras centrifugación durante 1 minuto, procediéndose a centrifugación-lavado psoteriormente de las células con PBS 2 veces. Las células se observaron bajo microscopía óptica y se contaron las células positivas para la presencia de azul tripán (células azules, muertas) en relación con el porcentaje de células negativas (células vivas). Para ello se eligió un campo amplio con al menos 100 células. Los resultados obtenidos se muestran a continuación en la Tabla 6. Tabla 6,- Porcentaje de células teñidas con azul tripán
Figure imgf000086_0001
n= 100 células por contaje
Los mayores porcentajes de mortalidad correspondían a los PAMAM tanto formando complejo con los ODN como solos. Los CBS no mostraron un porcentaje aumentado de células positivas para TB respecto al control de células sin tratar, no apreciándose apenas diferencias cuando las células eran tratadas con CBS-ODN o con CBS sólo.
- Ensayo de citometría de flujo
Se compararon los porcentajes de células con tamaño y complejidad correspondientes a células en apoptosis-necrosis con las células vivas. Para ello, se realizó una evaluación del tamaño (FW) y de la complejidad (SD) por citometría de flujo. Para ello, se dibujó una región alrededor de las células con FW y SD correspondiente a células en apoptosis-necrosis y otra alrededor de las células con FW y
SD correspondiente a células vivas. Se compararon los porcentajes de células presentes en cada puerta. Los gráficos obtenidos se muestran en la Figura 15, en la que en el eje X está representado el tamaño (FW) y en el eje Y la complejidad (SD).
En la parte A se muestra una población celular tipo CMSP tratada con los dendrímeros CBS y en la parte B una población tratada con un dendrímero tipo PAMAM. La nube de células oscuras corresponde a células en apoptosis necrosis. En gris se representan las células vivas. Se obtuvieron los porcentajes numéricos correspondientes a cada uno de los tipos de células, obteniéndose los valores que se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7.- Porcentajes de células vivas y en apoptosis-necrosis
Figure imgf000087_0001
Estos resultados se representan gráficamente la Figura 14, donde se representa en negro el porcentaje de células muertas y en gris el de vivas. La primera barra (C), corresponde al control. Los mayores porcentajes de mortalidad correspondían a los PAMAM tanto formando complejo con los ODN como solos. Por otra parte, los dendrímeros CBS no mostraron un porcentaje mayor de apoptosis-necrosis respecto al control de células sin tratar, no apreciándose de nuevo apenas diferencias cuando las células eran tratadas con CBS-ODN o con CBS sólo.
- Tinciones con DAPI
Como test adicional para comprobar la viabilidad celular, se utilizó la tinción con el colorante vital DAPI (Vysys®), utilizando 10 μl por pocilio durante 10 minutos y lavando posteriormente 2 veces con PBS. Los núcleos celulares en apoptosis o necrosis muestran un tamaño nuclear reducido, condensación de la cromatina y fragmentación nuclear. La Figura 17 muestra los resultados obtenidos con las siguientes muestras: 1: Control; 2: 0DN+IM8; 3:ODN+IM16; 4:ODN+SF; 5: ODN; 6: IM8; 7: IM16; 8: SF
Las células tratadas bien con los complejos CBS-ODN, bien con CBS solamente, mostraron núcleos redondos con cromatina distribuida de forma homogénea, con aspecto similar al del control de células no tratadas. Los pocilios tratados con SF (4 y 8) mostraron una depleción celular marcada, haciendo difícil el análisis
- Vídeos
La evidencia más clara de que una célula está viva es que se mueve. Las células vivas muestran protusiones celulares transitorias moviéndose sobre una superficie de cristal sembrada con fibronectina. Las células tratadas con CBS mostraron un patrón de movimiento similar a las células control no tratadas.
Como ejemplo, en la Figura 18 se muestra una secuencia de fotos tomadas a las 72 horas de incubación de las células con CBS IM8-0DN. Se resaltan con flechas algunos detalles de movimiento.
En conclusión, las concentraciones de uso de los dendrímeros en la formación de complejo demostraron ser bastante biocompatibles, mostrando las células similar viabilidad cuando eran tratadas con complejos CBS-ODN que cuando lo eran con CBS solos.
Capacidad antigénica
Es muy importante, cuando se quiere conocer el perfil de biocompatibilidad de una nueva molécula, el saber si la misma puede constituir un estímulo antigénico inespecífϊco. Esto sería un inconveniente, por cuanto las células del Sistema Inmune podrían reconocer a dicha molécula como un elemento extraño contra el cual se desencadenaría una respuesta que muy probablemente resultaría deletérea para el organismo. Por ello, se realizó un estudio de proliferación linfocitaria en presencia de los distintos CBS, con el fin de comparar la capacidad de estimulación linfocitaria que tendrán los mismos en comparación con un estímulo potente clásico como es la Fitohemaglutinina (PHA). Ei'emplo 41. Ensayo proliferativo
Para evaluar la capacidad antigénica de los dendrímeros CBS, se realizó un ensayo linfoproliferativo. El experimento se preparó por triplicado en placa de 96 pocilios de fondo plano (100.000 células por pocilio en 200 μl de medio completo AB humano con antibióticos, glutamina y 10% de suero AB). El experimento contaba con un pocilio control negativo de proliferación (células sin tratar), un pocilio tratado con una dosis de uso habitual (2 μM) de cada dendrímero a ensayar, otro con una dosis mayor rayando en la citotoxicidad (5 μM) y otro control positivo de proliferación tratado con 1 μg/mL de fitohemaglutinina. Tras 5 días de incubación a a 37 0C con atmósfera al 5% de CO2 se procedió a la retirada de 100 μl de sobrenadante, añadiéndose luego 100 μL de un medio con un intercalante isotópico de ADN, Timidina Tritiada (preparada con medio AB al 10% y Timidina 1/100). La placa se filtró entonces utilizando un Harvester pasando su contenido a un filtro, el cual se dejó secar toda la noche (aprox. 16 horas). Tras este periodo, se procedió a la fusión por calor de una lámina de Metilex ® conteniendo medio de centelleo, y se procedió a su lectura en gammacámara para evaluación del número de cuentas (a más cuentas, más proliferación). Los resultados, que se muestran a continuación en la Tabla 8, se expresan como cuentas de timidina tritiada por minuto (cpm). Cada resultado de cada concentración se hizo por triplicado, siendo el valor que aparece en la tabla la media de los 3. La PHA y el control se ensayaron 12 veces.
Tabla 8. Lectura del número de cuentas en un ensayo linfoproliferativo
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En la Figura 19 puede observarse una representación gráfica de estos datos. Como se puede extraer de este ensayo, los dendrímeros CBS no constituyeron un estimula antigénico para las CMSP, a ninguna de las concentraciones ensayadas.
Ensayos de transfección Se evaluó la capacidad del ODN para atravesar las membranas plasmática y nuclear de las CMSP y se comparó dicha capacidad con la que presentaba dicho ODN formando complejo con los distintos CBS. Se compararon los dendrímeros de la invención con los de tipo PAMAM, utilizando microscopía confocal.
Ejemplo 42. Ensayos de transfección
- Obtención de células CMSP e incubación con las muestras
Se utilizó el mismo procedimiento explicado en ejemplos anteriores.
- Tratamiento previo de las células Dos días antes del tratamiento con los ODN o, con los dendriplejos, las CMSP fueron estimuladas con fitohemaglutinina a dosis entre 1-2 μg/ml y con interleuquina-2 (IL-2) a dosis de 100 Ul/ml, siendo la concentración celular entre 3 y 5 millones /mi. En el día del tratamiento, las células fueron resuspendidas a una concentración de entre 300.000-500.000 células por cada 340 μl. Sin embargo, y dado que el volumen final tras los respectivos tratamientos posteriores fue de 500 μl, se añadió IL-2 para mantener la activación celular durante el transcurso del experimento a una dosis de 50 Ul/ml calculadas en base a los 500 μl que constituirían el volumen final.
- Microscopía confocal Se siguió el procedimiento descrito anteriormente en otros Ejemplos.
- Resultados obtenidos con los ODN
Se realizaron pruebas con cada uno de los ODN de las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO:5. Los ODN mostraron, por contra de lo publicado previamente, una sorprendente capacidad para atravesar la membrana plasmática, así como, la nuclear.
Este proceso es dependiente del tiempo. Así, a las 3 horas, el ODN se encontraba en el citoplasma celular, y a las 24 horas en el núcleo. Un ejemplo de ello puede observarse en la Figura 20, donde se pueden observar fotografías tomadas tras 1, 3 o 24 horas desde el comienzo de la transfección con el ODN RF.
El patrón de fluorescencia era difuso, sin formación de agregados.
La localización nuclear queda aún más clara cuando se realiza un corte en XY de una célula seleccionada en un corte medio y se analiza la fluorescencia presente. Una prueba de este tipo puede observarse en la Figura 21. Cuando se analiza la fluorescencia presente a lo largo de una línea en un plano intermedio (Figura 21 A), la fluorescencia azul representada en la gráfica superior (núcleo) y la fluorescencia verde representada en la gráfica intermedia (ODN) colocalizan por dentro de la señal roja representada en la gráfica inferior (membrana). Cuando se realiza un análisis similar pero tomando una región de interés (ROI) (Figura 21 B) dibujada alrededor del núcleo a lo largo de varias secciones en el eje Z, se ve como el verde (gráfica inferior) colocaliza con el azul
(gráfica superior) y está presente más allá en el citoplasma hasta llegar a la membrana.
Los resultados fueron los mismos independientemente de la longitud de los ODN probados (de 15 a 28 bases).
- Resultados obtenidos con dendripejos ODN+CBS
Se realizaron pruebas de transfección utilizando el ODN PPT para formar dendriplejos con distintos dendrímeros de la invención. Concretamente, se utilizaron para transfectar las siguientes muestras: 1: Control; 2: PPT; 3: PPT+IM8; 4: PPT+NN; 5: PPT+Phe; PPT+FM16.
Los resultados obtenidos tras 48 horas se muestran en la Figura 22.
Todos los dendrímeros menos el C1NH4 conseguían un patrón similar al del
ODN sin CBS, es decir, difuso, nuclear y citoplasmático. Alguno de los complejos consiguieron unos resultados superiores en unidades arbitrarias de fluorescencia que el
ODN sin CBS (los que llevaban el NN y el Phe) en algunos de los experimentos realizados, pero esto no se repitió con significación estadística en diferentes experimentos con repeticiones de hasta 7 series comparativas entre complejos y ODN solo. La muestra de PPT con C1NH4, en cambio, dio lugar al patrón de fluorescencia en agregados que se muestra en la Figura 23.
Para demostrar que efectivamente se trata de un patrón de fluorescencia citoplasmático y nuclear, se realizaron histogramas de una sola célula en un plano medio en XY, de forma similar a lo realizado con el ODN sin CBS. En la Figura 23 se muestra, como ejemplo, uno de los análisis sobre una célula tratada con el PPT+NN:
A partir de estos datos, se puede concluir que los dendrímeros CBS, a excepción del C1NH4, no interfieren de forma alguna con la distribución del ODN en la célula.
Inhibición de virus u otros agentes biológicos por parte de los dendrímeros
Por la biocompatibilidad demostrada en los experimentos anteriores, los dendrímeros de la invención serían adecuados para la elaboración de composiciones de medicamentos (parenterales u orales) o dispositivos de interferencia (geles vaginales, antisépticos) para la prevención y/o el tratamiento de agentes biológicos tales como el virus VIH u otros virus como el de la hepatitis C o de otros agentes biológicos tales como priones. Con ese objetivo, se diseñaron ensayos de inhibición del virus VIH en los que se estudiaba esta capacidad.
Ejemplo 43: Ensayos de inhibición del VIH - Preparación de virus
Se utilizaron células MT-2 (linfocitos T humanos inmortalizados con virus linfocitotrópico humano tipo I). 2OxIO6 MT-2 se lavaron dos veces con medio RPMI 1640 suplementado con 10% STF y se transfirieron a tubos cónicos de 25 mi a una concentración de 2x106 células/ml en medio RPMI con 10% de STF. Posteriormente se añadió la cepa de virus VIHNL4.3 a una concentración de 1 partícula por célula (1 MOI). Se cultivaron las MT-2 y el virus durante al menos 2 horas a 37 0C, agitando el cultivo cada 15-30 minutos. Finalmente, se lavaron los cultivos (células-virus) dos veces para retirar el virus que no se hubiera integrado en el genoma celular. Las células se transfirieron y se cultivaron en botellas de 25 cm en el mismo medio de cultivo.
Cada 72-96 horas se recogió la mitad del sobrenadante con cuidado de no recoger también células. Se añaden 4OxIO6 MT-2 a la misma concentración en medio RPMI con 10% STF. El sobrenadante se alicuoteó y se almacenó en nitrógeno líquido, y posteriormente se tituló. - Titulación de virus
El aislado viral VIHNL4.3, cepa viral de laboratorio establecida, se tituló en la línea celular MT-2. Se cultivaron 2x104 células MT-2 con medio completo en placas de
96 pocilios y se afiadiron 40 μl de la preparación viral a distintas concentraciones para lo que se realizan las correspondientes diluciones. Todas ellas se pusieron por octuplicado y se mantuvieron a 37° C en atmósfera de CO2 durante una semana.
Transcurrido este tiempo, se procedió a la lectura de titulación por visualización del efecto citopático y formación de sincitios. El título se calculó aplicando la fórmula de
Spearman-Karber I30], que sirve para cuantifícar el número de partículas de virus por mi de medio en un cultivo en el cual se han sembrado por octuplicado diluciones seriadas del concentrado de virus a titular.
- Infección in vitro de linfocitos T
Las CMSP se estimularon durante 48 horas con 2 μg/ml de PHA y 100 UI de IL- 2, para provocar una activación policlonal; a las 24 horas se lavaron las células con
PBS. La concentración deseada de células se incubó con el número de partículas de
VIHNL4.3 por célula calculado en medio RPMI con 10% STF durante 4 horas a 37 0C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2 . Tras este tiempo se recogieron las células del cultivo y se lavaron tres veces para eliminar el virus adherido a la superficie celular, se depositaron de nuevo en placa de 24 pocilios en medio RPMI con 10% STF y
50 Ul/ml de IL2 y se tratan con los diferentes dendrímeros. Los cultivos se incubaron a
37 0C y se mantuvieron en atmósfera humidificada con un 5% de CO2.
- Inhibición del VIH mediante CBS Se sembraron 400.000 CMSP/pocillo de placa de 24 y se trataron con 1, 3 y 5 μM de NN, en un caso antes de infectarlas y en otro después de infectarlas a una multiplicidad de infección de 0,4 MOL Se recogieron células a las 24 hs para extracción de ADN y posterior cuantificación de copias de virus por célula (siguiendo el método para detección y cuantificación de ADN de VIH en células infectadas registrado con el n° de patente 2401986 de la Oficina Nacional de Patentes).
Para eliminar la influencia de Ia posible toxicidad del dendrímero sobre el número de células y la cantidad de copias virales, se ajustó el número de copias de virus al porcentaje de células vivas para poder hacer comparaciones entre distintas concentraciones de dendrímeros. No obstante, los dendrímeros no indujeron una mortalidad significativa a las concentraciones utilizadas (cuantifícado por FW y SD en citometría de flujo). Se hizo por tanto el siguiente ajuste: n° de copias ADN VIH / 106 de células por
% células vivas, obteniéndose la siguiente gráfica que se muestra en la Figura 25, en la que los prefijos pre o post hacen referencia a la administración de 1, 3 ó 5 μM de NN antes o después de la infección y la barra marcada como "C" corresponde al control.
Los resultados obtenidos indican que el dendrímero ejerce un claro impedimento en la infección de las CMSP por VIH, tanto aplicado previamente a la infección como después. Por tanto, debe actuar tanto sobre los pasos preintegración como los postintegración.
Conclusiones de los experimentos de los Ejemplos 31 a 43
- Los dendrímeros CBS ensayados presentan una buena biocompatibilidad para las CMSP a las dosis utilizadas para vehiculizar ODN.
- Cuando se toman en conjunto los datos de toxicidad sobre linfocitos y hematíes, el dendrímero que resulta tener un mejor perfil de biocompatibilidad es el CBS-NN.
- Los CBS NN, IM8 e IM 16 liberan el ODN a lo largo del tiempo, habiendo liberado prácticamente el 100% del ODN las 24 horas. Estos dendrímeros liberan también el ODN a pHs ácidos (<5).
- Los ODN ensayados muestran una capacidad elevada de entrada en la célula por sí mismos, atravesando tanto la membrana plasmática como la nuclear en casi el
100% de las células vivas a las 17 horas de haberse añadido al cultivo celular, en presencia de un 10% de STF.
- Todos los dendriplejos CBS-ODN ensayados (a excepción del C1NH4) no interfieren con la internalización del ODN y su distribución citoplasmática y nuclear. - El CBS NN protege al ODN de la unión a proteínas del plasma, no interfiriendo esta protección con la posterior liberación paulatina del ODN a lo largo del tiempo en medio acuoso en presencia de dichas proteínas. Por esta razón y las anteriores, los dendrímeros de la invención parecen adecuados para su utilización en terapias antisentido para la inhibición de síntesis de proteínas cuyo nivel convenga en general disminuir, por estar implicadas en algún trastorno, ser de tipo tumoral, viral o estar implicadas de cualquier otra forma en distintas enfermedades humanas o animales. - El dendrímero NN muestra una buena capacidad de impedir la infección de linfocitos por el virus VIH lo que, junto con la buena biocompatiblidad demostrada, indica que pueda utilizarse para la prevención y/o el tratamiento de trastornos producidos por agentes biológicos tales como el mismo VIH u otros virus como el de la hepatitis C, incluso otros agentes biológicos tales como los priones. - Los CBS Phe y C1NH4 muestran una buena capacidad para fijar de forma eficiente y perdurable los ácidos nucleicos, por lo que pueden ser adecuados para la generación de microchips de ARN o ADN u otros dispositivos que requieran la fijación a una superficie de ácidos nucleicos ya que, además, por la forma de fijación del ADN (electrostática con los grupos fosfato del ADN), los CBS aquí descritos dejan la secuencia nucleotídica expuesta a la interacción con secuencias complementarias de otros ácidos nucleicos.
Síntesis de nuevos dendrímeros Para aumentar la versatilidad de los dendrímeros carbosilano de la invención, se procedió a sintetizar dendrímeros adicionales a aquellos cuya síntesis está descrita en los Ejemplos 1 a 30, tanto variando el compuesto de partida utilizado para dar lugar al resto terminal de las ramificaciones (Ejemplos 44 a 47) como aumentando la concentración del reactivo de cuaternización en procesos de cuaternización de grupos amino de dendrímeros cuya síntesis había sido ya descrita en Ejemplos previos, de manera que se asegure la cuaternización no sólo de los grupos amino que puedan constituir como tales los extremos de los restos terminales sino de otros grupos amino que puedan estar contenidos en dichos restos terminales (Ejemplos 48 y 49). La síntesis de estos dendrímeros se describe a continuación: Ejemplos 44 a 47.-
Ejemplo 44.- Síntesis de IG-FSJf CH^)2CnH3(OMe)(Of CH2I2NMe7)I4. (31)
Para la síntesis de este dendrímero y del dendrímero 32, descrito en el Ejemplo siguiente, se utilizó 4-alil-2-metoxi-l-(N,N-dimetilamino) benceno ((CH2=CH- CH2)C6Hs(OMe)(O(CHa)2NMe2)), compuesto no comercial que fue necesario sintetizar previamente a la correspondiente reacción de hidrosililación.
- Síntesis de (CH2=CH-CH7)C^ fOMe){OfCH?)?NMe?} A una disolución de 4-Alil-2-Metoxifenol (8,Og, 48,7 mmol) en acetona se le añadió 1 equivalente de ClCH2CH2NMe2H+Cl" (7,02 g, 48,7 mmol), 4 equivalentes de K2CO3 (26,93 g, 195 mmol) y éter corona 18-Corona-6 (2,57 g, 9,74 mmol). La reacción se mantuvo a reflujo durante 48 h. Tras la eliminación del disolvente a vacío se realizó una extracción en CH2C12/H2O (2 x 50 mi). La fase orgánica se secó con MgSO4 durante 2 h. Posteriormente se filtró y se eliminó el disolvente a vacío, obteniéndose un aceite amarillo pálido que se lavó con hexano (2 x 10 mi) para eliminar el éter corona 18-Corona-6. Así se obtuvo el compuesto como un aceite amarillo pálido (5,49 g, 48%). RMN-1H (CDCl3): δ 6,79 (d, IH, C6H3), 6,68 (m, 2H, C6H3), 5,92 (t, IH, CH=CH2-CH2-Ph), 5,02 (m, 2H, CH=CH2-CH2-Ph), 4,07 (t, 2H, Ph-O-CH2-CH2- NMe2), 3,81 ( s, 3H, CH3O), 2,52 (m, 2H, Si-CH2-CH2-CH2-Ph), 2,74 (t, 2H, Ph-O- CH2-CH2-NMe3), 2,31 (s, 6H, NMe2). RMN-13C(1H) (CDCl3): δ 149,51 (Cipso unido a -O(CH2)2NMe2), 146,55 (Cipso unido a -OMe), 137,59 (Cipso unido a - CH2), 133,17 (CH=CH2-CH2-Ph)5 120,37, 113,76, 112,26 (C6H3), 115,58 (CH=CH2-CH2-Ph), 67,39 (Ph-O-CH2-CH2-NMe2), 58,12 (Ph-O-CH2-CH2-NMe2), 55,78 (CH3O), 45,94 (NMe2), 39,76 (Si-CH2-CH2-CH2-Ph).
- Síntesis del dendrímero 31
A una disolución del dendrímero IG-H4 (0,50 g, 1,16 mmol) en la mínima cantidad de THF (3 mi) se le añadió (CH2=CH- CH2) C6H3 (OMe) {O(CH2)2NMe2} (0,9 gr, 4,64 mmol) y una gota del catalizador de Karstedt (3-3,5% Pt). La mezcla de reacción se calentó a 45 0C en una ampolla de vacío durante 12h. La disolución obtenida se llevó a sequedad por eliminación del disolvente a vacío, dando lugar al compuesto 31 como un aceite amarillo (1,60 gr, 100%). RMN-1H (CDCl3): δ 6,80 (d, IH, C6H3), 6,65 (m, 2H, C6H3), 4,07 (t, 2H, Ph-O-
CJJ2-CH2-NMe2), 3,81 ( s; 3H, CH3O), 2,74 (t, 2H, Ph-O-CH2-CH3-NMe2), 2,52 (m,
2H, Si-CH2-CH2-CJJ2-Ph), 2,31 (s, 6H, NMe2), 1,55 (m ancho, 2H, Si-CH2-CH2-CH2-
Ph), 1,28 (m ancho, 2H, Si-CH2-CH2-CH2-Si), 0,53 (m, 6H, Si-CH2-CH2-CH2-Si), -0,07 (s, 6Η, SiMe2), RMN-13C(1H) (CDCl3): δ 149,40 (Cipso unido a -O(CH2)2NMe2),
146,29 (Cpso unido a -OMe), 136,03 (Cφso unido a - CH2), 120,24, 113,72, 112,30
(C6H3), 67,47 (Ph-O-CH2-CH2-NMe2), 58,22 (Ph-O-CH2-CH2-NMe2), 55,88 (CH3O),
46,00 (NMe2), 39,67 (Si-CH2-CH2-CH2-Ph), 26,26 (Si-CH2-CH2-CH2-Ph), 20,29, 18,56,
17,53 (Si(CH2J3Si), 15,41 (Si-CH2-CH2-CH2-Ph), -3,28 (SiMe2), 29Si(1H)-RMN (CDCl3): δ (G0-Si) no se observa, 1 ,60 (G1-Si).
- Ejemplo 45: Síntesis de 2G-rSifCH7)?QH3/OMe¥OÍCH^7NMe2)k(32) El dendrímero de segunda generación 32 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 31, partiendo del dendrímero 2G-Hg (0,32 g, 0,27 mmol), (CH2=CH-CH2)C6H3(OMe)(O(CH2)2NMe2}] (0.51 gr, 2.17 mmol), 3ml de THF y una gota del catalizador de Karstedt De esta forma se obtuvo 32 como un aceite marrón (0,38 g, 50%).
RMN-1H (CDCl3): δ 6,80 (d, 2H, C6H3), 6,66 (m, 4H, C6H3), 4,08 (t, 4H, Ph-O-
CH2-CH2-NMe2), 3,81 (s, 6H, CH3O), 2,74 (t, 4H, Ph-O-CH2-CH2-NMe2), 2,52 (m, 4Η, Si-CH2-CH2-CH2-Ph), 2,30 (s, 12Η, NMe2), 1,55 (m ancho, 4H, Si-CH2-CH2-CH2-Ph),
1,28 (m ancho, 6H, Si-CH2-CH2-CH2-Si), 0,53 (m ancho, 16H, -CH2 unidos a Si), -
0,072 (s, 12H, SiMe2), -0,01 (s, 3H, SiMe), RMN-13C(1H) (CDCl3): δ 149,37 (C]pso unido a -O(CH2)2NMe2), 146,29 (CφS0 unido a -OMe), 135,98 (Cipso unido a -CH2),
120,24, 113,69, 112,30 (C6H3), 67,44 (Ph-O-CH2-CH2-NMe2), 58,19 (Ph-O-CH2-CH2- NMe2), 55,86 (CH3O)5 45,98 (NMe2), 39,65 (Si-CH2-CH2-CH2-Ph), 26,23 (Si-CH2-
CH2-CH2-Ph), 20,13, 18,81, 18,60 (Si(CEb)3Si)5 15,38 (Si-CH2-CH2-CH2-Ph), -3,25
(SiMe2), -4,93 (SiMe)3 29Si(1H)-RMN (CDCl3): δ 0,1,00 (Gj-Si); 1,70 (G2-Si).
- Ejemplo 46: Síntesis de lG-rSi((CH;)7CήHj(OMe)ÍO(CH2)2NMe%r))l^(33) Sobre una disolución del dendrímero 31 (0,094 g, 0.068 mmol) en éter (3 mi) se añadieron 0,02 mi de una disolución 2M de MeI (0,27 mmol) en éter dietílico. La mezcla de reacción se mantuvo con agitación constante durante 48h a temperatura ambieníe, después, se llevó a sequedad para eliminar el exceso de MeI. El residuo resultante se lavó con Hexano (2 x 5 mi) y se secó a vacío para obtener el dendrímero 33 como un sólido de color blanco (0,10 g, 83%).
RMN-1H (DMSO): δ 6,94 (d, IH3 C6H3), 6,75 (m, 2H, C6H3), 4,34 (t, 2H, Ph-O- CZJ2-CH2-NMe2), 3 ,74 ( s, 3H, CH3O y t, 2H, Ph-O-CH2-CH2-NMe+ 3 solapada), 3 , 18 (s,
9H, NMe+ 3), 2,49 (m, 2H, Si-CH2-CH2-CH2-Ph, solapada con señal de DMSO), 1,51 (m ancho, 2Η, Si-CH2-CH2-CH2-Ph) 1,28 (m ancho, 2H5 Si-CH2-CiT2-CH2-Si)5 , 0,9 l(m,
2H, Si-CH2-CH2-CH2-Ph), 0,51 (m, 4H, Si-CH2-CH2-CH2-Si), -0,07 (s, 6Η, SiMe2),
RMN-13C(1H) (DMSO): δ 148,6 (Cipso unido a -O(CH2)2NMe2), 144,3 (Cipso unido a - OMe), 135,9 (Cipso unido a - CH2), 119,5, 114,2, 111,9 (C6H3), 63,6 (Ph-O-CH2-CH2-
NMe2), 62,6 (Ph-O-CH2-CH2-NMe2), 55,1 (CH3O), 52,7 (NMe+ 3), 39,0 (Si-CH2-CH2-
CH2-Ph, solapada con la señal de DMSO), 25,3 (Si-CH2-CH2-CH2-Ph), 19,1, 17,6, 16,4
(Si(CH2)3Si), 14,3 (Si-CH2-CH2-CH2-Ph), -3,7 (SiMe2).
- Ejemplo 47: Síntesis de 2G-rSi((CH?)?CήH1(OMe)(O(CH;)2NMe+ 3r)Η« Í34)
El dendrímero de segunda generación 34 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 33, partiendo de 32 (0,38 g, 0,13 rπmol) y 0,07 mi de una disolución 2M en éter de MeI (1,04 mmol). De esta forma se obtuvo el compuesto 34 como un sólido de color blanco (0,45 g, 85%). RMN-1H (DMSO): δ 6,94 (d, 2H, C6H3), 6,75 (m, 4H, C6H3), 4,33 (t, 4H, Ph-O-
CH2-CH2-NMe2), 3,74 ( s, 6H, CH3O y t, 4H, Ph-O-CH2-CH2-NMe+ 3 solapada), 3,18 (s, 18Η, NMe+ 3), 3,18 (m, 4H, Si-CH2-CH2-CH2-Ph, solapada con señal de DMSO), 1,50 (m ancho, 4Η, Si-CH2-CH2-CH2-Ph) 1,29 (m ancho, 6H, Si-CH2-CH2-CH2-Si), 0,50 (m, 16H, CH2Si), -0,09 (s, 12Η, SiMe2), -0,11 (s, 3H, SiMe), 13Ci1H)-RMN(DMSO): δ 148,6 (Cipso unido a -O(CH2)2NMe2), 144,3 (Cipso unido a -OMe), 135,9 (Cφso unido a - CH2), 119,5, 114,3, 111,9 (C6H3), 63,6 (Ph-O-CH2-CH2-NMe2), 62,6 (Ph-O-CH2-CH2- NMe2), 55,1 (CH3O), 52,7 (NMe+ 3), 39,0 (Si-CH2-CH2-CH2-Ph5 solapada con la señal de DMSO), 25,3 (Si-CH2-CH2-CH2-Ph), 19,0, 17,7, 17,6 (Si(CH2)3Si), 14,3 (Si-CH2- CH2-CH2-Ph), -3,8 (SiMe2), -5,4 (SiMe). Eiemplos 48 y 49
- Ejemplo
Figure imgf000099_0001
El dendrímero 35, que presenta todos los átomos de nitrógeno de su estructura cuatemizados, se preparó a partir del dendrímero de primera generación 25 (0,24 g, 0,24 mmol) y 1 ,2 mi de MeI (2,4 mmol) en éter dietílico como disolvente. De esta forma se obtuvo el dendrímero 35 como un sólido de color blanco insoluble en éter dietílico (0,49 g, 95%).
RMN-1H (DMSO-d6): δ 4,00 (2H, t, CH2O), 3,93 (4H, m, CH2N(Me)2 +), 3,53
(2H, t, CH2N(Me)3 +), 3,18 (15Η, sancho, N(Me)2 + y N(Me)3 +), 1,31 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,70 (2H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,55 (2Η, m,
SiCH2CH2CH2SiO), 0,13 (6H, s, OSiMe2). RMN-13C(1HJ (DMSO-d6): δ 64,9 (CH2O),
56,3, 55,9, 55,6 (CH2N(Me)2 + y CH2N(Me)3 +), 52,5 (NMe3 +), 50,9 (NMe2 +), 21,2
(SiCH2CH2CH2SiO), 17,8 (SiCH2CH2CH2SiO), 17,2 (SiCH2CH2CH2SiO), -2,6
(OSiMe2). Análisis elemental de C52H128N8O4Si5I8. Cale. %: C, 39,59; H, 8,18; N, 7,10. Exp. %: C, 38,65; H, 7,98; N, 6,94.
- Ejemplo 49: Síntesis de 2G4SiíOÍCH2)2N+ÍMeMCH?;)2NMe2 +2r% (36)
El dendrímero de segunda generación 36 se preparó siguiendo un procedimiento similar al descrito para 35, partiendo de 26 (0,11 g, 0,04 mmol) y 0,06 mi de MeI (0,91 mmol). De esta forma se obtuvo el compuesto 36 como un sólido de color blanco (0,18 g, 86%).
RMN-1H (DMSO-ífe): δ 4500 (4H5 t, CH2O), 3,93 (8Η, m, CH2N(Me)2 +), 3,59
(4Η, t, CH2N(Me)3 +), 3,21 (30Η, Sailcho, N(Me)2 + y N(Me)3 +), 1,35 (6H, m5
SiCH2CH2CH2SiO y SiCH2CH2CH2Si ), 0,72 (4H, m, SiCH2CH2CH2SiO), 0,56 (8Η, m, SiCH2), 0,13 (12Η, s, OSiMe2), -0,07 (3H, s, SiMe). RMN-13C(1Hi (DMSO-ífe): δ 64,7
(CH2O), 56,3, 56,0, 55,7 (CH2N(Me)2 + y CH2N(Me)3 +), 52,6 (NMe3 +), 50,9 (NMe2 +),
21,2-17,2 (grupos -CH2- del esqueleto carbosilano), -2,5 (OSiMe2), -5,5 (SiMe).
Análisis elemental de C128H316N16O8Si13I16. Cale. %: C, 33,40; H, 6,92; N, 4,87. Exp.
%: C, 32,90; H, 6,75; N, 4,57. Este dendrímero, que se utiliza en ensayos descritos en los Ejemplos siguientes, recibió la denominación abreviada NN 16, denominación por la cual se aludirá a él en lo sucesivo. Su fórmula estructural, peso molecular (Pm) y número de cargas positivas son los que se muestran a continuación:
NN16:
2G-[SiO(CH2)2N+(Me)2(CH2)2NMe3 +2r]8 (36) Pm = 4603,56 g/mol 16 cargas positivas
Figure imgf000100_0001
Ensayos de unión de dendrímeros a fármacos
Con el fin de comprobar la utilidad de los dendrímeros de la invención como transportadores de fármacos que presentan carga negativa a pH fisiológico, se procedió a realizar ensayos en los que se comprobó, en primer lugar, si distintos dendrímeros de la invención eran capaces de formar complejos con diversos fármacos y, posteriormente, se verificó si la unión era reversible, comprobando si la variación del pH del medio da lugar a la disociación del complejo dendrímero-fármaco. Con ello se pretendió emular lo que se sucedería en condiciones fisiológicas comprobando, por una parte, que los dendrímeros son capaces de formar con los fármacos complejos que los protejan de la interacción con proteínas del plasma o de las membranas celulares durante su transporte por la sangre; por otra parte, con los ensayos de disociación con el cambio de pH, se intentó reproducir las condiciones que encontraría el complejo dendrímero-fármaco en el interior de la célula, en la cual se supone que el complejo dendrímero-fármaco penetra o puede penetrar mediante un endosoma cuyo interior, una vez en el citoplasma, se acidifica por acción de bombas de transporte de H+ tipo ATPasas, ambiente en el que el dendrímero debería captar parte del exceso de protones y liberar la molécula transportada, lo que permitiría que la misma ejerciera su acción.
Ensayos de determinación de unión dendrímero-fármaco
Los dendrímeros elegidos para realizar los ensayos fueron:
- NN (2G-[Si(O(CH2)2N(Me)(CH2)2NMe3 +r)]8 (26))
- NNl 6 (2G-[Si(O(CH2)2N+(Me)2(CΗ2)2NMe3 +2r)]s (36)) - IMl 6 (2G-[Si(OCH2CH2NMe 3 Y)2Je (19)
Los fármacos elegidos para realizar los ensayos, todos ellos con al menos una carga negativa a pH fisiológico, fueron:
- Metotrexato (sal sódica):
1 carga (-) Laboratorio suministrador: Almirall
Presentación: disolución 25 mg/ml Excipientes: NaCl, NaOH, HCl, H2O bidestilada
- Heparina (sal sódica)
Varias cargas (-) Laboratorio suministrador: Rovi
Presentación: disolución 10 mg/ml (1000 U)
Excipientes: p-oxibenzoato de metilo, p-oxibenzoato de propilo, NaCl, H2O bidestilada
- Insulina (insulina humana recombinante) 4 cargas (-)
Laboratorio suministrador: Novo Nordisk
Nombre comercial producto: Actrapid
Presentación: disolución 3,5 mg/ml (100 U)
Excipientes: ZnCl2, HCl, NaOH, H2O bidestilada La determinación de la unión y formación de complejos entre el dendrímero y el fármaco se realizó por evaluación del retraso en gel de poliacrilamida del dendrímero unido al fármaco respecto al dendrímero libre: - Formación del complejo: Se realiza en un volumen final de la mezcla de 30μl, que es el volumen máximo para cargar en el gel. Para ello, se parte de la cantidad necesaria de dendrímero que proporcione una banda perfectamente identificable por tinción con nitrato de plata en el gel una vez realizada la electroforesis: 20 μl de una disolución 100 μM, que corresponden a 1,2x10 moléculas. En los 10 μl restantes se añade el fármaco a diferentes concentraciones para obtener las relaciones de cargas (+) y (-) elegidas, determinando también la cantidad de moléculas de fármaco presentes en la mezcla. Se realiza una incubación de dichas mezclas a 370C durante 1 hora para que dé tiempo a formarse el complejo más estable termodinámicamente, aunque sea el que necesite más tiempo para su formación. Cada complejo se realiza por duplicado.
- Electroforesis y tinción del gel: Los geles utilizados fueron de poliacrilamida/bis-acrilamida al 7,5%, preparados con Tris 1,5M pH 8,8. Cada electroforesis se realizó a 90 voltios durante 4 horas, tras lo cual el gel se tiñó con nitrato de plata y se fotografió. Para cada ensayo referente a la formación de complejos entre un determinado dendrímero y un fármaco en concreto, se realizó una electroforesis previa en un gel en el que se cargó el dendrímero solo, a diferentes concentraciones, para comprobar su estado, poniendo por duplicado cada una de las concentraciones, tras lo cual se realizó otra electroforesis en otro gel en el que se cargaron los complejos dendrímero-fármaco previamente incubados, cargando también en un par de pocilios los controles de mezclas de incubación en las que se había añadido dendrímero pero no fármaco, para poder verificar la existencia de retraso en las bandas obtenidas en las calles correspondientes a las mezclas de dendrímero y fármaco.
Los resultados obtenidos con cada uno de los dendrímeros y los fármacos ensayados se describen en los Ejemplos 50 a 52.
- Ejemplo 50; Ensayos de unión de fármacos al dendrímero NN
El dendrímero NN se disolvió en H2O destilada a una concentración inicial de
576 μM y, a partir de ésta, se realizaron diluciones para obtener concentraciones de 100 μM, 10 μM y 1 μM. La electroforesis previa realizada con alícuotas de las disoluciones correspondientes a cada una de estas concentraciones demostraron que el dendrímero estaba en todas ellas en buen estado. Se eligió la concentración de 100 μM como concentración que permitía visualizar el dendrímero en el gel tras la tinción y detectar posibles retrasos de la banda obtenida al ser sometido a electroforesis no en forma libre, sino formando complejos con un fármaco.
A continuación se procedió a realizar los ensayos de unión con los distintos fármacos, de la siguiente manera: a) Metotrexato
Como se ha comentado, el metotrexato utilizado en este ensayo se presente en forma de disolucióna cuosa a 25 mg/ml, con un peso molecular Pm=476,427 g/mol y 1 carga(-) por molécula. Se prepararon e incubaron mezclas dendrímero-metotrexato que respondían a las características que se muestran a continuación en la Tabla 9:
Tabla 9.- Características de las mezclas dendrímero NN-metotrexato
MEZCLA
1 2 3 4
Relación cargas
1+/1- 2+/1- 4+/1- 8+/1- Dendrimero/Fármaco
Relación moléculas
1/8 1/4 1/2 1/1 Dendrimero/Fármaco
Moléculas totales Dendrímero 1,2x1015 1,2x1015 l,2xlθ15 1,2x1015 Fármaco 8xlO!5 4x1015 2x1015 IxIO15
Los resultados de someter a electroforesis estas mezclas, así como el control de dendrímero sin fármaco, se muestran en la Fig. 26b, marcada como "NN+Met". En ella puede observarse como se producen retrasos del dendrímero unido frente al libre en todas las relaciones de complejos. Por tanto se puede decir que se forma complejo NN- Metotrexato. El retraso no es mayor cuando se ponen más moléculas de fármaco (1), y menor en el que hay menos (4), sino al contrarío. Esto puede deberse a que la accesibilidad a las cargas (+) del dendrímero por parte de las moléculas de metotrexato no es libre, es decir, no pueden estar ocupadas todas las cargas (+) por moléculas de metotrexato a la vez ya que se pueden interferir entre ellas estéricamente, de modo que en presencia de un alto número de moléculas de metotrexato en el medio, estas compiten entre ellas por unirse a las cargas (+), de modo que no se estabilizan las uniones y el resultado es un complejo en el que hay unidas menos moléculas de fármaco que las previstas teóricamente por unidad de tiempo. Se forma un equilibrio dinámico. X. b) Heparina
La heparina utilizada en el ensayo se presenta en disolución acuosa, a 10 mg/ml (1000 U). Al no disponer de su peso molecular, ni del número de cargas negativas, aunque se sabe que son varias, la unión con el dendrímero se realizó por unidades de heparina. Así, se prepararon e incubaron mezclas dendrímero-heparina que respondían a las características que se muestran a continuación en la Tabla 10.
Tabla 10.- Composición de las mezclas dendrímero NN-heparina
Figure imgf000104_0001
Los resultados de someter a electroforesis estas mezclas, así como el control de dendrímero sin fármaco, se muestran en la Fig. 26c, marcada como "NN+Hep". Tal como se puede observar en dicha Figura, se produce retrasos del dendrímero incubado con heparina frente al control en todas las relaciones dendrímero/fármaco; de hecho, el dendrímero sólo migra un poco cuando está unido a 0,1 U de heparina. Por tanto, se puede decir que se forma complejo NN-Heparina.
c) Insulina
La insulina utilizada en el ensayo se presenta en disolución acuosa, a una concentración de 3,5 mg/ml (100 U). A pesar de disponer de su peso molecular (5825 g/mol) y de establecer una media de 4 cargas (-), la unión con el dendrímero se diseñó calculándola por unidades de insulina, pensando que puede ser útil de cara a comparar los resultados con las dosis de insulina libre utilizadas en clínica. Así, se prepararon e incubaron mezclas dendrímero-insulina que respondían a las características que se muestran a continuación en la Tabla 11. Tabla 11.- Características de las mezclas dendrímero NN-insulina
MEZCLA
1 2 3 4
Unidades de insulina I U O5S U 0,1 U 0,05 U
Relación cargas
8+/12- 8+/6- 32+/4- 80+/4- Dendrimero/Fármaco
Relación moléculas
1/3 1/1,5 4/1 10/1 Dendrimero/Fármaco
Moléculas totales Dendrímero L2xlO15 l,2xlθ15 l,2xlθ15 1,2x1015 Fármaco 3,6xlO15 1,8x1015 OJxIO15 O5IxIO13
Los resultados de someter a electroforesis estas mezclas, así como el control de dendrímero sin fármaco, se muestran en la Fig. 26d, marcada como "NN+Ins". En ella puede observarse que se producen retrasos del dendrímero incubado con insulina frente al control en todas las relaciones dendrímero/fármaco; de hecho, el dendrímero sólo migra un poco cuando está unido a 0,1 U o a 0,05 U de insulina. Por tanto, se puede decir que se forma complejo NN-insulína.
- Ejemplo 51 : Ensayos de unión de fármacos al dendrímero NNl 6
El dendrímero NN 16 se disolvió en H2O destilada a una concentración inicial de 434 μM y, a partir de ésta, se realizaron diluciones para obtener concentraciones de 100 μM, 10 μM y 1 μM. La electroforesis previa realizada con alícuotas de las disoluciones correspondientes a cada una de estas concentraciones, a la cual corresponde el gel mostrado en la Fig. 27a, demostró que el dendrímero estaba en todas ellas en buen estado y que la concentración de 100 μM era adecuada para visualizar fácilmente el dendrímero en el gel tras la tinción y para detectar posibles retrasos de la banda obtenida al ser sometido el dendrímero a electroforesis no en forma libre, sino formando complejos con un fármaco A continuación se procedió a realizar los ensayos de unión con los distintos fármacos, de la siguiente manera: a) Metotrexato
Como se ha comentado, el metotrexato utilizado en este ensayo se presente en forma de disolución acuosa a 25 mg/ml, con un peso molecular Pm=476,427 g/mol y 1 carga(-) por molécula. Se prepararon e incubaron mezclas dendrímero-metotrexato que respondían a las características que se muestran a continuación en la Tabla 12: Tabla 12.- Características de las mezclas dendrímero NN16-metotrexato
MEZCLA
1 2 3 4
Relación cargas
1+/1- 2+/1- 4+/1- 8+/1- Dendrimero/Fármaco
Relación moléculas
1/16 1/8 1/4 1/2 D endrímero/Fármaco
Moléculas totales Dendrímero 1,2x1015 1,2x1015 l,2xlθí5 1,2x1015 Fármaco 16x1015 8x1015 4x1015 2xlO15
Los resultados de someter a electroforesis estas mezclas, así como el control de dendrímero sin fármaco, se muestran en la Fig. 27a, marcada como "NN16+Met". En ella puede observarse que se producen retrasos, aunque no muy pronunciados, del dendrímero incubado con metotrexato frente al control en todas las relaciones dendrímero/fármaco. Por tanto, se puede decir que se forma complejo NNl 6- metotrexato.
b) Heparina
Al igual que en el Ejemplo anterior, la heparina utilizada en el ensayo se presenta en disolución acuosa, a 10 mg/ml (1000 U). Al no disponer de su peso molecular, ni del número de cargas negativas, aunque se sabe que son varias, la unión con el dendrímero se realizó por unidades de heparina. Así, se prepararon e incubaron mezclas dendrímero-heparina que respondían a las características que se muestran a continuación en la Tabla 13.
Tabla 13,- Composición de las mezclas dendrímero NN16-heparina
Figure imgf000106_0001
Los resultados de someter a electroforesis estas mezclas, así como el control de dendrímero sin fármaco, se muestran en la Fig. 27c, marcada como "NN16+Hep". Tal como se puede observar en dicha Figura, se produce retrasos del dendrímero incubado con heparina frente al control en todas las relaciones dendrímero/fármaco; de hecho,no hay migración en los pocilios de dendrímero con heparina. Por tanto, se puede decir que se forma complejo NN16-Heparina.
c) Insulina
Al igual que en el Ejemplo anterior, la insulina utilizada en el ensayo se presenta en disolución acuosa, a una concentración de 3,5 mg/ml (100 U). A pesar de disponer de su peso molecular (5825 g/mol) y de establecer una media de 4 cargas (-), la unión con el dendrímero se diseñó calculándola por unidades de insulina, pensando que puede ser útil de cara a comparar los resultados con las dosis de insulina libre utilizadas en clínica. Así, se prepararon e incubaron mezclas dendrímero -insulina que respondían a las características que se muestran a continuación en la Tabla 14.
Tabla 14.- Características de las mezclas dendrímero NN16-insulina
MEZCLA
1 2 3 4
Unidades de insulina I U 0,5 U 0,1 U 0,05 U
Relación cargas
16+/12- 16+/6- 64+/4- 160+/4- Dendrimero/Fármaco
Relación moléculas
1/3 1/1,5 4/1 10/1 Dendrimero/Fármaco
Moléculas totales Dendrímero 1,2x10" l,2xlθϊ5 l,2xlθ15 1,2x1015 Fármaco 3,6xlO15 1,8x1015 0,3x1015 0,IxIO15
Los resultados de someter a electroforesis estas mezclas, así como el control de dendrímero sin fármaco, se muestran en la Fig. 27d, marcada como "'NN16+Ins". En ella puede observarse que se producen retrasos del dendrímero incubado con insulina frente al control en todas las relaciones dendrímero/fármaco; de hecho, el dendrímero sólo migra un poco cuando está unido a 0,1 U o a 0,05 U de insulina. Por tanto, se puede decir que se forma complejo NN16-insulina. - Ejemplo 52: Ensayos de unión de fármacos al dendrimero IM 16
El dendrímero IM 16 se disolvió en H2O destilada a una concentración inicial de 442 μM y, a partir de ésta, se realizaron diluciones para obtener concentraciones de 100 μM, 10 μM y 1 μM. La electroforesis previa realizada con alícuotas de las disoluciones correspondientes a cada una de estas concentraciones, a la cual corresponde el gel mostrado en la Fig. 28a, demostró que el dendrímero estaba en todas ellas en buen estado.
A continuación se procedió a realizar los ensayos de unión con los distintos fármacos, de la siguiente manera: a) Metotrexato
Como se ha comentado, el metotrexato utilizado en este ensayo se presente en forma de disolución acuosa a 25 mg/ml, con un peso molecular Pm=476,427 g/mol y 1 carga(-) por molécula. Se prepararon e incubaron mezclas dendrímero-metotrexato que respondían a las características que se muestran a continuación en la Tabla 15:
Tabla 15.- Características de las mezclas dendrímero IM16-metotrexato
MEZCLA
1 2 3 4
Relación cargas
1+/1- 2+/1- 4+/1- 8+/1- Dendrimero/Fármaco
Relación moléculas
1/16 1/8 1/4 1/2 Dendrimero/Fármaco
Moléculas totales Dendrímero 1,2x1015 l,2xlθ15 1,2x10" l,2xlθis Fármaco 16xlO!5 8x1015 4x10i5 2x1015
Los resultados de someter a electroforesis estas mezclas, así como el control de dendrímero sin fármaco, se muestran en la Fig. 28b, marcada como "'IM16+Met". En ella puede observarse que no se producen retrasos del dendrímero incubado con metotrexato frente al control en ninguna de las relaciones dendrímero/fármaco. Por tanto, se puede decir que se forma no se forma complejo IM16-metotrexato.
b) Heparina
Al igual que en los Ejemplos 50 y 51, la heparina utilizada en el ensayo se presenta en disolución acuosa, a 10 mg/ml (1000 U). Al no disponer de su peso molecular, ni del número de cargas negativas, aunque se sabe que son varias, la unión con el dendrímero se realizó por unidades de heparina. Así, se prepararon e incubaron mezclas dendrímero-heparina que respondían a las características que se muestran a continuación en la Tabla 16.
Tabla 16.- Composición de las mezclas dendrímero IM16-Heparina
Figure imgf000109_0001
Los resultados de someter a electroforesis estas mezclas, así como el control de dendrímero sin fármaco, se muestran en Ia Fig. 28c, marcada como "IM16+Hep". Tal como se puede observar en dicha Figura, las bandas que aparecen en las calles correspondientes a mezclas del tipo 4 (0,1 U de heparina) son más débiles que las obtenidas con los controles, lo que indica que la heparina se une a una pequeña fracción de dendrímero. En las demás relaciones dendrímero/fármaco la heparina impide la migración del dendrímero. Por tanto, se puede decir que se forma complejo IMl 6- Heparina.
c) Insulina
Al igual que en los Ejemplos 50 y 51, la insulina utilizada en el ensayo se presenta en disolución acuosa, a una concentración de 3,5 mg/ml (100 U). A pesar de disponer de su peso molecular (5825 g/mol) y de establecer una media de 4 cargas (-), la unión con el dendrímero se diseñó calculándola por unidades de insulina, pensando que puede ser útil de cara a comparar los resultados con las dosis de insulina libre utilizadas en clínica. Así, se prepararon e incubaron mezclas dendrímero-insulina que respondían a las características que se muestran a continuación en la Tabla 17. Tabla 17.- Características de las mezclas dendrímero IMló-insulina
MEZCLA
1 2 3 4
Unidades de insulina I U 0,5 U O5I U 0,05 U
Relación cargas
16+/12- 16+/6- 64+14- 160+/4- Dendrimero/Fármaco
Relación moléculas
1/3 1/1,5 4/1 10/1 Dendrímero/Fármaco
Moléculas totales Dendrímero 1,2x1015 l,2xlθ15 l,2xlθ15 l,2xlθ15 Fármaco 3,6x1015 l,8xlθ15 0,3xl015 O5IxIO15
Los resultados de someter a electroforesis estas mezclas, así como el control de dendrímero sin fármaco, se muestran en la Fig. 28d, marcada como "IM16+íns". En ella puede observarse que se producen retrasos del dendrímero incubado con insulina frente al control en todas las relaciones dendrímero/fármaco, aunque en las calles correspondientes a las mezclas que contenían 0,05 U o 0,01 U de insulina sólo se retrasan algunas moléculas de dendrímero: la banda migra igual que en el control pero es más débil. En cambio, cuando la incubación se ha producido con 0,5 U de insulina el retraso es importante y en el carril correspondiente a la mezcla de incubación del dendrímero con 1 U de insulina no aparece banda, lo que indica que se ha formado complejo, que no llega a entrar en el gel. Por tanto, se puede decir que se forma complejo IMl 6 -insulina.
Determinación de estabilidad frente a pH de los complejos dendrímero-fármaco
Una vez comprobada la unión a los dendrímeros de diversos fármacos, se intentó verificar si la unión era reversible, comprobando si se producía disociación del complejo dendrímero-fármaco por variación del pH en el medio, intentando reproducir con ello lo que sucedería en condiciones fisiológicas, en las que se supone que el complejo dendrímero-fármaco penetraría en la célula mediante un endosoma, cuyo interior se acidificaría al llegar al citoplasma por la acción de bombas de H+, lo que daría lugar a la liberación del fármaco del dendrímero al captar éste parte del exceso de protones.
Se sabe que el pH que se alcanza en un endosoma puede estar entre 4,5 y 6,5 [77>78>79]_ por euOj ios pjj elegidos para realizar los ensayos fueron: 5 - 6 - 7,4 - 9 - 10
El ensayo sobre el comportamiento de los complejos dendrímero-fármaco previamente formados al variar el pH del medio se realizó de nuevo por evaluación del retraso en gel de poliacrilamida del dendrímero unido al fármaco respecto al dendrímero libre siguiendo un procedimiento similar al utilizado en los ensayos de determinación de la unión dendrímero-fármaco, aunque introduciendo una etapa de variación de pH en el proceso de formación del complejo previo a la electroforesis, proceso que se realizó de la siguiente manera:
- Formación del complejo: Se realizó en un volumen final de la mezcla de 30μl, que es el volumen máximo para cargar en el gel. Para ello, se partió de la cantidad necesaria de dendrímero que proporciona una banda perfectamente identificable por tinción con nitrato de plata en el gel una vez realizada la electroforesis: 20 μl de una disolución 100 μM, que corresponden a 1,2x10l5 moléculas. En los 10 μl restantes se añadió el fármaco, eligiendo para el mismo la concentración mínima que, según los ensayos de formación de complejos previamente realizados, es capaz de producir un retraso evidente de la banda del complejo dendrímero-fármaco con respecto a la banda correspondiente al dendrímero libre; la elección de esa concentración asegura que se forme complejo dendrímero-fármaco. Se realizó una incubación de las mezclas de dendrímero y fármaco a 37°C durante 1 hora para que diera tiempo a que se formase el complejo más estable termodinámicamente, aunque fuera el que necesitara más tiempo para su formación. Por cada pH a ensayar, se incubaron 2 mezclas. A continuación, se añadieron 10 μl de un tampón 0,1 M, que fuera capaz de mantener el pH buscado en cada muestra a la concentración final de 0,025 M que alcanzaba en ella, manteniendo entonces cada muestra a 370C durante 15 minutos más. - Electroforesis y tinción del gel: Se realizaron en las mismas condiciones descritas en los ensayos de determinación de unión dendrímero-fármaco. - Dendrímeros: Los ensayos se realizaron con el dendrímero IMl 6:
(2G-[Si(OCH2CH2NMe3 +r)2]8 (19). - Fármacos:
Se seleccionó para realizar el ensayo la insulina, añadiendo a cada mezcla de reacción 0,5 unidades (0,5 U). - Soluciones tampón
Se elegieron como soluciones tampón soluciones preparadas con distintas sales del ácido fosfórico. Para ello, se prepararon disoluciones 0,2 M de cada una de las especies H2PO4Na, HPO4Na2 y PO4NaS1 a partir de las cuales se prepararon soluciones tamponantes de cada uno de los pH deseados, todas ellas 0,1 M, mezclando los volúmenes de dichas soluciones que se indican a continuación en la Tabla 18 y completando con H2O hasta 100 mi.
Tabla 18.- Composición de las soluciones tampón
Figure imgf000112_0001
Los detalles del ensayo y el resultado se describen en el siguiente Ejemplo.
- Ejemplo 53: Ensayo de estabilidad frente al pH de complejos dendrímero IM16-fármaco
Se prepararon 10 mezclas de reacción (muestras "C": complejo) para la formación de complejos dendrímero fármaco añadiendo a cada una de ellas 20 μl de la solución de dendrímero de concentración 100 μM y 10 μl de una solución de insulina que contenía 0,5 U de la misma. Para cada una de dichas mezclas de reacción se preparó una muestra control ("D": dendrímero libre) en la que se añadió dendrímero pero no fármaco. Transcurrida 1 hora de incubación, se añadieron 10 μl de tampón a cada muestra, de manera que las 20 muestras presentaban la composición y características que se muestran a continuación en la Tabla 19:
Figure imgf000113_0001
Transcurrido el tiempo de espera tras la adición del tampón (15 minutos) se sometió a las muestras a electroforesis y tinción del gel, obteniéndose la distribución de bandas que se muestra en las Fig. 29, en la que las muestras aparecen distribuidas entre dos geles diferentes. En dicha figura puede observarse que a pHs ácidos el dendrímero libre se mantiene estable, mientras que en los carriles con complejo se aprecia la aparición de bandas, por lo que se deduce que se ha producido la disociación parcial de los complejos y el fármaco se ha liberado del dendrímero, dejando libre a éste último. A pHs básicos, el dendrímero no es estable y se degrada, lo que da lugar a Ia disociación del complejo.
La conclusión es que el complejo dendrímero IM16-insulina sí se disocia a pH ácido, lo que hace concebible que otros complejos dendrímero-fármaco puedan mostrar también un comportamiento similar.
Por tanto, los ensayos descritos en los Ejemplos 50 a 53 apoyan la la utilidad de los dendrímeros como transportadores de fármacos con carga negativa en la sangre y que, además, la unión es reversible, siendo posible la liberación del fármaco en el interior de la célula al pH ácido que se alcanza en el endosoma de entrada. Transfecciόn de células derivadas de sistema nervioso con oligonucleόíidos vehiculizados por dendrímeros
Puesto que los ensayos realizados con las CMSP demuestran que los complejos dendrímero-ODN pueden penetrar en la célula y disociarse en la misma, se realizaron ensayos para comprobar si los dendrímeros podían servir como vehículos de transfección de ODN u otras moléculas de carácter polianiónico como pueden ser los ARNi en células en las que dichas moléculas den lugar a una tasa baja de transfección, incrementando la misma. Para ello, se eligieron dos líneas derivadas de sistema nervioso, SK-N-MC (neuroblastoma: ATCC HTBlO) y U87-MG (astroglioma: ICLC HTL 00013) y se comprobó, en primer lugar, que los dendrímeros carbosilano de la invención no resultaban tóxicos para las mismas ni inducían su proliferación, tras lo cual se ensayó si la tasa de transfección de ODN en estas células podía aumentarse al penetrar los mismos formando complejos con dendrímeros de la invención. Las pruebas se realizaron con los dendrímeros NN (2G-[Si(O(CH2)2N(Me)(CH2)2NMe3 +r)]s (26)) y NN16 C2G-[Si(O(CH2)2N+(Me)2(CH2)2NMe3 +2r)]g (36)). Los ensayos de transfección se realizaron con el ODN anti-rev RF (SEQ ID NO :2). El medio de cultivo fue DMEM + suero bovino fetal al 10%.
- Ejemplo 54: Proliferación de células SK-N-MC y U-87-MG incubadas con dendrímeros
Se realizaron sendos experimentos, uno con células SK-N-MC y otro con células U-87-MG, en los que se estudió el efecto de los dendrímeros sobre la proliferación de dichas líneas. Para ello, se plaquearon 7000 células/pocilio de la línea correspondiente en una placa de 96 pocilios. Las células se incubaron con distintas concentraciones (1 μM, 5 μM y 10 μM) o bien del dendrímero NN o del dendrímero NN 16, durante 3 días. Como control positivo de proliferación, se incubaron células con 20 μg/ml de LPS y, como control positivo de inducción de muerte se utilizaron células incubadas con DMSO al 7%. Como control negativo se utilizaron células sin tratar. Tras 3 días de incubación se midió la proliferación celular mediante el kit CellTiter 96 Aqueous One Solution Ceíl Proliferation Assay de Promega, que permite cuantificar la proliferación celular a partir de la evaluación de la capacidad reductora celular, determinada a partir del cambio colorimétrico producido por la biorreducción del MTS (3-(4,5-dimetiltizol- 2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio en combinación con el reactivo de acoplamiento de electrones PES (etosulfato de fenazina). Al valor de absorbancia obtenido 490 nm para el control negativo se le dio el valor de 1 y se utilizó para referir al mismo el resto de las absorbancias obtenidas.
La parte superior de la Fig. 30, marcada como "A", muestra un gráfico con los resultados obtenidos en células U87-MG. Se observa como las barras correspondientes a las muestras incubadas con los dendrímeros indican una proliferación de las células en las mismas muy similar a la del control negativo (C-), por lo que se puede decir que los dendrímeros NN y NN 16 ni inducen proliferación ni provocan muerte celular tras incubarlos durante tres días con la línea celular U87-MG.
La parte inferior de la Fig. 30, marcada como ''B", muestra un gráfico con los resultados obtenidos en células SK-N-MC. En el mismo puede observarse que tanto el dendrímero NN como el NN16 son tóxicos para la línea celular SK-N-MC a una concentración 10 μM. En cambio, las concentraciones de 1 μM y 5 μM no producen toxicidad ni tampoco proliferación celular.
Ejemplo 55: Estudio de toxicidad de los dendrímeros en células U-87-MG - Ensayos con MTT Se realizó un ensayo con células U-87-MG, en los que se estudió el efecto de los dendrímeros sobre la viabilidad de dichas líneas a distintos tiempos. Para ello, se plaquearon en placas de 96 pocilios 15000 (incubaciones de 24 horas), 7000 (incubaciones de 3 días) o 1500 (incubaciones de 7 días) células por pocilio. Las células se incubaron con distintas concentraciones (1 μM, 5 μM y 10 μM) o bien del dendrímero NN o del dendrímero NN16, durante 24 horas, 3 días y 7 días. Se utilizaron dos controles negativos diferentes: células sin tratar (C-) y adicionalmente, células incubadas con distintas concentraciones (1 μM, 5 μM y 10 μM) de dextrano, una macromolécula que se utiliza habitualmente como control negativo de citotoxidad en ensayos de nuevos biomateriales. También se utilizaron dos controles positivos diferentes: células tratadas con DMSO al 7% y células tratadas con Tritón X-100 al 1%. Para poder tener otros valores de referencia se estudió también la toxicidad de los dendrímeros comerciales Superfect® y Polyfect® (ambos de Qiagen) a 24 horas, 3 y 7 días. En el caso del Superfect se probaron tres dosis, la dosis óptima recomendada por el fabricante (2,5 μl), una dosis inferior (1,25 μl) y otra superior (5 μl). En cuanto al Polyfect, diseñado específicamente para células adherentes, las tres dosis probadas fueron: dosis óptima (0,6 μl), dosis inferior (0,3 μl) y dosis superior (1,2 μl). Transcurrido cada tiempo de incubación correspondiente, se realizó un ensayo con MTT de forma análoga a la descrita en el Ejemplo 38. Al valor de absorbancia obtenido en las células sin tratar (C-) se le dio el valor de 1 y se utilizó para referir al mismo el resto de las absorbancias obtenidas.
La Fig. 31 permite observar los resultados obtenidos con células U87-MG. El gráfico de la parte superior, marcado como "A" corresponde a los valores obtenidos tras 24 horas de incubación; el gráfico situado en la zona intermedia, marcado como '"B*', corresponde a los valores obtenidos tras 3 días de incubación; por último, el gráfico situado en la parte inferior, marcado como "C", corresponde a los valores obtenidos tras 7 días de incubación. En dichos gráficos puede observarse que las células tratadas con dextrano, tanto a las 24 horas como tras 3 y 7 días presentaban valores de viabilidad iguales o superiores a 0,8.
El dendrímero comercial Superfect , tras 24 horas de incubación, da lugar a una viabilidad similar de las células en cualquiera de las concentraciones, igual a 0,7. Este valor se ve disminuido a los tres días incluso en la dosis más baja (1,25 μl), llegando a tener un valor de hasta 0,4. Tras 7 días de incubación con Superfect, las células están muertas a cualquiera de las tres dosis utilizadas.
El dendrímero Polyfect presentó menor toxicidad que el Superfect a cualquiera de las tres dosis probadas. En lo que se refiere a los dendrímeros de la invención NN y NNl 6, las viabilidad obtenidas a las 24 horas fueron similares entre sí y se encuentran en un rango entre 0,6 y 0,75 respecto al control negativo. La viabilidad celular a los 3 días, en el caso del dendrímero NN, va disminuyendo al aumentar la concentración pasando de valores de 0,95, a una concentración de 1 μM, hasta valores de 0,5 a 10 μM. En cuanto al dendrímero NN 16, presenta valores cercanos a 0,8 a cualquiera de las tres concentraciones estudiadas. Tras 7 días de incubación con los dendrímeros carbosilano, las U87-MG presentan viabilidades cercanas o superiores a la del control negativo excepto en el caso de NN 16 a una concentración de 10 μM, cuya viabilidad es de 0,7.
- Medición de la concentración de lactato deshidrogenasa (LDH) en el sobrenadante
Otra forma de evaluar la toxicidad celular que puedan inducir los dendrímeros es mediante la cuantificación de la concentración de LDH en el sobrenadante de cultivo de las células, lo cual se considera una medida directa de la citotoxicidad de un determinado compuesto o molécula y da idea del daño que han sufrido las células a nivel de membrana. Por ello, se realizó en células U87-MG un ensayo de viabilidad similar al de la determinación mediante MTT, aunque en este caso la viabilidad se determinó mediante la medida de la concentración de LDH en el sobrenadante de cultivo de las células tras 24 horas de incubación en medio de cultivo al que se le había añadido dextrano, los dendrímeros comerciales Superfect o Polyfect, los dendrímeros de la invención NN o NNl 6, DMSO o Tritón X-IOO. Las concentraciones y volúmenes de cada uno de estos compuestos fueron las mismas utilizadas en el ensayo realizado con MTT. Para la determinación de la lactato deshidrogenasa se utilizó el kit comercial Cytotoxicity Detection KítPLUS (LDH), de Roche Applied Science, siguiendo las instrucciones del fabricante. Para evaluar los resultados, al control negativo (células sin tratar) se le asignó el valor de 1 , calculándose a partir del mismo los valores de citotoxicidad de cada uno de los compuestos con los que se incubaron las células.
Los resultados obtenidos, que se muestran en la Fig. 32, demuestran que, al igual que se observa en el ensayo realizado con MTT, el Polyfect es el dendrímero comercial que menor toxicidad presenta a cualquiera de las concentraciones, mientras el Superfect produce más daño en la membrana a medida que aumenta la concentración, llegando a producir hasta 5 veces más citotoxicidad que el control negativo en la dosis máxima (5 μl).
Los dendrímeros NN y NNl 6 presentan mayor citotoxicidad a medida que aumenta su concentración. Al comparar uno con otro, el NN16 resulta ser menos tóxico que el NN. Ejemplo 56: Estudios de toxicidad de los dendrímeros en células SK-N-MC Se realizaron en células SK-N-MC ensayos análogos a los descrito en el Ejemplo 55 para las células U87-MG (evaluación de la viabilidad celular mediante ensayos realizados con MTT y por cuantificación de LDH en el sobrenadante celular): las células fueron incubadas con los mismos compuestos a las mismas concentraciones, aunque en este caso las medidas con MTT sólo se realizaron tras 24 horas de incubación.
Como en el Ejemplo 55, los valores de absorbancia obtenidos en el ensayo con MTT se referenciaron al control negativo, obteniéndose los resultados que se muestran en la parte superior de la Fig. 33 (A)..
Según estos resultados, las células incubadas con dextrano mostraron valores de viabilidad iguales o superiores a los del control negativo a cualquiera de las concentraciones utilizadas.
Las células tratadas con Polyfect presentaron viabilidades superiores al 0,7 en cualquiera de las tres concentraciones utilizadas, contrariamente a lo que ocurre cuando las células se trataron con Superfect, que dio lugar a viabilidades en torno a 0,5.
En cuanto a los dendrímeros de la invención se observa como, al contrario de los ocurre en la línea U87-MG, los cambios en las concentraciones de los dendrímeros dieron lugar a variaciones muy acusadas en la viabilidad celular. De los dos dendrímeros de la invención ensayados (NN y NNl 6), el NNl 6 fue el que presentó menor toxicidad.
En el ensayo de cuantificación de la LDH, se asignó de nuevo el valor 1 al control negativo, calculándose los restantes valores de citotoxicidad a partir de dicho valor y obteniéndose los resultandos que se muestran en la parte inferior de la Fig. 33 (B). Los resultados obtenidos confirman las observaciones realizadas respecto al ensayo con MTT.
Ejemplo 57: Transfección de células U87-MG y SK-N-MC mediada por dendrímeros Se plaquearon 100000 células/pocilio de la línea celular correspondiente en una placa de 24 pocilios con 500 μl de medio. Se foπnaroB dendriplejos con los dendrímeros NN y NN16 y el oligonucleótido antisentido anti-rev fluoresceinado en un volumen total de 75 μl de medio sin suero, en el que se mezclaron el oligonucleótido anti-rev a una concentración 250 nM y el correspondiente dendrímero en diferentes proporciones, de manera que se obtuvieran distintas relacionas carga-/carga+: 1:1, 1:2, 1:4 y 1 :8. La mezcla se incubó durante media hora a temperatura ambiente y posteriormente se añadió al pocilio correspondiente para incubar las células con los dendriplejos.
Tras 24 horas de incubación, se despegaron las células del pocilio, se lavaron dos veces con PBS, se incubaron 1 minuto con glicina acida para retirar los posibles restos de dendriplejos que pudieran haber quedado pegados en la membrana celular, y se realizó un último lavado con PBS. Finalmente, se resuspendieron las células en 500 μl de PBS y se cuantificó la cantidad de oligonucleótido fluoresceinado que había en el interior celular mediante un citómetro de flujo.
Las Figs. 34a y 34b muestran los resultados obtenidos con la línea celular U87- MG. Los gráficos corresponden a los resultados obtenidos con células incubadas con el oligonucleótido sin dendrímero (Ctrl) o con complejos formados con uno de los dendrímeros y el oligonucleótido anti-rev en proporciones que daban lugar a las relaciones carga-/carga+ indicadas sobre cada gráfico: 1 :1, 1 :2, 1:4 y 1 :8. La Fig. 34a, corresponde a los ensayos realizados con el dendrímero NN, mientras que la Fig. 34b, corresponde a los ensayos realizados con el dendrímero NNl 6. En ambos casos, los gráficos permiten observar que la incubación de las células U87-MG con complejos formados con mayor cantidad de dendrímero da lugar a un aumento de la transfección, pasando desde un 19% obtenido en el caso de la incubación de las células sólo con el oligonucleótido (Ctrl) hasta un 95% cuando se incuba con el dendriplejo formado con el dendrímero NN con una relación carga-/carga+ 1 :8 y un 97,8% en el caso del dendriplejo formado con el dendrímero NN 16 igualmente con una relación carga- /carga+ 1 :8. Los resultados demuestran, por tanto, que un aumento del dendrímero con respecto al oligonucleótido produce un aumento en el porcentaje de células transfectadas, llegando a alcanzar un punto máximo de transfección cuando la relación carga-/carga+ es 1:8. La Fig. 35 muestra los resultados obtenidos con la línea celular SK-N-MC con el dendrímero NNl 6. En este caso, la máxima transfección se produce con dendriplejos formados con una relación carga-/carga+ 1:4 (82,3%).
Tanto en una línea celular como en otra, se produce un aumento en el porcentaje de transfección obtenido al incubar las células con dendriplejos con respecto al que se obtiene cuando se incuban con el oligonucleótido solo, especialmente cuando las proporciones carga-/carga+ son de 1:4 ó 1:8, es decir, cuando aumenta la proporción de dendrímero con respecto al oligonucleótido. Es de esperar que cualquier otro oligonucleótido, compuesto por ribonucleótidos o por desoxirríbonucleótidos, diera lugar a resultados similares, aunque las relaciones óptimas carga-/carga+ podrían ser diferentes según el tipo de célula a transfectar y el dendrímero y el oligonucleótido concreto que formaran el dendriplejo. En cualquier caso, los ensayos descritos apoyan la utilidad de los dendrímeros carbosilano de la invención como vehículos para aumentar la transfección de moléculas polianiónicas como los oligonucleótidos, bien oligodesoxirribonucleótidos (ODN) o ARN de interferencia (ARNi).
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Un dendrímero carbosilano ramificado con restos terminales en extremos de sus ramificaciones que contienen grupos amino primarios, secundarios, terciarios o cuaternarios que responde a una cualquiera de las fórmulas:
i
Si- ( Al q1- S i -Xp ) 4 , en el caso de ser de primera generación;
( R ) 3 -m ( R ) 3-p
I I
Si- (Alq1-Si- (Alq2-Si-Xp ) m) 4, en el caso de ser de segunda generación;
( R1 J 3-M ( R2 ) 3 n (R3U-P
I I I
Si- (Alq1-Si- (Alq2-Si- (Alq3-Si-Xp) n) m) ¿ , en el caso de ser de tercera generación; o a las fórmulas análogas correspondientes en el caso de generaciones superiores, en las que la fórmula correspondiente a cada generación i resultaría de sustituir Xp en la fórmula correspondiente a la generación anterior por un nuevo bloque del tipo:
Figure imgf000126_0001
i
AIq^-S i -Xp pasando el grupo unido al mismo átomo de silicio que este bloque sustitutorio de estar representado por (R1" )3-p a estar representado por (R1" )3-z, fórmulas en las que:
AIq1, AIq2, AIq3, , AIq1 representan restos alquileno de 2 a 4 carbonos que se eligen independientemente unos de otros según la longitud de las ramificaciones en cada generación;
R1, R2, R3, R1"3, R1 representan restos que se eligen independientemente unos de otros entre metilo y fenilo; X representa un resto que contiene al menos un grupo amino primario, secundario, terciario o cuaternario; p es un número entero que varía entre 1 y 3; m, n,...., z son números enteros que varían independientemente entre 1 y 3.
2. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación I5 en el que los restos AIq , AIq2, AIq3,..., AIq1 se seleccionan independientemente entre etileno y propileno.
3. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 2, en el que los restos AIq1, AIq2, AIq3,..., AIq1 son todos iguales y corresponden a restos propileno.
4. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 1, en el que los números enteros m, n, ..., z son iguales entre sí y tienen el valor 2.
5. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 1, en la que los restos R1, R2, R3, R1"1, R1 son todos iguales y corresponden a restos metilo.
6. Un dendrímero carbosilano según las reivindicaciones 1 a 5, en el que los restos AIq1, AIq2, AIq3,..., AIq1 son iguales entre sí y corresponden a restos propileno; los números enteros m, n, ..., j son iguales entre sí y tienen el valor 2 y los restos R , R , R3, R1"1, R1 son todos iguales y corresponden a restos metilo.
7. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 6, en el que el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino se encuentra unido al dendrímero mediante un grupo -O- que se ha formado a partir del grupo -OH de una alcohol-amina.
8. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 7, en el que el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino se elige entre los restos -OCH2CH2N(CH3)I, -OCH2-(C6H3)-3,5-(OCH2CH2N(CH3)2)2 y
-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2.
9. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 8, en el que el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino es el resto -OCH2CH2N(CH3)I.
10. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 9, en el que el índice "p" toma el valor 1 y cada ramificación termina con un único resto -OCH2CH2N(CH3)2.
11. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 10 que es de primera, segunda o tercera generación.
12. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 9, en el que el índice "p" toma el valor 2 y cada ramificación termina con dos restos -OCH2CH2N(CHs)2.
13. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 12, que es de primera, de segunda o de tercera generación.
14. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 8, en el que el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino es el resto -OCH2-(C6H3)-3,5-(OCH2CH2N(CH3)2).
15. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 14, en el que el índice
"p" toma el valor 1 y cada ramificación termina con un único resto -OCH2-(C<5H3)-3,5- (OCH2CH2N(CH3)2)2.
16. Un dendrímero carbosilano según Ia reivindicación 15, que es de primera, segunda o tercera generación.
17. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 14, en el que el índice
"p" toma el valor 2 y cada ramificación termina con dos restos -OCH2-(C6H3)-3,5- (OCH2CH2N(CH3)2)2.
18. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 17, que es de primera, segunda o tercera generación.
19. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 8, en el que el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino es el resto -OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2.
20. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 19, en el que el índice '"p"' toma el valor 1 y cada ramificación termina con un único resto
-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2
21. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 20, que es de primera, de segunda o de tercera generación.
22. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 19, en el que el índice "'p" toma el valor 2 y cada ramificación termina con dos restos
-OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N(CH3)2
23. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 22, que es de primera, de segunda o de tercera generación.
24. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 6, en el que el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino se encuentra unido al dendrímero mediante un grupo -CH2- que se ha formado a partir de un carbono terminal que se encontraba formando parte de un doble enlace carbono-carbono en un compuesto que contiene al menos un grupo amino con el que se hace reaccionar el dendrímero para obtener restos terminales de ramificaciones.
25. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 24, en el que el resto terminal de las ramificaciones corresponde a la fórmula -CH2CH2(CH2)C-NH2, donde *'e" es un número entero que oscila entre 0 y 2.
26. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 25, en el que "e" toma el valor 1, correspondiendo el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino a la fórmula -CH2CH2CH2-NH2.
27. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 26, en el que el índice "sp" toma el valor 1 y cada ramificación termina con un único resto -CH2CH2CH2-NH2.
28. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 27, en el que el dendrímero carbosilano es de primera, de segunda o de tercera generación.
29. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 6, en el que parte o la totalidad de los grupos amino presentes en los restos terminales de las ramificaciones están cuaternizados.
30. Un dendrímero carbosilano según Ia reivindicación 29, en el que el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino cuaternizado se elige entre los restos -OCH2CH2N+(CHs)3I", -OCH2-(C6H3)-3,5- (OCH2CH2N+(CH3)S)F)2 y -OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N+(CH3)3r.
31. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 30, en el que el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino cuaternizado es el resto -OCH2CH2N+(CH3)3r.
32. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 31, en el que el índice "'p*' toma el valor 1 y cada ramificación termina con un único resto -OCH2CH2N+(CH3)3r.
33. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 32, que es de primera, de segunda o de tercera generación.
34. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 31, en el que el índice "p" toma el valor 2 y cada ramificación termina con dos restos -OCH2CH2N+(CH3)3Γ.
35. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 34, que es de primera, de segunda o de tercera generación.
36. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 3O5 en el que el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino cuaternizado es el resto -OCH2-(C6H3)-3,5-(OCH2CH2N+(CH3)3)r)2.
37. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 36, en el que el índice "p" toma el valor 1 y cada ramificación termina con un único resto -OCH2-(CgH3)-3,5- (OCH2CH2N+(CH3)3)r)2.
38. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 37, que es de primera, de segunda o de tercera generación.
39. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 36, en el que el índice
"p" toma el valor 2 y cada ramificación termina con dos restos -OCH2-(C6H3)^5S- (OCH2CH2N+(CH3)3)r)2.
40. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 39, que es de primera, de segunda o de tercera generación.
41. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 30, en el que el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino cuaternizado es el resto -OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N+(CH3)3r.
42. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 41, en el que el índice "p" toma el valor 1 y cada ramificación termina con un único resto -OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N+(CH3)3r.
43. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 42, que es de primera, de segunda o de tercera generación
44. Un dendrímero carbosilano según Ia reivindicación 41, en el que el índice "p" toma el valor 2 y cada ramificación termina con dos restos -OCH2CH2N(CH3)CH2CH2N+(CH3)3r.
45. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 44, que es de primera, de segunda o de tercera generación.
46. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 29, en el que el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino cuaternizado se corresponde con la fórmula -CH2CH2(CH2)e-N+H3Cr, donde "e" es un número entero que oscila entre 0 y 2.
47. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 46, en el que "e" toma el valor 1, correspondiendo el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino cuaternizado a la fórmula -CH2CHICH2-N+H3CF.
48. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 47, en el que el índice "p" toma el valor 1 y cada ramificación termina con un único resto -CH2CH2CH2-N+H3Cl".
49. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 48, en el que el dendrímero carbosilano es de primera, de segunda o de tercera generación.
50. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 6, en el que el resto terminal que contiene al menos un grupo amino forma parte de un resto antigénico.
51. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 50, en el que el resto amino forma parte de un péptido.
52. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano, que comprende las etapas de: a) obtener un esqueleto de dendrímero carbosilano siguiendo los pasos de: al) obtener un dendrímero carbosilano básico de partida de fórmula:
SÍ [ ( CH2 ) aCH=CH2 ] 4 donde a varía entre 0 y 2, según la longitud que se desee para las ramificaciones, haciendo reaccionar SiCl4 con BrMg(CH2XCH=CH2; a2) obtener un dendrímero carbosilano de primera generación precursor de un dendrímero de una generación superior haciendo reaccionar el dendrímero carbosilano básico de partida de al) con
Figure imgf000133_0001
de forma que se obtenga un dendrímero de fórmula: (R1J 3-H1
¡
S i - [ ( CH2 ) aCHCH2-Si -Clm] 4 donde m varía entre 1 y 3 y equivale al número de ramificaciones que se pueden conseguir en la siguiente generación o el número de grupos funcionales terminales por los que pueden sustituirse los grupos Cl;
R1 representa un resto metilo o fenilo; a3) opcionalmente, obtener un dendrímero carbosilano de segunda generación precursor de un dendrímero de una generación superior sometiendo el derivado con enlaces terminales Si-Cl obtenido en la etapa a2) a la repetición de las etapas al) y a2), es decir, i) obteniendo nuevas ramificaciones haciendo reaccionar el derivado correspondiente con enlaces terminales Si-Cl con
BrMg(CH2)bCH=CH2j donde "b" varía entre 0 y 2, según la longitud que se desee para esas ramificaciones, y puede ser igual o diferente al índice "'a''; ii) haciendo reaccionar el esqueleto de dendrímero carbosilano de la nueva generación obtenido en i) con HSi(R2)3-nCln, donde "n" varía entre 1 y 3 y puede ser igual o diferente al índice "m" de la generación anterior y R representa un resto metilo o fenilo; a4) opcionalmente, obtener dendrímeros carbosilanos de sucesivas generaciones precursores de dendrímeros de generaciones superiores sometiendo el derivado con enlaces terminales Si-Cl correspondiente a la generación anterior a la que se busca a la repetición de la etapa a3) i) utilizando un reactivo
Figure imgf000134_0001
y la repetición de la etapa a3) ii) utilizando un reactivo HSi(R3)3.zClz, reactivos en los que"c" varía entre 0 y 2 y "z" varía entre 1 y 3; a5) obtener el esqueleto de dendrímero carbosilano final al que van a añadírsele en la etapa b) restos que contienen al menos un grupo amino utilizando en la etapa a2). a3) o en la repetición i-1 de la etapa a4), según sea el dendrímero de primera, de segunda o de una generación i, respectivamente, un reactivo
Figure imgf000134_0002
donde "p" varía entre 1 y 3 y
R1 representa un resto metilo o fenilo. b) obtener un dendrímero carbosilano con restos terminales con grupos aminos primarios, secundarios o terciarios siguiendo una de las siguientes vías: bl) provocar la alcoholisis de enlaces terminales Si-Cl de un dendrímero carbosilano obtenido en la etapa a5) haciéndolo reaccionar con una alcohol-amina primaria, secundaria o terciaria en presencia de un exceso de una base; b2) obtener previamente un dendrímero carbosilano con enlaces terminales Si-H al que posteriormente se unen los restos que contienen al menos un grupo amino primario, secundario o terciario, haciéndolo pasar por las etapas de: i) obtener un derivado con enlaces terminales Si-H de un dendrímero carbosilano de una generación cualquiera haciendo reaccionar el correspondiente dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl con un reactivo capaz de ceder grupos hidruro, de manera que parte o la totalidad de los átomos de Cl queden sustituidos por átomos de H; ii) hacer reaccionar el dendrímero carbosilano con enlaces Si-H, en presencia de un catalizador de hidrosililación, con un compuesto que contiene un grupo amino primario, secundario o terciario y que posee un doble enlace carbono-carbono en un extremo, de forma que el compuesto quede unido al dendrímero por el extremo en el que se encontraba el doble enlace; c) opcionalmente, obtener un dendrímero carbosilano con restos terminales con grupos amino cuaternizados mediante la reacción de un dendrímero obtenido en la etapa b) con un reactivo A-HaI, en el que A representa hidrógeno, alquilo de 1 a 10 átomos de carbono o arilo y HaI representa Cl, Br5 1.
53. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 52, en el que el índice "a" del reactivo de partida es igual a 1, siendo por tanto BrMgCH2CH=CH2.
54. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 52, en el que el índice "b" del reactivo BrMg(CH2)bCH=CH2 utilizado para obtener nuevas ramificaciones en la etapa a3) i) opcional y los distintos índices "c" de los reactivos BrMg(CH2)cCH=CH2 utilizados para obtener nuevas ramificaciones en cada una de las repeticiones opcionales de la etapa a4) son todos ellos iguales a I3 siendo por tanto el reactivo BrMgCH2CH=CH2.
55. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según las reivindicaciones 53 y 54, en el que el reactivo BrMgCH2CH=CH2 se utiliza tanto en la etapa al) de partida como en todas las ocasiones en las que se obtienen nuevas ramificaciones mediante la etapa a3) i) opcional o mediante las repeticiones opcionales de la etapa a4).
56. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 52 a 55, en el que tanto el resto R1 del reactivo
Figure imgf000135_0001
de la etapa a2) como el resto R2 del reactivo HSi(R2)3-nCln utilizados para obtener derivados con enlaces terminales Si-Cl en la etapa opcional a3) ii) como los sucesivos restos R1 de los reactivos HSÍ(R!)3-ZC1Z de las repeticiones opcionales de la etapa a4) son todos iguales entre sí y corresponden a restos metilo.
57. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 52 a 56, en el que tanto el índice '"m" del reactivo HSitR^s.mClm de la etapa a2) como el índice "n" del reactivo HSi(R2)3-nCln de la etapa opcional a3) ii) como los índices "z" de los reactivos HSi(R1^zCIz de las repeticiones opcionales de la etapa a4) son todos ellos iguales entre sí e iguales a 2, utilizándose en todos los casos el reactivo HSi(R^1Cl2.
58. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según las reivindicaciones 56 y 57, en el que:
- tanto el resto R1 del reactivo
Figure imgf000136_0001
de la etapa a2) como el resto R2 del reactivo HSi(R )3-nCln utilizado para obtener derivados con enlaces terminales Si-Cl en la etapa opcional a3) ii) como los sucesivos restos R1 de los reactivos HSi(R1^-2Cl2 utilizados en las repeticiones opcionales de la etapa a4) son todos iguales entre sí y corresponden a restos metilo;
- tanto el índice "ςm" del reactivo HSi(R1^-111Cl111 de la etapa a2) como el índice "n" del reactivo HSi(R2)3-πCln de la etapa opcional a3) ii) como los índices "z" de los reactivos HSi(R1^-2CIz de las repeticiones opcionales de la etapa a4) son todos ellos iguales entre sí e iguales a 2; por lo que en todos los pasos en los que se obtienen enlaces Si-Cl terminales destinados a permitir la obtención de derivados de generaciones superiores mediante la sustitución de cada uno de los restos Cl por una nueva rama, es el reactivo HSÍCH3CI2 el que se utiliza.
59. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según las reivindicaciones 55 y 58, en el que:
- el reactivo BrMgCH2CH=CH2 se utiliza tanto en la etapa al) de partida como en todas las ocasiones en las que se obtienen nuevas ramificaciones mediante la etapa a3) i) opcional o mediante las repeticiones opcionales de la etapa a4);
- en todos los pasos en los que se obtienen enlaces Si-Cl terminales destinados a permitir la obtención de derivados de generaciones superiores mediante la sustitución de cada uno de los restos Cl por una nueva rama, es el reactivo HSiCH3Cl2 el que se utiliza.
60. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 59, en el que el reactivo HSi(R1^pCIp que se utiliza para obtener enlaces Si-Cl terminales en el esqueleto final de dendrímero carbosilano al que van a añadírsele restos con grupos amino en la etapa b) es HSi(CHa)2Cl.
61. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 60, en el que al esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-
Cl terminales se le unen restos que contienen al menos un grupo amino en la etapa b) siguiendo la vía bl) de reacción con una alcohol-amina.
62. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 61 , en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-
Cl terminales se trata en la etapa bl) con una alcohol-amina elegida entre N5N- dietiletanolamina (CH2OH-CH2-N(CH3 )2), 2-[(2-(dimetilaminoetíl)metil]amino etanol (CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2) o 3,5-bis(drmetilaminoetoxi)bencilalcohol (CH2OH-(C6Hs)-(O-CH2-CH2- N(CH3)2)2).
63. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 62, en el que se utilizan cantidades preferentemente estequiométricas de la alcohol-amina elegida con respecto al número de enlaces Si-Cl terminales presentes en el esqueleto final de dendrímero carbosilano obtenido en la etapa a).
64. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 62 ó 63, en el que se realiza la etapa opcional c) de cuaternización de grupos amino del dendrímero carbosilano obtenido en la etapa bl) tratándolo con un exceso de CH3I.
65. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 62 a 64, en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl terminales tratado en la etapa bl) con una alcohol-amina se ha obtenido haciendo coincidir la etapa a2) con la etapa a5) de finalización de la obtención del esqueleto del dendrímero carbosilano, obteniéndose en la etapa b) un dendrímero carbosilano de primera generación.
66. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 62 a 64, en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl terminales tratado en la etapa bl) con una alcohol-amina se ha obtenido haciendo coincidir la etapa a3) con la etapa a5) de finalización de la obtención del esqueleto del dendrímero carbosílano, obteniéndose en la etapa b) un dendrímero carbosilano de segunda generación.
67. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 62 a 64, en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl terminales tratado en la etapa bl) con una alcohol-amina se ha obtenido haciendo coincidir la primera ejecución de la etapa a4) con la etapa a5) de finalización de la obtención del esqueleto del dendrímero carbosilano, obteniéndose en la etapa b) un dendrímero carbosilano de tercera generación.
68. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 59, en el que el reactivo HSi(R')3-pClp que se utiliza para obtener enlaces Si-Cl terminales en el esqueleto final de dendrímero carbosilano al que van a añadírsele restos con grupos amino en la etapa b) es HSiCH3Cl2.
69. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 68, en el que al esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si- Cl terminales se le unen restos que contienen al menos un grupo amino en la etapa b) siguiendo la vía bl) de reacción con una alcohol-amina.
70. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 69, en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si- Cl terminales se trata en la etapa bl) con una alcohol-amina elegida entre N,N- dietiletanolamina (CH2OH-CH2-N(CH3)I), 2-[(2-(dimetilaminoetil)metil]amino etanol (CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2) o 3 ,5-bis(dimetilaminoetoxi)bencilalcohol (CH2OH-(C6Hs)-(O-CH2-CH2- N(CH3)2)2).
71. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 70, en el que se utilizan cantidades preferentemente estequiométricas de la alcohol-amina elegida con respecto al número de enlaces Si-Cl terminales presentes en el esqueleto final de dendrímero carbosilano obtenido en la etapa a).
72. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 70 ó 71, en el que se realiza la etapa opcional c) de cuaternización de grupos amino del dendrímero carbosilano obtemdo en la etapa bl) tratándolo con un exceso de CH3I.
73. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 70 a 72, en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl terminales tratado en la etapa bl) con una alcohol-amina se ha obtenido haciendo coincidir la etapa a2) con la etapa a5) de finalización de la obtención del esqueleto del dendrímero carbosilano, obteniéndose en la etapa b) un dendrímero carbosilano de primera generación.
74. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 70 a 72, en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl terminales tratado en la etapa bl) con una alcohol-amina se ha obtenido haciendo coincidir la etapa a3) con la etapa a5) de finalización de la obtención del esqueleto del dendrímero carbosilano, obteniéndose en la etapa b) un dendrímero carbosilano de segunda generación.
75. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 70 a 72, en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl terminales tratado en la etapa bl) con una alcohol-amina se ha obtenido haciendo coincidir la primera ejecución de la etapa a4) con la etapa a5) de finalización de la obtención del esqueleto del dendrímero carbosilano, obteniéndose en la etapa b) un dendrímero carbosilano de tercera generación.
76. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 60 ó 68, en el que al esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl terminales se le unen restos que contienen al menos un grupo amino en la etapa b) siguiendo la vía b2) de reacción con un compuesto que posee un doble enlace carbono-carbono en un extremo y que contiene al menos un grupo amino.
77. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 76, en el que el reactivo capaz de ceder grupos hidruro para convertir parte o la totalidad de los enlaces Si-Cl en enlaces Si-H es LiAlH4 y el catalizador de bidrosililación utilizado para unir al dendrímero carbosilano con enlaces Si-H un compuesto que contiene un grupo amino primario, secundario o terciario por un extremo en el que dicho compuesto posee un doble enlace carbono -carbono es el catalizador de Karstedt.
78. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 77, en el que el compuesto que posee un doble enlace carbono-carbono en un extremo es una alquilenamina primaria de fórmula CH2=CH-(CH2)C-NH2, en la que el índice "e" varía entre 0 y 2.
79. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 78, en el que el índice '"e" de Ia fórmula CH2=CH-(CH2)e-NH2 tiene el valor 1, siendo la alquilenamina utilizada en la etapa b2) la alilamina, CH2=CH-CH2- NH2.
80. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 79, en el que se utilizan cantidades preferentemente estequiométricas de alilamina con respecto al número de enlaces Si-H presentes en el esqueleto de dendrímero carbosilano.
81. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 79 u 80, en el que se realiza la etapa opcional c) de cuaternización de grupos amino del dendrímero carbosilano obtenido en la etapa b2) tratándolo con HCl.
82. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 79 a 81, en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl terminales tratado en la etapa b2) i) con LiAlH4 se ha obtenido haciendo coincidir la etapa a2) con la etapa a5) de finalización de la obtención del esqueleto del dendrímero carbosilano, obteniéndose en la etapa b) un dendrímero carbosilano de primera generación.
83. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 79 a 81, en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl terminales tratado en la etapa b2) i) con LiAlH4 se ha obtenido haciendo coincidir la etapa a3) con la etapa a5) de finalización de la obtención del esqueleto del dendrímero carbosilano, obteniéndose en la etapa b) un dendrímero carbosilano de segunda generación.
84. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 79 a 81, en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl terminales tratado en la etapa b2) i) con LiAlH4 se ha obtenido haciendo coincidir la primera ejecución de la etapa a4) con la etapa a5) de finalización de la obtención del esqueleto del dendrímero carbosilano, obteniéndose en la etapa b) un dendrímero carbosilano de tercera generación.
85. Una composición que contiene al menos un dendrímero carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51.
86. Una composición según la reivindicación 85, que contiene además al menos un molécula de carácter amónico o polianiónico.
87. Una composición según la reivindicación 86, en la que la molécula de carácter polianiónico es una secuencia de un ácido nucleico o un derivado suyo.
88. Una composición según la reivindicación 87, en la que la secuencia de ácido nucleico o derivado suyo es un ADN antisentido.
89. Una composición según Ia reivindicación 88, en la que al menos uno de los dendrímeros carbosilano presentes tiene la finalidad de actuar como vehículo transportador del ADN antisentido o de un derivado del mismo para que disminuyan las posibilidades de interacción del ADN antisentido con proteínas del plasma o con las superficies celulares.
90. Una composición según la reivindicación 89, en la que al menos uno de los dendrímeros carbosilano presentes tiene la finalidad de facilitar la liberación controlada de al menos un ADN antisentido presente en ella o de un derivado del mismo.
91. Una composición según la reivindicación 90, en la que al menos uno de los dendrímeros carbosilano presentes es un dendrímero elegido entre NN, IM8 y/o IMl 6.
92. Una composición según cualquiera de las reivindicación 88 a 91, en la que el ADN anti sentido tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1.
93. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 88 a 91, en la que el ADN antisentido tiene la secuencia de SEQ ID NO:2.
94. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 88 a 91, en la que el ADN antisentido tiene la secuencia de SEQ ID NO:3.
95. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 88 a 91, en la que el ADN antisentido tiene la secuencia de SEQ ID NO :4.
96. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 88 a 91, en la que el ADN antisentido tiene la secuencia de SEQ ID NO:5.
97. Una composición según la reivindicación 87, en Ia que la secuencia de ácido nucleico o derivado suyo es una secuencia de ADN bicatenario.
98. Una composición según la reivindicación 97, en la que la secuencia de ácido nucleico o derivado suyo es un plásmido o ADN derivado de un virus.
99. Una composición según la reivindicación 86, en la que la molécula de carácter polianiónico es un ARN de interferencia o un derivado del mismo.
100. Una composición según la reivindicación 99, en la que la molécula del
ARN de interferencia contiene la secuencia de SEQ ID NO: 6.
101. Una composición según la reivindicación 86, en la que la molécula de carácter aniónico es un fármaco con carga negativa a pH fisiológico.
102. Una composición según la reivindicación 101, en la que el fármaco con carga negativa es el ácido acetilsalicílico, la indometacina, la furosemida, la penicilina, la fenitoína, la tolbutamida, la warfarina, el ácido nalidíxico o la clorotiacida.
103. Una composición según la reivindicación 85, en la que al menos uno de los dendrímeros carbosilano presente tiene la finalidad de actuar como sustancia activa destinada a la prevención y/o al tratamiento de enfermedades causadas por virus o por priones en cuyo ciclo vital es capaz de interferir.
104. Una composición según la reivindicación 103, en la que la enfermedad que se intenta prevenir o tratar está causada por el virus VIH.
105. Una composición según la reivindicación 104, en la que está presente al menos el dendrímero NN.
106. Una composición según la reivindicación 85, en la que al menos uno de los dendrímeros carbosilano presentes tiene la finalidad de actuar como sustancia activa destinada a la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad causada por bacterias o por hongos cuyas membranas o paredes celulares sean susceptibles de ser alteradas por dicho dendrímero.
107. Una composición según la reivindicación 85, en la que al menos uno de los dendrímeros carbosilano presentes tiene la finalidad de actuar como sustancia activa destinada a interferir con la formación de o facilitar la disolución de agregados proteicos tales como los que aparecen en la enfermedad de Alzheimer o en las encefalopatías provocadas por priones.
108. Una composición que contiene al menos un dendrímero carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones 50 y 51, destinado a desencadenar una respuesta inmune que prevenga o proteja frente a una enfermedad provocada por un organismo que contenga el péptido o resto antigénico unido al dendrímero.
109. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 86 a 108, destinada a ser administrada mediante iontoforesis, por vía transdérmica o por inhalación.
1 10. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 86 a 108, destinada a ser inyectada.
111. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 86 a 108, destinada a formar con ella una película para recubrimiento de estructuras protésicas o mallas STENT para la liberación controlada desde las mismas de al menos un dendrímero carbosilano presente en la composición o de al menos otra sustancia presente en la composición.
112. Una composición que contiene al menos un dendrímero carbosilano según la reivindicación 85, destinada a ser utilizada en la fijación de moléculas de ácidos nucleicos a superficies tales como las bases de los microchips de secuencias de nucleótidos.
113. Una composición según la reivindicación 112, en la que el dendrímero es Phe y/o ClNH4.
114. Uso de un dendrímero carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones
1 a 51 o de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 85 a 96 en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad producida por un viras o por una alteración en un gen cuyos síntomas pueden paliarse o eliminarse mediante la utilización de un ADN anti sentido.
115. Uso según la reivindicación 114, en el que la enfermedad que se intenta prevenir o tratar está producida por el virus VIH.
116. Uso de un dendrímero carbosilano según cualquiera de las reivindicaciones I a 51 o de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 85 ó 97 en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un trastorno o enfermedad cuyos síntomas pueden paliarse o eliminarse mediante la introducción de un ADN bicaternario en una célula.
117. Uso según la reivindicación 116, en el que el ADN bicatenario es capaz de expresar al menos una proteína en la célula a la que va dirigido.
118. Uso de un dendrímero carbosilano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51 o de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 85, 99 ó 100 en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un trastorno o enfermedad producida por un virus o por una alteración en un gen, cuyos síntomas pueden paliarse o eliminarse mediante la utilización de uno o más ARN de interferencia.
119. Uso de un dendrímero carbosilano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51 o de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 85, 101 ó 102 en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un trastorno o enfermedad cuyos síntomas pueden paliarse o eliminarse mediante la administración de un fármaco que tiene carga negativa a pH fisiológico.
120. Uso de un dendrímero carbosilano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51 o de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 85, 103, 104 ó 105 en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un trastorno o enfermedad producido por un virus o prión con cuyo ciclo vital es capaz de interferir el dendrímero.
121. Uso de un dendrímero carbosilano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51 o de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 85 ó 106 en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de un trastorno o enfermedad producido por una bacteria o por un hongo cuya membrana o pared celular es susceptible de ser alterada por el dendrímero.
122. Uso de un dendrímero carbosilano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51 o de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 85 ó 107 en la fabricación de un medicamento destinado a interferir con la formación de o facilitar la disolución de agregados proteicos tales como los que aparecen en la enfermedad de Alzheimer o en las encefalopatías provocadas por priones.
123. Uso de un dendrímero carbosilano según una cualquiera de las reivindicaciones 50 ó 51 o de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 85 ó 108 en la fabricación de un medicamento destinado a desencadenar una respuesta inmune que prevenga o proteja frente a una enfermedad provocada por un organismo que contenga el péptido o resto antigénico presente en el dendrímero.
124. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 24, en el que el resto terminal de las ramificaciones corresponde a la fórmula -(CH2)2C6H3(OCH3)(O(CH2)2N(CH3)2.
125. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 124, en el que el índice
"p" toma el valor 1 y cada ramificación termina con un único resto -(CH2)2C6H3(OCH3)(O(CH2)2N(CH3)2.
126. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 125, que es de primera o de segunda generación.
127. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 29, en el que el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino cuaternizado es el resto -(CH2)2C6H3(OCH3)(O(CH2)2N+(CH3)3r.
128. Un dendrímero carbosilano según Ia reivindicación 127, en el que el índice "p" toma el valor 1 y cada ramificación termina con un único resto
-(CH2)2C6H3(OCH3)(O(CH2)2N+(CH3)3Γ.
129. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 128, que es de primera o de segunda generación.
130. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 29, en el que el resto terminal de las ramificaciones que contiene al menos un grupo amino cuaternizado es el resto -O(CH2)2N(CH3)2(CH2)2NMe3 +2r.
131. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 130, en el que el índice "p" toma el valor 1 y cada ramificación termina con un único resto -O(CH2)2N(CH3)2(CH2)2NMe3 +2r.
132. Un dendrímero carbosilano según la reivindicación 131, que es de primera o de segunda generación.
133. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 77, en el que el compuesto que posee un doble enlace carbono-carbono en un extremo es (CH2=CH-CH2)C6H3(OCH3){O(CH2)2N(CH3)2.
134. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 133, en el que se utilizan cantidades preferentemente estequiométricas de (CH2=CH-CH2)C6H3(OCH3){O(CH2)2N(CH3)2 con respecto al número de enlaces Si-H presentes en el esqueleto de dendrímero carbosilano.
135. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según una cualquiera de las reivindicaciones 133 ó 134, en el que se realiza la etapa opcional c) de cuaternización de grupos amino del dendrímero carbosilano obtenido en la etapa b2) tratándolo con CH3I.
136. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según una cualquiera de las reivindicaciones 133 a 135, en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl terminales tratado en la etapa b2) i) con LiAlH4 se ha obtenido haciendo coincidir la etapa a2) con la etapa a5) de finalización de la obtención del esqueleto del dendrímero carbosilano, obteniéndose en la etapa b) un dendrímero carbosilano de primera generación.
137. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según una cualquiera de las reivindicaciones 133 a 135, en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl terminales tratado en la etapa b2) i) con LiAlH4 se ha obtenido haciendo coincidir la etapa a3) con la etapa a5) de finalización de la obtención del esqueleto del dendrímero carbosilano, obteniéndose en la etapa b) un dendrímero carbosilano de segunda generación.
138. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 62, en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si- Cl terminales se trata en la etapa bl) con 2-[(2-dimetilammoetil)metií]amino etanol (CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2).
139. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 138, en el que se utilizan cantidades preferentemente estequiométricas de
2-[(2-dimetilaminoetil)nietil]amino etanol (CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2) con respecto al número de enlaces Si-Cl terminales presentes en el esqueleto final de dendrímero carbosilano obtenido en Ia etapa a).
140. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 139, en el que se realiza la etapa opcional c) de cuaternización de grupos amino del dendrímero carbosilano obtenido en la etapa bl) tratándolo con un exceso de CH3I, exceso que se calcula con respecto a la cantidad estequiométrica necesaria para la completa cuaternización tanto de los átomos de nitrógeno presentes en los grupos amino terminales de las ramificaciones como de los átomos de nitrógeno presentes en los restantes grupos amino internos que formen parte también de los restos procedentes de la alcohol-amina que constituyen los extremos de las ramificaciones del esqueleto de dendrímero carbosilano.
141. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 140, en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl terminales tratado en la etapa bl) con 2-[(2-dimetüaminoetÍl)metil]amÍno etanol (CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2) se ha obtenido haciendo coincidir la etapa a2) con la etapa a5) de finalización de la obtención del esqueleto del dendrímero carbosilano, obteniéndose en Ia etapa b) un dendrímero carbosilano de primera generación.
142. Un procedimiento de preparación de dendrímeros carbosilano según la reivindicación 14O5 en el que el esqueleto final de dendrímero carbosilano con enlaces Si-Cl terminales tratado en la etapa bl) con 2-[(2-dimetilaminoetil)metil]amino etanol
(CH2OH-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-N(CH3)2) se ha obtenido haciendo coincidir la etapa a3) con la etapa a5) de finalización de la obtención del esqueleto del dendrímero carbosilano, obteniéndose en la etapa b) un dendrímero carbosilano de segunda generación.
143. Una composición según la reivindicación 101, en la que el fármaco con carga negativa es el metotrexato, la heparina o la insulina.
144. Una composición según la reivindicación 143, en la que el dendrímero carbosilano presente se selecciona de NN, NN 16 o IMl 6.
145. Una composición según la reivindicación 144, en la que el dendrímero carbosilano presente es el NN 16 y el fármaco es la insulina.
146. Uso según la reivindicación 119, en el que el medicamento para cuya fabricación se utiliza un dendrímero carbosilano contiene metotrexato, heparina o insulina.
147. Uso según la reivindicación 146, en el que el medicamento contiene insulina.
148. Uso según la reivindicación 146 ó 147, en el que el dendrímero carbosilano utilizado en la fabricación del medicamento se selecciona entre NN5 NNl 6 o IM16.
149. Uso según la reivindicación 148, en el que el dendrímero carbosilano utilizado en la fabricación del medicamento es el NN 16 y el medicamento contiene insulina.
150. Uso de un dendrímero carbosilano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51 para aumentar la tasa de transfección de una molécula de carácter amónico o polianiónico a pH fisiológico con la cual el dendrímero carbosilano forma un complejo a dicho pH.
151. Uso según la reivindicación 150, en el que la molécula de carácter aniónico o polianiónico es un ácido nucleico o un derivado suyo.
152. Uso según la reivindicación 151, en el que el ácido nucleico es un ADN antisentido o un ARN de interferencia.
153. Uso según la reivindicación 151 ó 152, en el que las células a transfectar son células del sistema nervioso o de líneas celulares derivadas del sistema nervioso.
154. Uso según la reivindicación 153, en el que el ácido nucleico cuya tasa de transfección se desea aumentar es un ADN antisentido.
155. Uso según la reivindicación 154, en el que el dendrímero forma un complejo con el ADN antisentido en una relación de cargas negativas: cargas positivas que varía entre 1 :1 y 1:8.
156. Uso según la reivindicación 155, en el que el dendrímero se selecciona entre NN y NN 16.
157. Uso según las reivindicaciones 153 a 156, en el que las células a transfectar son células de la línea U87-MG.
158. Uso según la reivindicación 157, en el que el dendrímero forma un complejo con el ADN antisentido en una relación de cargas negativas: cargas positivas 1 :8.
159. Uso según la reivindicación 158, en el que el dendrímero es el NN.
160. Uso según la reivindicación 158, en el que el dendrímero es el NN 16.
161. Uso según las reivindicaciones 153 a 156, en el que las células a transfectar on células de la línea SK-N-MC.
162. Uso según la reivindicación 161, en en el que el dendrímero forma un complejo con el ADN antisentido en una relación de cargas negativas: cargas positivas 1:4.
163. Uso según la reivindicación 162, en el que el dendrímero es el NN 16.
164. Un kit para aumentar la tasa de transfección de una molécula de carácter aniónico o polianiónico al pH fisiológico que comprende al menos un dendrímero carbosilano según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 51 con el que la molécula de carácter aniónico o polianiónico es capaz de formar un complejo a pH fisiológico.
165. Kit según la reivindicación 1645 en el que las células a transfectar son células del sistema nervioso o células de líneas celulares derivadas del sistema nervioso.
166. Kit según la reivindicación 165, en el que la molécula de carácter aniónico o polianiónico a pH fisiológico cuya tasa de transfección se desea aumentar es un ácido nucleico o un derivado suyo.
167. Kit según la reivindicación 166, en el que el ácido nucleico es un ADN antisentido o un ARN de interferencia.
168. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 166 ó 167» en el que el ácido nucleico está comprendido también en el kit.
169. Kit según la reivindicación 168, en el que el ácido nucleico está comprendido en el kit en una composición separada de la composición de la que forma parte el dendrímero carbosilano.
170. Kit según la reivindicación 168, en el que el ácido nucleico está comprendido en el kit en la misma composición de la que forma parte el dendrímero carbosilano.
171. Kit según la reivindicación 170, en el que el ácido nucleico está comprendido en el kit en la misma composición de la que forma parte el dendrímero en una relación de cargas negativasxargas positivas que varía entre 1:1 y 1 :8.
172. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 164 a 171, en el que el dendrímero carbosilano se selecciona entre el NN y el NNl 6.
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