WO2012017119A2 - Vectores no virales para terapia génica - Google Patents

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WO2012017119A2
WO2012017119A2 PCT/ES2011/070563 ES2011070563W WO2012017119A2 WO 2012017119 A2 WO2012017119 A2 WO 2012017119A2 ES 2011070563 W ES2011070563 W ES 2011070563W WO 2012017119 A2 WO2012017119 A2 WO 2012017119A2
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Valentín CEÑA CALLEJO
Mª del Prado SÁNCHEZ VERDÚ
Sonia Merino Guijarro
Joaquín Calixto GARCÍA MARTÍNEZ
Julián RODRÍGUEZ LÓPEZ
Ester VÁZQUEZ FERNÁNDEZ-PACHECO
María Antonia HERRERO CHAMARRO
Ana Campo Rodrigo
Noelia Rubio Carrero
Francisco PÉREZ MARTÍNEZ
Francisco Javier Guerra Navarro
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Universidad Castilla La Mancha
Nanodrugs, S. L.
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    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation

Definitions

  • the present invention relates to new non-viral vectors, comprising carbon nanostructures that comprise dendrons and / or dendrimers on their surface that are in turn linked to at least one biologically active molecule, for use in gene therapy and its use for The preparation of a medicine.
  • the method of synthesis of said non-viral vectors is described.
  • non-viral vectors in gene therapy is especially relevant, since the FDA has suspended, sine die, clinical trials using viruses (adenoviruses, adeno-associates, etc.) because they generate immune reactions that have caused the death of some patients who They participated in these trials.
  • Viral vectors have several disadvantages, such as, insecurity in their management, toxicity, provocation of an immune response that decreases their effectiveness or lack of cellular specificity. Along with this, these systems are quickly eliminated from the circulation, limiting the process of transfection to first-pass organs (lungs, liver and spleen).
  • dendrimers represent one of these alternatives, since they have a nanometric size, a globular structure, a low polydispersity and a high functional density on the surface with a small molecular volume.
  • the present invention relates to new non-viral vectors for use in gene therapy that solve all the problems that arise in the other routes of action in gene therapy.
  • the present invention relates to the use of a non-viral vector, wherein said non-viral vector comprises: i) a carbon nanostructure comprising dendrons and / or dendrimers on its surface; ii) where dendrons and / or dendrimers are linked with at least one biologically active molecule;
  • carbon nanostructure is understood as: carbon structures that have at least one of their dimensions measured in the order of the nanometer (10 ⁇ 9 m) and that exhibit some kind of unique electromagnetic, optical or structural property which is directly a consequence of its nanometric size.
  • the carbon nanostructures are carbon nanotubes.
  • carbon nanotube is understood to be nanostructures that are constituted by curved and closed hexagonal carbon networks, forming nanometric carbon tubes. They are light, hollow and porous systems that have high mechanical strength, and therefore, interesting for the structural reinforcement of materials and the formation of composites of low weight, high tensile strength and enormous elasticity.
  • the carbon nanotubes are mono (only one tube), bi (two tubes inserted into each other) or multilayers (several tubes inserted into each other).
  • the carbon nanotubes have a diameter that will depend on the number of layers:
  • the carbon nanotubes are cut at the tips and / or their outer layer.
  • the carbon nanostructures and dendrimers are chemically linked by covalent bonds.
  • dendron is understood as a macromolecule with dendritic structure and whose subsequent couplings to other dendrons or nuclei will constitute the dendrimer in its entirety.
  • the amide bond is carried out by amino groups present in the dendrimers and carboxyl groups present on the surface of the carbon nanostructure.
  • dendrimers comprise from 0 to 8 generations, preferably from 2 to 6 generations. When the dendrimer is of generation 0 (G0) it is called dendron.
  • generation is understood as the stages of growth of a dendrimer.
  • the dendrimers have a molecular weight between 300 and 100,000 g / mol, preferably between 1,000 and 10,000 g / mol.
  • the dendrimers have a diameter between 5 to 140 A, preferably have a diameter between 10 and 70 A.
  • the surface group is understood as: amino groups, carboxylic acid groups, ester groups, hydroxyl groups, alkyl groups, quaternized amino groups or other structures such as amino acids or polyethylene glycol.
  • the charge / mass ratio of dendrimers at pH less than 5 is between 0.1 to 10 mmol of positive charges per gram of dendrimer.
  • the dendrimers are soluble in water at pH below 6 both before and after the dendrimers are attached to the carbon nanostructure.
  • the dendrimers in their neutral forms are soluble in methanol both before and after the union of the dendrimers to the carbon nanostructure.
  • n is an integer from 1 to 4.
  • the dendrimers are selected from:
  • PAMAM type dendrimer is understood to be those dendrimers that have a high degree of molecular uniformity, narrow molecular weight distribution, size and specific shape characteristics, and a highly functionalized terminal surface.
  • the manufacturing process is through a series of repetitive steps from a central initiator core. Each step represents a subsequent growth of the new "generation" of polymer with a larger molecular diameter, twice the number of surface groups, and approximately twice the molecular weight of the preceding generation. This is common to any dendrimers, not just those of PAMAM.
  • PAMAM dendrimers are commercial polidoamidoamine dendrimers (by Dendritech, Inc.) and are synthesized by a series of repetitive steps being these aminolysis and addition reactions of Michael, 1, 4.
  • the fourth or sixth generation PAMAM type dendrimers contain gold particles.
  • the gold nanoparticles are not bound to the dendrimer but are encapsulated within it by a steric effect, that is, the dendrimer "cages" the gold nanoparticles.
  • the presence of the gold nanoparticles results in the dendrimer adopting a more rigid conformation.
  • the presence of gold can favor the application of these compounds in resonance imaging or hyperthermia treatments.
  • the PAMAM type dendrimers comprise on their surface quaternary amino groups.
  • the fourth or sixth generation PAMAM type dendrimers are selected from: where R is— CH 2 -CH (OH) -CH 2 -N + (CH 3 ) 3.
  • the biologically active molecule is an oligonucleotide chain and / or an amino acid chain and / or a pharmaceutically active molecule.
  • oligonucleotide is understood as a linear sequence of nucleotides linked by phospho-diester bonds, usually not greater than 50 nucleotides.
  • amino acid chain is understood as the binding of a certain number of amino acids for the formation of a protein with or without enzymatic activity.
  • a pharmaceutically active molecule is understood as any drug in the form of a pharmaceutically acceptable salt for the prevention and / or treatment of any of the diseases to which the non-viral vector described in the present invention is directed.
  • the dendrimers are linked with at least one chain of oligonucleotides and / or amino acids and / or pharmaceutically active molecule through electrostatic interactions and / or covalent bonds, preferably amide and / or ester.
  • electrostatic interaction is understood as the attraction or repulsion of electric charges, in particular the amino groups of the dendrimers and the carboxyl groups of the oligonucleotide and / or amino acid chains and / or of the pharmaceutically active molecules. .
  • Another aspect of the present invention relates to the use of non-viral vectors as described above for the preparation of a drug in gene therapy.
  • Another preferred embodiment relates to the use of the non-viral vectors described above for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of an infection.
  • the infection is bacterial or viral.
  • the infection is caused by the human immunodeficiency syndrome (AIDS) virus.
  • AIDS human immunodeficiency syndrome
  • Another preferred embodiment relates to the use of the non-viral vectors described above for the preparation of a medicament for the treatment of cancer.
  • Another preferred embodiment relates to the use of the non-viral vectors described above for the preparation of a contrast medium or imaging probe comprising said non-viral vector and a radiological marking compound can be used for observation and diagnosis by techniques. Radiological routinely used in clinic.
  • marking compounds are gadolinium or iodine, although it may be anyone known to a person skilled in the art.
  • Another aspect of the present invention relates to a non-viral vector as described above.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising the non-viral vector as defined above and at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the pharmaceutical composition for the manufacture of a medicament.
  • a preferred embodiment relates to the use of the composition described above for the preparation of a medicament for diseases of the nervous system, neurodegenerative diseases and strokes.
  • Another preferred embodiment relates to the use of the composition described above for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of an infection.
  • the infection is caused by the human immunodeficiency syndrome (AIDS) virus.
  • AIDS human immunodeficiency syndrome
  • Another preferred embodiment relates to the use of the composition described above for the preparation of a medicament as an anticancer.
  • Another preferred embodiment relates to the use of the composition described above for the preparation of a medicament for a chronic disease, preferably diabetes and rheumatoid arthritis.
  • Another aspect of the present invention relates to a silencing RNA transfection kit comprising the non-viral vector as defined above.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the silencing RNA transfection kit in primary cultures of nerve cells, glia, tumor cells and primary cells.
  • Another aspect of the present invention relates to a process for the synthesis of non-viral vectors as defined above, which comprises the following steps:
  • the nanostructures are previously cut.
  • the nanostructures are dispersed in at least one solution of DMF (N, N-Dimethylformamide).
  • pharmaceutically acceptable salts, solvates, prodrugs refers to any pharmaceutically acceptable salt, ester, solvate, or any other compound that, when administered to a receptor, is capable of providing (directly or indirectly) a compound as described in This document.
  • pharmaceutically unacceptable salts are also within the scope of the invention since these may be useful in the preparation of salts. pharmaceutically acceptable.
  • the preparation of salts, prodrugs and derivatives can be carried out by methods known in the art.
  • base addition salts include inorganic salts such as, for example, sodium, potassium, calcium, ammonium, magnesium, aluminum and lithium salts, and salts of organic bases such as, for example, ethylenediamine, ethanolamine, N, N - dialkylene ethanolamine, glucamine and basic amino acid salts.
  • Particularly preferred derivatives or prodrugs are those that increase the bioavailability of the compounds of this invention when such compounds are administered to a patient (for example, by making a compound administered orally more easily absorbed by the blood), or which potentiates the release of the original compound in a biological compartment (for example, the brain or lymphatic system) in relation to the original species.
  • the compounds of the present invention may be in crystalline form as free compounds or as solvates and it is intended that both forms are within the scope of the present invention.
  • Solvation methods are generally known within the art. Suitable solvates are pharmaceutically acceptable solvates. In a particular embodiment, the solvate is a hydrate.
  • Said additional drugs may be part of the same pharmaceutical composition or, alternatively, they may be provided in the form of a separate composition for simultaneous or non-simultaneous administration to the pharmaceutical composition comprising the compounds of the present invention or a prodrug, solvate, derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • compositions are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the elaboration of therapeutic compositions.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of the agent or compound capable of developing the therapeutic action determined by its pharmacological properties, calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, due to the characteristics of the compounds, including the age, condition of the patient, the severity of the alteration or disorder, and the route and frequency of administration.
  • said therapeutic composition is prepared in the form of a solid form or aqueous suspension, in a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the therapeutic composition provided by this invention can be administered by any appropriate route of administration.
  • FIG. 1 Analysis of electrophoretic retardation of siRNA by coupling to MAHC17.
  • the numbers in (A) correspond to different volumes of MAHC17 1 mg / ml incubated with 25 ⁇ of siRNA 1, 6 ⁇ and brought to a final volume of 50 ⁇ with H 2 0 free of RNAsas.
  • siRNA For 100nM of siRNA corresponds a concentration of MAHC17 of: (1) 0 ⁇ ig / m ⁇ (siRNA only), (2) 0.5 ⁇ ig / m ⁇ , (3) 1 Mg / ml, (4) 5 ⁇ ig / m ⁇ , (5) 10 ⁇ ig / m ⁇ , (6) 20 ⁇ ig / m ⁇ and (7) 40 ⁇ ig / m ⁇ . Densitometric analysis of the results of the gel delay experiment are shown in (B).
  • FIG. 2 Analysis of electrophoretic retardation of siRNA by coupling to MAHC23.
  • the numbers in (A) correspond to different volumes of MAHC23 1 mg / ml incubated with 25 ⁇ of siRNA 1, 6 ⁇ and taken to a final volume of 50 ⁇ with H 2 0 free of RNAsas.
  • 100nM of siRNA corresponds a concentration of MAHC23 of: (1) 0 g / ml (siRNA only), (2) 5 Mg / ml, (3) 10 Mg / ml, (4) 30 Mg / ml, (5) 40 Mg / ml and (6) 50 Mg / ml.
  • Densitometric analysis of the results of the gel delay experiment are shown in (B).
  • siRNA For 100nM of siRNA corresponds an MAHC28 concentration of: (1) 0 Mg / ml (siRNA only), (2) 1 Mg / ml, (3) 2 Mg / ml, (4) 5 Mg / ml, (5) 10 ⁇ ig / m ⁇ , (6) 15 ⁇ ig / m ⁇ , (7) 20 Mg / ml and (8) 25 ig / m ⁇ .
  • Densitometric analysis of the results of the gel delay experiment are shown in (B).
  • FIG. 5 Analysis of electrophoretic retardation of siRNA by coupling to MAHC29.
  • the numbers in (A) correspond to different volumes of MAHC29 1 mg / ml incubated with 25 ⁇ of siRNA 1, 6 ⁇ and brought to a final volume of 50 ⁇ with H 2 0 free of RNAsas.
  • 100nM of siRNA corresponds a concentration of MAHC29 of: (1) 0 g / ml (siRNA only), (2) 1 Mg / ml, (3) 2 Mg / ml, (4) 5 Mg / ml, (5) 10 Mg ml, (6) 15 Mg ml, (7) 20 Mg / ml and (8) 25 Mg / ml.
  • Densitometric analysis of the results of the gel delay experiment are shown in (B).
  • the numbers in (A) correspond to different volumes of MAHC34 1 mg / ml incubated with 25 ⁇ of 1, 6MM siRNA and brought to a volume final of 50 ⁇ with H 2 0 free of RNAsas.
  • 100nM of siRNA corresponds an MAHC34 concentration of: (1) 0 ⁇ ig / m ⁇ (siRNA only), (2) 2 g / ml, (3) 20 Mg / ml, (4) 40 Mg / ml and ( 5) 50 Mg / ml- Densitometric analysis of the results of the gel delay experiment are shown in (B).
  • FIG. 10 Study of the toxicity of MAHC17 in cortical neurons.
  • FIG. 11. Study of the toxicity of MAHC28 in cortical neurons.
  • FIG. 13. Quantification of the transfection of the fluorescent MAHC28-siRNA complex in cortical neurons (A) and the toxicity produced by the complex (percentage of cells marked with propidium iodide) in this same cell type (B) through cytometry study flow.
  • the complexes were formed with different concentrations of MAHC28 and 100nM of fluorescent siRNA. The treatments lasted 48 hours. Data are expressed as mean (% control) ⁇ SEM, of a minimum of 3 different experiments. * p ⁇ 0.05, compared to the control.
  • FIG. 14 Quantification of the transfection of the fluorescent MAHC29-siRNA complex in cortical neurons (A) and the toxicity produced by the complex (percentage of cells marked with propidium iodide) in this same cell type (B) through cytometry study flow.
  • the complexes were formed with different concentrations of MAHC29 and 100nM of fluorescent siRNA. The treatments lasted 48 hours. Data are expressed as mean (% control) ⁇ SEM, of a minimum of 3 different experiments. * p ⁇ 0.05, compared to the control.
  • FIG. 14 Quantification of the transfection of the fluorescent MAHC29-siRNA complex in cortical neurons (A) and the toxicity produced by the complex (percentage of cells marked with propidium iodide) in this same cell type (B) through cytometry study flow.
  • the complexes were formed with different concentrations of MAHC29 and 100nM of fluorescent siRNA. The treatments lasted 48 hours. Data are expressed as mean (% control) ⁇ SEM, of
  • FIG. 16 Quantification of transfection of the fluorescent CNH35-siRNA complex in rat cerebellum granular neurons (A) and the toxicity produced by the complex (percentage of cells marked with propidium iodide) in this same cell type (B) by his study by flow cytometry.
  • the complexes were formed with different concentrations of CNH35 and 100nM of fluorescent siRNA. The treatments lasted 48 hours. Data are expressed as mean (% control) ⁇ SEM, of a minimum of 3 different experiments. * p ⁇ 0.05, compared to the control.
  • FIG. 17 Study of the effect of the CNH35-S ⁇ RNA or SC RAM BLE (Control) complex against p42MAPK on the gene expression of p42MAPK in cortical neurons using real-time PCR. Quantification of p42MAPK mRNA was performed in cells transfected for 48 hours with CNH35. Data are expressed as mean (% control) ⁇ SEM, of a minimum of 3 different experiments. * p ⁇ 0.05, compared to the control.
  • cut nanotubes 1 20 mg are dispersed in 10 ml of DMF and then 20 mg of EDC (1-ethyl-3- (3- dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) and 20 mg of HOBt (1-hydroxybenzotriazole) are added and stirred for 30 minutes
  • Cerebellar granular neuron culture was obtained according to previously described protocols (Hansen RK J Neurochem. 2007; 103 (4): 1396-407 Peng LA Brain Res Dev Brain Res. 1991; 63 (1-2): 1-12 ) j with minor modifications. Briefly, 7-day-old offspring of the Spragle-Dawley strain were quickly decapitated and the brains were carefully removed. We separated the cerebellum aseptically, removed the meninges and the cerebellum was cut into pieces of about 0.4 mm. The tissue was then exposed to trypsin and DNAse in a culture medium free of calcium and magnesium and seeded in culture plates pretreated with poly-lysine.
  • the cells were cultured in BME medium (basal medium “eagle”) supplemented with 24.5 mM potassium, 2mM glutamine, 10% FBS (fetal bovine serum) and 50 ⁇ g / ml gentamicin.
  • BME medium basic medium “eagle”
  • FBS fetal bovine serum
  • Ara- C cytosine arabinoside
  • cortical neurons The primary culture of cortical neurons was performed according to the methodology previously described (V. Bruno et al., Eur. J. Neurosci., 2001 13: 1469-1478;). Frontolateral cortical lobes were dissected in 17-day fetuses of female rats of the Spragle-Dawley strain and mechanically dissociated in HBSS ("Hank's Buffered Salt Solution"). The cortical lobes were crushed by pipetting about ten times with a Pasteur pipette.
  • the cells were resuspended in Neurobasal culture medium supplemented with B27 serum, 2mM glutamine, 100 U / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin. Cells were seeded in culture plates pretreated with poly-lysine and used no earlier than 7 days after cultivation, which is the time they need to finish differentiating and glutamate receptors appear.
  • the nanotube siRNA complexes were formed by mixing equal amounts of the solution containing the chosen nanotube and the one containing the siRNA ⁇ Chonco L, et al., Org Biomol Chem. 2007 Jun 21; 5 (12): 1886-93 .; Posadas I, et al., Pharm Res. 2009 May; 26 (5): 1181-91), and incubating the mixture under stirring for 30 minutes at room temperature. Both molecules were dissolved in DEPC (diethyl pyrocarbonate) water (free of RNAsas).
  • DEPC diethyl pyrocarbonate
  • the agarose gel delay was used to determine the appropriate concentration to obtain the highest possible binding effectiveness between both molecules ⁇ Haberland A Mol Biol Rep. 2009; 36: 1083-93; Zou K et al Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2008; 147B (6): 769-77).
  • the mixture of different concentrations of nanotube and 250ng of siRNA was tested. The mixture was run for 15 minutes at 60V on a 1.2% agarose gel with 0.017% ethidium bromide. The gels were photographed and the bands were quantified with an appropriate image analysis system (Quantity One). The results can be seen in Figures 1 to 9 for MAHC 17, MAHC23, MAHC24, MAHC28, MAHC29, MAHC32, MAHC33 and MAHC34 and CNH35 respectively.
  • the toxicity of the treatments with the nanotube-siRNA complexes was studied by flow cytometry. To do this, after the treatments, the cells were incubated with 0.5 mg / ml propidium iodide for at least 1 hour at 37 ° C in the dark. The cells were then trypsinized and analyzed in a flow cytometer (FACSCalibur, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). From the evaluation of 10,000 cells per experimental condition, the percentage of cells with the damaged cytoplasmic membrane (positive propidium iodide) was calculated (Weber J Control Relay. 2008 Nov 24; 132 (1): 55-64. Perumal Biomaterials 2008 Aug-Sep; 29 (24-25): 3469-76). The cytotoxicity results for cortical neurons can be seen in Figure 10 for MAHC17 and in Figure 1 1 for MAHC28.
  • the translocation of the nanotube-siRNA complex was also studied by confocal microscopy.
  • the cells were seeded on coverslips and treated in the same way as the previous samples.
  • Cells treated with fluorescent siRNA, alone or forming nanotube-siRNA complexes were visualized and photographed in a confocal microscope (Nikon Eclipse TE200) using the appropriate wavelength for fluorophore excitation with which the siRNA is labeled ⁇ Gras R Pharm Res. 2009 Mar; 26 (3): 577-86).
  • the beta-actin gene was used as a reference gene for all real-time PCR experiments.
  • the reaction was performed using standard procedures for the "StepOnePlus Real-Time PCR System" (Applied Biosystems). In each experiment, the average of the threshold cycle [cycle threshold (C T )] of the triplicates of each of the genes studied and the gene used as a reference was calculated, thus being able to compare the gene expression after the different treatments. The results are shown in Figure 17.

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Abstract

La presente invención se refiere a nuevos vectores no virales, que comprenden nanoestructuras de carbono que comprenden en su superficie dendrones y/o dendrimeros que a su vez están unidos con al menos una molécula biológicamente activa, para su uso en terapia génica y su uso para la elaboración de un medicamento. Además se describe el procedimiento de síntesis de dichos vectores no virales.

Description

VECTORES NO VIRALES PARA TERAPIA GÉNICA
La presente invención se refiere a nuevos vectores no virales, que comprenden nanoestructuras de carbono que comprenden en su superficie dendrones y/o dendrímeros que a su vez están unidos con al menos una molécula biológicamente activa, para su uso en terapia génica y su uso para la elaboración de un medicamento. Además se describe el procedimiento de síntesis de dichos vectores no virales. ESTADO DE LA TECNICA ANTERIOR
El uso de vectores no virales en terapia génica es especialmente relevante, ya que la FDA ha suspendido, sine die, los ensayos clínicos usando virus (adenovirus, adenoasociados, etc) debido a que generan reacciones inmunes que han causado la muerte de algunos pacientes que participaban en dichos ensayos. Los vectores víricos poseen varios inconvenientes, tales como, inseguridad en su manejo, toxicidad, provocación de una respuesta inmune que disminuye su efectividad o falta de especificidad celular. Junto a ello, estos sistemas son rápidamente eliminados de la circulación, limitando el proceso de transfección a órganos de primer paso (pulmones, hígado y bazo).
También hay que tener en cuenta que procesos de recombinación pueden originar un virus replicante aunque el peligro es remoto. No obstante, los problemas que plantean los virus como vectores en terapia génica son serios y los ensayos clínicos de terapia génica en, por ejemplo, Estados Unidos, han sido interrumpidos recientemente por la FDA (Food and Drug Administration) debido a la muerte de varios pacientes por fallo multiorgánico. Este tipo de graves problemas han llevado a la búsqueda y desarrollo de alternativas al uso de los virus como vectores de material génico.
Los vectores no virales poseen una serie de ventajas con respecto a los análogos víricos: a) facilidad en la preparación (incluso a escala multigramo) y modificación, b) mayor flexibilidad con respecto al tamaño del material genético a transfectar, c) son generalmente seguros in vivo y d) no provocan una respuesta inmune específica y por tanto pueden ser administrados repetidamente.
La introducción de nanotubos acoplados a dendrímeros polares como vehículos para la transfección génica se basa en tres factores distintos: (i) el distinto mecanismo que estos aducios poseen para atravesar la membrana celular si lo comparamos con macromoléculas orgánicas como pueden ser los dendrímeros (Podesta, J. E.; Al-Jamal, K. T.; Herrero, M. A.; Han, B.; Ali- Boucetta, H.; Hegde, V.; Bianco, A.; Prato, M.; Kostarelos, K., Antitumor Activity and Prolonged Survival by Carbon-Nanotube-Mediated Therapeutic siRNA Silencing in a Human Lung Xenograft Model Small 2009, 5, 1176-1185); (ii) los dendrímeros de PAMAM Poli(amido amina)), especialmente los de generaciones altas, han demostrado ser tóxicos debido fundamentalmente a procesos de hemolisis y (iii) los nanotubos son inertes químicamente lo que les confiere una alta estabilidad.
Dentro de los vectores no virales, los dendrímeros representan una de estas alternativas, ya que presentan un tamaño nanométrico, una estructura globular, una baja polidispersidad y una alta densidad funcional en la superficie con un pequeño volumen molecular.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
La presente invención se refiere a nuevos vectores no virales para su uso en terapia génica que solventan todos los problemas que se plantean en las otras vías de actuación en terapia génica. Estas ventajas son las siguientes:
- a) Facilidad en la preparación y reproducibilidad del método sintético (incluso a escala multigramo).
- b) Posibilidad de modificación de la superficie del nanotubo pudiendo optimizar sus propiedades de acuerdo a la metodología sintética. - c) Distinto mecanismo que estos aducios poseen para atravesar la membrana celular si lo comparamos con macromoléculas orgánicas como pueden ser los dendrímeros.
- d) Son generalmente seguros in vivo y poco tóxicos.
- e) No provocan una respuesta inmune específica y por tanto pueden ser administrados repetidamente.
Por lo tanto la presente invención se refiere al uso de un vector no viral, donde dicho vector no viral comprende: i) una nanoestructura de carbono que comprende en su superficie dendrones y/o dendrímeros; ii) donde los dendrones y/o dendrímeros están unidos con al menos una molécula biológicamente activa;
En la presente invención, se entiende por nanoestructura de carbono a: estructuras de carbono que poseen al menos en una de sus dimensiones medidas en el orden del nanómetro (10~9 m) y que exhiben algún tipo de propiedad única electromagnética, óptica o estructural que es directamente una consecuencia de su tamaño nanométrico.
Según una realización preferida, las nanoestructuras de carbono son nanotubos de carbono.
En la presente invención se entiende por nanotubo de carbono a nanoestructuras que están constituidas por redes hexagonales de carbono curvadas y cerradas, formando tubos de carbono nanométricos. Son sistemas ligeros, huecos y porosos que tienen alta resistencia mecánica, y por tanto, interesantes para el reforzamiento estructural de materiales y formación de composites de bajo peso, alta resistencia a la tracción y enorme elasticidad. Según otra realización preferida, los nanotubos de carbono son de tipo mono (solo un tubo), bi (dos tubos metidos uno dentro del otro) o multicapas (varios tubos metidos uno dentro de otro). Según otra realización preferida, los nanotubos de carbono tienen un diámetro que dependerá del número de capas:
a) Los nanotubos monocapa están comprendidos entre 0,6 y 3 nm.
b) Los nanotubos de doble capa son dos láminas las que se pliegan en torno a un eje con espacios de 0,3-0,4 nm entre las capas por lo que su diámetro puede estar entre 1 y 4 nm.
c) Los nanotubos multicapas constan de numerosas capas y en cuanto a su diámetro no existe un máximo, actualmente es común llegar hasta unos 80 nm. Según otra realización preferida, los nanotubos de carbono tienen una longitud inferior a 105 nm.
Según otra realización preferida, los nanotubos de carbono están cortados en las puntas y/o en su capa exterior.
Se entiende por nanotubos cortados a aquellos cuya longitud es menor de la inicial ya que se tratan mediante el uso de medio ácido fuerte y calefacción originando grupos carboxílicos y un corte indiscriminado de los nanotubos. El corte da lugar a que los nanotubos se funcionalicen preferentemente en las puntas (es decir, los extremos) de los nanotubos pero también en la capa exterior de los nanotubos. (Liu J.; RinzlerA. G.; Dai H.; Hafner J. H.; Bradley R. K.; Boul P. J.; Lu A; Iverson T.; Shelimov K.;. Huffman C. B; Rodriguez-Macias F.; Shon Y-S; Lee T. R.; Colbert D. T.; Smalley R. E. Science 1998, 280, 1253- 1256; Ziegler K J; Gu Z; Peng H; Flor E L; Hauge R H; Smalley R E J. Am. Chem. Soc, 2005, 127, 1541). Según otra realización preferida, las nanoestructuras de carbono y los dendrímeros están enlazados químicamente mediante enlaces covalentes.
En la presente invención se entiende por dendrímero a una macromolécula tridimensional de construcción arborescente. Los dendrímeros forman parte de los polímeros, pero su diferencia radica en que la distribución de las moléculas que constituyen los polímeros lineales es probabilística, en tanto que en el caso de los dendrímeros, se tiene una estructura química precisa, donde los enlaces químicos entre los átomos pueden ser descritos con exactitud. Las macromoléculas dendriméricas presentan una forma de crecimiento generacional, G0, G1 , G2.
En la presente invención se entiende por dendrón una macromolécula con estructura dendrítica y cuyos posteriores acoplamientos a otros dendrones o núcleos constituirán el dendrímero en su totalidad.
Según otra realización preferida, el enlace covalente se ha formado mediante grupos amino, carboxilo y/o éster presentes en la superficie de la nanoestructura de carbono, preferiblemente mediante un enlace de tipo amida.
Según otra realización preferida, el enlace amida se lleva a cabo mediante grupos amino presentes en los dendrímeros y grupos carboxilo presentes en la superficie de la nanoestructura de carbono. Según otra realización preferida los dendrímeros comprenden desde 0 a 8 generaciones, preferiblemente de 2 a 6 generaciones. Cuando el dendrímero es de generación 0 (G0) se le denomina dendrón.
En la presente invención se entiende por generación a las etapas del crecimiento de un dendrímero. Según otra realización preferida, los dendrímeros tienen un peso molecular comprendido entre 300 y 100.000 g/mol, preferiblemente entre 1 .000 y 10.000 g/mol. Según otra realización preferida, los dendrímeros tienen un diámetro comprendido entre 5 a 140 A, preferiblemente tienen un diámetro comprendido entre 10 y 70 A.
Según otra realización preferida, los dendrímeros comprenden entre 2 y 1 .024 grupos de superficie, preferiblemente entre 4 y 260 grupos de superficie.
En la presente invención se entiende por grupo de superficie a: grupos amino, grupos ácido carboxílico, grupos ester, grupos hidroxilo, grupos alquílicos, grupos amino cuaternizados u otras estructuras como pudieran ser aminoácidos o polietilenglicol.
Según otra realización preferida, los grupos de superficie de los dendrímeros son grupos amino, preferiblemente aminas terciarias y/o primarias, y más preferiblemente estas aminas terciarias y/o primarias estás protonadas a un pH inferior a 6.
Según otra realización preferida, la relación carga/masa de los dendrímeros a pH inferior a 5 es de entre 0, 1 a 10 mmoles de cargas positivas por gramo de dendrímero. Según otra realización preferida, los dendrímeros son solubles en agua a pH inferiores a 6 tanto antes como después de la unión del dendrímeros a la nanoestructura de carbono.
Según otra realización preferida, los dendrímeros en sus formas neutras son solubles en metanol tanto antes como después de la unión del dendrímeros a la nanoestructura de carbono.
Según otra realización preferida, el núcleo de los dendrímeros se selecciona entre i)
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000008_0002
Figure imgf000009_0001
iv)
Figure imgf000009_0002
donde n es un número entero desde 1 a 4.
Según otra realización preferida, los dendrímeros se seleccionan entre:
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000010_0002
y/o los dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación. En la presente invención se entiende por dendrímero tipo PAMAM a aquellos dendrímeros que tienen un alto grado de uniformidad molecular, estrecha distribución del peso molecular, tamaño y características específicas de la forma, y una superficie terminal altamente funcionalizada. El proceso de fabricación es mediante una serie de pasos repetitivos a partir de un núcleo iniciador central. Cada paso representa un crecimiento posterior de la nueva "generación" de polímero con un diámetro molecular más grande, el doble del número grupos de superficie, y aproximadamente el doble del peso molecular de la generación precedente. Esto es común a cualquier dendrímeros, no sólo a los de PAMAM. Los dendrímeros de PAMAM son dendrímeros de polidoamidoamina comerciales (por Dendritech, Inc.) y que se sintetizan mediante una serie de pasos repetitivos siendo estos aminolisis y reacciones de adición de Michael, 1 ,4. Según otra realización preferida, los dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación contienen partículas de oro. Las nanopartículas de oro no están unidas al dendrímero sino que se encuentran encapsuladas dentro del mismo mediante un efecto estérico, es decir, el dendrímero "enjaula" las nanopartículas de oro. La presencia de la nanopartículas de oro da lugar a que el dendrímero adopte una conformación más rígida. Además la presencia de oro puede favorecer la aplicación de estos compuestos en resonancia de imagen o en tratamientos de hipertermia.
Según otra realización preferida los dendrímeros tipo PAMAM comprenden en su superficie grupos amino cuaternarios.
Según otra realización preferida, los dendrímeros tipos PAMAM tienen unidos a través de sus grupos amino cuaternarios un grupo: -CH2-CH(OH)-CH2- N+(CH3)3.
Según otra realización preferida, los dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación se seleccionan entre:
Figure imgf000012_0001
donde R es— CH2-CH(OH)-CH2-N+(CH3)3.
Según otra realización preferida, la molécula biológicamente activa es una cadena de oligonucleótidos y/o una cadena de aminoácidos y/o una molécula farmacéuticamente activa. En la presente invención se entiende por oligonucleótido a una secuencia lineal de nucleótidos unidos por enlaces fosfo-diéster, habitualmente no mayor de 50 nucleótidos.
En la presente invención se entiende por cadena de aminoácidos a la unión de un número determinado de aminoácidos para la formación de una proteína con o sin actividad enzimática.
En la presente invención se entiende por molécula farmacéuticamente activa a cualquier fármaco en forma de sal farmacéuticamente aceptable para la prevención y/o tratamiento de cualquiera de las enfermedades a las que va dirigido el vector no viral descrito en la presente invención. Según otra realización preferida, los dendrímeros están unidos con al menos una cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o molécula farmacéuticamente activa mediante interacciones electrostáticas y/o enlaces covalentes, preferiblemente amida y/o ester.
Según otra realización preferida la interacción electrostática y/o la unión covalente tiene lugar entre una de las posiciones terminales finales las cadenas de oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o de la molécula farmacéuticamente activa y la superficie de los dendrones y/o dendrímeros.
En la presente invención se entiende por interacción electrostática a la atracción o repulsión de cargas eléctricas, en concreto de los grupos amino de los dendrímeros y de los grupos carboxilo de las cadenas de oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o de las moléculas farmacéuticamente activas.
Según otra realización preferida, los dendrímeros están unidos a ADN, ARN, ARN de silenciamiento, micro ARN, antagomir, anticuerpos, proteínas o cualquier combinación de los mismos. En la presente invención se entiende por antagomir a una nueva clase de oligonucleótidos modificados químicamente que se utilizan para silenciar micro ARN endógeno.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de los vectores no virales tal cual han sido descritos anteriormente para la elaboración de un medicamento en terapia génica.
En la presente invención se entiende por terapia génica a la introducción de cualquier tipo de material genético (DNA, RNA, RNAi, siRNA) en el interior de una célula con el objetivo de reponer la función de un gen defectuoso o de eliminar una proteína de forma selectiva para poder interferir con una vía de señalización activada durante la génesis de una enfermedad. Una realización preferida se refiere al uso de los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación de un medicamento para enfermedades del sistema nervioso, enfermedades neurodegenerativas y los accidentes cerebrovasculares.
Otra realización preferida se refiere al uso de los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección.
Según una realización preferida la infección es bacteriana o viral.
Según otra realización preferida la infección es causada por el virus del síndrome de inmunodeficiencia humano (SIDA). Otra realización preferida se refiere al uso de los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
Otra realización preferida se refiere al uso de los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación de un medicamento para una enfermedad crónica, preferiblemente la diabetes y la artritis reumatoide.
Otra realización preferida se refiere al uso de de los vectores no virales descritos anteriormente para la preparación de un medio de contraste o sonda de imagen que comprenda dicho vector no viral y un compuesto de mareaje radiológico pueda ser utilizado para la observación y diagnóstico mediante las técnicas radiológicas habitualmente utilizadas en clínica. Ejemplos no limitantes de dichos compuestos de mareaje son gadolinio o yodo, aunque puede ser cualquiera conocido por un experto en la materia.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un vector no viral como se ha descrito anteriormente. Otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el vector no viral como se definió anteriormente y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Según una realización preferida, la composición farmacéutica además comprende al menos otro principio activo.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de la composición farmacéutica para la elaboración de un medicamento.
Una realización preferida se refiere al uso de la composición descrita anteriormente para la preparación de un medicamento para enfermedades del sistema nervioso, enfermedades neurodegenerativas y los accidentes cerebrovasculares.
Otra realización preferida se refiere al uso de la composición descrita anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección.
Según una realización preferida la infección es bacteriana o viral.
Según otra realización preferida la infección es causada por el virus del síndrome de inmunodeficiencia humano (SIDA).
Otra realización preferida se refiere al uso de la composición descrita anteriormente para la preparación de un medicamento como anticancerígeno.
Otra realización preferida se refiere al uso de la composición descrita anteriormente para la preparación de un medicamento para una enfermedad crónica, preferiblemente la diabetes y la artritis reumatoide. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit de transfeccion de ARN de silenciamiento que comprende el vector no viral tal cual ha sido definido anteriormente. Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del kit de transfeccion de ARN de silenciamiento en cultivos primarios de células nerviosas, glía, células tumorales y células primarias.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la síntesis de los vectores no virales tal cual se definieron anteriormente, que comprende las siguientes etapas:
a. mezclar una disolución de dendrón o dendrímero con una disolución de una cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos biológicamente activos; y
b. añadir la mezcla anterior a una disolución de nanoestructuras previamente dispersadas. Según una realización preferida las nanoestructuras están previamente cortadas.
Según otra realización preferida las nanoestructuras se dispersan en al menos una disolución de DMF (N,N-Dimetilformamida).
Según otra realización preferida, la disolución del dendrón o dendrímero es añadida a una disolución acuosa de HAuCI4 y posteriormente se reduce mediante NaBH4. Según otra realización preferida, las nanoestructuras de carbono han sido previamente funcionalizadas mediante una cicloadición dipolar de iluros de azometino, mediante reacción radicálica de derivados de anilina o mediante oxidación directa de las nanoestructuras para obtener en su superficie grupos carboxilo y anclar sobre ellos grupos amino, y/o éster.
El término "sales, solvatos, prodroga farmacéuticamente aceptables" se refiere a cualquier sal, éster, solvato farmacéuticamente aceptable, o cualquier otro compuesto que, cuando se administra a un receptor es capaz de proporcionar (directamente o indirectamente) un compuesto según se describe en el presente documento. Sin embargo, se apreciará que las sales farmacéuticamente no aceptables también están dentro del alcance de la invención ya que éstas pueden ser útiles en la preparación de sales farmacéuticamente aceptables. La preparación de sales, prodrogas y derivados puede llevarse a cabo mediante métodos conocidos en la técnica.
Por ejemplo, sales farmacéuticamente aceptables de compuestos previstos en el presente documento, se sintetizan mediante métodos químicos convencionales a partir de un compuesto original que contiene un resto básico ó acido. Generalmente, tales sales se preparan, por ejemplo, haciendo reaccionar las formas de ácido o base libre de los compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de sales de adición de ácidos incluyen sales de adición de ácido mineral tales como, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato y sales de adición de acido orgánico tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato. Ejemplos de sales de adición de bases incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, y sales de bases orgánicas tales como, por ejemplo, etilendiamina, etanolamina, N,N- dialquilenetanolamina, glucamina y sales de aminoácidos básicos.
Los derivados o prodrogas particularmente favoritos son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los compuestos de esta invención cuando se administran tales compuestos a un paciente (por ejemplo, haciendo que un compuesto administrado por vía oral se absorba mas fácilmente por la sangre), o que potencia la liberación del compuesto original en un compartimento biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático) con relación a la especie original.
El termino "prodroga" o "profármaco" se usa en su sentido más amplio y abarca aquellos derivados que se convierten en vivo en los compuestos de la invención. Tales derivados serán evidentes para aquellos expertos en la técnica, e incluyen, dependiendo de los grupos funcionales presentes en la molécula y sin limitación, los siguientes derivados de los compuestos presentes esteres, esteres de aminoácido, esteres de fosfato, esteres de sulfonato de sales metálicas, carbamatos, y amidas.
Los compuestos de la presente invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y se pretende que ambas formas están dentro del alcance de la presente invención. Los métodos de solvatación se conocen generalmente dentro de la técnica. Los solvatos adecuados son solvatos farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, el solvato es un hidrato.
Los compuestos descritos en la presente invención, sus sales farmacéuticamente aceptables, profármacos y/o solvatos así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos adicionales para proporcionar una terapia de combinación.
Dichos fármacos adicionales pueden formar parte de la misma composición farmacéutica o, alternativamente, pueden ser proporcionados en forma de una composición separada para su administración simultánea o no a la de la composición farmacéutica que comprende los compuestos de la presente invención o un profármaco, solvato, derivado o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del agente o compuesto capaz de desarrollar la acción terapéutica determinada por sus propiedades farmacológicas, calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración. En otra realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1 , Análisis de retardo electroforético de siRNA por el acoplamiento a MAHC17. Los números en (A) corresponden a diferentes volúmenes de MAHC17 1 mg/ml incubadas con 25μΙ de siRNA 1 ,6μΜ y llevadas a un volumen final de 50μΙ con H20 libre de RNAsas. Para 100nM de siRNA corresponde una concentración de MAHC17 de: (1 ) 0 \ig/m\ (siRNA sólo), (2) 0,5 \ig/m\, (3) 1 Mg/ml, (4) 5 \ig/m\, (5) 10 \ig/m\, (6) 20 \ig/m\ y (7) 40 \ig/m\. El análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
FIG. 2 Análisis de retardo electroforético de siRNA por el acoplamiento a MAHC23. Los números en (A) corresponden a diferentes volúmenes de MAHC23 1 mg/ml incubadas con 25μΙ de siRNA 1 ,6μΜ y llevadas a un volumen final de 50μΙ con H20 libre de RNAsas. Para 100nM de siRNA corresponde una concentración de MAHC23 de: (1 ) 0 g/ml (siRNA sólo), (2) 5 Mg/ml, (3) 10 Mg/ml, (4) 30 Mg/ml, (5) 40 Mg/ml y (6) 50 Mg/ml. El análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B). FIG. 3 Análisis de retardo electroforético de siRNA por el acoplamiento a MAHC24. Los números en (A) corresponden a diferentes volúmenes de MAHC24 1 mg/ml incubadas con 25μΙ de siRNA 1 ,6M M y llevadas a un volumen final de 50μΙ con H20 libre de RNAsas. Para 100nM de siRNA corresponde una concentración de MAHC24 de: (1 ) 0 Mg/ml (siRNA sólo), (2) 5 Mg/ml, (3) 10 Mg/ml, (4) 20 Mg/ml, (5) 40 Mg/ml y (6) 60 Mg/ml. El análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
FIG. 4 Análisis de retardo electroforético de siRNA por el acoplamiento a MAHC28. Los números en (A) corresponden a diferentes volúmenes de MAHC28 1 mg/ml incubadas con 25μΙ de siRNA 1 ,6M M y llevadas a un volumen final de 50μΙ con H20 libre de RNAsas. Para 100nM de siRNA corresponde una concentración de MAHC28 de: (1 ) 0 Mg/ml (siRNA sólo), (2) 1 Mg/ml, (3) 2 Mg/ml, (4) 5 Mg/ml, (5) 10 \ig/m\, (6) 15 \ig/m\, (7) 20 Mg/ml y (8) 25 ig/m\. El análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B). FIG. 5 Análisis de retardo electroforético de siRNA por el acoplamiento a MAHC29. Los números en (A) corresponden a diferentes volúmenes de MAHC29 1 mg/ml incubadas con 25μΙ de siRNA 1 ,6μΜ y llevadas a un volumen final de 50μΙ con H20 libre de RNAsas. Para 100nM de siRNA corresponde una concentración de MAHC29 de: (1 ) 0 g/ml (siRNA sólo), (2) 1 Mg/ml, (3) 2 Mg/ml, (4) 5 Mg/ml, (5) 10 Mg ml, (6) 15 Mg ml, (7) 20 Mg/ml y (8) 25 Mg/ml. El análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
FIG. 6 Análisis de retardo electroforético de siRNA por el acoplamiento a MAHC32. Los números en (A) corresponden a diferentes volúmenes de MAHC32 1 mg/ml incubadas con 25μΙ de siRNA 1 ,6μΜ y llevadas a un volumen final de 50μΙ con H20 libre de RNAsas. Para 100nM de siRNA corresponde una concentración de MAHC32 de: (1 ) 0 g/ml (siRNA sólo), (2) 2 Mg/ml, (3) 10 μg/ml, (4) 20 μg/ml, (5) 30 μg/ml y (6) 50 μg/ml. El análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
FIG. 7.- Análisis de retardo electroforético de siRNA por el acoplamiento a MAHC33. Los números en (A) corresponden a diferentes volúmenes de MAHC33 1 mg/ml incubadas con 25μΙ de siRNA 1 ,6μΜ y llevadas a un volumen final de 50μΙ con H20 libre de RNAsas. Para 100nM de siRNA corresponde una concentración de MAHC33 de: (1 ) 0 Mg ml (siRNA sólo), (2) 2 g/ml, (3) 20 Mg/ml, (4) 40 Mg/ml y (5) 50 Mg/ml. El análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B). FIG. 8.- Análisis de retardo electroforético de siRNA por el acoplamiento a MAHC34. Los números en (A) corresponden a diferentes volúmenes de MAHC34 1 mg/ml incubadas con 25μΙ de siRNA 1 ,6M M y llevadas a un volumen final de 50μΙ con H20 libre de RNAsas. Para 100nM de siRNA corresponde una concentración de MAHC34 de: (1 ) 0 \ig/m\ (siRNA sólo), (2) 2 g/ml, (3) 20 Mg/ml, (4) 40 Mg/ml y (5) 50 Mg/ml- El análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
FIG. 9.- Análisis de retardo electroforético de siRNA por el acoplamiento a CNH35. Los números en (A) corresponden a diferentes volúmenes de CNH35 1 mg/ml incubadas con 25μΙ de siRNA 1 ,6μΜ y llevadas a un volumen final de 50μΙ con H20 libre de RNAsas. Para 100nM de siRNA corresponde una concentración de CNH31 de: (1 ) 0 \ig/m\ (siRNA sólo), (2) 0,5 \ig/m\, (3) 1 Mg/ml, (4) 2 Mg/ml, (5) 3 Mg/ml y (6) 4 Mg/ml. El análisis densitométrico de los resultados del experimento de retardo en gel se muestran en (B).
FIG. 10.- Estudio de la toxicidad de MAHC17 en neuronas corticales. Las células se trataron con diferentes concentraciones de MAHC17 (1 a 30 Mg/ml) durante 48 horas. La viabilidad celular se evaluó cuantificando el porcentaje de LDH liberada al medio de cultivo. Los datos se expresan como media (% control) ± SEM (desviación estándar de la media), n=12. * p <0,05, comparados con el control.
FIG. 11.- Estudio de la toxicidad de MAHC28 en neuronas corticales. Las células se trataron con diferentes concentraciones de MAHC28 (1 a 30 Mg/ml) durante 48 horas. La viabilidad celular se evaluó cuantificando el porcentaje de LDH liberada al medio de cultivo. Los datos se expresan como media (% control) ± SEM, n=12. * p <0,05, comparados con el control.
FIG. 12.- Estudio de la toxicidad de CNH35 en neuronas corticales. Las células se trataron con diferentes concentraciones de CNH35 (1 a 30 Mg/ml) durante 48 horas. La viabilidad celular se evaluó cuantificando el porcentaje de LDH (lactato deshidrogenasa) liberada al medio de cultivo. Los datos se expresan como media (% control) ± SEM, n=12. * p <0,05, comparados con el control. FIG. 13.- Cuantificación de la transfección del complejo MAHC28-siRNA fluorescente en neuronas corticales (A) y de la toxicidad producida por el complejo (porcentaje de células marcadas con yoduro de propidio) en este mismo tipo celular (B) mediante su estudio por citometría de flujo. Los complejos se formaron con distintas concentraciones de MAHC28 y 100nM de siRNA fluorescente. Los tratamientos duraron 48 horas. Los datos se expresan como media (% control) ± SEM, de un mínimo de 3 experimentos diferentes. * p <0,05, comparados con el control.
FIG. 14.- Cuantificación de la transfección del complejo MAHC29-siRNA fluorescente en neuronas corticales (A) y de la toxicidad producida por el complejo (porcentaje de células marcadas con yoduro de propidio) en este mismo tipo celular (B) mediante su estudio por citometría de flujo. Los complejos se formaron con distintas concentraciones de MAHC29 y 100nM de siRNA fluorescente. Los tratamientos duraron 48 horas. Los datos se expresan como media (% control) ± SEM, de un mínimo de 3 experimentos diferentes. * p <0,05, comparados con el control. FIG. 15.- Cuantificación de la transfección del complejo CNH35-siRNA fluorescente en neuronas corticales (A) y de la toxicidad producida por el complejo (porcentaje de células marcadas con yoduro de propidio) en este mismo tipo celular (B) mediante su estudio por citometría de flujo. Los complejos se formaron con distintas concentraciones de CNH35 y 100nM de siRNA fluorescente. Los tratamientos duraron 48 horas. Los datos se expresan como media (% control) ± SEM, de un mínimo de 3 experimentos diferentes. * p <0,05, comparados con el control.
FIG. 16.- Cuantificación de la transfección del complejo CNH35-siRNA fluorescente en neuronas granulares de cerebelo de rata (A) y de la toxicidad producida por el complejo (porcentaje de células marcadas con yoduro de propidio) en este mismo tipo celular (B) mediante su estudio por citometría de flujo. Los complejos se formaron con distintas concentraciones de CNH35 y 100nM de siRNA fluorescente. Los tratamientos duraron 48 horas. Los datos se expresan como media (% control) ± SEM, de un mínimo de 3 experimentos diferentes. * p <0,05, comparados con el control.
Figura 17.- Estudio del efecto del complejo CNH35-SÍRNA o SC RAM BLE (Control) contra p42MAPK sobre la expresión génica de p42MAPK en neuronas corticales mediante real-time PCR. La cuantificación del RNAm de p42MAPK se realizó en células transfectadas durante 48 horas con CNH35. Los datos se expresan como media (% control) ± SEM, de un mínimo de 3 experimentos diferentes. * p <0,05, comparados con el control.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención. Sin embargo, estos ejemplos no son limitativos. Tienen carácter informativo y en ningún caso limitante de las metodologías empleadas, las cuales pueden ser alteradas con el fin de alcanzar unos resultados similares.
En esta memoria descriptiva los símbolos y convenciones usadas en estos procedimientos, esquemas y ejemplos son consistentes con los usados en el Sistema Internacional y la bibliografía científica contemporánea, por ejemplo, el Journal of Medicinal Chemistry. Salvo que se indique otra cosa, todos los materiales de partida se obtuvieron de proveedores comerciales y se usaron sin purificación adicional. Específicamente, se pueden usar las siguientes abreviaturas en los ejemplos y a lo largo de toda la memoria descriptiva: g (gramos); mg (miligramos); Kg (kilogramos); mi (mililitros); μΙ (microlitros); mmol (milimoles); P.f. (punto de fusión); Hz (hertzio); MHz (megahertzio); δ (desplazamiento químico); ppm (partes por millón); s (singlete); d (doblete); t (triplete); q (cuartete); c (quintuplete); m (multiplete); J (constante de acoplamiento); RMN (resonancia magnética nuclear); EM (espectrometría de masas); ES (electrospray); m/z (Relación masa/carga); Anal. (Análisis Elemental); Rto (Rendimiento); TEA (trietilamina); CH2CI2 (diclorometano); CDCI3 (cloroformo deuterado); CD3OD (metanol deuterado) DMSO (dimetilsulfóxido); i.p. (administración parenteral). Todas las temperaturas se expresan en °C (grados Celsius). Ejemplo 1 - Síntesis de los complejos nanotubos-dendrímeros.
COMPUESTO 3 (MAHC34)
20 mg de nanotubos cortados 1 (Liu J.; Rinzler A. G. et al. Science 1998, 280, 1253-1256; Ziegler K J; et al., J. Am. Chem. Soc, 2005, 127, 1541) se dispersan en 10 mi de DMF (dimetil formamida) y seguidamente se adicionan 20 mg de EDC (hidrocloruro de 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida) y 20 mg de HOBt (1 -hidroxibenzotriazol) y se agita durante 30 minutos. Posteriormente se añade una disolución del compuesto 2 (precursor de FJGC 57, 42 mg, 0,1 mmol) en 5 mi de metanol. La mezcla de reacción se calienta a 40 °C durante 24 horas. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE (Politetrafluoroetileno), 0,2 μηπ). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol, agua y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente, finalmente se secan y se obtienen 20 mg del compuesto 3.
Figure imgf000027_0001
Compuesto 5 (MAHC32)
20 mg de nanotubos cortados 1 se dispersan en 10 mi de DMF y seguidamente se adicionan 20 mg de EDC (hidrocloruro de 1 -etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida) y 20 mg de HOBt (1 -hidroxibenzotriazol) y se agita durante 30 minutos.
Posteriormente se añade una disolución del compuesto 4 (70 mg, 0, 1 mmol) en 5 mi de metanol. La mezcla de reacción se calienta a 40 °C durante 24 horas. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 μηπ). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol, agua y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente, finalmente se secan y se obtienen 18 mg del compuesto 5.
Figure imgf000028_0001
Compuesto 7 (MAHC33)
20 mg de nanotubos cortados 1 se dispersan en 10 mi de DMF y seguidamente se adicionan 20 mg de EDC (hidrocloruro de 1 -etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida) y 20 mg de HOBt (1 -hidroxibenzotriazol) y se agita durante 30 minutos.
Posteriormente se añade una disolución del compuesto 6 (140 mg, 0,1 mmol) en 5 mi de metanol. La mezcla de reacción se calienta a 40 °C durante 24 horas. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 μηπ). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol, agua y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente, finalmente se secan y se obtienen 19 mg del compuesto 7.
Figure imgf000029_0001
Compuesto 9 (MAHC35)
15 mg de nanotubos cortados 1 se dispersan en 10 mi de DMF y seguidamente se adiciona 15 mg de EDC y 15 mg de HOBt y se agita durante 30 minutos.
Posteriormente se añade una disolución del compuesto 8 (IR 8, 65 mg, 0,04 mmol) en 5 mi de metanol. La mezcla de reacción se calienta a 40 °C durante 24 horas. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 μηπ). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol, agua y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente, finalmente se secan y se obtienen 14 mg del compuesto 9.
Figure imgf000030_0001
Compuesto 11 (MAHC23)
20 mg de nanotubos cortados 1 se dispersan en 5 mi de DMF y se adiciona gota a gota una disolución acuosa 1 ,6 μΜ del dendrímero (10) (2 x 25 mi, pH 7,5). La mezcla de reacción se calienta a 40 °C durante 24 horas. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 μηπ). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente y finalmente se secan y se obtienen 20 mg del compuesto 11 .
Figure imgf000030_0002
Compuesto 12 (MAHC24)
20 mg de nanotubos cortados 1 se dispersan en 5 mi de DMF y seguidamente se adiciona 20 mg de EDC y 20 mg de HOBt y se agita durante 30 minutos. Posteriormente se añade gota a gota una disolución acuosa 1 ,6 μΜ del dendrímero (10) (2 x 25 mi, pH 7,5). La mezcla de reacción se calienta a 40 °C durante 24 horas. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 μηπ). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente y finalmente se secan y se obtienen 19 mg del compuesto 12.
Figure imgf000031_0001
Síntesis del dendrímero 10 (G6-NH2(Au2oo))- 50,0 mi (2x25 mi) de una disolución 1 ,6 μΜ G6-NH2(Au2oo) se preparó de acuerdo al procedimiento descrito en la literatura {Kim, Y. G.; et al., Chem. Mater., 2004, 16, 167-172). Brevemente, 0,8 mi de una disolución acuosa recién preparada de HAuCI4 10,0 mM se añade a una disolución acuosa 1 ,6 μΜ (concentración final) de PAMAM G6-NH2 (24, 16 mi). El complejo dendrímero-ión metálico se agita durante 1 min. Tras este tiempo, se reduce rápidamente mediante una disolución acuosa recién preparada de NaBH4 1 M (0,04 mi) disuelto en una disolución de hidróxido sódico 0,3 M. El vial se cierra. La reducción ocurre inmediatamente y va acompañada de un cambio de color de amarillo a rosado. Se agita durante 1 h antes de ser utilizado. Estudios de alta resolución de microscopía electrónica revelan que las nanopartículas tienen un diámetro de 2,0 ± 0,3 nm.
Compuesto 13 (MAHC17)
10 mg de nanotubo cortado 12 se dispersan en 10 mi de MeOH (metanol) y se adiciona el epóxido a la mezcla (1 ,4 μηποΙ, 0,2 mg). La mezcla de reacción se calienta a 40 °C durante 24 horas. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 μηπ). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente y finalmente se secan y se obtienen 9 mg del compuesto 13 (MAHC17).
Figure imgf000032_0001
Compuesto 15 (MAHC28).
20 mg de nanotubos cortados 1 se dispersan en 5 mi de DMF y se adiciona gota a gota una disolución acuosa del dendrímero comercial en metanol, PAMAM de cuarta generación (14) (0,09 mmol). La mezcla de reacción se calienta a 40 °C durante 24 horas. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 μηπ). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente y finalmente se secan y se obtienen 20 mg del compuesto 15.
Figure imgf000033_0001
Compuesto 16 (MAHC29)
20 mg de nanotubos de carbono 1 se dispersan en 5 mi de DMF y seguidamente se adiciona 20 mg de EDC y 20 mg de HOBt y se agita durante 30 minutos. Posteriormente se adiciona gota a gota una disolución acuosa del dendrímero comercial en metanol, PAMAM de cuarta generación (14) (0,09 mmol). La mezcla de reacción se calienta a 40 °C durante 24 horas. Tras enfriar la mezcla a temperatura ambiente, el crudo de reacción se filtra empleando un sistema Millipore de membrana (PTFE, 0,2 μηπ). El sólido negro que se recoge tras la filtración, se lava empleando ciclos en los que se combina sonicación y filtración con metanol, acetona y diclorometano hasta que el filtrado sea transparente y finalmente se secan y se obtienen 17 mg del compuesto 16.
Figure imgf000033_0002
Ejemplo 2
Se ha investigado la capacidad de un nanotubo de carbono unido a diferentes dendrímeros con aminas nitrogenadas en su periferia de interaccionar y formar complejos con un RNA de interferencia corto (siRNA), y de vehiculizarlo al interior celular sin producir ningún tipo de citotoxicidad. Materiales y Métodos
Cultivos celulares Cultivos primarios de neuronas granulares de cerebelo de rata
El cultivo de neuronas granulares del cerebelo se obtuvieron conforme a protocolos descritos previamente (Hansen RK J Neurochem. 2007;103(4): 1396- 407 Peng LA Brain Res Dev Brain Res. 1991;63(1-2):1-12)j con pequeñas modificaciones. Brevemente, crías de 7 días de edad de la cepa Spragle- Dawley fueron decapitadas rápidamente y se extrajeron los cerebros cuidadosamente. Separamos el cerebelo asépticamente, quitamos las meninges y se cortó el cerebelo en trozos de unos 0,4 mm. A continuación, se expuso el tejido a tripsina y DNAsa en un medio de cultivo libre de calcio y magnesio y se sembraron en placas de cultivo pretratadas con poli-lisina. Las células se cultivaron en medio BME (medio basal "eagle"} suplementado con 24,5 mM de potasio, 2mM de glutamina, 10% de FBS (suero fetal bovino) y 50μg/ml de gentamicina. A las 24 horas, Ara-C (arabinosido de citosina) se añadió al medio para obtener una concentración final de 10 μΜ para reducir el crecimento de astrocitos. Las células se utilizaron no antes de 7 días tras el cultivo, que es el tiempo que necesitan para terminar de diferenciarse.
Cultivos primarios de neuronas corticales de rata
El cultivo primario de neuronas corticales se realizó de acuerdo a la metodología descrita previamente (V. Bruno et al., Eur. J. Neurosci., 2001 13:1469-1478;). Los lóbulos corticales frontolaterales se disecaron en fetos de 17 días de ratas hembra de la cepa Spragle-Dawley y se disociaron mecánicamente en HBSS ("Hank's Buffered Salt Solution"). Los lóbulos corticales se trituraron pipeteando unas diez veces con una pipeta Pasteur. Después de centrifugar 5 minutos a 800*g, las céulas se resuspendieron en medio de cultivo Neurobasal suplementado con suero B27, 2mM de glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina. Las células se sembraron en placas de cultivo pretratadas con poli-lisina y se utilizaron no antes de 7 días tras el cultivo, que es el tiempo que necesitan para terminar de diferenciarse y que aparezcan receptores de glutamato.
Formación de los complejos nanotubo-siRNA
Los complejos nanotubo siRNA se formaron mezclando cantidades iguales de volumen de la solución que contenía el nanotubo elegido y de la que contenía el siRNA {Chonco L, et al., Org Biomol Chem. 2007 Jun 21;5(12):1886- 93.;Posadas I, et al., Pharm Res. 2009 May;26(5):1181-91 ), e incubando la mezcla en agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. Ambas moléculas se disolvieron en agua DEPC (dietil pirocarbonato) (libre de RNAsas).
Experimentos de retardo en gel del complejo nanotubo-siRNA
El retardo en gel de agarosa se utilizó para averiguar la concentración adecuada para obtener la mayor efectividad de unión posible entre ambas moléculas {Haberland A Mol Biol Rep. 2009; 36:1083-93; Zou K et al Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 2008;147B(6):769-77). Se testó la mezcla de distintas concentraciones de nanotubo y de 250ng de siRNA. La mezcla se corrió durante 15 minutos a 60V en un gel de agarosa al 1 ,2% con 0,017% de bromuro de etidio. Los geles se fotografiaron y las bandas se cuantificaron con un sistema de análisis de imagen apropiado (Quantity One). Los resultados se pueden observar en las figuras 1 a 9 para MAHC 17, MAHC23, MAHC24, MAHC28, MAHC29, MAHC32, MAHC33 y MAHC34 y CNH35 respectivamente.
Estudios de Citotoxicidad
Pruebas para evaluar la toxicidad del nanotubo se realizaron en distintos tipos celulares, determinando la actividad de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) {Posadas I, et al., Pharm Res. 2009 May;26(5):1181). Para ello, las células fueron sembradas en placas de 24 pocilios y se expusieron a soluciones con diferentes concentraciones de nanotubo para realizar curvas de toxicidad concentración-dependiente durante 24, 48 o 74 horas. Los efectos tóxicos se evaluaron midiendo la ruptura de la membrana celular y la consiguiente liberación de la LDH al sobrenadante a través del kit CytoTox96® (Promega). Las células se despegaron mecánicamente, se lavaron con PBS (Phosphate buffered saline) y fueron centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos. La absorbancia del lisado y del sobrenadante celular se midió utilizando un espectofotómetro de microplacas a una longitud de onda de 490 nm.
La toxicidad de los tratamientos con los complejos nanotubo-siRNA, utilizando distintas concentraciones de nanotubo (1 -8 μΜ) en combinación con 100 nM de siRNA, se estudió por citometría de flujo. Para ello, después de los tratamientos, las células se incubaron con yoduro de propidio 0,5 mg/ml al menos durante 1 hora a 37°C en oscuridad. Seguidamente, las células se tripsinizaron y se analizaron en un citómetro de flujo (FACSCalibur, Becton- Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EEUU). A partir de la evaluación de 10.000 células por condición experimental, se calculó el porcentaje de células con la membrana citoplasmática dañada (yoduro de propidio positivas) (Weber J Control Reléase. 2008 Nov 24;132(1):55-64. Perumal Biomaterials. 2008 Aug- Sep;29(24-25):3469-76 ). Los resultados de la citotoxicidad para neuronas corticales se pueden observar en la figura 10 para MAHC17 y en la figura 1 1 para MAHC28.
Estudio del porcentaje de translocación del complejo nanotubo-siRNA al interior celular
Después de 24-72 horas con las células en presencia de los complejos nanotubo-siRNA, utilizando 100nM de siRNA fluorescente para realizarlos, se recogieron los medios condicionados y las células se tripsinizaron y se lavaron con PBS. Las células totales - vivas y muertas - presentes en la suspensión resultante al juntar el tripsinizado celular y el medio condicionado se analizaron en un citómetro de flujo (FACSCalibur, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EEUU). A partir de la evaluación de 10.000 células por condición experimental se calculó el porcentaje de células transfectadas con siRNA fluorescente {Weber J Control Reléase. 2008 Nov 24; 132(1): 55-64. Perumal Biomaterials. 2008 Aug-Sep;29(24-25):3469-76).
La translocación del complejo nanotubo-siRNA también se estudió por microscopía confocal. Para esto, las células se sembraron en cubreobjetos y se trataron del mismo modo que las muestras anteriores. Las células tratadas con siRNA fluorescente, sólo o formando complejos nanotubo-siRNA, se visualizaron y fotografiaron en un microscopio confocal (Nikon Eclipse TE200) utilizando la longitud de onda adecuada para la excitación del fluoróforo con el que el siRNA esta marcado {Gras R Pharm Res. 2009 Mar;26(3):577-86). Los resultados sirvieron para determinar el porcentaje de células positivas para la transfección intracelular de siRNA, y se muestran en las figuras 13 a 15 para los complejos MAHC28-SÍRNA, MAHC29-SÍRNA y CNH35-SÍRNA en neuronas corticales y en la figura 16 para CNH35-SÍRNA en neuronas granulares de cerebelo.
Estudio del silenciamiento génico por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (real-time PCR)
El ARN total celular se aisló mediante un método estándar con tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo (TriPure Isolation Reagent, Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN). El ARN se transformó en cDNA y éste se utilizó para realizar la real-time PCR. Utilizamos la real-time PCR para estudiar el silenciamiento de distintos genes por medio de 100 nM de siRNA vehiculizado con distintas concentraciones de IR8. El gen beta-actina se utilizó como gen de referencia para todos los experimentos de real-time PCR. La reacción se realizó utilizando procedimientos estándar para la "StepOnePlus Real-Time PCR System" (Applied Biosystems). En cada experimento, se calculó la media del ciclo umbral [cycle threshold (CT)] de los triplicados de cada uno de los genes estudiados y del gen utilizado como referencia, pudiendo así comparar la expresión génica tras los diferentes tratamientos. Los resultados se muestran en la figura 17.

Claims

REIVINDICACIONES - Uso de un vector no viral, donde el vector no viral comprende:
i) una nanoestructura de carbono que comprende en su superficie dendrones y/o dendrímeros;
ii) donde los dendrones y/o dendrímeros están unidos con al menos una molécula biológicamente activa;
para la elaboración de un medicamento para terapia génica.
2.- El uso según la reivindicación anterior, donde la nanoestructura de carbono es un nanotubo de carbono.
3. - El uso según la reivindicación anterior, donde el nanotubo de carbono es de tipo mono, bi o multicapas.
4. - El uso según la reivindicación anterior, donde el nanotubo de carbono tiene un diámetro de entre 0,6 y 3 nm cuando es monocapa, de entre 1 y 4 nm en los bicapa y de hasta 80 nm si son multicapa.
5.- El uso según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, donde el nanotubo de carbono tiene una longitud inferior a 105 nm.
6. - El uso según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde el nanotubo de carbono está cortado en las puntas y/o en su capa exterior.
7. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las nanoestructuras de carbono y los dendrones y/o dendrímeros están enlazados químicamente mediante enlaces covalentes.
8.- El uso según la reivindicación anterior, donde el enlace covalente se ha formado mediante grupos amino, carboxilo y/o éster presentes en la superficie de la nanoestructura de carbono.
9. - El uso según la cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde las nanoestructuras de carbono y los dendrones y/o dendrímeros están enlazados mediante un enlace de tipo amida.
10. - El uso según la reivindicación anterior, donde el enlace amida se lleva a cabo mediante grupos amino presentes en los dendrones y/o dendrímeros y grupos carboxilo presentes en la superficie de la nanoestructura de carbono.
1 1 .- El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los dendrones y/o dendrímeros comprenden desde 0 a 8 generaciones.
12. - El uso según la reivindicación anterior, donde los dendrones y/o dendrímeros comprenden de 2 a 6 generaciones.
13. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero tiene un peso molecular comprendido entre 300 y 100000 g/mol, preferiblemente entre 1000 y 10000 g/mol.
14.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero tiene un diámetro comprendido entre 5 y 140 A.
15. - El uso según la reivindicación anterior, donde el dendrón y/o dendrímero tiene un diámetro comprendido entre 10 y 70 A.
16. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el dendrón y/o dendrímero comprende entre 2 y 1024 grupos funcionales de superficie.
17.- El uso según la reivindicación anterior, donde el dendrón y/o dendrímero comprende de 4 a 260 grupos de superficie.
18. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, donde los grupos de superficie son grupos amino, preferiblemente aminas terciarias y/o primarias, y más preferiblemente estas aminas terciarias y/o primarias están protonadas a un pH inferior a 6.
19. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la relación carga/masa de los dendrones y/o dendrímeros a pH inferior a 5 es de entre 0, 1 a 10 mmoles de cargas positivas por gramo de dendrímero.
20.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los dendrones y/o dendrímeros son solubles en agua a pH inferior a 6 tanto antes como después de la unión del dendrímero a la nanoestructura de carbono.
21 . - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde los dendrones y/o dendrímeros en sus formas neutras son solubles en metanol tanto antes como después de la unión del dendrímero a la nanoestructura de carbono.
22. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el núcleo de los dendrones o dendrímeros se selecciona entre:
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000041_0002
Figure imgf000041_0003
Figure imgf000041_0004
donde n es un número entero desde 1 a 4.
23.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, donde los dendrones y/o dendrímeros se seleccionan entre:
Figure imgf000042_0001
y/o los dendrímeros tipo PAMAM de cuarta o sexta generación.
24.- El uso según la reivindicación anterior, donde los dendrímeros tipo
PAMAM de cuarta o sexta generación contienen partículas de oro.
25. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 ó 24, donde los dendrímeros tipo PAMAM comprenden en su superficie grupos amino cuaternarios.
26. - El uso según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, donde los dendrímeros tipos PAMAM tienen unido a través de sus grupos amino cuaternarios un grupo: -CH2-CH(OH)-CH2-N+(CH3)3.
27. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, donde el dendrímero PAMAM de cuarta o sexta generación se selecciona entre:
Figure imgf000043_0001
donde R es— CH2-CH(OH)-CH2-N+(CH3)3.
28. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la molécula biológicamente activa es una cadena de oligonucleótidos y/o una cadena de aminoácidos y/o una molécula farmacéuticamente activa.
29. - El uso según la reivindicación anterior, donde los dendrones y/o dendrímeros están unidos con al menos una cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o a la cadena farmacéuticamente activa mediante interacciones electrostáticas y/o enlaces covalentes, preferiblemente amida y/o ester.
30. - El uso según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde la interacción electrostática y/o la unión covalente tiene lugar entre una de las posiciones terminales finales de las cadenas de oligonucleótidos y/o de aminoácidos y/o de la sustancia farmacéuticamente activa y la superficie de los dendrones y/o dendrímeros.
31 . - El uso según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, donde los dendrímeros están unidos a ADN, ARN, ARN de silenciamiento, micro ARN, antagomir, anticuerpos, proteínas o cualquier combinación de los mismos.
32. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso, enfermedades neurodegenerativas y los accidentes cerebrovasculares.
33. - El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 , para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección.
34. - El uso según la reivindicación anterior donde la infección es bacteriana o viral.
35. - El uso según la reivindicación anterior donde la infección es causada por el virus del síndrome de inmunodeficiencia humano (SIDA).
36.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 , para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
37.- El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 , para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad crónica, preferiblemente la diabetes y la artritis reumatoide.
38.- El uso de los vectores descritos en las reivindicaciones 1 a 31 , para la preparación de un medio de contraste o sonda de imagen que comprenda el vector no viral y una molécula de mareaje radiológico.
39.- Vector no viral como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31 .
40.- Composición farmacéutica que comprende el vector no viral según la reivindicación 39 y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
41 .- Composición farmacéutica según la reivindicación anterior, donde además comprende al menos otro principio activo.
42. - Uso de la composición según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, para la elaboración de un medicamento.
43. - Kit de transfección de ARN de silenciamiento que comprende el vector no viral según la reivindicación 39.
44. - Uso del kit de transfección de ARN de silenciamiento según la reivindicación anterior en cultivos primarios de células nerviosas, glía, células tumorales y células primarias.
45. - Procedimiento para la síntesis de los vectores no virales según la reivindicación 39, que comprende las siguientes etapas:
a. mezclar una disolución de dendrón o dendrímero con una disolución de una cadena de oligonucleótidos y/o de aminoácidos biológicamente activos; y
b. añadir la mezcla anterior a una disolución de nanoestructuras previamente dispersadas.
46. - El procedimiento según la reivindicación anterior, donde las nanoestructuras están previamente cortadas.
47. - El procedimiento según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, donde las nanoestructuras se dispersan en al menos una disolución de DMF.
48. - El procedimiento según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, donde a la disolución del dendrón y/o dendrímero es añadida una disolución acuosa de HAuCI4 y posteriormente se reduce mediante NaBH4.
49. El procedimiento según cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores, donde las nanoestructuras de carbono han sido previamente funcionalizadas mediante una cicloadición dipolar de iluros de azometino, mediante reacción radicálica de derivados de anilina o mediante oxidación directa de las nanoestructuras para obtener en su superficie grupos carboxilo y anclar sobre ellos grupos amino, y/o éster.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109415297A (zh) * 2016-07-01 2019-03-01 布洛斯 & 库珀制药私人有限公司 新型抗生素
DE102017009607A1 (de) 2017-10-17 2019-04-18 Daimler Ag Zuführungs- und Zündvorrichtung für einen Gasmotor und Verfahren zum Betrieb einer Zuführungs- und Zündvorrichtung für einen Gasmotor
WO2022051555A2 (en) 2020-09-03 2022-03-10 Rampart Bioscience, Inc. Soluble alkaline phosphatase constructs and expression vectors including a polynucleotide encoding for soluble alkaline phosphatase constructs

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200307563A (en) * 2002-02-14 2003-12-16 Sixty Inc C Use of BUCKYSOME or carbon nanotube for drug delivery

Non-Patent Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHONCO L ET AL., ORG. BIOMOL. CHEM., vol. 5, no. 12, 21 June 2007 (2007-06-21), pages 1886 - 93
GRAS R PHARM RES., vol. 26, no. 3, March 2009 (2009-03-01), pages 577 - 86
HABERLAND A, MOL. BIOL. REP., vol. 36, 2009, pages 1083 - 93
HANSEN RK, J. NEUROCHEM., vol. 103, no. 4, 2007, pages 1396 - 407
KIM, Y. G. ET AL., CHEM. MATER., vol. 16, 2004, pages 167 - 172
LIU J., RINZLER A. G. ET AL., SCIENCE, vol. 280, 1998, pages 1253 - 1256
LIU J., RINZLER A. G., DAI H., HAFNER J. H., BRADLEY R. K., BOUL P. J., LU A., IVERSON T, SHELIMOV K., HUFFMAN C. B, SCIENCE, vol. 280, 1998, pages 1253 - 1256
PENG LA, BRAIN RES. DEV. BRAIN RES., vol. 63, no. 1-2, 1991, pages 1 - 12
PERUMAL BIOMATERIALS, vol. 29, no. 24-25, August 2008 (2008-08-01), pages 3469 - 76
PODESTA, J. E., AI-JAMAL, K. T, HERRERO, M. A., TIAN, B., ALI-BOUCETTA, H., HEGDE, V., BIANCO, A., PRATO, M., KOSTARELOS, K., ANTITUMOR ACTIVITY AND PROLONGED SURVIVAL BY CARBON-NANOTUBE-MEDIATED THERAPEUTIC SIRNA SILENCING IN A HUMAN LUNG XENOGRAFT MODEL SMALL, vol. 5, 2009, pages 1176 - 1185
POSADAS ET AL., PHARM. RES, vol. 26, no. 5, May 2009 (2009-05-01), pages 1181
POSADAS ET AL., PHARM. RES., vol. 26, no. 5, May 2009 (2009-05-01), pages 1181 - 91
V. BRUNO ET AL., EUR. J. NEUROSCI., vol. 13, 2001, pages 1469 - 1478
WEBER J, CONTROL RELEASE, vol. 132, no. 1, 24 November 2008 (2008-11-24), pages 55 - 64
ZIEGLER K J, GU Z, PENG H, FLOR E L, HAUGE R H, SMALLEY R E, J. AM. CHEM. SOC, vol. 127, 2005, pages 1541
ZIEGLER K. J. ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 127, 2005, pages 1541
ZOU K ET AL., AM. J. MED. GENET. B. NEUROPSYCHIATR. GENET., vol. 147B, no. 6, 2008, pages 769 - 77

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109415297A (zh) * 2016-07-01 2019-03-01 布洛斯 & 库珀制药私人有限公司 新型抗生素
DE102017009607A1 (de) 2017-10-17 2019-04-18 Daimler Ag Zuführungs- und Zündvorrichtung für einen Gasmotor und Verfahren zum Betrieb einer Zuführungs- und Zündvorrichtung für einen Gasmotor
WO2019076581A1 (de) 2017-10-17 2019-04-25 Daimler Ag Zuführungs- und zündvorrichtung für einen gasmotor und verfahren zum betrieb einer zuführungs- und zündvorrichtung für einen gasmotor
WO2022051555A2 (en) 2020-09-03 2022-03-10 Rampart Bioscience, Inc. Soluble alkaline phosphatase constructs and expression vectors including a polynucleotide encoding for soluble alkaline phosphatase constructs

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