WO2005054486A1

WO2005054486A1 - 遺伝子導入試薬調製法

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Publication number: WO2005054486A1
Application number: PCT/JP2004/018426
Authority: WO
Inventors: Tetsuyuki Akao; Kenichi Kusumoto
Original assignee: Fukuoka Prefectural Government
Priority date: 2003-12-05
Filing date: 2004-12-03
Publication date: 2005-06-16
Also published as: JPWO2005054486A1

Abstract

本発明は、自己組織化された陽イオン性両親媒性分子集合体の用途及び調製方法を提供する。当該自己組織化された陽イオン性両親媒性分子集合体を用いれば、非常に高い効率で核酸等の化合物を細胞内に導入することが可能であるので、従来法では導入効率が低かった神経細胞等へも高効率で核酸等の化合物を導入することができ、またｓｉＲＮＡを高効率で細胞内へ導入することができる。

Description

明細書

遺伝子導入試薬調製法技術分野

本発明は、自己糸 1哉化された陽イオン性両親媒性分子集合体の用途、及ぴその調製方法等に関する。背景技術 '

近年、脳腫瘍、ァ /レツハイマー病、パーキンソン病やその他の脳疾患の治療法の一つとして、神経細胞に遺伝子を導入する遺伝子治療に期待が集まっている。しかし、適当な遺伝子導入法がないため、これまで神経細胞への遺伝子導入や薬物運搬について充分な検討がなされなかった。また、遺伝子治療を取り巻く環境においても、最も実用化に近かつたウィルスを用、た遺伝子導入法にお、て導入細胞が癌ィ匕するなどの事故が発生したため、ウィルスを使用しない高効率な遺伝子導入法の開発が求められている。

ウィルスを使用しない細胞内への遺伝子導入法としては、リン酸カルシウム法、 D EAE—デキストラン試薬等を用いた方法や、リポフエクチン（商標名）ゃリポフエクトァミン（商標名）、リポフエクトァミン 2 0 0 0 (商標名）等の陽イオン性リボソームを用いた方法があるが、導入効率が低かったり、多くの場^田胞毒性が認められる。また、マイクロインジェクション法やエレクト口ポレーシヨン法等の機器をもちいる方法は、高価な »を購入しなくてはならない点や、操作に熟練を要する等の問題から大量の細胞を処理するには適さない。

本願発明者らは、従来の遺伝子の細胞内導入方法に換わる、操作が簡単で、細胞毒性がなく、且つ、効率よく細胞内へ遺伝子を導入する方法として、両親媒性分子より構成されたリボソームを用いた方法をした（例えば特許第 1 9 8 4 7 3 7 号、平 7— 2 0 4 2 9等参照）。しかし、例えば神経細胞等の一部の細胞への導入効率は依然充分ではなく、また _s i RNAの導入効率の更なる改善が求められていた。また、ペプチドやタンパク質等を細胞内へ導入する方法としては、例えば Protein Transduction Domain (PTD)と呼ばれるぺプチドをタンパク質等に結合させることにより目的のタンパク質等を細胞内に導入する方法が知られているが（例えば、 Cell, vol. 88, p223-233, 1997等参照）、導入効率や副作用の点から満足できるものではない。発明の開示

上記事情に鑑み、本発明は、高い効率で核酸、ペプチド等の化合物を細胞内へ導入することが可能である陽ィオン性两親媒性分子集合体、及びその調製方法をすることを目的とする。

本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究したところ、例えば、 4 0 °C以下の温度で水性溶媒と陽イオン性両親媒性分子とを混合し、当該陽イオン性両親媒性分子を自己纖化させることにより得られる陽ィオン性両親媒性集合体を用いることで、リボソーム等を用いた従来法と比較して、極めて高い効率で核酸、ぺプチド等の所望の化合物を細胞内へ導入することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本発明は以下に関する。

( 1 ) 陽イオン性両親媒性分子を自己糸纖化させることを赚とする、ィ匕合物の細胞内への導入に用いるための陽イオン性両親媒性分子集合体の調法。

( 2 ) 7性溶媒と陽イオン性両親媒性分子とを混合し、当該陽イオン性両親媒性分子を自己糸!!裁ィ匕させる、上記 ( 1 ) 記載の調製方法。

( 3 ) 4 0 °C以下の温度で水性溶媒と陽ィオン性両親媒性分子とを混合する、上記 ( 2 ) 記載の調法。

( 4 ) 7性溶媒と陽ィオン性両親媒性分子の混合液の? が当該混合液の凝固点以上である、上記（2 ) 記載の調製方法。

( 5 ) 陽イオン性両親媒性分子を自己糸纖化させる工程からなる、上記 ( 1 ) 記載の調製方法。 ( 6 ) 陽ィオン性両親媒性分子が第 4級ァンモニゥム基を有することを樹敷とする、上記 (1) 〜（5) のいずれかに記載の調法。

(7) 陽イオン性両親媒性分子が式（I)

CHs

(式中、 mは 12〜16の整数を、 nは 2〜11の整数を、 Xは B rまたは C 1を示す）

で表される化合物、式（I I)

(式中、 ρは 12〜16の整数を、 qは 2〜11の整数を、 Xは B rまたは C 1を示す）

で表される化合物、式（I I I)

(式中、 rは 12〜16の整数を、 sは 2〜： L 1の整数を、 Xは B rまたは C 1を示す）

で表される化合物、式（I V)

(式中、 tは 12〜16の整数を、 uは 2〜： L 1の整数を、 Xは Brまたは C 1を示す） .

で表される化合物、及ぴ式 (V)

CH₃(CH₂)_V__{1 X + /C}H₃

GH₃(CH₂) 、CH₃

X- (式中、 Vは 12〜 16の整数を、 Xは B rまたは C 1を示す）で表される化合物力、らなる群から選ばれる化合物である上記 (6) 記載の調法。

(8) 陽イオン性両親媒性分子が式（IV) で表される化合物である上記 (7) 記載の調製方法。

(9) t力 S14、 uが 2、 Xが C 1である上記 (8) 記載の調歡法。

(10) ィ匕合物が核酸である上記 (1) 記載の調法。

(11) 上記 (1) 〜（10) のいずれかに記載の調駄法により調製された陽ィオン性両親媒性分子集合体。

(12) 上記 (11) 記載の陽イオン性両親媒性分子集合体と化合物との複合体。

(13) 化合物が核酸である、上記（12) 記載の複合体。

(14) 上記（11) 記載の陽イオン性両親媒性集合体と化合物との複合体と細胞とを撤虫させることを特徴とする、ィ匕合物を細胞内へ導入する方法。

(15) 化合物は核酸である、上記（14) 記載の方法。

(16) 核酸がプラスミド DNAである、上記（15) 記載の方法。

(17) 核酸が s i RNAである、上記（15) 記載の方法。

(18) 細胞が神経細胞である、上記（14) 〜（17) のいずれかに記載の方法。

(19) 上記（11) 記載の陽イオン性両親媒性分子集合体と化合物との複合体を対象に投与することを特徴とする、生体内で化合物を細胞内へ導入する方法。

(20) 上記（11) 記載の陽イオン性両親媒性分子集合体を含む、ィ匕合物を細胞内へ導入するための剤。

(21) 生体内で化合物を細胞内へ導入するための剤である、上記（20) 記載の剤。 (22) 化合物を細胞内へ導入するための剤を製造するための、上記（11) 記載の陽イオン性両親媒性分子集合体の使用。

(23) 該剤は生体内で化合物を細胞内へ導入するための剤である、上記（22) 記載の使用。

(24) 上記 (1) 〜（10) のいずれかに記載の調法で陽イオン性両親媒性分子集合体を調製するためのキットであって、当該陽イオン性両親媒性分子を含むキット。

(25) 上記 (14) 又は（19) 記載の方法で化合物を細胞内へ導入するためのキットであって、当該陽イオン性両親媒性分子又はその集合体を含むキット。

(26) 該化合物は核酸である、上記（25) 記載のキット。

(27) 自己糸 J哉化された陽イオン性両親媒性分子集合体と化合物との複合体。

( 28 ) 自己糸膽化された陽ィオン性両親媒性分子集合体とィ匕合物との複合体と細胞とを接触させることを赚とする、化合物を細胞内へ導入する方法。

(29) 自己 ¾戠化された陽イオン性両親媒性分子集合体と化合物との複合体を対象に投与することを糊敷とする、生体内で化合物を細胞内へ導入する方法。

(30) 自己系纖化された陽イオン性両親媒性分子集合体を含む、化合物を細胞内へ導入するための剤。

(31) 化合物を細胞内へ導入するための剤を製造するための、自己糸 I戠化された陽ィオン性両親媒性分子集合体の使用。

( 32) 上記（11) に記載の陽イオン性両親媒性分子集合体を含む剤、及び当該剤を化合物の細胞内への導入に使用し得る又は使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。

(33) 自己 ¾哉化された陽イオン性両親媒性分子集合体を含 ¾¾、及び当該剤をィ匕合物の細胞内への導入に使用し得る又は使用すべきであることを記載した記載物を含む商業的パッケージ。

本発明の調製方法を用いて調製された陽イオン性両親媒性分子集合体を用いれば、非常に高い効率で核酸を細胞内に導入することが可能であるので、従来法では導入効率が低かった神経細胞等へも高効率で核酸を導入することができ、また s i RN Aを高効率で細胞内へ導入することができる。図面の簡単な説明

図 1は調製方法の違いによる遺伝子（プラスミド DNA) 導入効率の差を示す。白色カラムは 2 5 °Cで調製された集合体を用いた^ \ 黒色カラムは 5 0°Cで調製されたリボソームを用いた場合の遺伝子発田胞の割合を示す。

図 2は調製方法の違いによる siRNA導入効率の差を示す。白丸は 2 5 °Cで調製された集合体を用いた:^、黒丸は 5 0°Cで調製されたリボソームを用いた^^のターゲット遺伝子の発現量を示す。

図 3はマウスの各 βへの siRNA導入の結果を示す^ ¾である。 aは肺、 bは肝臓、 c dは腎臓をそれぞれ示す。発明の詳細な説明

以下、本発明を詳述する。

本発明は自己繊戠化された陽イオン性両親媒性分子集合体の用途及びその調製方法等を^^するものである。

該陽イオン性両親媒性分子集合体は、該集合体が下記に記す用途（例えば化合物の細胞内への導入等）に適用可能である範囲で任意の方法で調製することが可能であるが、好ましい調法として、例えば下記に記すような方法を挙げることが出来る。

本発明の調製方法にぉレ、ては、陽ィオン性両親媒性分子を自己糸赚化させる。該方法は、「陽イオン性両親媒性分子」を用いることを要する。「両親媒性分子」とは、同一分子内に親水部と疎水部とを有する合成分子をいう。

本発明において用いられる両親媒性分子は、陽イオン性であることを要する。陰イオン性である核酸等の化合物と、陽イオン性である両親媒性分子とが非共梳合をし、安定した複合体を形成することができるからである。

当該陽ィオン性両親媒性分子は合成分子であることが好まし、。本発明に用いられる「陽イオン性両親媒性分子」は、自己糸 II戠化された該陽ィォン性両親媒性分子の集合体力 s化合物（核酸等）の細胞内への導入に適用可能である範囲において特に限定されないが、好ましくは親水部に第 4級アンモユウム基を有する。

より好ましくは、本発明に用いられる「陽イオン性両親媒性分子」は、式（I) H₃) ₃ (I)

CHa

(式中、 mは 12〜16の整数を、 nは 2〜11の整数を、 Xは Brまたは C 1を示す）

で表される化合物、式（I I) 、 + 、

(CH₂)_q—， - N(CH₃)₃

χ-

で表される化合物、式（I I I)

0Η₃

(式中、 rは 12〜 16の整数を、 sは 2〜 11の整数を、 Xは B rまたは C' 1を示す）

で表される化合物、式（ I V) GH₃)₃

(式中、 tは 12〜16の整数を、 uは 2〜11の整数、 Xは Brまたは C 1を示す）

で表される化合物、及び式 (V)

CH₃(CH₂)_V—へ +ノ GH₃

>( (V)

CH₃(GH₂)_V_ ^XCH₃

X

(式中、 Vは 12〜 16の整数を、 Xは B rまたは C 1を示す）

で表される化合物である。

ここで、式 (I) 中、 mは好ましくは 12〜14、より好ましくは 12又は 14 である。 nは好ましくは 2〜8であり、より好ましくは 2、 4、 6及ぴ 8からなる群から選ばれるである。 Xは好ましくは B rである。

式（I I) 中、 pは好ましくは 12〜14、より好ましくは 12又は 14である。 qは好ましく fま 2〜6、より好ましくは 2、 4及ぴ 6からなる群から選ばれる整数である。更に好ましくは、 Xが B rであるとき qは 2又は 4であり、 Xが C 1であるとき qは 6である。

式（I I I) 中、 rは好ましくは 12〜： L 4、より好ましくは 12又は 14である。 sは好ましくは 2〜6、より好ましくは 2、 4及ぴ 6からなる群から選ばれる整数、更に好ましくは 2である。

式（IV) 中、 tは好ましくは 12〜14、より好ましくは 12又は 14、更に好ましくは 14である。 uは好ましくは 2〜6、より好ましくは 2、 4及ぴ 6からなる群から選ばれる ¾¾、更に好ましくは 2である。 Xは好ましくは 1である。式（V) 中、 Vは好ましくは 12、 14及ぴ 16からなる群から選ばれるである。 Xは好ましくは B rである。集合体の安定性や、ィ匕合物（核酸等）の導入効率の視点から、上記化合物の中でも、式（I V) で表される化合物が更に好ましい。

即ち、本発明に用いられる、最も好ましい陽イオン性両親媒性分子は、 tが 1 4、が 2、 Xが C 1である式（I V) で表される化合物、即ち式（V I )

で表される化合物である。

式（ I ) 及ぴ（I I ) で表されるィ匕合物は、「Bulletin of the Chemical Society of Japan, vol. 64, p3677 (1991)」、「Journal of the American Chemical Society, vol. 102, p6642(1980)」等に、式（I I I ) 、（I V) 及ぴ (V I ) で表される化合物は rBiochemistry and Molecular Biology International, vol. 34, p915 (1994)」、 Γ Journal of the American Chemical Society, vol. 102, p6642 (1980)」等に、式 (V) で表される化合物は「Journal of the American Chemical Society, vol. 102, P6642 (1980)」等にそれぞれ開示された方法で合成することができる。

調製（例えば混合等）前の陽イオン性両親媒性分子は、特に限定されないが、好ましくは固体であり、更に好ましくは粉体である。

また、調製（例えば混合等）前の陽イオン性両親媒性分子は、特に限定されない力好ましくはリボソームを形成していない。

「陽イオン性両親媒性分子の自己繊戠化」とは、人為的に織哉化を誘導する操作を加えない状態で、 7性溶媒中等において、陽イオン性両親媒性分子同士が疎水結合等の非共有結合を介して集合することにより、集合体を形成することをいう。

し側戠化」とは、分子同士が集合することにより、集合体を形成することをいう。「人為的に |¾戠化を誘導する操作」には、超音波処理、ポノレテックス、エタノー /レ注入法、フレンチ 'プレス法、コール酸法、 C a ²⁺融合法、一融角军法、カロ熱等の物理的な刺激を与える操作が含まれる。従来法のように超音波発生装置等により人為的にリボソームを形成させると、かえって化合物（核酸等）の導入効率が低下する。

本発明において「両親媒性の集合体」とは、両親媒性分子同士が自己糸 II哉化により集合することにより形成された集合体をいい、単一な状態として特定し難いが、当該集合体には、両親媒性^^の疎水部同士が疎水結合し形成される二、リボソーム、多重べシクノレ、ひも状会合体、ディスク状会合体、ラメラ状会合体、ロッド状会合体等及びこれらの混合物;^含まれる。

通常、「两親媒性^^の集合体」は肅己多様な状態の集合体の混合物として存在する。

本癸明の調法においては、陽イオン性両親媒性分子を自己糸纖化させるために、好ましくは水溶性溶媒と当該陽ィオン性両親媒性分子とを混合する。

本発明の調製方法において用いられる「水性溶媒」は、該方法により得られる集合体が化合物の細胞内への導入に適用可能である範囲において特に限定されなレヽが、好ましい水性溶媒としては、水（脱イオン水等）、生理食 ¾¾Κ、リン酸緩衝生理食塩水（P B S) 、当業者が通常の細胞培養で用いる培地（例えば R PM I 1 6 4 0、 DMEM、 HAM F— 1 2、ィーグノ kt咅地等）等が挙げられる。当該水性溶媒は血清等のタンパク質を含有しないことが好ましい。タンパク質は両親媒性分子の自己糸慮化を阻害する可能性があるからである。

性溶媒の ρ Ηは、特に限定されないが、 ρ Η 4〜 1 0の範囲であることが好ましく、より好ましくは ρ Η 7〜8の範囲である。

本発明の調製方法においては、 7_性溶媒と陽ィオン性両親媒性分子との混合液の？显度は、該方法により得られる集合体力 Μ匕合物の細胞内への導入に適用可能である範囲において特に限定されないが、 4 0°C以下であることが好ましい。

当該温度は特に限定されないが、好ましくは 4 0°C以下、より好ましくは 3 8 °C 以下、更に好ましくは 3 6°C以下、最も好ましくは 3 4°C以下である。

4 0°Cを超える温度で陽イオン性両親媒性分子集合体を調製すると、陽イオン性両親媒性分子の自己繊哉化が阻害され、また形成された陽イオン性両親媒性分子集合体が不安定となり、当該集合体を用いた際の化（核酸等）の導入効率が低下する ^がある。

当該混合液のは、操作上の便宜から、当該混合液の凝固点以上であることが好ましレ、。当該凝固点は、水性溶媒の組成、陽イオン性両親媒性分子の種類、濃度等に依存し変ィ匕するため、一律に設定し難いが、当該混合液の献が好ましくは 1 °C 以上、より好ましくは 2 °C以上、更に好ましくは 3¾以上、最も好ましくは 4°C以上であれば多くの齢問題とはならない。

当該温度が凝固点以下であると、混合液が凍結してしまい、操作の続行が困難となる。

即ち、当該混合液の温度は、好ましくは 1 °C以上 4 0 °C以下、より好ましくは 2 °C 以上 3 8 °C以下、更に好ましくは 3 °C以上 3 6 °C以下、最も好ましくは 4 以上 3 4 °C以下の範囲である。

本発明の調製方法の工程をより具体的に説明すると、次の通りである。

即ち、例えばまず水性溶媒と陽イオン性両親媒性分子とを混合することにより、混合液を得る。

当該混合液中の陽ィオン性両親媒性好の濃度は、用いる陽イオン性両親媒性分子の種類等を考慮し適宜設定できる力通常:！〜 2 0 0 mM、好ましくは 1〜 1 0 O mM、より好ましくは 1〜5 O mM、更に好ましくは 5〜 5 0 mM、最も好ましくは 1 O〜 3 0 mMの範囲である。

濃度が低すぎると充分量の陽イオン性両親媒性分子集合体が形成されず、濃度が高すぎると陽イオン性両親媒性分子が析出することがある。

次に、上記混合液をインキュベーションすることで、陽イオン性両親媒性分子が自己糸!^裁ィ匕され、集合体が形成される。「自己糸 1ί戠化」の工程においては、超音波処理等の上記の人為的に! ¾戠化を誘導する操作を行わない。好ましくは混合液を静置又は緩やかに攪拌（例えばピペッティング等）する。

温度をコントロールするために、混合液は恒温槽中でィンキュベーションされるのが好ましい。上記インキュベーションの時間は、用いる陽イオン性两親媒性分子の種類等の条件を考慮し適宜設定することが可能であるが、通常 1〜96時間、好ましくは 1〜 72時間、より好ましくは 1〜48時間、更に好ましくは 1~24時間、最も好ましくは 2〜 24時間の範囲である。

以上の工程により、自己1哉化された陽イオン性両親媒性分子集合体を得ることが出来る。

自己糸 II哉化された陽イオン性両親媒性分子集合体（例えば本発明の調法により調製された該集合体）を用いれば、極めて高い効率で所望の化合物を細胞内へ導入することが可能である。該集合体を用いて細胞内へ導入することが可能である化合物としては、該導入が可能である限り特に限定されないが、例えば、核酸、ぺプチド、タンパク質、脂質、糖、生理活性物質、薬物 (Doxorubicin (抗腫鍵）、 Daunorubicin (抗腫瘍薬）、 Vincristine (抗腫瘍薬）、 Vinblastine (抗腫瘍薬）、 Idarubicin (抗膾瘍薬）、 Dibucaine (局所麻酔薬）、 Propranolol ()3遮断薬）、 Quinidine (不整脈治療薬）、 Dopamine (強心 ·昇圧薬）、 Imipramine (抗うつ薬）、 Diphenhydramine (抗ヒスタミン薬) 、 Quinine (抗マラリア薬) 、 Chloroquine ¾ マラリア薬）、 Diclofenac (抗炎症薬）等）、ィ匕粧品等用の保湿斉 « (マンニトール等）等が挙げられる。

「核酸」としては DN A又は RN Aを用いることができる。

DNAの種類は、使用の目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されないが、例えばプラスミド DNA、アンチセンス DNA、染色体 DNA、 PAC、 B AC等が挙げられ、好ましくはプラスミド DNA、アンチセンス DNAであり、より好ましくはプラスミド DNAである。プラスミド DNA等の環状 DNAは適宜制限酵素等により消化され、線形 DNAとして用いることもできる。

RNAの種類は、使用の目的に応じて適宜選択することができ、特に限定されないが、例えば s i RNA, アンチセンス RNA、メッセンジャー RNA、トランスファー RNA、リポゾ一マル RNA等が挙げられ、好ましくは s i RNA, アンチセンス RNAであり、更に好ましくは s i RNAである。自己系職化された陽イオン性両親媒性分子集合体（例えば本発明の調法により調製された該集合体）を用いると、リボソーム等を用いた従来法と比較して、特に s i R N Aを高い効率で細胞へ導入することが可能である。

核酸は 1〜 3本鎖のレ、ずれも用、ることができる力好ましくは 1本鎖又は 2本鎖である。核酸は、ホスホロチォエート化等の修飾をされていてもよい。

核酸の大きさは、特に限定されず、染色体（人工染色体等）等の巨大な核酸分子

(例えば約 1 0 ⁷ k b pの大きさ）力ら、低分子核酸（例えば約 5 b pの大きさ）を導入することが可能である力細胞内への核酸導入効率を考慮すると、 1 5 k b p 以下であることが好ましい。例えばプラスミド DN Aのような高核酸の大きさとしては、 2〜 1 5 k b p、好ましくは 2〜 1 O k b pが例示される。また、 s i R N Aのような低分子核酸の大きさとしては 5〜 5 0 b p、好ましくは 1 0〜3 0 b p力 S例示される。

核酸は天然に存在するもの又は合成されたもののいずれでもよいが、 1 0 0 b p 程度以下の大きさのものであれば、ホスホトリェチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられる核酸自動合成装置を利用して合成することが可能である。本明において用いられる核酸は、特に限定されないが、当が通常用いる方法により精製されていることが好まし、。

ま†こ、自己糸纖化された陽ィオン性両親媒性分子集合体を用いて細胞内へ導入し得る化合物は、上記陽ィオン性両親媒性分子集合体との複合体の安定性という観点からほ、陰イオン性であること力 S好ましいが、陽イオン性、中性の水溶性化合物のほか、脂溶性化合物であってもよい。

上記陽イオン性両親媒性分子集合体を化合物（核酸等）の細胞内への導入に用いるためには、当該陽イオン性両親媒性集合体と化合物（核酸等）とを接触させることにより、当該集合体と化合物（核酸等）との複合体（以下単に「複合体」と呼ぶことがある）を形成させる。当該集合体は陽イオン性であるので、陰イオン性である化合物（核酸等）と非共猫合をし、安定な複合体が形成される。陽イオン性両親媒性分子集合体と化合物（核酸等）との複合体は、当該集合体を含む水性溶媒と化合物（核酸等）とを混合し、インキュベーションすることにより得られる。

当該水性溶媒の種類は、上述と同様である。

また、当該インキュベーション時の献は、上記陽イオン性両親媒性分子集合体の調製方法におけると同様の範囲で設定されることが好ましい。

当該混合液中の陽ィオン性両親媒性分子集合体の濃度は、用いられる陽ィオン性両親媒性分子の種類等を考慮して適宜設定できるが、通常 0. 05〜 500 mM、例えば 1〜20 OmM、好ましくは:！〜 10 OmM、より好ましくは 1〜5 OmM、更に好ましくは 5〜 50 mM、最も好ましくは 10〜 30 mMの範囲である。

濃度が低すぎると充分量の複合体が形成されず、濃度が高すぎると陽イオン性両親媒'性分子集合体が析出することがある。

混合物中の化合物（核酸等）の濃度は、用いる化合物の種類、サイズ（分子量）等を考慮し適宜設定できるが、該化合物が DNAである場合は通常 3〜： L 00 n _g / n Lの範囲である。

たとえば DNAが通常のプラスミド DNA (サイズが 3kbp@^) であるは、当該混合液中の DNA濃度は好ましくは 10〜 90 n g/μ L、より好ましくは 20〜80 n gZ L、更に好ましくは 30〜70 n g/μ L、最も好ましくは 40〜60ngZ Lの範囲である。

濃度が低すぎると細胞へ導入された DNAが期待された機能を発現することができず、濃度が高すぎるとかえつて核酸導入効率が低下する。

該化合物が RN Aである # ^も、 RN Aのサイズ等を考慮し、濃度を適宜設定できるが、 RN Aのサイズが数 k bp程度である^は、上記混合液中の RNA濃度は、通常 3〜1 OOng L、好ましくは 10〜90ng//iL、より好ましくは 20〜80 n gZ L、更に好ましくは 30〜 70 n g/ L、最も好ましくは 40〜60 n g/ μ Lの範囲である。

RNAが s i RNAのように比較的サイズの小さいものである (22 bp程度）は、 RNA濃度は通常 1〜500 nM、好ましくは 20〜400 nM、より好ましくは 2 0〜3 0 0 nM、更に好ましくは 2 0〜 2 0 0 nM、最も好ましくは 2 0〜： L 0 0 nMの範囲である。

濃度が低すぎると細胞へ導入された RNAが期待された機能を発現することができず、濃度が高すぎるとかえつて核酸導入効率が低下する。

当該集合体を含む水性溶媒と化合物（核酸等）とを混合した後のインキュベーションの時間は、用いる試薬の種類等の条件を考慮し適定することが可能である ί 通常 0. 5〜1 0 0分間、好ましくは 0. 5〜3 0分間、より好ましくは 0 . 5〜1 0分間、更に好ましくは 0. 5〜2分間、最も好ましくは 0. 5〜1分間の範囲である。

インキュベーション時間が短すぎると、ィ匕合物（核酸等）一両親媒性分子集合体

(複合体）の形成が不十分となり、インキュベーション時間が長すぎると、形成された化合物（核酸等）一両親媒性分子集合体（複合体）が不安定化するがあり、それぞれィ匕合物（核酸等）の導入効率が低下する。

上記工程によって、化合物（核酸等）の細胞内への導入に用いる陽イオン性両親媒性分子集合体と化^^ (核酸等）の複合体を含む混合液（以下「複合体含有謙」と記載することがある）を得ることができる。

更に、上記工程で得られた複合体と細胞とを接触させることで、複合体に含まれる化合物（核酸等）を細胞内へ導入することができる。

上記「細胞」の種類は、特に限定されず、原核生物及び,生物の細胞を用いることができるが、好ましくは ¾ ^生物である。

真核生物の種類も、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類（ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ゥシ等）、魚類（ゼブラフィッシュ等）、昆虫（蚕、蛾、ショウジヨウバエ等）、植物、酵母等の微生物等が挙げられる。

当該細胞は、癌細胞を含む培養細胞株であっても、個体や糸職より単離された細胞であってもよい。また、細胞は接着細胞であっても、非接着細胞であってもよい。自己組織化された陽イオン性両親媒性集合体（例えば本発明の調製方法により調製された該集合体）を用いると、リボソーム等を用いた従来法と比較して、特に哺乳動物の細胞（例えば神経細胞、白血球等）へ化合物（核酸等）を高い効率で導入することが可能である。ここで、「神経細胞」、「白血球」は、それぞれ、神織且 '織由来の培養細胞株、白血球由来の培養細胞株を含む。

複合体と細胞とを翻虫させる工程をより具体的に説明すると、例えば次の通りである。

即ち、細胞は当赚合体との擲虫の数日前に適当な培地に懸濁され、適切な条件で培養されることにより、当合体との翻虫時に対数増殖期にあるように調製されることが好ましい。

当該翻虫時の培養液は、血清含培地であっても血清不含培地であってもよいが、培地中の血清濃度は 20 %以下、好ましくは 10 %以下であることが好まし!/、。培地中に過剰な血清等のタンパク質が含まれていると、複合体と細胞との撤虫が阻害される可能性があるからである。

当該繳虫時の細胞濃度は、特に限定されず、細胞の種類等を考慮して適宜設定することが可能であるが、通常 0. 5X 10⁵〜5X 10⁵c e 1 1 s/mL、好ましくは 0. 5X 10⁵〜4 X 10⁵ c e 1 1 s/mL、より好ましくは 0. 5 X 10⁵ 〜3 X 10⁵ c e 1 1 s/mL、更に好ましくは 1 X 10⁵〜3 X 10⁵ c e 1 1 s/ mL、最も好ましくは l X 10⁵〜2X 10⁵c e 1 1 s /mLの範囲である。このように調製された細胞を含む培地に、上述の複合体含有赚を添加する。複合体含有の添加量は、特に限定されず、細胞数等を考慮して適宜設定することが可能であるが、培地 lmLにっき、通常1〜1000 、好ましくは 1〜50 0 L、より好ましくは l〜300/zL、更に好ましくは l〜200/iL、最も好ましくは 1〜 100// Lの範囲である。

培地に複合体含有赚を添加後、細胞を培養する、培養時の温度、湿度、 CO₂濃度等は、細胞の種類を考慮して適宜設定する。哺乳動物の細胞の ^は、通常約 3

7 °C、湿度約 95 %、 C O ₂濃度は約 5 %である。

また、培養時間も用いる細胞の種類等の条件を考慮して適宜設定することが可能であるが、通常 1〜36時間、好ましくは 1〜24時間、より好ましくは 1〜12 時間、更に好ましくは 2〜 8時間、最も好ましくは 3〜 6時間の範囲である。上記培養時間が短すぎると、ィ匕合物（核酸等）が充^!田胞内へ導入されず、培養時間が長すぎると、細胞が弱ることがある。

上記培養により、化合物（核酸等）が細胞內へ導入されるが、好ましくは培地を新鮮な培地と交換するか、培地に纏な培地を添加して更に培養を続ける。細胞が哺乳動物由来の細胞であるは、 βな培地は血清又は栄養因子を含むことが好ましい。

更なる培養の時間は、導入された化合物（核酸等）に期待される機能等を考慮して、適宜設定することが可能であるが、該化合物力 S発現ベクター等のプラスミド D ΝΑである^^は、通常 1 6〜7 2時間、好ましくは 1 6〜6 0時間、より好ましくは 1 6〜4 8時間、更に好ましくは 1 6〜3 6時間、最も好ましくは 1 6〜2 4 時間の範囲であり、該化合物が s i RNAである場合は、通常 1 6〜7 2時間、好ましくは 1 6〜6 0時間、より好ましくは 1 6〜4 8時間、更に好ましくは 1 6〜 3 6時間、最も好ましくは 1 6〜 2 4時間の範囲である。

また、上述の自己細裁化された陽ィオン性雨親媒性分子集合体とィ匕合物との複合体を用いることで、試験管内（in vitro) のみならず、生体内（in vivo) においても該化合物を細胞内へ導入することが可能である。即ち、龍合体を対象に投与することにより、赚合体がターゲットの細胞へ到達 ·纖虫し、生体内で辦复合体に含まれる化合物が細胞内へ導入される。

該複合体を投与可能なとしては、特に限定されず、例えば、ヒトを含む哺乳類（ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ゥシ等）、魚類（ゼブラフイツシュ等）、鳥類（ニヮトリ、ダチョウ等）等の脊椎動物、昆虫（蚕、蛾、 .ショウジョゥパェ等）、植物等を挙げることが出来る。

また、 ¾t合体の投与方法は、ターゲットの細胞へ^ m合体が到達'纖虫し、該複合体に含まれる化合物を細胞内へ導入可能な範囲で特に限定されず、導入されるィヒ合物の種類や、ターゲット細胞の種類や部位等を考慮して、自体公知の投与方法 (経口投与、非経口投与（静脈内投与、筋肉内投与、局所投与、経皮投与、皮下投与、赚内投与等）等）を適宜選択することができる。該複合体の投与量は、化合物の細胞内への導入を達成可能な範囲で特に限定されず、投与 ¾ ^の種類、投与方法、導入される化合物の種類、ターゲット細胞の種類や部位等を考慮し適宜選択することが出来るが、経口投与の、一般的に例えばヒト（6 0 k gとして）においては、その 1回投与量は複合体として約 0. 0 0 1 m g〜 1 0 0 0 0 m gである。非経口的に投与する：^ (例えば静脈内投与等）は、一般的に例えばヒト（6 0 k gとして）においては、その 1回投与量は複合体として約 0. 0 0 0 l m g〜3 0 0 O m gである。他の動物の場合も、 6 O k g当たりに換算した量を投与することができる。

自己糸職化された陽イオン性両親媒性分子集合体を用いれば、極めて高い効率でィ匕合物を細胞内へ導入することが可能であるので、本発明は、該陽イオン性両親媒性分子集合体を含む、生体外又は生体内で化合物を細胞内へ導入するための剤を提供する。該剤は研究用試薬、医薬等として搬さ L る。該剤を上述の方法において用いることによって、容易に所望の化合物を細胞内へ導入することが可能である。自己糸纖化された陽イオン性両親媒性分子集合体を、ィ匕合物を細胞内へ導入するための剤として使用する^ 1ま、常套手段に従って製剤ィ匕することができる。

該剤が研究用試薬として徹されるは、自己繊化された陽ィオン性両親媒性分子集合体は、そのままで、あるいは例えば水もしくはそれ以外の生理学的に許容し得る液（例えば上述の水溶性溶媒等）との無菌性赚、または懸濁液等として撤され得る。該剤は適宜、自体口の生理学的に許容し得る、賦形剤、べヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等を含むことが出来る。

また、該剤が医薬として難されるは、自己糸戠化された陽イオン性両親媒性分子集合体は、そのままで、あるいは薬学的に認められる公知の担体、香麵、賦形剤、べヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって経口剤（例えば錠剤、カブセル剤等）あるいは非経口剤（例えば謝剤等）として製造することができる。錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシゥムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘,、ペパーミント、ァカモノ油またはチェリーのような香などが用いられる。調剤単位形態がカプセルであるには、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。剤用の水性液としては、例えば、生理食、ブドウその他の補助薬を含む等張液（例えば、 D—ソルビトール、 D—マンュトー/レ、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例：エタノール）、ポリアルコール（例：プロピレングリコール、ポリエチレンダリコール）、非イオン性界面活性剤（例：ポリソルベート 8 Ο ^τ ^M、 HC O- 5 0 ) などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。

また、上記剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコユウム、塩酸プロ力インなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フエノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。これらの剤に含まれる自己糸 II哉化された陽イオン性両親媒性分子集合体の含有量は、上記方法において用いられたときに化合物の細胞内への導入が達成されうる範囲において特に限定されず、剤型の種類、導入される化合物の種類等に応じて適宜選択することが可能である。

また、本発明の剤と、所望の化合物とを組み合わせることによって、これらを含む、当該化合物を細胞内へ導入するためのキットとすることもできる。当該キットは、更に上記方法において用いられ得るあらゆる試薬等（例えば上記水溶性溶媒、調製プロトコルが記載された指示書、反応容器等）を更に含むことが出来る。該キットを用いることにより、上述の方法に従い、容易に所望の化合物を細胞内へ導入することが可能である。

あるいは、本発明の剤に含まれる自己！ ¾裁化された陽イオン性両親媒性分子集合体は、細胞内への導入が所望される化合物との複合体であってもよい。また、本発明は、本発明の調 »法により陽イオン性両親媒性、子集合体を調製するためのキットをする。当該キットには少なくとも上記の陽イオン性両親媒性分子が含まれる。当該キットには、更に本発明の調法において用いら H るあらゆる試薬等（例えば上記水溶性溶媒、調製プロトコールが記載された指示書、反応^!等）を更に含むことが出来る。当該キットを用いることにより、上記調製方法に従って容易に化合物の細胞内への導入に用いるための陽イオン性両親媒性分子集合体を調製することが出来る。

また、本発明は、本発明の方法により化合物（核酸等）を細胞内へ導入するためのキットを撤する。当該キットには少なくとも上記の陽イオン性両親媒性好又はその集合体（自己糸纖化された集合体）力 s含まれる。当該キットは、更に上記方法において用いられ得るあらゆる試薬等（例えば、細胞内への導入が所望される化合物、上曾 ¾κ溶性溶媒、試験プロトコールが記載された指示書、反応容器等）を更に含むことが出来る。該キットを用いることにより、上述の方法に従レ、、容易に目的とする化合物を細胞内へ導入することが可能である。

以下、例を示して本発明をより具体的に説明する力本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。実施例

実施例 1

(プラスミド DNAの導入）

陽イオン性両親媒性分子として式 (VI)の化合物（化合物 (VI)と呼ぶ）を用いた。またプラスミド DNAとして、プラスミド pQBI (日本ジーン）を用いた。プラスミド pQBIは CMV-IEプロモーターの下流に GFP遺伝子が挿入されたプラスミドであり、細胞内に導入されると GFPを発現する。

4 0 °C以下ので調製された化合物 (VI)の集合体 4. 3 gとプラスミド pQBI

1. 5 gとを血清不含培地 3 0 μ Lに添加し 3 0秒間ィンキュベートし、プラスミド

PQBIと化合物 (VI)の集合体との複合体を調製した。（ここでは 2 5°Cで調製されたィ匕合物 (VI)の集合体を用いたときの結果を示す。 ) 従来法として、 4 を超える温度で調製された化合物 (VI)のリボソーム 4.3 gとプラスミド pQBIとを血清不^ t咅地 30 μ L·に添し、 5分間ィンキュベートし、プラスミド pQBIと化合物 (VI)のリポソ"ムとの複合体を調製した。（ここでは 50°C で調製された化合物 (VI)のリポソームを用いたときの結果を示す。 )

細胞としては、 Hela (ヒト子宫癌細胞）、 Jurkat (ヒト白血病細胞）、 SME (マウス神経幹細胞）、 CH0 (ハムスター卵巣細胞）を用いた。

細胞は 0.3 mLの血清不^ t咅地中に調製した。ここへ上記複合体を勸口し、 37°C、 5%C0₂の条件で、 4時間培養した。更に 1 mLの 10 % F B S含有培地を添加し、翌日まで培養した。

培養後、細胞を蛍光顕微鏡下観察した。

GFP遺伝子を発現している細胞の割合を、

遺伝子発現細胞 (%) = (GFP発卿胞数田胞数） X I 00

として算出した。結果を図 1に示す。

図 1から明らかなように、 40°C以下ので調製された化合物 (VI)の集合体を用いると、 40°Cを超える温度で調製された化合物 (VI)のリボソームを用いた時と比較して高い効率でプラスミド DNAを細胞内へ導入できる。実施例 2

(s i RNAの導入）

両親媒性分子として式 (VI)の化合物（化合物 (VI)と呼ぶ）を用いた。用いた s i RNAのターゲット遺伝子は EGFPであり、 s i RNAは日本ジーン社製のものを用いた。

40°C以下ので調製されたィ匕合物 (VI)の集合体 4.3 gと 20、 50、 100 nM (調製後における濃度）にそれぞれ調製された s i RNAとを血清不含培地 30 μ Lに添加し、 30秒間ィンキュベートし、 s i R Ν Αと化合物 (VI)の集合体との複合体を調製した。（ここでは 25°Cで調製された化合物 (VI)の集合体を用いたときの結果を示す。 ) 従来法として、 40°C以上ので調製された化合物 (VI) のリボソーム 4.3 g と 20、 50、 100 nM (調 »における濃度）にそれぞれ調製された s i RNAとを血清不含培地 30〃Lに添カ卩し、 5分間インキュベートし、 s i RNAと化^ VI) のリポソームとの複合体を調製した。（ここでは 50°Cで調製された化合物 (VI)のリボソームを用いたときの結果を示す。 )

また、陰 '|¾ ^照として、 40°C以下ので調製されたィ匕合物 (VI)の集合体 4.3 gのみを血清不含培地 0 μ L·に添加し、 5分間ィンキュベートしたものを調製した。

細胞としては、 EGFPを安定的に発現している CH0細胞を用いた。

細胞は 0· 3 m Lの血清不含培地中に調製した。ここへ上記複合体を添加し、 3 7 °C、 5%C0₂の条件で、 4時間培養した。更に 1 m Lの 1 0 % F B S含有培地を添加し、翌日まで培養した。

培養後、細胞を回収し、 EGFPの発現量をフローサイトメトリー法により籠した。 EGFP遺伝子発現量は、陰'性対照細胞の蛍光強度を 1 00%としたときの相対値として算出した。

結果を図 2に示す。

図 2から明らかなように、 40で以下ので調製された化合物 (VI)の集合体を用いると、 40°Cを超える温度で調製された化合物 (VI)のリボソームを用いた時と比較して高い効率で siRNAを細胞内へ導入することができ、ターゲット遺伝子の発現をより強力に抑制できる。実施例 3

(生体内での核酸分子の導入）

両親媒性分子として式 (VI)の化合物（化合物 (VI)と呼ぶ）を用いた。以下の試薬を緩やかなピぺッティングにより混合した。

150 mM NaCl 175 1

DNA又は R A 10^g (1μ /μ1) ΙΟμΙ

1.3 mM化合物 (VI)集合体 15 μ 1 本実施例においては分子のデリパリ一の軒を観察するために核酸分子として、蛍光^ " Cy-3で標識した siRNAを用いた。混合物を室温で 5分間職した後に、調製された赚を BALB/cマウス（7週齢）に尾静脈より ¾Λした。 ¾Λから 4時間後にマウスより肺、肝臓、脾臓及び腎臓を摘出し、小片にカットした後で、蛍光顕微鏡で観察した。図 3及び表 1に結果を示す。

表 1はマウスの各臓器への siRNA導入の結果を示す。表中、 + +は siRNAが約 2 5 %の細胞に導入されていること、 +は約 1 0 %の細胞に導入されていること、土はわずかに導入されていること、一は導入されていないことをそれぞれ示す。

図 3及び表 1に示される通り、化合物 (VI)を用いることにより、生体内の各 β へ siRNAを導入出来た。特に脾臓と肝臓への導入効率力優れていた。産業上の利用可能性

自己裁化された陽ィオン性両親媒性分子集合体（例えば本発明の調法を用いて調製された陽イオン性両親媒性分子集合体等）を用いれば、非常に高い効率で核酸等の化合物を細胞内に導入することが可能であり、遺伝子治療等への応用が可能であるので、医薬産業上有用である。本出願は日本で出願された特願 2 0 0 3 - 4 0 8 2 3 1 (出願日： 2 0 0 3年 1 2月 5日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

1. 陽イオン性両親媒性分子を自己細裁化させることを特徴とする、ィ匕合物の細胞内への導入に用いるための陽イオン性両親媒性分子集合体の調法。

2. 7性溶媒と陽イオン性両親媒性好とを混合し、当該陽イオン性両親媒性分子を自己糸 II戠化させる、請求項 1記載の調製方法。

3. 40で以下の温度で水性溶媒と陽イオン性両親媒性分子とを混合する、請求項 2記載の調製方法。

4. 7j性溶媒と陽ィオン性両親媒性分子の混合液の温度が当該混合液の凝固点以上である、請求項 2記載の調製方法。

5. 陽イオン性両親媒性好を自己 mi戠化させる工程からなる、請求項 1記載の調製方法。

6. 陽ィオン性両親媒性分子が第 4級ァンモニゥム基を有することを特徴とする、請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の調製方法。

7. 陽イオン性両親媒性^^が式（I)

CHg

(式中、 mは 12〜16の整数を、 nは 2〜11の整数を、 Xは Brまたは C1を示す）

で表される化合物、式（I I)

(式中、 ρは 12〜16の整数を、 qは 2〜： L 1の整数を、 Xは Brまたは C1を示す）で表される化合物、式（I I I) ,' , '、

(I I I)

(式中、 rは 12〜： L 6の整数を、 sは 2〜； L 1の整数を、 Xは B rまたは C 1を示す）

で表される化合物、式（IV)

(式中、 tは 12〜16の整数を、 uは 2〜： 11の整数を、 Xは B rまたは C 1を示す）

で表される化合物、及ぴ式 (V)

(式中、 Vは 12〜16の整数を、 Xは B rまたは C 1を示す）で表される化合物からなる群から選ばれる化合物である請求項 6記載の調製方法。

8. 陽イオン性両親媒性分子が式 (IV) で表される化合物である請求項 7記載の調製方法。

9. t力 14、 uが 2、 Xが C 1である請求項 8記載の調法。

10. ィ匕合物が核酸である請求項 1記載の調製方法。

11. 請求項 1〜10のいずれか 1項に記載の調法により調製された陽イオン性両親媒性分子集合体。

12. 請求項 11に記載の陽イオン性両親媒性分子集合体と化合物との複合体。

13. 化合物が核酸である、請求項 12記載の複合体。

1 4. 請求項 1 1に記載の陽ィオン性両親媒性分子集合体とィ匕合物との複合体と細胞とを撤虫させることを樹敫とする、化合物を細胞内へ導入する方法。

1 5 . 化合物は核酸である、請求項 1 4記載の方法。

1 6 . 核酸がプラスミド DNAである、請求項 1 5記載の方法。

1 7. 核酸が s i RNAである、請求項 1 5記載の方法。

1 8 . 細胞が神経細胞である、請求項 1 4〜1 7のいずれか 1項に記載の方法。

1 9 . 請求項 1 1記載の陽イオン性両親媒性分子集合体と化合物との複合体を ¾·象に投与するこどを特徴とする、生体内で化合物を細胞内へ導入する方法。

2 0. 請求項 1 1記載の陽イオン性両親媒性分子集合体を含む、ィ匕合物を細胞へ導入するための剤。

2 1 . 生体内で化合物を細胞内へ導入するための剤である、請求項 2 0記載の剤。

2 2. ィ匕合物を細胞内へ導入するための剤を製造するための、請求項 1 1記載の陽ィオン性両親媒性分子集合体の使用。

2 3 . 該剤は生体内で化合物を細胞内へ導入するための剤である、請求項 2 2曹己载の使用。

2 4. 請求項 1〜 1 0のレヽずれか 1項に記載の調法で陽ィオン性両親媒性分子集合体を調製するためのキットであって、当該陽イオン性両親媒性分子を含むキッ

2 5 . 請求項 1 4又は 1 9記載の方法で化合物を細胞内へ導入するためのキットであって、当該陽イオン性両親媒性分子又はその集合体を含むキット。

2 6 . 該化合物は核酸である、請求項 2 5記載のキット。

2 7. 自己編哉化された陽イオン性両親媒性分子集合体と化合物との複合体。

2 8 . 自己糸纖化された陽ィオン性両親媒性分子集合体と化合物との複合体と細胞とを掘虫させることを特徴とする、ィ匕合物を細胞内へ導入する ^去。

2 9 . 自己繊戠化された陽イオン性両親媒性分子集合体と化合物との複合体を対象に投与することを特徴とする、生体内で化合物を細胞内へ導入する方法。

3 0. 自己糸慮化された陽イオン性両親媒性分子集合体を含む、ィ匕合物を細胞内へ導入するための剤。

3 1 . 化合物を細胞内へ導入するための剤を製造するための、自己糸纖化された陽ィオン性両親媒性好集合体の使用。