KR20140041593A - 아미노 지질, 이의 합성 및 이의 용도 - Google Patents

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파벨 레브킨
린시안 리
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Abstract

본 발명은 새로운 아미노 지질 및 이들 화합물을 합성하기 위한 간편한 방법을 제공한다. 이들 (양이온성) 아미노 지질은 형질감염제로서 우수한 특성을 가진다. 본 방법은 다양한 아미노 지질을 제조하여 형질감염제에 대한 조합 라이브러리를 어셈블리할 수 있는, 경제적이고 다목적인 2 단계 합성법이다. 아울러, 본 발명은 상기 아미노 지질을 포함하는 지질 입자 (리포솜) 및 생활성 물질을 세포에 전달하기 위한 이의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 의약제로서 양이온성 아미노 지질을 포함하는 지질 입자의 용도를 포함한다.

Description

아미노 지질, 이의 합성 및 이의 용도 {AMINO LIPIDS, THEIR SYNTHESIS AND USES THEREOF}
본 발명은 새로운 아미노 지질 및 이의 합성 방법을 제공한다. 이들 (양이온성) 아미노 지질은 형질감염제로서 우수한 특성을 가지고 있다. 이것은 지질 입자, 특히 리포솜의 제조에 이용될 수 있어, 세포에 생활성 물질을 전달할 수 있다. 합성이 단순하여, 키트와 같은 방식으로 아미노 지질의 조합 라이브러리를 개발할 수 있다. 이러한 라이브러리에 포함되는 화합물들을 대상으로, 특정한 특성, 특히 다양한 세포주에서의 형질전환에 대해 스크리닝할 수 있다. 또한, 본 발명은 의약제로서 (양이온성) 아미노 지질을 함유한 지질 입자의 용도도 포괄한다.
세포를 핵산과 같은 생활성 물질로 형질감염시키는데 사용되는 다양한 시약들 중에서도, 리포솜 매개 전달을 기반으로 하는 시약이 가장 효과적인 것으로 널리 공지되어 있다. 그 이유는, 대부분, 이의 효율성과 사용 용이성 때문이다. 리포솜은 지질 2중층의, 인공적으로 제조된 구형 소낭이다. 분자를 작용 부위에 전달하기 위해, 지질 2중층이 세포 막과 같은 다른 2중층과 융합하여, 리포솜의 내용물을 세포 안으로 전달할 수 있다.
리포솜은 이의 독특한 특성으로 인해 약물 전달에 사용되고 있다. 리포솜은 소수성 막으로 내부 수용액 영역을 둘러싸고 있어; 용해된 친수성 용질이 쉽게 지질을 통과하지 못한다. 소수성 화학물질은 막에 용해될 수 있으며, 이런 방식으로 리포솜은 소수성 분자와 친수성 분자를 둘다 보유할 수 있다. 리포솜은 약물, 핵산, 펩타이드 등과 같은 생활성 물질과 조합될 수 있으며, 세포의 생화학적 경로를 조절하기 위해 이들 물질들을 전달하는데 이용될 수 있다. 이런 점은 새로운 질병 치료법의 가능성을 열어준다.
Gershon 등 (Gershon H, et al. Mode of formation and structural features of DNA-cationic liposome complexes used for transfection. Biochemistry. 1993, 32:7143-7151)은, 양이온성 리포솜과 핵산 간에 형성되는 나노입자가 DNA와 RNA를 세포로 전달하기 위한 효율적인 비히클이라고 언급하였다. 양이온성 리포솜이 먼저 DNA 분자에 결합하여, 핵산과 더불어 응집된 비히클 클러스터를 형성한다. 리포솜 임계 밀도에서는, 2가지 공정, 즉 DNA-유도성 막 융합과 리포솜-유도성 DNA 응축이 발생한다. DNA 응축은 신속하고 고도로 협동적인 공정으로 융합된 지질 2중층에 의해 완전히 둘러싸일 수 있는 응축된 구조가 형성되게 한다.
음으로 하전된 핵산을 전달하기 위해서는, 양이온성 지질이 가장 효과적인 형질감염제이다. 양이온성 지질은 DNA를 전달용 합성 물질로서 기대되는 대표적인 유형의 물질이다. 지금까지, 수 종의 양이온성 지질들이 시판되고 있지만, 유전자를 안전하고 효과적으로 전달하기 위한 양이온성 지질의 수는 여전히 한정적이다.
"유전자 전달을 위한 양이온성 리포솜" (Miller AD, Angew Chem Int Ed. 1998, 37:1768-1785)에는, 일반적으로 사용되고 있으며, 시판되는 대부분의 형질감염제들이 기술되어 있다. 그러나, 기존의 지질 합성법은, 통상적으로, 화학적 보호 및 탈보호, 촉매의 사용과 제거, 용매 치환 및 정제 등의 시간-집약적인 공정들을 비롯하여, 개별적으로 최적화된 다단계 합성을 필요로 한다.
WO 01/42200에서는 양이온성 양친매성 화합물의 예들과 이의 형질감염제로서의 약학 조성물의 용도를 기술하였다. 이 문헌에 기술된 화합물들은 시간이 소모되는 다단계 합성으로 제조된다.
양이온성 지질은, 세포막과 보다 효과적으로 융합할 수 있는 리포솜을 형성하기 위해서는, 천연 인지질 (헬퍼 지질로 지칭됨)과 조합되어야 한다. 리포솜은, 단독으로는 타겟 세포의 막을 통해 확산할 수 없는 DNA나 약물과의 조합에 의해, 이를 지질 2중층을 통과하여 (무차별적으로) 전달할 수 있다. DNA를 숙주 세포에 형질전환 또는 형질감염시키기 위해 리포솜을 사용하는 것을 리포펙션 (lipofection)이라고 한다.
리포솜 시약이 세포 형질감염제로서 당해 기술 분야에 대표적인 것이지만, 다음과 같은 문제점들이 있다:
1. 다수의 세포주 (예, 일차 세포)들은 리포솜 시약을 이용하더라도 현재 효율적인 형질감염을 달성할 수 없다.
2. 리포솜은 상대적으로 합성하기 어렵고 비용이 많이 들어, 대게 최종 사용자에게 고가이다.
2번째의 이유로, 많은 실험실에서는 효율은 낮지만 저렴한 형질감염 대체제 (예, 칼슘 포스페이트)를 사용하고 있다. 이에, 합성이 용이하고 매우 다양한 타입의 세포들에서 우수한 형질감염 효율을 나타내는, 새로운 형질감염제가 실제적으로 요구되고 있다. 대안책으로서, 다양한 여러가지 화합물들을 제조할 수 있는 간편한 형질감염제의 조합 합성법을 제공하는 것도 도움이 될 것이다.
당해 기술 분야의 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 새로운 양이온성 아미노 지질과 이의 합성 방법을 제공하는 것이다. 본 방법은 보편적으로, 경제적이고, 실행이 용이하여야 한다. 이러한 보편적인 방법으로 양이온성 아미노 지질 라이브러리의 개발이 가능하다. (수백개의 다른 지질 분자들을 포함하는) 이러한 지질 라이브러리의 구축은 최상의 형질감염제 특성을 구비한 지질의 동정율을 크게 향상시킨다.
본 발명의 다른 목적은 상기 양이온성 아미노 지질을 포함하는 지질 입자, 특히 리포솜을 제공하는 것이다. 특히, 이들 지질 입자 또는 리포솜은 세포 막을 통해 생활성 물질을 전달할 수 있어야 한다. 다른 목적은 상기 지질 입자 또는 리포솜의 질병 치료 용도이다.
본 발명은 일반식 (I)의 신규한 아미노 지질을 제공한다:
Figure pct00001
상기 식에서, R1 및 R2는 동일하거나 상이하며, 독립적으로, C6-C24 알킬, C6-C24 알케닐, C6-C24 알키닐 또는 C6-C24 아실이되, 이들은 선택적으로 C1-C6 하이드로카르빌기로 치환될 수 있으며,
X1 및 X2는 동일하거나 상이하며, S, S=O 또는 S(=O)2이며,
Y는 식
Figure pct00002
의 아미드, 에스테르 또는 헤테로사이클릭 아미드이되, 이때 k와 l은 0-2의 정수이고,
R3 및 R4는 동일하거나 상이하며, 독립적으로, C1-C12 알킬, C1-C12 알케닐 또는 C1-C12 알키닐이되, 여기서 알킬, 알케닐 또는 알키닐은 선택적으로 C1-C6 하이드로카르빌기로 치환될 수 있거나,
또는 R3 및 R4가 연결되어, 질소, 티올 및 산소로부터 선택되는 0-6개의 이종원자를 가진 원자수 3-10의 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있으며,
R5는 생략되거나, 또는 수소 또는 4급 아민을 제공하기 위한 C1-C12 알킬이며,
m은 1 내지 12의 정수이고,
n은 2 내지 12의 정수이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, R1 및 R2는 동일하거나 상이하며, 독립적으로 C6-C24 알킬이며, 보다 바람직하게는, R1과 R2는 동일한 C6-C18 알킬이다.
또한, 본 발명은 일반식 (II)의 아미노 지질을 제공한다:
Figure pct00003
상기 식에서,
R1 및 R2는 동일한 C6-C18 알킬이고,
Y는 식
Figure pct00004
의 아미드, 에스테르 또는 헤테로사이클릭 아미드이되, k와 l은 0 내지 2의 정수이고,
R3 및 R4는 동일하거나 상이하며, 알킬이 C1-C6 하이드로카르빌기로 선택적으로 치환될 수 있는, C1-C12 알킬이거나,
또는 R3 및 R4는 연결되어, 질소, 티올 및 산소로부터 선택되는 0-6개의 이종원자를 가진 원자수 3 내지 10의 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있으며,
m은 1-12의 정수이고,
n은 2-12의 정수이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, Y는 아미드이다.
식 (I) 또는 식 (II)에 따른 화합물에 대한 바람직한 구현예에서,
n과 m은 독립적으로 정수 2 또는 3이다.
가장 바람직한 구현예는, 식 (IIIa), (IIIb) 또는 (IIIc)의 구조에 해당한다.
Figure pct00005
(IIIa),
Figure pct00006
(IIIb), 또는
Figure pct00007
(IIIc).
상기 식들에서, R1 및 R2는 동일한 C11-C12 알킬이고,
R3 및 R4는 동일한 C1-C2 알킬이고,
m은 1-2의 정수이고,
n은 2-3의 정수이다.
본 발명은, 청구항 1 내지 4항에 정의된 아미노 지질의 합성 방법을 제공한다. 본 방법은, 하기 단계를 포함하는, 크로마토그래피 정제 과정 없이 액상 조합 합성으로 티올-인(yne) 화학법을 기초로 하는, 이온화가능한 양이온성 아미노 지질들로 구성된 거대 라이브러리들의 제1 병렬식 합성 방법이다.
제1 단계는 일반식 (IVa), (IVb) 또는 (IVc)의 알킨을, 일반식 HS-R1 및 HS-R2의 화합물과, UV-조사 하에 또는 라디칼 개시제를 이용하여 반응시켜, 일반식 (Va), (Vb) 또는 (Vc)의 화합물을 수득하는 단계이다:
Figure pct00008
,
Figure pct00009
또는
Figure pct00010
상기 식들에서, n은 2-12의 정수임,
HS-R1 및 HS-R2
상기 식에서, R1 및 R2는 동일하거나 상이하며, 독립적으로, C6-C24 알킬, C6-C24 알케닐, C6-C24 알키닐 또는 C6-C24 아실이되, 이들은 C1-C6 하이드로카르빌기로 선택적으로 치환될 수 있음,
Figure pct00011
(Va),
Figure pct00012
(Vb),
Figure pct00013
(Vc)
상기 식들에서, n, R1 및 R2는 상기에서 정의된 바와 같이 정의된다.
이 반응은 라디칼 메카니즘 (radical mechanism)을 통해 수행된다. 화학적 라디칼 소스를 반응 개시를 위해 첨가할 수 있으며, 또는 태양광 하에 간단하게 수행할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이 반응은 UV 조사에 의해 개시된다.
제2 단계는, 제1 단계의 산물 (식 Va)을 일반식 (R3R4R5N)(CH2)mZ (m은 1-12의 정수이고, Z는 NH2, OH, 또는 식
Figure pct00014
의 2차 헤테로사이클릭 아민이되, 이때 k와 l은 0-2의 정수임)의 아민 또는 알코올과 축합 반응하거나,
또는, 제1 단계의 산물과, 일반식 (R3R4R5N)(CH2)mZ (m은 1-12의 정수이고, Z는 COOH임)의 카르복실산을 축합 반응하여, 일반식 (VI)의 화합물을 수득하는 단계로서,
상기 일반식에서, R3 및 R4는 동일하거나 상이하며, 독립적으로, C1-C12 알킬, C1-C12 알케닐 또는 C1-C12 알키닐이되, 이들은 C1-C6 하이드로카르빌기로 선택적으로 치환될 수 있거나, 또는 R3 및 R4는 연결되어, 질소, 티올 및 산소로부터 선택되는 이종원자 0-6개를 가진 탄소수 3-10의 고리를 형성할 수 있으며,
R5는 생략되거나, 또는 수소이거나, 또는 4급 아민을 제공하기 위한 C1-C12 알킬이다.
Figure pct00015
상기 식에서, n, m, Y, R1, R2, R3, R4 및 R5는 상기에서 정의된 바와 같이 정의된다.
제2 단계는, 바람직하게는, 다이메틸포름아미드 (DMF) 등의 용매 중에서, 실온에서 수행된다. 바람직한 구현예에서, N, N'-다이이소프로필카르보다이이미드 (DIC)가 반응 혼합물에 첨가된다.
선택 사항인 제3 단계는, 제2 단계의 산물의 티오에테르기를 산화제와 산화반응하여, n, m, Y, X1, X2, R1, R2, R3, R4 및 R5가 상기에서 정의된 바와 같이 정의되는 일반식 (I)의 화합물을 수득하는 단계이다. 제3 단계는, 바람직하게는, 실온에서, 메탄올과 같은 용매 중에서 수계 과산화수소를 이용하여 수행된다. 제3 단계는, 아울러, 티타늄-함유 제올라이트와 같은 촉매에 의해 촉매될될 수 있다. 본 반응은 이전에 Hulea 등 (Hulea V, Moreau P, Renzo FD. thioether oxidation by hydrogen peroxide using titanium-containing zeolites as catalysts. Journal of Molecular Catalysis A: Chemcial. 1996, 111:325-332)에 의해 제안된 바 있다. 놀랍게도, 이 반응은 단계 b)의 아미노 지질의 다른 관능기에는 작용하지 않는다.
이러한 반응의 반응식은 매우 다재다능하여, 이를 활용하여, 상당히 저렴한 방식으로, 신속한 세포-기반의 스크리닝 분석을 위한, 양이온성 아미노 지질로 구성된 거대 라이브러리를 합성할 수 있다. 제조되는 화합물들 모두 긴 무극성 잔기들로 인한 소수성 특징과 이의 아미노기로 인한 친수성 특징 둘다를 가진다. 이러한 양친매성 특징을 이용하여, 지질 입자, 예를 들어, 지질 2중층, 미셀, 리포솜 등을 제조할 수 있다. 아울러, 이들 화합물의 아미노기는 형질감염제에게 유용한 양이온성 전하를 부여한다. 새로운 특징을 구비한 여러가지 화합물들로 구성된 라이브러리는 매우 다양한 세포 타입들에 대한 이의 형질감염 역량을 쉽게 테스트할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예는 청구항 1 내지 4항 중 어느 한항에 따른 아미노 지질을 함유한 지질 입자에 관한 것이다. 본 발명의 범위에서, 용어 '지질 입자'는 수용액으로 배치된 아미노 지질로 제조된 나노크기의 물질을 의미한다. 이 입자들은 특히 지질 2중층 소낭 (리포솜), 다층 소낭 (multi-lamellar vesicle) 또는 미셀이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 나노입자는 청구항 1 내지 4항 중 어느 한항의 아미노 지질을 포함하는 리포솜이다. 본 발명의 범위에서, 리포솜은 수계 구획을 둘러싼 지질 양친매성(amphipathic) (양친성(amphiphilic)) 분자로 구성된 마이크로소낭이다.
리포솜 형성은 자연적으로 이루어지는 공정이 아니다. 인지질과 같은 지질이 수 중에 위치되었을 때 지질 소낭이 먼저 형성된 다음, 각각 물 분자를 분리하는 1개의 2중층 또는 일련의 2중층이 형성된다. 리포솜은 수 중에 지질 소낭에 초음파 처리하여, 형성할 수 있다.
본 발명의 범위에서, 용어 '지질 2중층'은 지질 분자로 구성된 층이 2층으로 제작된 얇은 막을 의미한다. 용어 '미셀'은 액체 콜로이드 중에 분산된 계면활성제 분자들의 응집체를 지칭한다. 전형적인 미셀은 수용액 중에서 친수성 헤드 영역은 물과 접촉하여 집합하고 소수성 단일 꼬리 영역은 미셀 중심부로 격리된다.
본 발명의 범위에서, 용어 "세포"는 포괄적인 용어로서, 개개 세포, 조직, 장기, 곤충 세포, 조류 세포, 어류 세포, 양서류 세포, 포유류 세포, 일차 세포 (primary cell), 연속 세포주 (continuous cell line), 줄기 세포 및/또는 유전자 조작된 세포, 예를 들어, 이종의 폴리펩타이드나 단백질을 발현하는 재조합 세포를 망라한다. 재조합 세포는, 예를 들어, 성장인자 또는 혈액 인자 등의 이종의 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현하는 세포를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기 지질 입자 또는 리포솜은 헬퍼 지질을 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 헬퍼 지질은 비-양이온성 지질이다. 보다 바람직한 구현에에서, 상기 헬퍼 지질은 비-양이온성 인지질이다. 본 발명의 범위에서, 비-양이온성 지질은 양이온성 관능기 (예, 아미노기)를 포함할 수 있지만, 적어도 분자를 중화시키기 위해 음이온성 관능기를 포함하여야 한다. 지질 분자의 모든 관능기들의 합은 비-양이온성이어야 한다.
양이온성 아미노 지질과 비-양이온성 (중성) 인지질로 구성된 혼합물로 이루어진 리포솜은 세포로 핵산을 전달하는데 가장 효과적이다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 상기 비-양이온성 지질은 DOPE이다.
보다 바람직한 구현예에서, 지질 입자 또는 리포솜은 스테롤을 추가로 포함한다. 스테롤은 콜레스테롤과 마찬가지로 세포 막의 천연 성분이다. 이를 사용하여 입자를 안정화하고 세포 막과의 융합에 도움을 줄 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 지질 입자 또는 리포솜은 생활성 물질을 추가로 포함한다. 본 발명의 범위에서, 생활성 물질은, 예를 들어 면역 반응 또는 염증 반응을 자극함으로써, 효소학적 활성을 발휘함으로써, 또는 돌연변이 보완(complementing) 등에 의해, 숙주나 세포에 도입되었을 때, 생물학적 효과를 가지는 것이다. 생활성 물질로는 특히 핵산, 펩타이드, 단백질, 항체 및 소형 분자를 포함한다.
리포솜을 사용하여 지질 2중층 안으로 또는 리포솜의 내부 수계 공간 안으로 약물 성분을 캡슐로 둘러싸는 경우에, 용어 '리포솜 약물'이라 할 수 있다.
가장 바람직한 구현예에서, 생활성 물질은 핵산이다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 생활성 물질은 항신생물제, 항생제, 면역조절제, 항염증제, 중추신경계에 작용하는 물질, 폴리펩타이드 또는 폴리펩토이드로 이루어진 군으로부터 선택적으로 선택되는 멤버이다.
또 다른 구현예에서, 지질 입자 또는 리포솜은 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-지질을 추가로 포함한다. PEG 지질은 입자 및 이의 운반물(cargo)을 시험관내 및 생체내 분해로부터 보호하는데 도움을 준다. 아울러, PEG는 리포솜 표면 상에 보호층을 형성하여, 생체내 순환 수명을 늘인다. 이것은 리포솜 약물 전달에 사용될 수 있다 (PEG-리포솜).
생활성 물질을 함유한 지질 입자 또는 리포솜을 사용하여, 다양한 모든 치료학적 물질을 세포로 전달할 수 있다. 본 발명은 생활성 물질을 세포로 전달하기 위한, 전술한 바와 같은, 지질 입자, 특히 리포솜의 사용을 포괄한다.
바람직하게는, 상기 생활성 물질은 핵산이며, 비제한적인 예로, RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, DNA, 플라스미드, 리보솜 RNA (rRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 트랜스퍼 RNA (tRNA), 소형 저해 RNA (siRNA) 또는 소형 핵 RNA (snRNA)를 포함한다. 생활성 물질은 또한 항신생물제, 항생제, 면역조절제, 항-염증제, 중추 신경계에 작용하는 물질, 항원 또는 이의 단편, 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 백신 및 소분자, 또는 이들의 혼합물일 수도 있다.
상기에서 기술한 바와 같이, 본원에 정의된 바와 같은 아미노 지질을 포함하는 지질 입자 또는 리포솜은 생활성 물질을 세포로 전달하는데 적합할 수 있다. 언급된 다목적 합성 방법에 의해 합성할 수 있는 매우 다양한 여러가지 아미노 지질들에서, 리포솜에 부여되는 특별한 특징을 스크리닝할 수 있다. 중요한 특징으로는, 예를 들어, 형질감염 효율, 세포독성, 세포에 전달할 물질의 부착, 리포솜 안정성, 리포솜의 크기 등이 있다. 본 방법으로 특정한 용도로 특수 제작된 리포솜을 제조할 수 있다.
예를 들어, 지질 입자 (리포솜)은 다세포성 조직 또는 유기체를 형질감염시키는데 사용할 수 있다. 이는, 새로운 치료학적인 환자 치료 가능성을 제공한다.
본 발명에 따르면, 환자는 모든 포유류일 수 있으며, 바람직하게는 인간, 마우스, 랫, 돼지, 고양이, 개, 말, 염소, 소 및 원숭이 및/또는 그외 동물들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 가장 바람직하게는, 환자는 인간이다.
본 발명의 주요 구현예는 의약제로서 사용하기 위한 식 (I-III)들 중 한가지 식에 따른 아미노 지질을 포함한, 지질 입자 또는 리포솜의 용도이다.
특히, 상기 지질 입자 또는 리포솜은 유전자 요법, 유전자 백신 접종, 안티센스 요법 또는 간섭 RNA에 의한 치료에 사용하기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 지질 입자는, 핵산 전달에 사용하기 위한, 예를 들어, 인간 또는 동물의 신체를 치료 요법으로 치료하는데 사용하기 위한, 특히 유전자 결함이나 변형에 의해 유발되는 병태를 치료하는데 사용하기 위한, 의약제의 제조에 이용될 수 있다.
유전자 요법의 타겟은 잘 알려져 있으며, 단일유전자성 장애 (monogenic disorder), 예를 들면, 낭성 섬유증, 다양한 암들, 및 감염증, 예를 들어, 바이러스 감염, 예컨대 HIV 감염을 포함한다. 예를 들어, p53 유전자로의 형질감염은 암 치료에 대한 상당한 가능성을 부여한다. 또한, 유전자 백신 접종의 타겟도 잘 알려져 있으며, 천연원 유래 백신은 인간에게 사용하기 매우 위험하지만 재조합 백신이 항상 효과적이지 않은, 예를 들어, B형 간염, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), C형 간염 바이러스 (HCV) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스 등의 병원체에 대한 백신 접종을 포함한다.
또한, 안티센스 요법의 타겟도 알려져 있다. 유전자 요법과 안티센스 요법의 추가적인 타겟들은, 유전자 백신 접종의 추가적인 타겟이 그러한 바와 같이, 질병에 대한 유전자 기초 지식이 늘어남에 따라 개시되고 있다.
본 발명의 지질 입자는 백신 접종에 이용할 수 있다. 즉, 본 발명의 지질 입자 또는 리포솜은 항원을 코딩하는 핵산 또는 항원을 전달하는데 이용할 수 있다. 이러한 기법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 익숙한 일이다. 리포솜 백신의 예는, Butts C, et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV Non-Small-Cell Lung Cancer. Journal of Clinical Oncology. 2005, 23:6674-6681 및 U'Ren L, et al. Vaccination with liposome-DNA complexes elicits enhanced antitumor immunity. Cancer Gene Therapy. 2006, 13:1033-1044에 기술되어 있다.
본 발명의 지질 입자를 이용하여, 비제한적인 예로서, 암, 알레르기, 독성, 및 바이러스, 세균, 곰팡이 및 그외 병원성 유기체 등의 병원체에 의한 감염 등의 다수의 병태들을 치료 및/또는 예방하기 위해, 광범위한 항원에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 지질 입자 또는 리포솜은 바이러스 감염, 간 질환 또는 장애, 또는 암을 치료하는 의약제로서 사용할 수 있다. 간 질환의 경우, 리포솜은 주로 간에 위치한 세망-내피계 세포에 포획될 수 있다. 그곳에 리포솜이 축적될 것이다.
아래 도면들과 실시예들은 본 발명의 방법 및 개념 측면에 대한 내용을 더 잘 이해시키기 위해 제공된다.
도 1: 아미노 리포솜 시약과 2종의 시판 형질감염 시약을 이용한 리포펙션 결과를 보여주는 현미경 비교 사진들.
도 2: 시판 시약 대비 120종의 형질감염 시약들로 구성된 라이브러리의 형질감염 효율을 개괄적으로 나타낸 그래프.
도 3: HEK 293 및 MEF 세포에서의 siRNA 유전자 침묵화.
실시예 1: N-(2-(다이메틸아미노)에틸)-4,5-비스(도데실티오)펜탄아미드 (DEDPA)의 합성 및 특정화
Figure pct00016
아미노 지질을 2단계로 합성하였다. 제1 단계는 4,5-비스(도데실티오)펜탄산을 합성하는 것이다. 0.5 mmol 펜트-4-이노익산, 1 mmol 도데칸-1-티올 및 5 mg 2,2-다이메톡시-2-페닐아세톤페논 (DMPA)을 1.5 ml THF에 용해하고, 알루미늄 호일로 감싼 20 ml 유리 바이얼에 넣었다. 5분간 바이얼에서 탈기하고, 3분간 아르곤 (Ar)을 충전한 다음 뚜껑을 덮었다. 혼합물을 1시간 동안 UV 365 nm로 조사한 다음, THF를 50 ml 플라스크로 옮겨 증발시켰다.
제2 단계는 4,5-비스(도데실티오)펜탄산을 N1,N1-다이메틸에탄-1,2-다이아민과 공액하여, N-(2-(다이메틸아미노)에틸)-4,5-비스(도데실티오)펜탄아미드를 제조하는 것이다. 제1 단계로부터 유래된 4,5-비스(도데실티오)펜탄산을 8 ml 다이클로로메탄 (DCM)에 용해하였다. 이 용액 1 ml을 DCM 4 ml로 용해하고, 11.61 ㎕의 N,N'-다이이소프로필카르보다이이미드 (DIC) (0.075 mmol, 1.2 eq.)를 첨가하였다. 이 혼합물에 0.063 mmol N1,N1-다이메틸에탄-1,2-다이아민을 첨가하고, 볼텍싱하였다. 하이드록실벤조트리아졸 (HOBt)을 다이메틸포름아미드 (DMF) (608 ㎕ DMF 중의 304 mg)에 용해하고, 19.45 ㎕의 HOBt 용액을 첨가하였다. 그런 후, 바이얼을 알루미늄 호일로 덮고, Ar을 충전하였다. 16시간 교반한 후, 다이클로로메탄 (DCM)을 증발시키고, 잔사를 2 ml 헥산에 용해하고, 새로운 바이얼로 옮겼다. 산물을 원심분리로 분리하고, 상층물을 수집하고, 데실케이터로 헥산을 증발시켰다. 산물을 파라필름으로 밀봉하고, Ar 하에 보관하였다.
분자의 실체를 검증하기 위해, 조산물을 질량 분광분석으로 분석하였다. 분자 이온은 574.0 MW/z으로 명확하게 동정되었다.
실시예 2-7의 화합물의 합성은 실시예 1과 유사하게 수행하였다. 단계 1은 동일한 방식으로 수행한다. 단계 2는 추출물에 차이가 있으나, 화학량론적 비율은 유지되었다. 제조되는 화합물들과 해당 MW/z 값들은 표 1에 요약 개시한다.
표 1: 실시예 2-7의 합성 화합물들 및 해당 MW/z 값들
실시예 화합물 MW/z
2 4,5-비스(도데실티오)-N-(2-모르폴리노에틸)펜탄아미드
Figure pct00017
 614.8
3 N-(2-(다이에틸아미노)에틸)-4,5-비스(도데실티오)펜탄아미드
Figure pct00018
 600.0
4 N-(3-(다이에틸아미노)프로필)-4,5-비스(도데실티오)펜탄아미드
Figure pct00019
 616.0
5 4,5-비스(도데실티오)-N-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)펜탄아미드
Figure pct00020
 601.9
6 N-(3-(다이메틸아미노)프로필)-4,5-비스(도데실티오)펜탄아미드
Figure pct00021
 587.9
7 1-(4-(2-(다이메틸아미노)에틸)피페라진-1-일)-4,5-비스(도데실티오)펜탄-1-온
Figure pct00022
 642.9
실시예 8: N-(2-(다이메틸아미노)에틸)-5,6-비스(도데실티오)헥산아미드의 합성 및 특정화
Figure pct00023
N-(2-(다이메틸아미노)에틸)-5,6-비스(도데실티오)헥산-아미드의 합성 공정은 상기 실시예와 유사하다.
제1 단계는 5,6-비스(도데실티오)헥사노익산을 합성하는 것이다. 0.5 mmol 헥스-5-이노익산, 1 mmol 도데칸-1-티올 및 5 mg DMPA를 1.5 ml THF에 용해하고, 20 ml 유리 바이얼에 넣었다. 이 바이얼을 알루미늄 호일로 덮고, Ar를 충전한 다음, 1시간 동안 UV 365 nm 하에 조사하였다. 그런 후, THF를 50 ml 플라스크로 옮겨, 증발시켰다.
제2 단계는 5,6-비스(도데실티오)헥사노익산을 N1,N1-다이메틸에탄-1,2-다이아민과 공액하여, N-(2-(다이메틸아미노)에틸)-5,6-비스(도데실티오)헥산아미드를 제조하는 것이다. 이 단계는 상기 실시예와 유사하게 수행하였다. 화학량론적 비율을 유지하였다.
분자의 실체를 검증하기 위해, 조산물을 질량 분광측정으로 테스트하였다 (m/z 587.9).
실시예 9-14에 따른 합성을 실시예 8과 유사한 방식으로 수행하였다. 단계 1은 동일한 방식으로 수행한다. 단계 2는 추출물에 차이가 있지만, 화학량론적 비율은 유지되었다. 제조되는 화합물들과 해당 분자 이온은 표 2에 요약 개시한다.
표 2: 실시예 9-14의 합성 화합물 및 해당 MW/z 값들.
실시예 화합물 MW/z
9 5,6-비스(도데실티오)-N-(2-모르폴리노에틸)헥산아미드
Figure pct00024
 629.9
10 N-(2-(다이에틸아미노)에틸)-5,6-비스(도데실티오)헥산아미드
Figure pct00025
 614.0
11 N-(3-(다이에틸아미노)프로필)-5,6-비스(도데실티오)헥산아미드
Figure pct00026
 630.0
12 5,6-비스(도데실티오)-N-(2-(피롤리딘-1-일)에틸)헥산아미드
Figure pct00027
 615.8
13 N-(3-(다이메틸아미노)프로필)-5,6-비스(도데실티오)헥산아미드
Figure pct00028
 601.9
14 1-(4-(2-(다이메틸아미노)에틸)피페라진-1-일)-5,6-비스(도데실티오)헥산-1-온
Figure pct00029
 657.1
실시예 15: N-(2-(다이메틸아미노)에틸)-4-(도데실설피닐)-5-(도데실티오)펜탄아미드의 합성 및 특정화
Figure pct00030
아미노 지질은 한 단계로 합성한다. 1 mmol N-(2-(다이메틸아미노)에틸)-4,5-비스(도데실티오)펜탄아미드 (DEDPA, 실시예 1의 산물)를 10 ml 메탄올 중의 10 mmol 수계 과산화수소 (30%)와 혼합하고, 실온에서 1시간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 50 ml 플라스크에 옮겨 증발시켰다.
분자의 실체를 검증하기 위해, 조산물을 질량 분광측정으로 분석하였다. 분자 이온은 명확하게 589.7 MW/z로 확인되었다.
실시예 16: N-(2-(다이메틸아미노)에틸)-4,5-비스(도데실설포닐)펜탄아미드의 합성 및 특정화
Figure pct00031
아미노 지질은 한 단계로 합성한다. 1 mmol N-(2-(다이메틸아미노)에틸)-4,5-비스(도데실티오)펜탄아미드 (DEDPA, 실시예 1의 산물)를 10 ml 메탄올 중의 10 mmol 수계 과산화수소 (30%)와 혼합하고, 실온에서 2일간 교반하였다. 그런 후, 혼합물을 50 ml 플라스크에 옮겨 증발시켰다.
분자의 실체를 검증하기 위해, 조산물을 질량 분광측정으로 분석하였다. 분자 이온은 명확하게 637.5 MW/z로 확인되었다.
세포 형질감염을 위한 양이온성 지질의 스크리닝
실시예 17: 세포 형질감염을 위한 초기 최적의 지질 비율 결정
실시예 17 및 18에서는 충분히 입증된 HEK 293T 세포주를 사용한다.
천연 인지질 다이올레올릴포스파티딜에탄올아민 (DOPE - 아래 나타낸 구조)을 필수 공-지질 (co-lipid) (헬퍼 지질이라고도 함)으로서 선택하였다. 이것은, 리포솜 안정성 자체를 위한 것이기 보다는, 세포의 엔도사이토시스 구획물 (엔도솜) 안에서 지질막이 파괴되어, 생활성 물질이 세포질 및/또는 핵으로 방출되게 하는데 필요하다. 기본적으로, 바람직한 작용은, 본 발명의 양이온성 아미노 지질 (DEDPA)과 조합하여 안정적인 리포솜을 형성하는데 요구된다. DOPE를 여러가지 비율로 대표적인 양이온성 아미노 지질 (아래 표시된 구조)과 혼합하였다. 이들 2종의 지질을 50 mg/ml로 에탄올에 용해하고, 최종 부피 30 ㎕로 합하였다.
DOPE (중성의 헬퍼 지질):
Figure pct00032
대표적인 새로운 양이온성 아미노 지질로서 N-(2-(다이메틸아미노)에틸)-4,5-비스(도데실티오)펜탄아미드 (DEDPA):
Figure pct00033
표 3: DEDPA : DOPE 테스트 비율
DEDPA DOPE
0 1
1 3
1 2
1 1
2 1
3 1
1 0
이들 30 ㎕의 에탄올 혼합물을 0,2 M 소듐 아세테이트 완충액 (pH 5.0) 70 ㎕에 30초간 일정하게 볼텍싱하면서 첨가한 다음, 5분간 초음파 처리하여, 리포솜을 제조하였다. 최종 지질 함량은 2 mg/ml이다. 이 최종 2 mg/ml 리포솜 샘플을 "지질 시약"으로 지칭한다.
상기 지질 시약 0.1 ㎕, 0.2 ㎕, 0.3 ㎕, 0.4 ㎕ 및 0.5 ㎕를, 하기와 같이, (각각 9:1 비율의 pCS-LacZ 및 pEGFP-C1 플라스미드를 포함하는) 플라스미드 DNA 50 ng 또는 100 ng와 혼합하고, 세포와 혼합하였다:
(표시된 양은 96웰 배양 플레이트의 웰 하나에 대한 것임)
1. 지질 시약 0.1 ㎕ - 0.5 ㎕를 50 mM 소듐 아세테이트 완충액, pH 5.0 10 ㎕에 희석하였다.
2. 2-5분간 인큐베이션한 후, (1)의 희석한 지질 시약을 플라스미드 DNA (50 mM 소듐 아세테이트 완충액, pH 5.0 10 ㎕에 용해한 DNA) 50 ng 또는 100 ng에 첨가하였다.
3. 샘플들을 30분간 RT에서 방치하여, 지질/DNA 형질감염 복합체를 형성시켰다. DNA는 음 전하를 띄므로, 리포솜에서 양이온성 지질의 양으로 하전된 헤드 그룹과 비특이적으로 조합한다.
4. 30분 후, (세포 약 50,000개, 10% 소태아 혈청이 첨가된 DMEM 배양 배지 중의) 금방 현탁한 HEK 293 세포를 지질/DNA 복합체에 첨가하고, 파이펫 작용으로 혼합한 다음, 세포 + 지질/DNA 복합체 65 ㎕를 96웰 플레이트의 웰 하나에 넣었다.
플라스미드 DNA를 세포로 전달하는 지질 혼합물의 전달력을 평가하기 위해, 현미경을 사용하여, 처음 형질감염하고 20-24시간 후에 그린 형광 단백질 (GFP)에서 방출되는 형광을 가시화하였다. GFP 단백질은 pEGFP-C1 플라스미드에 의해 코딩되며, 성공적으로 형질감염된 세포의 세포질에서 효과적으로 합성되어 위치된다.
결과:
아미노 지질 : DOPE의 최적 비율은 1:1로 확인되었으며, 최적 지질 시약 : DNA 비율은 DNA 50 ng 당 지질 시약 0.4 ㎕였다. 이러한 조건들을 1차 스크리닝에 사용하여, 세포 형질감염율이 가장 높고 세포 독성이 가장 낮은 지질 시약을 아래 실시예 18에 기술된 바와 같이 동정하였다.
실시예 18: 새로운 지질 시약을 이용한 1차 스크리닝
세포주: HEK 293 세포
스크리닝 포멧: 96웰
검출 (판독): (핵 염료인 회흐스트를 이용하여 평가한 총 세포수 - 도 1 참조) 총 세포수 대비 GFP 형광
시판 리포솜 형질감염 시약을 제조사의 지침에 따라 기준물질 (기준 시약)로서 사용하였다. 도 1을 참조한다.
방법:
8- 또는 12-채널의 멀티파이펫을 이용하여 96 튜브/플레이트 포멧으로 모든 단계들을 수행하였다. 표시된 양은 96웰 플레이트의 2개(2x)의 웰에 해당된다.
1. 0.8 ㎕ 지질 시약을 50 mM NaOAc 완충액, pH 5.0 20 ㎕에 희석하였다.
2. (1)의 희석한 지질 시약들을 NaOAc 완충액, pH 5.0 20 ㎕ 중의 100 ng DNA (10ng pEGFP-C1 + 90ng pCS-LacZ 플라스미드)에 첨가하여, 파이펫으로 혼합하였다.
3. RT에서 30분 인큐베이션한 다음, (10% 소태아 혈청이 첨가된 DMEM 배양 배지 50 ㎕ 중의 세포 3 -5 x 105) 금방 현탁한 세포 100 ㎕를 첨가하고, 파이펫으로 혼합하였다.
4. 세포 + 지질/DNA 복합체 분액 65 ㎕씩 2번 즉시 96웰 배양 플레이트의 각 웰에 넣고, 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에 두었다.
5. 5시간 후, 신선한 세포 배양 배지 (10% FCS가 첨가된 DMEM) 50 ㎕를 첨가하였다.
6. 처음 세포 형질감염한지 20 - 24시간 후, 회흐스트 33258 염료를 세포에 최종 농도 0.2 ㎍/ml로 첨가하고, 세포를 37℃에서 다시 30분간 인큐베이션하였다. 그런 후, 세포를 도립 현미경에 위치시켜, 도 1에 나타낸 바와 같이 각 웰로부터 세포의 이미지를 2번 독립적으로 포착하였다.
각 샘플에 대해, 이미지를 3번 촬영하였다: 세포의 명시야 상 (도 1, 상당 패널), 회흐스트 염료로 염색한 총 세포 핵 사진 (도 1, 중앙 패널) 및 플라스미드 DNA로 성공적으로 형질감염되어 GFP 단백질을 발현하는 세포를 나타낸 GFP 이미지 (도 1, 하단 패널).
형질감염된 HEK 293 세포의 현미경 사진은, 일반적으로 사용되는 시판 형질감염 시약 (기준 시약)과 비교하여, 지질 분자들 중 한가지 (#29)의 형질감염율과 독성 수준을 나타낸다. 지질 시약 #29는 약 95%의 형질감염율과 낮은 세포 독성 (매우 밝게 염색된 세포자살 핵)을 나타낸다. 일반적으로, 리포솜 시약의 형질감염율이 높을 수록 세포 독성이 높아진다. 이런 점은 많은 비율의 세포가 형질감염되지만, 결과적으로 대부분 건강하지 않고 세포자살 세포가 존재하는, 기준 시약에서 명확하게 나타난다.
GFP 신호를 나타낼 뿐만 아니라 독성이 감소된 세포의 수적 증가에 주목하였다. 독성은 총 세포수 감소와, 회흐스트 염색 후 밝게 염색된 세포로 검출되는 세포자살 세포의 증가에 의해 확인한다.
실시예 18에 제시된 프로토콜에 따라, 청구항 제1 항에 따른 새롭게 합성한 화합물 120종으로 구성된 라이브러리를 대상으로, HEK 293 세포에 대한 형질감염력을 테스트하였다. 도 2의 그래프는 시판 형질감염제인 기준 시약과 비교하여 이들 지질 화합물들의 형질감염율을 보여준다. 지질 분자들 중 15종은, 실선으로 표시된, 널리 사용되는 시판 형질감염 시약과 비교하여, HEK 293 세포에 플라스미드 DNA (GFP 유전자)를 전달하는데 유의적으로 훨씬 유효하였다. 15종의 매우 유효한 새로운 형질감염 시약들 중에서, 특히 1종이 매우 저 독성인 것으로 동정되었고, 세포에 siRNA 분자를 매우 효과적으로 전달하는 능력을 나타내었다 (#29; 도 1 및 도 3).
실시예 19: siRNA 형질감염력에 대한 라이브러리 "히트(hit)" 스크리닝
세포와 전체 유기체 둘다에서 유전자 기능을 조작하기 위한 주된 기술 중 한가지는 RNA 간섭 (RNAi)을 통한 유전자 침묵화이다. 소형 간섭 RNA (siRNA) 분자를 포유류 세포에 전달하는 것이 이 기술에서 중요하며, 유의한 임상적/치료학적 의미를 가진다.
이에, 플라스미드 DNA (유전자) 전달에 대해 본 지질을 스크리닝하는 것 외에도, 또한 본 발명에 따라 아미노 지질이 siRNA 분자 (유전자 침묵유발제)를 효과적으로 전달하는 능력에 대해 스크리닝하였다.
이를 스크리닝하기 위해, 다른 타입의 세포 2종을 사용하여, 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 6 (LRP6)를 타겟팅하는 siRNA를 전달하는 지질 시약의 전달력을 테스트하였다. 이것은 Wnt 리간드에 대한 200 kD의 1회 관통 막통과 수용체이며, Wnt/b-카테닌 신호전달 경로를 활성화한다. 이것은 HEK 293 세포에서 상대적으로 낮은 수준으로 발현되며, 상대적으로 MEF 세포에서 높은 수준으로 발현된다.
분석 1. HEK 293 세포에 siRNA 형질감염
방법:
모든 단계들은 1.5 ml 에펜도르프 튜브와 24웰 플레이트 포멧으로 수행하였다. 표시된 양은 24웰 플레이트의 웰 하나에 대한 것이다.
1. 지질 시약 2 ㎕를 50 mM NaOAc 완충액, pH 5.0 50 ㎕에 희석하였다.
2. (1)의 희석한 지질 시약을 20 ㎕ NaOAc 완충액, pH 5.0 중의 20 pmol (20 uM, 1 ㎕) siRNA 분자에 첨가하고, 파이펫으로 혼합하였다. 사용한 siRNA는 임의의 공지된 유전자 (Con siRNA)에 비특이적인 스크램블화된 서열 (scrambled sequence) 또는 LRP6 유전자 (LRP6 siRNA) 유래 내인성 mRNA를 특이적으로 타겟팅하는 서열이다.
3. RT에서 30분간 인큐베이션한 후, 금방 현탁한 세포 (3 - 5 x 105 세포/50 ㎕의, 10% 소태아 혈청이 첨가된 DMEM 배양 배지) 400 ㎕을 첨가하여, 파이펫으로 혼합하였다.
4. 지질/siRNA 복합체를 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 즉시 넣어, 37℃ 및 5% CO2의 인큐베이터에 넣었다.
5. 처음 형질감염한지 48시간 후, 세포를 50 ㎕ 디터전트 완충액 (50mM Tris, 1% Triton X-100, 0.15 M NaCl, pH7.0, 프로테아제 및 포스파타제 저해제 함유)에서 세포를 용혈한 후, 스핀 다운하여 불용성 세포 파편을 제거하고, 맑은 세포 용혈물 30 ㎕를 4x SDS 로딩 완충액 (250 mM Tris HCl, 40% 글리세롤, 8% SDS, 0.01% 브로모페놀 블루, 5% 2-머캅토에탄올, pH 6.8) 10 ㎕에 첨가하였다.
6. 샘플을 96℃에서 2분간 가열하여 변성시킨 다음, 10 ㎕를 9% SDS-PAGE 겔에 로딩하여 분자량에 따라 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질들을 SDS-PAGE 겔에서 니트로셀룰로스 막으로 웨스턴 블롯 (WB) 분석을 위해 이동시켰다.
7. 자동 BioLane HTI 장치에서 LRP6에 대한 항체를 이용하여 WB를 수행하였다. HRP 연결된 2차 항체와 화학발광체를 사용하여, 막에서 단백질을 검출하였다.
분석 2. 마우스 배아 섬유모 (MEF) 세포에 siRNA 형질감염
방법:
모든 단계들은 1.5 ml 에펜도르프 튜브와 24웰 플레이트 포멧으로 수행하였다. 표시된 양은 24웰 플레이트의 웰 하나에 대한 것이다.
1. 지질 시약 2 ㎕를 50 mM NaOAc 완충액, pH 5.0 50 ㎕에 희석하였다.
2. (1)의 희석한 지질 시약을 20 ㎕ NaOAc 완충액, pH 5.0 중의 20 pmol (20 μM, 1 ㎕) siRNA 분자에 첨가하고, 파이펫으로 혼합하였다. 사용한 siRNA 분자는 임의의 공지된 유전자 (Con siRNA)에 비특이적인 스크램블화된 서열 또는 LRP6 유전자 (LRP6 siRNA) 유래 내인성 mRNA를 특이적으로 타겟팅하는 서열이다.
3. RT에서 30분간 인큐베이션한 후, 10% 소태아 혈청이 첨가된 DMEM 배양 배지 400 ㎕을 첨가하여, 파이펫으로 혼합한 다음, 유착성 MEF 세포 (50%-70% 컨플루언시)를 24웰 플레이트의 웰 1개에 넣고, 37℃ 및 5 % CO2 인큐베이터에 넣었다.
4. 처음 형질감염한지 48시간 후, 세포를 100 ㎕ 디터전트 완충액 (50mM Tris, 1% Triton X-100, 0.15 M NaCl, pH7.0, 프로테아제 및 포스파타제 저해제 함유)에서 세포를 용혈한 후, 스핀 다운하여 불용성 세포 파편을 제거하고, 맑은 세포 용혈물 30 ㎕를 4x SDS 로딩 완충액 (250 mM Tris HCl, 40% 글리세롤, 8% SDS, 0.01% 브로모페놀 블루, 5% 2-머캅토에탄올, pH 6.8) 10 ㎕에 첨가하였다.
5. 샘플을 96℃에서 2분간 가열하여 변성한 다음, 5 ㎕를 9% SDS-PAGE 겔에 로딩하여 분자량에 따라 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질들을 SDS-PAGE 겔에서 니트로셀룰로스 막으로 웨스턴 블롯 (WB) 분석을 위해 이동시켰다.
6. 자동 BioLane HTI 장치에서 LRP6 및 베타-액틴 단백질에 대한 항체를 이용하여 WB를 수행하였다. HRP 연결된 2차 항체와 화학발광체를 사용하여, 막에서 단백질을 검출하였다.
결과
도 3A는 표시된 siRNA 분자로 형질감염시키고 48시간 인큐베이션한 293 세포의 전체 세포 용혈물 유래 내인성 LRP6 단백질의 웨스턴 블롯 (WB) 분석 결과를 나타낸 것이다. LRP6의 내인성 수준은, 시약 A를 이용한 LRP6 siRNA 전달 후, 강력하게 하향-조절되지만, 이러한 효과는 본 발명에 따른 지질 시약 #29 이용시 더 강화된다. Con은 타겟팅되지 않은 스크램블화된 siRNA 대조군이고, 로딩은 비슷한 양의 단백질을 각 샘플에 대해 로딩하였음을 (즉, siRNA 타겟에 대한 특이적인 침묵화를 입증해주는) 보여주기 위한, 기준 물질로서 사용되는 비-특이적인 단백질 밴드이다.
도 3B는 표시된 siRNA 분자로 형질감염시키고 48시간 인큐베이션한 MEF (마우스 배아 섬유모세포) 세포의 전체 세포 용혈물 유래 LRP6 단백질의 웨스턴 블롯 (WB) 분석 결과를 나타낸 것이다. 재차, 지질 #29는 siRNA 매개 유전자 침묵화에 있어 시판 시약 A 보다 더 효과적이다. 2번째 지질 시약 (#35)은, 또한, 세포를 플라스미드 DNA로 효과적으로 형질감염시킬 수 있음에도 불구하고, 거의 효과가 없는 것으로 확인된다. 이는, 해당 형질감염 시약들의 현저한 특성 차이를 입증해주는 것으로, 최적의 특성 (예, DNA와 siRNA의 매우 효과적인 전달성 뿐만 아니라 낮은 세포 독성)을 가진 것을 동정하기 위해 스크리닝할 수 있는 수천개의 관련 지질들을 쉽게 합성한다는 점에서 본 발명의 방법의 중요성을 강조해준다.
약어 목록
Ar 아르곤
DCM 다이클로로메탄
DEDPA N-(2-(다이메틸아미노)에틸)-4,5-비스(도데실티오)펜탄아미드
DIC N, N'-다이이소프로필카르보디이미드
DMEM 배양 배지
DMF 다이메틸포름아미드
DMPA 2,2-다이메톡시-2-페닐아세톤페논
DNA 데스옥시리보뉴클레산
DOPE 다이올레올릴포스파티딜에탄올아민
EGFP 증강된 GFP
GFP 그린 형광 단백질
HOBt 하이드록실벤조트리아졸
HRP 호르세라디쉬 퍼옥시다제
kD 킬로 달톤
LRP6 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 6
MEF 마우스 배아 섬유모세포
PEG 폴리에틸렌 글리콜
RNA 리보뉴클레산
RNAi RNA 간섭
siRNA 소형 간섭 RNA
SDS 소듐 도데실 설페이트
THF 테트라하이드로푸란
WB 웨스턴 블롯
Wnt 세포 분화와 관련된 신호전달 단백질

Claims (15)

  1. 식 (I)의 아미노 지질:
    Figure pct00034

    상기 식에서,
    R1 및 R2는 동일하거나 상이하며, 독립적으로, C6-C24 알킬, C6-C24 알케닐, C6-C24 알키닐 또는 C6-C24 아실로서, 이들은 선택적으로 C1-C6 하이드로카르빌기로 치환될 수 있으며,
    X1 및 X2는 동일하거나 상이하며, S, S=O 또는 S(=O)2이며,
    Y는 식
    Figure pct00035
    의 아미드, 에스테르 또는 헤테로사이클릭 아미드이되, k와 l은 0-2의 정수이고,
    R3 및 R4는 동일하거나 상이하며, 독립적으로, C1-C12 알킬, C1-C12 알케닐 또는 C1-C12 알키닐이되, 여기서 알킬, 알케닐 또는 알키닐은 선택적으로 C1-C6 하이드로카르빌기로 치환될 수 있거나, 또는 R3 및 R4는 연결되어 질소, 티올 및 산소로부터 선택되는 0-6개의 이종원자와 3-10개의 원자를 가진, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있으며,
    R5는 생략되거나, 수소이거나, 또는 4급 아민을 제공하기 위한 C1-C12 알킬이며,
    m은 1-12의 정수이고,
    n은 2-12의 정수이다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1 및 R2는 동일하거나 상이하며, 독립적으로, C1-C6 하이드로카르빌기로 선택적으로 치환될 수 있는, C6-C24 알킬인 것을 특징으로 하는 아미노 지질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 식 (II)의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 아미노 지질:
    Figure pct00036
    (II)
    상기 식에서,
    R1 및 R2는 동일한 C6-C18 알킬이고,
    Y는 식
    Figure pct00037
    의 아미드, 에스테르 또는 헤테로사이클릭 아미드이고,
    R3 및 R4는 동일하거나 상이하며, 선택적으로 C1-C6 하이드로카르빌기로 치환될 수 있는 C1-C12 알킬이거나, 또는 R3 및 R4는 연결되어 3-10개의 원자와 질소, 티올 및 산소로부터 선택되는 0-6개의 이종원자를 가진, 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성하며,
    m은 1-12의 정수이고,
    n은 2-12의 정수이다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 식 (IIIa), (IIIb) 또는 (IIIc)를 가지는 것을 특징으로 하는 아미노 지질:
    Figure pct00038
    (IIIa),
    Figure pct00039
    (IIIb), 또는
    Figure pct00040
    (IIIc),
    상기 식들에서,
    R1 및 R2는 동일한 C11-C12 알킬이고,
    R3 및 R4는 동일한 C1-C2 알킬이고,
    m은 1-2의 정수이고,
    n은 2-3의 정수이다.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 따라 정의되는 아미노 지질의 합성 방법으로서,
    a) 일반식 (IVa), (IVb) 또는 (IVc)의 알킨을,
    Figure pct00041
    (IVa),
    Figure pct00042
    (IVb), 또는
    Figure pct00043
    (IVc)
    (상기 식에서, n은 2-12의 정수임)
    R1 및 R2가 동일하거나 상이하며, 독립적으로, C6-C24 알킬, C6-C24 알케닐, C6-C24 알키닐 또는 C6-C24 아실이되, 선택적으로 C1-C6 하이드로카르빌기로 치환될 수 있는, 일반식 HS-R1 및 HS-R2의 화합물과,
    UV-조사 하에 또는 라디칼 개시제를 이용하여 반응시켜, 일반식 (Va), (Vb) 또는 (Vc)의 화합물을 수득하는 단계:
    Figure pct00044
    (Va),
    Figure pct00045
    (Vb),
    Figure pct00046
    (Vc)
    (상기 식에서, R1 및 R2는 위에서 정의된 바와 같이 정의됨),
    b) 단계 a)의 산물 식 Va를 일반식 (R3R4R5N)(CH2)mZ (m은 1-12의 정수이고, Z는 NH2, OH, 또는 식
    Figure pct00047
    의 2차 헤테로사이클릭 아민이되, 이때 k와 l은 0-2의 정수임)의 아민 또는 알코올과 축합 반응하거나,
    또는, 단계 a)의 산물 식 Vb 및 Vc를, 일반식 (R3R4R5N)(CH2)mZ (m은 1-12의 정수이고, Z는 COOH임)의 카르복실산과 축합 반응하여,
    일반식 (VI)의 화합물을 수득하는 단계로서,
    R3 및 R4는 동일하거나 상이하며, 독립적으로, C1-C12 알킬, C1-C12 알케닐 또는 C1-C12 알키닐이되, 이들은 선택적으로 C1-C6 하이드로카르빌기로 치환될 수 있거나, 또는 R3 및 R4는 연결되어 3-10개의 탄소 원자와 질소, 티올 및 산소로부터 선택되는 0-6개의 이종원자를 가진 고리를 형성하며,
    R5는 생략되거나, 수소이거나, 또는 4급 아민을 제공하기 위한 C1-C12 알킬인,
    단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    Figure pct00048

    상기 식 VI에서, n, m, Y, R1, R2, R3, R4 및 R5는 위에서 정의된 바와 같이 정의된다.
  6. 제5항에 있어서, 산화제를 이용하여 일반식 (VI) (단계 b의 산물)의 티오에테르를 설폭사이드 (S=O) 및/또는 설폰 (S(=O)2)으로 산화하는 선택 단계 c)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 따른 아미노 지질을 포함하는 지질 입자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 지질 입자가 리포솜인 것을 특징으로 하는 지질 입자.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 비-양이온성 지질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 입자.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서, 스테롤을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 입자.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한항에 있어서, 생활성 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 지질 입자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 생활성 물질이 핵산, 항신생물제, 항생제, 면역조절제, 항염증제, 중추 신경계에 작용하는 물질, 폴리펩타이드 또는 폴리펩토이드 (polypeptoid)로 이루어진 군으로부터 선택적으로 선택되는 멤버인 것을 특징으로 하는 지질 입자.
  13. 생활성 물질을 세포에 전달하기 위한, 제7항 내지 제12항 중 어느 한항에 따른 지질 입자의 용도.
  14. 제7항 내지 제12항 중 어느 한항에 있어서, 의약제로서 사용하기 위한, 지질 입자.
  15. 제7항 내지 제12항 중 어느 한항에 있어서, 바이러스 감염, 간 질환, 간 장애 또는 암 치료용 의약제로서 사용하기 위한, 지질 입자.
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Families Citing this family (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104910025B (zh) 2008-11-07 2019-07-16 麻省理工学院 氨基醇类脂质和其用途
NZ600616A (en) 2009-12-01 2014-11-28 Shire Human Genetic Therapies Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
EP2609135A4 (en) 2010-08-26 2015-05-20 Massachusetts Inst Technology POLY (BETA-AMINO ALCOHOLS), THEIR PREPARATION AND USES THEREOF
WO2012135025A2 (en) 2011-03-28 2012-10-04 Massachusetts Institute Of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
KR102128248B1 (ko) 2011-06-08 2020-07-01 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. Mrna 전달을 위한 지질 나노입자 조성물 및 방법
KR102272498B1 (ko) 2011-10-27 2021-07-06 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 약물 캡슐화 마이크로스피어를 형성할 수 있는, ｎ-말단 상에 관능화된 아미노산 유도체
US20150267192A1 (en) 2012-06-08 2015-09-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
CA2884870C (en) 2012-08-13 2022-03-29 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
DK2968586T3 (en) 2013-03-14 2018-10-08 Translate Bio Inc CFTR MRNA COMPOSITIONS AND RELATED PROCEDURES AND APPLICATIONS
AU2014236396A1 (en) 2013-03-14 2015-08-13 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods for purification of messenger RNA
WO2014179562A1 (en) 2013-05-01 2014-11-06 Massachusetts Institute Of Technology 1,3,5-triazinane-2,4,6-trione derivatives and uses thereof
US9895443B2 (en) 2013-06-26 2018-02-20 Massachusetts Institute Of Technology Multi-tailed lipids and uses thereof
WO2015061500A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for argininosuccinate synthetase deficiency
MX2016005239A (es) 2013-10-22 2016-08-12 Shire Human Genetic Therapies Tratamiento con acido ribonucleico mensajero para la fenilcetonuria.
EA201690576A1 (ru) 2013-10-22 2016-10-31 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Липидные композиции для доставки матричной рнк
JP6571679B2 (ja) 2014-04-25 2019-09-04 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａの精製方法
EP3587409B8 (en) 2014-05-30 2022-07-13 Translate Bio, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
ES2819175T3 (es) * 2014-06-19 2021-04-15 Rafael Pharmaceuticals Inc Compuestos farmacéuticos
WO2015200465A1 (en) 2014-06-24 2015-12-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Stereochemically enriched compositions for delivery of nucleic acids
EP3164379A1 (en) 2014-07-02 2017-05-10 Massachusetts Institute of Technology Polyamine-fatty acid derived lipidoids and uses thereof
AU2016278970B2 (en) 2015-06-19 2020-10-29 Massachusetts Institute Of Technology Alkenyl substituted 2,5-piperazinediones and their use in compositions for delivering an agent to a subject or cell
EP3141582B1 (en) * 2015-09-10 2018-06-13 Karlsruher Institut für Technologie Synthesis and use of polyalkylamines
EP3362102A1 (en) * 2015-10-14 2018-08-22 Life Technologies Corporation Ribonucleoprotein transfection agents
CN105622473B (zh) * 2016-02-06 2017-07-25 吴国球 一种阳离子氨基脂质及其合成方法和用途
BR112018073671A2 (pt) * 2016-05-16 2019-02-26 The Board Of Regents Of The University Of Texas System composições para a entrega de rnat como nanopartículas e métodos de uso
AU2018224326B2 (en) 2017-02-27 2024-01-04 Translate Bio, Inc. Novel codon-optimized CFTR mRNA
MA49138A (fr) 2017-05-16 2020-03-25 Translate Bio Inc Traitement de la fibrose kystique par administration d'arnm à codons optimisés codant pour la cftr
AU2019325702A1 (en) 2018-08-24 2021-02-25 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
CN111087332B (zh) * 2019-12-11 2021-07-06 东南大学 一种阳离子氨基脂质及其合成方法与应用
CN113999184A (zh) * 2020-02-28 2022-02-01 深圳深信生物科技有限公司 一种胺基脂质化合物、其制备方法和应用
CN111909069B (zh) * 2020-08-25 2022-04-19 安徽启威生物科技有限公司 一种可降解的季铵盐化合物及其制备方法和应用
WO2023160702A1 (zh) * 2022-02-28 2023-08-31 深圳深信生物科技有限公司 氨基脂质化合物、其制备方法、组合物和应用
CN115557851B (zh) * 2022-06-27 2023-04-18 上海云沂生物医药科技有限公司 一种氨基脂质、其合成方法、颗粒及用途

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2001401A1 (en) * 1988-10-25 1990-04-25 Claude Piantadosi Quaternary amine containing ether or ester lipid derivatives and therapeutic compositions
SE9101709L (sv) * 1991-06-03 1992-12-04 Karlshamns Lipidteknik Ab Lipidderivat som diagnostikum eller kontrastmedel
FR2694559B1 (fr) * 1992-08-06 1994-10-28 Atta Nouveaux dérivés amphiphiles d'aminoacides ou de peptides, leur procédé de préparation et leur utilisation dans des préparations à usage biomédical.
CA2217550A1 (en) 1996-10-22 1998-04-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Cationic lipids for gene therapy
IT1306129B1 (it) * 1999-04-13 2001-05-30 Sigma Tau Ind Farmaceuti Esteri della l-carnitina o di alcanoil l-carnitine utilizzabili comelipidi cationici per l'immissione intracellulare di composti
WO2001026625A2 (en) * 1999-10-08 2001-04-19 Alza Corp Neutral-cationic lipid for nucleic acid and drug delivery
WO2001042200A1 (en) 1999-12-10 2001-06-14 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules
DE10207178A1 (de) * 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Komponenten für die Herstellung amphoterer Liposomen
WO2009086558A1 (en) * 2008-01-02 2009-07-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
US20090285881A1 (en) * 2008-04-16 2009-11-19 Abbott Laboratories Cationic lipids and uses thereof
US20100055169A1 (en) * 2008-04-16 2010-03-04 Abbott Laboratories Cationic lipids and uses thereof
WO2009129387A2 (en) * 2008-04-16 2009-10-22 Abbott Laboratories Cationic lipids and uses thereof
WO2011156686A2 (en) * 2010-06-11 2011-12-15 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Method for synthesizing a cyclic multivalent peptide using a thiol-mediated reaction

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