CN105622473B - 一种阳离子氨基脂质及其合成方法和用途 - Google Patents

一种阳离子氨基脂质及其合成方法和用途 Download PDF

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Abstract

一种阳离子氨基脂质及其合成方法和用途，结构如以下所示：本发明合成反应条件温和，溶剂选择性大，大大降低了反应的难度，提高了产率；且原料简单、便宜，大大降低了生成成本；更重要的是筛选得到的脂分子具有高效低毒的特点，可以在血清中达到很好的效果，大大简化了转染的操作步骤。

Description

一种阳离子氨基脂质及其合成方法和用途
技术领域
本发明属于细胞转染领域，具体涉及一种阳离子氨基脂质及其合成方法和用途。
背景技术
在目前所有类型的转染试剂中，基于脂质体的转染试剂是公认最为有效的一种。这是因为脂质体转染试剂简单易用，且往往具有很高的效率。脂质体是人工制备的具有双分子层结构的球形囊泡，它可以与其它双分子层，如细胞膜等融合，从而将其包裹的分子从细胞膜外传送至细胞内部。
由于其独特的性能，脂质体被广泛用于药物传送。脂质体即可携带亲水分子，也可携带疏水分子，它可以很好的与生物活性分子结合，如各种药物，核酸，多肽等，并且可将这些物质传送至细胞内以调控细胞的状态。这提供了治疗疾病的一种新的方式。
阳离子脂质体可与带负电荷的核酸(DNA)结合，并将其从细胞外送入细胞核内，使DNA在细胞核内表达，从而调控细胞的生长。这在生命科学相关的研究中具有至关重要的作用，同时也作为“基因治疗”的一种方式，在未来可能具有广阔的应用前景。迄今为止，存在一些商业化的阳离子脂质体，但高效低毒性的阳离子脂质体数量依然很有限。
目前脂质体转染试剂存在的主要问题如下：
1.适用范围有限。许多细胞系，尤其是初级细胞如干细胞等，绝大部分现有的脂质体试剂都无法有效的转染。
2.合成复杂，价格昂贵。由于目前主流的脂质体转染试剂往往具有极为复杂的结构，其生产和研发成本都较高，导致脂质体转染试剂的价格居高不下，这大大限制了脂质体转染试剂的应用范围。
因此，市场对高效而廉价的脂质体转染试剂具有巨大的需求。
发明内容
解决的技术问题：本发明针对上述技术问题，提供一种阳离子氨基脂质及其合成方法和用途，该阳离子细胞转染脂质具备低毒高效的特点。
技术方案：一种阳离子氨基脂质，结构如以下通式(I)所示：
其中R1为氢、C1-C4烷基或缺失；
R2，R3相同或不同，各自为C1-C4烷基；
m和n为1-4的整数；
R4，R5相同或不相同，各自为C9-C14的烷基。
上述阳离子氨基脂质，结构优选为：
一种合成所述阳离子氨基脂质的方法，包括以下步骤：
a)将通式(IIa)的炔烃与通式R4-S-S-R5的化合物以1:1.5的摩尔比加入THF或DCM溶液中，最终反应物总量的溶液浓度为30-500mg/mL，
再加入自由基光引发剂，所述自由基光引发剂为二甲氧基-2-苯基丙酮苯基酮或DMPA，加入量为反应物总质量的1％-5％，通氮气除氧后置于紫外光下光照3h，紫外光波长为250nm～360nm，强度在0.5mW/cm2-3mW/cm2之间，得到通式(IIIa)的化合物：
b)通式(IIIa)化合物与如通式所示的胺进行缩合反应，具体步骤为，将N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)加入步骤a反应完的溶液中，加入的量为步骤a开始时炔烃的摩尔量的1.2倍，反应半小时后加入如通式所示的胺，胺与DIC的摩尔比为1:1.2，反应半小时后加入二甲氨基吡啶，二甲氨基吡啶与DIC的摩尔比为1:1，反应过夜得到最终产物。
一种合成所述优选的阳离子氨基脂质的方法，包括以下步骤：1)合成4,5-双(十一烷基硫)-4-戊烯酸：按比例，将0.5mmol 4-戊炔酸，0.75mmol双十一烷基二硫醚和5mg 2,2-二甲氧基-2-苯基丙酮苯基酮(DMPA)溶于3mL THF中，通氮气除氧5min后置于365nm UV光下照射1h；2)4,5-双(十一烷基硫)-4-戊烯酸与N,N-二甲基乙二胺进行酰胺化反应，以生成N-(2-(二甲基氨基)乙基)-4,5-双(十一烷基硫)-4-戊烯酰胺：按比例，向上步反应体系中加入0.6mmol N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)，搅拌均匀后加入0.5mmol N,N-二甲基乙二胺，搅拌半小时后加入0.6mmol二甲氨基吡啶，搅拌过夜；随后将溶液中的THF蒸除，倒入8mL正己烷溶解产物，离心分离取上清液；再将得到的上清液蒸发，倒入8mL甲醇，离心分离取上清液，将甲醇蒸发即得到最终产物。
脂质颗粒，含有所述阳离子氨基脂质。
所述脂质颗粒是脂质体。
所述的脂质颗粒，含有生物活性剂siRNA、质粒、miRNA或mRNA。所述的脂质颗粒在制备细胞转染试剂中的应用。
本发明是一种高度通用化的方法，可以在很大范围内改变所用原料的结构，合成大的氨基脂质库，并将其用于筛选实验。由于此类分子一端具有长的疏水链，另一端具有高度亲水的氨基，在水中其可形成双分子层的脂质体。由于此类化合物具有带正电荷的氨基，可与DNA结合，因此可作为转染试剂用于细胞转染。
有益效果：(1)反应条件温和，溶剂选择性大，大大降低了反应的难度，提高了产率；
(2)原料简单、便宜，大大降低了生成成本；
(3)筛选的脂分子具有高效低毒的特点，可以在血清中达到很好的效果，大大简化了转染的操作步骤。
附图说明
图1为LW-30的质谱分子量图。LW-30理论分子量约为543.53和其质谱分子量基本一致。
图2为合成化合物的转染效率的筛查图。编号12号化合物为目前市场和科研机构流通使用的一种主流的转染试剂；其它化合物为本发明方法合成的一系列化合物；编号30号化合物即是LW-30。由图可见，合成的大部分脂质分子都比市场上主流的某型化合物转染HEK293细胞的效率高。
图3为合成化合物的细胞毒性的筛查图。编号12号化合物为目前市场和科研机构流通使用的一种主流的转染试剂；其它化合物为本发明方法合成的一系列化合物；编号30号化合物即是LW-30。由图可见，合成的所有的脂质分子都比市场上主流的某型转染试剂对HEK293细胞的毒性要小。
图4为LW-30和某型商业试剂对小鼠胚胎干细胞的转染效率比较图。LW-30的转染效率约为某商业试剂的3.5倍。
图5为LW-30和某型商业试剂对小鼠干细胞的转染效果图。A为某商业试剂的转染图，效果较差，效率为20％左右；B为LW-30的转染图，效果较好，效率为70％左右。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的包含范围不限于下述的实施例。下面的实施例中未注明的条件和方法等均按照常规或者制造厂商所建议的条件进行。
实施例1：N-(2-(二甲基氨基)乙基)-4,5-双(十一烷基硫)-4-戊烯酰胺(LW-30)的合成
氨基脂质的合成分为两步。第一步是合成4,5-双(十一烷基硫)-4-戊烯酸。将0.5mmol 4-戊炔酸，0.75mmol双十一烷基二硫醚和5mg 2,2-二甲氧基-2-苯基丙酮苯基酮(DMPA)溶于3mL THF中，并加入20mL玻璃小瓶中，通氮气除氧5min后将玻璃瓶置于365nm UV光下照射1h。
第二步是4,5-双(十一烷基硫)-4-戊烯酸与N,N-二甲基乙二胺进行酰胺化反应，以生成N-(2-(二甲基氨基)乙基)-4,5-双(十一烷基硫)-4-戊烯酰胺。向第一步的小瓶中加入0.6mmol N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)，搅拌均匀后加入0.5mmol N,N-二甲基乙二胺，搅拌半小时后加入0.6mmol二甲氨基吡啶，搅拌过夜。随后将溶液倒入25mL单口烧瓶中，将THF蒸发，倒入8mL正己烷溶解产物，离心分离取上清液。再将得到的上清液蒸发，倒入8mL甲醇，离心分离取上清液，将甲醇蒸发即得到最终产物。通过质谱分析粗产物，得到的结果可以清楚的看见分子离子的碎片峰543.4m/z(图1)。
实施例2:合成脂质的转染活性的筛选
细胞系：HEK293
转染物质：pBL-EGFP荧光质粒
细胞毒测试方法：MTT法
第一步；转染效率的筛查：
(1)将合成的29种新型阳离子脂质分子溶于乙醇溶液制备脂质体。具体步骤是每种脂分子分别取2mg置于圆底烧瓶中于旋蒸仪上旋干并过夜，待溶剂充分除尽后加入1mLPBS溶液充分水化，于旋蒸仪上孵育40min后即制得相应脂质体；
(2)取50纳克pBL-EGFP溶于100微升PBS中并加入50纳克脂质体，并于室温下孵育30min；
(3)将HEK293细胞用胰酶消化后用无血清DMEM培养基稀释成105个/mL的细胞悬液；
(4)于96孔板中加入100微升细胞悬液后再加入100微升孵育后的脂质体质粒混合物；
(5)将96孔板置于细胞培养箱中孵育24小时后用荧光酶标仪检测结果，结果如图2所示。细胞毒性检测:
第二步：MTT细胞毒性的筛查
(1)将HEK293细胞用胰酶消化后配置成5*104个/mL的细胞悬液，并于96孔板中每孔加入100微升，过夜培养；
(2)待细胞细胞增值到30％密度时加入100微升含不同浓度的脂质体或者同体积的PBS；
(3)细胞培养24小时后用加入MTT试剂并于酶标仪下检测各孔吸收值
(4)细胞毒性计算公式：％＝ODAx-ODA0/ODA1-ODA0；其中ODAx为加入脂质体相应板孔的紫外吸收，ODA0为空白孔的吸收，ODA1为加入PBS的吸收值。各脂质分子的细胞毒性结果见图3。
实施例3：原代小鼠胚胎干细胞的快速转染
用水化法将得到的氨基脂质制备成2mg/mL脂质体，此即为用于细胞转染的转染试剂母液。
试剂：A管为本发明转染试剂母液；B管为1×PBS稀释液
细胞系：原代小鼠胚胎干细胞
转染物质：pBL-EGFP荧光质粒
快速转染步骤
(1)使用前轻微晃动A管使溶液混合均匀，取转染试剂母液10微升加入390微升1×PBS稀释液制成转染工作液；
(2)取500纳克pBL-EGFP溶于400微升1×稀释液制成DNA悬液；
(3)将转染工作液和DNA悬液按体积比1:1混合后制成转染液于室温下孵育20min；
(4)将细胞用胰酶消化后用无血清DMEM培养基稀释成105个/mL的细胞悬液；
(5)于24孔板中加入400微升细胞悬液后再加入100微升孵育后的转染液；
(6)将24孔板置于细胞培养箱中孵育4小时；
(7)将24板孔中无血清培养基移除干净后，每孔加入500微升含10％FBS的DMEM培养基用于细胞培养；
(8)转染后于不同时间点在荧光显微镜下观察结果(图4&图5)。

Claims (6)

1.一种阳离子氨基脂质，其特征在于结构为：
2.一种合成权利要求1所述阳离子氨基脂质的方法，其特征在于包括以下步骤：1)合成4,5-双(十一烷基硫)-4-戊烯酸：按比例，将0.5mmol 4-戊炔酸，0.75mmol双十一烷基二硫醚和5mg 2,2-二甲氧基-2-苯基丙酮苯基酮(DMPA)溶于3mL THF中，通氮气除氧5min后置于365nm UV光下照射1h；2)4,5-双(十一烷基硫)-4-戊烯酸与N,N-二甲基乙二胺进行酰胺化反应，以生成N-(2-(二甲基氨基)乙基)-4,5-双(十一烷基硫)-4-戊烯酰胺：按比例，向上步反应体系中加入0.6mmol N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)，搅拌均匀后加入0.5mmolN,N-二甲基乙二胺，搅拌半小时后加入0.6mmol二甲氨基吡啶，搅拌过夜；随后将溶液中的THF蒸除，倒入8mL正己烷溶解产物，离心分离取上清液；再将得到的上清液蒸发，倒入8mL甲醇，离心分离取上清液，将甲醇蒸发即得到最终产物。
3.脂质颗粒，其特征在于含有权利要求1所述阳离子氨基脂质。
4.根据权利要求3所述的脂质颗粒，其特征在于所述脂质颗粒是脂质体。
5.根据权利要求3所述的脂质颗粒，其特征在于含有生物活性剂siRNA、质粒、miRNA或mRNA。
6.权利要求3所述的脂质颗粒在制备细胞转染试剂中的应用。
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