CN106554499B - 一种含二硫键的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含二硫键的聚(β‑氨基酯)类聚合物基因载体。该聚(β‑氨基酯)类聚合物是一种通过加成聚合反应制备的阳离子聚合物,可在体外通过静电作用与带负电的质粒DNA结合,进而把DNA转运到细胞中实现基因传递。该聚(β‑氨基酯)类聚合物引入二硫键,使其在细胞内具有氧化还原响应机制,有助于聚合物的降解以及DNA在细胞内的充分释放。细胞毒性实验与细胞转染实验表明该含二硫键的聚(β‑氨基酯)类聚合物基因载体在具有较低的细胞毒性的同时具备较高的转染效率,明显高于常规的商业化基因转染试剂。本发明的聚(β‑氨基酯)类聚合物基因载体是一种低毒高效的非病毒基因载体,具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种含二硫键的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体及其合成方法和应用。
技术背景
基因治疗是指将正常的外源基因导入靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,从而达到治疗目的。基因治疗的成功很大程度上依赖于合适的基因转运载体。现如今在基因治疗的体系中人们大多采用病毒载体转运基因,然而病毒载体其本身有很多不容忽视的缺点,包括免疫反应强、基因负载能力有限以及大规模生产难度大等。因此非病毒载体作为一种易制备、稳定性高、免疫反应小、质粒负载能力强的替代型载体得到了广泛的关注和研究。
聚乙烯亚胺(PEI)是迄今为止转染效率较高的非病毒载体之一,目前25kDa聚乙烯亚胺经常被用来作为新的基因转染载体评价物,将新设计与新开发的基因转染载体与之比较。但它的高转染效率往往伴随着较大的细胞毒性。以往的高效转染系统关注点主要集中在提高聚合物的分子量、正电荷及支化度上,但正电荷过高会导致包裹了DNA 后所形成的纳米颗粒过于紧密,胞吞后无法在胞内充分释放出DNA,此外分子量大还会导致细胞毒性的增加。因此为了获得转染效率高且细胞毒性小的基因转染载体,近些年来研究往往致力于含有可水解的酯键或者体内易于断裂的S-S键的阳离子聚合物的合成,其中聚(β-氨基酯)(PBAE)得到了人们的广泛关注。
聚(β-氨基酯)(PBAE)能够克服基因转运过程中主要的障碍,包括跨膜运输、质子泵作用下的胞内脱离以及细胞质环境下的质粒释放。(参见:J.J.Green,R.Langer,D.G.Anderson.A combinatorial polymer library approach yields insight intononviral gene delivery.Accounts of chemical research.2008,41,749.)与PEI相比,PBAE在化学制备、质粒负载能力和生物适应性方面都有显著的优势。聚(β-氨基酯)是通过简单的加成聚合反应制备的一类阳离子聚合物,携带正电,能够与带负电的质粒DNA通过静电作用结合形成纳米粒子进入细胞。(参见:M.Keeney,S.-G.Ong,A.Padilla,Z.Yao,S.Goodman, J.C.Wu,et al.Development of Poly(β-amino ester)-basedbiodegradable nanoparticles for nonviral delivery of minicircle DNA ACSnano.2013,7,7241)。此外在结构上聚(β-氨基酯) 中酯键的存在,其在细胞内的水解使聚(β-氨基酯)有良好的生物降解性。这些特点使得PBAE在非病毒基因载体方面具有很大的潜力。
发明内容
为了合成高效低毒的基因转染载体,本发明提供了一种新型的聚(β-氨基酯),在含有传统酯键的基础上成功引入了二硫键。众所周知,人体内含有谷胱甘肽(GSH),但是细胞内GSH的浓度远远高于血清中GSH的浓度。二硫键可以在血液循环过程中保持稳定,但是在胞内高浓度GSH环境下可在迅速断裂。对于合成的聚(β-氨基酯)来说,引入的二硫键有助于聚合物在进入细胞内充分的降解,从而一方面促进质粒DNA 的充分释放,另一方面降低基因传递载体的细胞毒性,两者协同提高质粒的转染效率。
本发明第一方面旨在提供一种含二硫键的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体。本发明通过化学合成方法制备了一种新型阳离子聚合物——聚(β-氨基酯)类聚合物,成功引入二硫键,加快其生物降解速率的同时提高基因转染效率,并降低细胞毒性。
一种含二硫键的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体,其结构式为:
SF-1:
或SF-2:
或SF-3:
或SF-4:
所述的聚(β-氨基酯)类聚合物的分子量为2000~12000Da。
第二方面,本发明提供了一种含二硫键的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体的合成方法,具体步骤如下:
步骤1,通过2-羟乙基二硫化物和丙烯酸异氰基乙酯的反应制备含二硫键的双丙烯酸酯单体化合物(S);
步骤2,双丙烯酸酯单体化合物(S)与5-氨基-1-戊醇加成聚合反应生成丙烯酸酯封端的聚(β-氨基酯)(SF);
步骤3,聚(β-氨基酯)(SF)经小分子胺封端合成聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体(SF-1、SF-2、SF-3或SF-4)。
步骤1中,反应介质为四氢呋喃,催化剂为二月桂酸二丁基锡,反应温度为30~50℃,所述的含二硫键的双丙烯酸酯化合物(S)的结构式为
步骤2中,所述的加成聚合反应采用无溶剂条件,反应时间为24~48h,反应温度为70~90℃,所述的含二硫键的双丙烯酸酯单体化合物(S)与5-氨基-1-戊醇的摩尔比为 1.1~1.2:1.0。
步骤3中,所述的小分子胺为1,3-二氨基戊烷、1,5-二氨基-2-甲基戊烷、1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪和四亚甲基二胺中的一种,反应溶剂为四氢呋喃。
第三方面,本发明提供了一种含二硫键的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体与质粒DNA形成的复合物。
所述的复合物为DNA与上述所述的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体通过静电作用形成的复合物。
第四方面,本发明提供了上述所述的复合物的制备方法,包括以下步骤:
聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体与质粒DNA加入到缓冲溶液中混合均匀,即得复合物。
所述的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体与质粒DNA的质量比为40~80:1,所述的缓冲液优选为浓度为25mM,pH值为5.2的NaOAc缓冲溶液。
第五方面,本发明提供了上述复合物在制备用于基因治疗的药物或基因转染试剂盒中的应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果:我们成功将二硫键引入到传统的聚(β-氨基酯)中,使其在进入细胞转染时出现一种氧化还原响应机制。在血液中稳定存在的聚(β- 氨基酯)在进入细胞后,由于一定浓度谷胱甘肽的存在,聚(β-氨基酯)结构中的二硫键断裂,促进聚(β-氨基酯)的降解,从而使得负载的DNA充分释放,提高转染效果。同时另一方面,聚(β-氨基酯)的降解也会使得其细胞毒性降低,从另一方面提高转染效率。
附图说明
图1为含二硫键的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体的合成路线。
图2为本发明实施例6中制备得到的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体(SF-1,SF-2,SF-3和SF-4)与商业化转染试剂PEI 25kDa细胞毒性的对比结果。
图3为本发明实施例6中聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体(SF-1,SF-2,SF-3和 SF-4)分别与DNA形成的复合物的电势。
图4为本发明实施例6中聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体(SF-1,SF-2,SF-3和 SF-4)分别与DNA形成的复合物的粒径。
图5为本发明实施例6中聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体(SF-1,SF-2,SF-3和 SF-4)与商业化转染试剂PEI 25kDa介导EGFP质粒转染A549细胞的转染结果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图,对本发明作进一步详述。
实施例1
步骤1,2-羟乙基二硫化物(3mmol)溶解于四氢呋喃溶液(10mL)中,加入丙烯酸异氰基乙酯(6mmol),滴加两滴二月桂酸二丁基锡(催化剂),于40℃下搅拌反应24h。反应后混合溶液经旋蒸得粗产物,继而用柱层析提纯(乙酸乙酯/石油醚=1/1)。
S(产率95%):1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.37(t,J=5.6Hz,2H),6.33(dd,J= 17.3,1.3Hz,2H),6.14(dd,J=17.3,10.4Hz,2H),5.93(dd,J=10.4,1.2Hz,2H),4.16(t,J =6.3Hz,4H),4.08(t,J=5.5Hz,4H),3.24(q,J=5.6Hz,4H),2.92(t,J=6.3Hz,4H)。
步骤2,步骤1合成的双丙烯酸酯单体化合物S(2.2mmol)与5-氨基-1-戊醇(2mmol)在无溶剂情况下搅拌反应24h,反应温度设定为70℃,从而生成丙烯酸酯封端的聚(β- 氨基酯)SF。SF(产率100%):1H NMR(500MHz,DMSO)δ6.35(CH2=CH-),6.14 (CH2=CH-),5.93(CH2=CH-),4.17(dd,J=13.6,7.2Hz,4H),3.99(t,J=5.5Hz,4H),3.46– 3.33(m,2H),3.21(dd,J=11.4,5.6Hz,4H),2.94(t,J=6.1Hz,4H),2.65(t,J=7.0Hz,4H), 2.38(t,J=6.7Hz,4H),2.35–2.25(m,2H),1.46–1.35(m,2H),1.33(dd,J=14.5,7.5Hz, 2H),1.23(dd,J=15.1,8.0Hz,2H)。
步骤3,丙烯酸酯封端的聚(β-氨基酯)SF(300mg)分别溶解于四氢呋喃溶液(4mL)中,反应体系中加入0.6mmol的一种小分子胺(1,3-二氨基戊烷、1,5-二氨基-2-甲基戊烷、1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪和四亚甲基二胺中的一种),室温搅拌24h,最终分别得到四种产物聚(β-氨基酯)(SF-1,SF-2,SF-3和SF-4)。
实施例2
实施例2与实施例1不同的是步骤2,步骤1与步骤3同实施例1。
步骤2,步骤1合成的双丙烯酸酯单体化合物S(2.2mmol)与5-氨基-1-戊醇(2mmol)在无溶剂情况下搅拌反应48h,反应温度设定为70℃,从而生成丙烯酸酯封端的聚(β- 氨基酯)SF。
实施例3
实施例3与实施例1不同的是步骤2,步骤1与步骤3同实施例1。
步骤2,步骤1合成的双丙烯酸酯单体化合物S(2.2mmol)与5-氨基-1-戊醇(2mmol)在无溶剂情况下搅拌反应24h,反应温度设定为90℃,从而生成丙烯酸酯封端的聚(β- 氨基酯)SF。
实施例4
实施例4与实施例1不同的是步骤2,步骤1与步骤3同实施例1。
步骤2,步骤1合成的双丙烯酸酯单体化合物S(2.2mmol)与5-氨基-1-戊醇(2mmol)在无溶剂情况下搅拌反应48h,反应温度设定为90℃,从而生成丙烯酸酯封端的聚(β- 氨基酯)SF。
实施例5
实施例5与实施例1不同的是步骤2,步骤1与步骤3同实施例1。
步骤2,步骤1合成的双丙烯酸酯单体化合物S(2.4mmol)与5-氨基-1-戊醇(2mmol)在无溶剂情况下搅拌反应24h,反应温度设定为70℃,从而生成丙烯酸酯封端的聚(β- 氨基酯)SF。
实施例6
实施例6与实施例1不同的是步骤2,步骤1与步骤3同实施例1。
步骤2,步骤1合成的双丙烯酸酯单体化合物S(2.4mmol)与5-氨基-1-戊醇(2mmol)在无溶剂情况下搅拌反应48h,反应温度设定为70℃,从而生成丙烯酸酯封端的聚(β- 氨基酯)SF。
实施例7
实施例7与实施例1不同的是步骤2,步骤1与步骤3同实施例1。
步骤2,步骤1合成的双丙烯酸酯类单体S(2.4mmol)与5-氨基-1-戊醇(2mmol)在无溶剂情况下搅拌反应24h,反应温度设定为90℃,从而生成丙烯酸酯封端的聚(β-氨基酯)SF。
实施例8
实施例8与实施例1不同的是步骤2,步骤1与步骤3同实施例1。
步骤2,步骤1合成的双丙烯酸酯类单体S(2.4mmol)与5-氨基-1-戊醇(2mmol)在无溶剂情况下搅拌反应48h,反应温度设定为90℃,从而生成丙烯酸酯封端的聚(β-氨基酯)SF。
实施例9
细胞毒性实验
将实施例6制备得到的四种聚(β-氨基酯)类基因载体(SF-1,SF-2,SF-3和SF-4)的细胞毒性通过四唑盐(MTT)比色法测定,并与商业化产品PEI 25kDa比较。A549 细胞培养在含10%新生牛血清的DMEM培养液(含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中,并放置于37℃,5%CO2的孵箱中生长。取处于对数生长期的A549细胞,用含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶消化液消化后以每孔1×104个细胞接种于96孔板,每孔体积为100μl。将培养板移入37℃,5%CO2的孵箱中培养过夜。除去培养液,用1×PBS洗,每孔加入不同剂量的合成聚合物或对照物及无血清培养液,培养4小时。除去培养液,1×PBS洗,每孔加入100μl完全培养液继续培养24小时。接着每孔加入20μl(5mg/mL)MTT溶液,37℃反应4小时。小心吸弃孔内培养上清液,每孔加入100μl二甲亚砜(DMSO),室温温育30分钟。振荡后通过酶标仪(Bio-RAD,Microplate Reader3550)测定各孔在570nm的光吸收值。
细胞存活率(%)=(OD570样品/OD570对照)×100
结果如图2所示,对A549细胞系,所合成的聚合物PBAE比PEI 25kDa的细胞毒性小很多。而且在最佳转染条件下,所合成聚合物的细胞毒性很小,细胞存活率均达到 95%以上。
实施例10
聚合物PBAE与增强型绿色荧光蛋白质粒(EGFP)复合物的制备
将实施例6制备得到的四种聚(β-氨基酯)类基因载体(SF-1,SF-2,SF-3和SF-4)分别溶于DMSO中,配成10mg/mL的储备液。将质粒DNA(EGFP)用ddH2O稀释为 1mg/mL储备液。按一定的聚合物/DNA质量比(40、60和80)配制转染复合物,具体过程如下:取1μl质粒DNA的溶液(1mg/mL)到NaOAc缓冲溶液(25mM,PH 5.2)中,轻轻混匀,再取一定量的聚合物(4μl、6μl和8μl)溶于50μl NaOAc缓冲溶液(25mM, PH 5.2)中,轻轻混匀,然后将二者混合,振荡10秒钟,室温静置10~15分钟,即可得到含二硫键的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体与质粒DNA形成的复合物,用于表征其性能和细胞转染的实验。
复合物的粒径与电势可以通过动态光照散射实验测得,如图3和图4所示,通过上述方法制备的PBAE/DNA复合物粒径在150nm左右,其电势在+23~+28mV范围内,复合物粒径能够满足其通过胞吞作用进入细胞的条件,同时复合物所带电势也较为适中,满足基因转染要求。PEI 25kDa作为对照样,当PEI 25kDa/DNA=3时转染效果做好,所以实验中PEI25kDa/DNA复合物制备通过以下方法:取1μl质粒DNA的溶液 (1mg/mL)到NaOAc缓冲溶液(25mM,PH 5.2)中,轻轻混匀,再取3μg PEI 25kDa 溶于50μl NaOAc缓冲溶液(25mM,PH5.2)中,轻轻混匀,然后将二者混合,振荡 10秒钟,室温静置10-15分钟,即可用于细胞转染实验。
实施例11
转染性能的测定
将A549人肺腺癌细胞培养在含10%新生牛血清的DMEM培养液(含100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中,并放置37℃,5%CO2的孵箱中生长。将实施例8制备得到的四种聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体与质粒DNA形成的复合物、对照转染试剂PEI 25kDa与DNA的复合物转染细胞实验具体步骤如下:转染前24小时,取处于对数生长期的细胞,用含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶消化液消化后以每孔1×105个细胞接种于24孔板,每孔加0.5mL完全培养液,将培养板移入孵箱,培养24小时。当细胞汇合度达到70-80%时,除去培养液,分别加入各复合物,然后再加入200μl不含新生牛血清的DMEM培养液,混匀后将上述转染液加入到24孔板的各个孔中。37℃下,培养4小时,之后吸除转染液,每孔分别加入含10%新生牛血清的DMEM培养液,24 小时后在荧光显微镜下观察或用流式细胞仪分析。结果如图5所示,PEI 25kDa的转染效率为22%,然后SF-1、SF-2、SF-3和SF-4在聚合物/DNA质量比为60时转染效率分别为48%、43%、52%和47%,远高于PEI 25kDa的转染效率,由此可见,本发明合成的聚(β-氨基酯)在基因传递方面有很好的应用前景。
Claims (6)
1.一种含二硫键的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体,其特征在于,结构式为:
SF-1:
SF-2:
SF-3:
SF-4:
中的一种,所述的聚(β-氨基酯)类聚合物的分子量为2000~12000Da。
2.一种如权利要求1所述的含二硫键的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体的合成方法,其特征在于,具体步骤如下:
步骤1,反应介质为四氢呋喃,催化剂为二月桂酸二丁基锡,反应温度为30~50℃,所述的含二硫键的双丙烯酸酯单体化合物(S)的结构式为通过2-羟乙基二硫化物和丙烯酸异氰基乙酯的反应制备含二硫键的双丙烯酸酯单体化合物(S);
步骤2,含二硫键的双丙烯酸酯单体化合物(S)与5-氨基-1-戊醇加成聚合反应生成丙烯酸酯封端的聚(β-氨基酯)(SF),所述的加成聚合反应采用无溶剂条件,反应时间为24~48h,反应温度为70~90℃,所述的双丙烯酸酯单体化合物(S)与5-氨基-1-戊醇的摩尔比为1.1~1.2:1.0;
步骤3,聚(β-氨基酯)(SF)经小分子胺封端合成聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体,所述的小分子胺为1,3-二氨基戊烷、1,5-二氨基-2-甲基戊烷、1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪和四亚甲基二胺中的一种,反应溶剂为四氢呋喃。
3.一种如权利要求1所述的含二硫键的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体与质粒DNA形成的复合物。
4.一种如权利要求3所述的复合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体与质粒DNA加入到缓冲溶液中混合均匀,即得复合物。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体与质粒DNA的质量比为40~80:1,所述的缓冲液为浓度为25mM,pH值为5.2的NaOAc缓冲溶液。
6.一种如权利要求3所述的复合物在制备用于基因治疗的药物或基因转染试剂盒中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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