CN111534475B - 一种细胞表面偶联抗体的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞表面偶联抗体的方法及其应用，包括如下步骤：(1)对天然唾液酸进行化学改造，获得含有叠氮基团的唾液酸衍生物；(2)使细胞吸收上述唾液酸衍生物，获得叠氮修饰细胞；(3)用一连接化合物对抗体进行修饰，获得修饰抗体；(4)将上述修饰抗体与上述叠氮修饰细胞共孵育，即成。本发明通过化学合成手段体外改造天然唾液酸，利用官能团化的唾液酸衍生物实现对细胞表面的抗体修饰。本发明的修饰方法简便，成本低，安全高效，无需复杂的基因编辑或者酶催化操作，并具有普适性，理论上可以实现细胞表面偶联任何抗体或者大分子物质。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种细胞表面偶联抗体的方法及其应用。
背景技术
随着肿瘤治疗进入细胞免疫疗法时代，人们对于抗击癌症的研究取得重大突破。目前主流的肿瘤免疫治疗可分为细胞疗法和免疫检测点抑制剂疗法，前者按照细胞来源又可分为自体细胞治疗(细胞来自于患者)和异体细胞治疗(细胞来自于第三方供体)，一般是从患者或其他人体内提取免疫细胞经改造、扩增后回输患者体内，抗击肿瘤。CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)疗法即是这类疗法中的佼佼者，受到广泛的关注和研究。另外一种免疫检查点抑制疗法，如PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体等，其原理是通过解除肿瘤对免疫细胞的耐受作用，恢复免疫细胞对肿瘤的识别、杀伤功能达到抗击肿瘤的目的。如今随着国际制药巨头对细胞免疫治疗的不断投入，相关技术将持续突破，细胞治疗市场前景一片光明。但同时也面对诸多挑战，如CAR-T治疗中的细胞因子风暴、脱靶，同时CAR-T在生产过程中操作复杂，技术要求高、难度大等由此带来的高昂治疗费用也非普通家庭能够承担的。PD1免疫检查点阻断疗法存在着耐药以及有效率低，再加上高昂的治疗费用，依然需要不断的技术突破和创新来克服这些困难。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种细胞表面偶联抗体的方法及其应用。
本发明的技术方案如下：
一种细胞表面偶联抗体的方法，包括如下步骤：
(1)对天然唾液酸进行化学改造，获得含有叠氮基团的唾液酸衍生物；
(2)使细胞吸收上述唾液酸衍生物，通过细胞的唾液酸代谢途径将叠氮基团表达于细胞膜的表面，获得叠氮修饰细胞；
(3)用一连接化合物对抗体进行修饰，获得修饰抗体，该连接化合物的一端具有可与巯基或氨基反应的第一活性基团，另一端具有可与叠氮基团发生生物正交反应的第二活性基团，其中第一活性基团与上述抗体上的巯基或氨基反应连接；
(4)将上述修饰抗体与上述叠氮修饰细胞共孵育，使上述修饰抗体的连接化合物的第二基团与叠氮修饰细胞表面的叠氮基团反应连接，即成。
在本发明的一个优选实施方案中，所述含有叠氮基团的唾液酸衍生物包括具有如下结构式的化合物：
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一活性基团包括琥珀酰亚胺活性酯基团和马来酰亚胺基团。
进一步优选的，所述连接化合物包括如有如下结构式的化合物：
在本发明的一个优选实施方案中，所述细胞为免疫细胞。
一种细胞，其表面具有通过吸收含有叠氮基团的唾液酸衍生物而经唾液酸代谢途径表达于表面的叠氮基团，该叠氮基团通过一连接化合物连接抗体，该连接化合物的一端具有可与巯基或氨基反应的第一活性基团，另一端具有可与叠氮基团发生生物正交反应的第二活性基团，其中，第一活性基团与上述抗体上的巯基或氨基反应连接，第二基团与上述叠氮基团反应连接。
在本发明的一个优选实施方案中，所述含有叠氮基团的唾液酸衍生物包括具有如下结构式的化合物：
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一活性基团包括琥珀酰亚胺活性酯基团和马来酰亚胺基团。
进一步优选的，所述连接化合物包括如有如下结构式的化合物：
在本发明的一个优选实施方案中，其为免疫细胞。
本发明的有益效果是：
1、本发明通过化学合成手段体外改造天然唾液酸，利用官能团化的唾液酸衍生物实现对细胞表面的抗体修饰。
2、本发明的修饰方法简便，成本低，安全高效，无需复杂的基因编辑或者酶催化操作，并具有普适性，理论上可以实现细胞表面偶联任何抗体或者大分子物质。
附图说明
图1为本发明的原理图。
图2为本发明中抗体与连接化合物的连接方式以及抗体连接通过生物正交反应连接细胞的原理图。
图3为本发明实施例1中的FITC-Stau检测细胞表面叠氮基团的原理图。
图4为本发明实施例1中的FITC-Stau对NK细胞表面叠氮唾液酸的荧光成像图。
图5为本发明实施例1中的流式细胞仪检测NK细胞表面偶联anti-Her2的情况图。
图6为本发明实施例1中的偶联Her2的NK细胞对4T1的杀伤情况图。
图7为本发明实施例1中的NK细胞偶联Her2抗体用于小鼠体内乳腺癌的治疗结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
一、偶联反应机理
利用细胞唾液酸代谢途径，在细胞生长过程中加入含有叠氮基团的唾液酸衍生物，得到表面被修饰了叠氮修饰细胞(Cell-N3)如图1所示。抗体的修饰是根据抗体蛋白氨基酸残链上剩余的氨基或者巯基与连接化合物linker-X中的琥珀酰亚胺活性酯基团或者马来酰亚胺基团反应，而连接化合物另一端含有能与叠氮基团发生生物正交反应的配体基团，完成抗体共价键偶联细胞的目的，
含有叠氮基团的唾液酸衍生物的优选的具体结构式如下：
连接化合物的优选的具体结构式如下：
二、相关分子的合成步骤
9N3-SA的合成参考文献Cheng B，et al.ACS chemical biology，2019，14，2141.进行。
5N3-SA和diN3-SA的合成方法如下：
5N3-SA的合成
1)取反应物1(合成步骤参考文献：Abdu-Allah，et al.Journal of MedicinalChemistry，2008，51，6665.)(500mg)溶于10mLN、N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU，736mg)、N，N-二异丙基乙胺(DIEA，500mg)和156mg叠氮乙酸，反应在室温下搅拌过夜，然后将反应液浓缩经硅胶柱纯化得到中间体2(300mg)。
2)把300mg中间体2加入到30mL超纯水中，然后加入323mg碘单质粉末，室温搅拌24小时，把反应液萃取、浓缩后经高压制备液相纯化得到100mg终产物5N3-SA。
diN3-SA的合成
1)取反应物3(合成步骤参考文献：Peng W，Paulson J C.Journal of theAmerican Chemical Society，2017，139，12450.)(500mg)溶于10mLDMF中，然后加入HATU691mg、DIEA 470mg和147mg叠氮乙酸，反应在室温下搅拌过夜，然后将反应液浓缩经硅胶柱纯化得到中间体4(280mg)。
2)把280mg中间体4加入到30mL超纯水中，然后加入323mg碘单质粉末，室温搅拌24小时，把反应液萃取、浓缩后经高压制备液相纯化得到80mg终产物diN3-SA。
上述连接化合物可以在一些试剂网站(如成都栢尔康生物科技有限公司、上海毕得医药科技有限公司)上购买或者利用常规的有机合成方法制备。
其中以linker-4为例，其合成路线如下：
具体合成方法为：取500mg Stau溶解在10mL二氯甲烷，然后加入317mg DIEA和123mg丁二酸酐，反应于室温搅拌1小时，将反应液浓缩后即得到产物Stau-1，该产物无需纯化直接进行下一步，将212mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、354mg(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，EDC)和上一步得到的Stau-1用10mL二氯甲烷溶解后室温反应3小时，然后用乙酸乙酯和水萃取，有机相浓缩后经硅胶柱纯化得120mg产物linker-4。
三、通用偶联步骤：
1，细胞表面叠氮化：
取适量含有叠氮基团的唾液酸衍生物加入到细胞正常培养基中，终浓度为100μM。用该培养基按照正常条件培养细胞24～48小时即得到叠氮修饰细胞Cell-N3，然后用PBS清洗2-3次换成正常培养基备用。
2，抗体的修饰：
抗体用PBS配制浓度为6mg/mL的溶液备用，取50μL已经用DMSO配好的linker(连接化合物)溶液(母液浓度为10mM)试剂加入到1mL已配好的抗体溶液中，室温孵育30分钟。然后加入50μLTrisbuffer(pH8.0，1M)进行淬灭，室温淬灭5分钟即可得到修饰后的修饰抗体IgG-B，溶液备用可直接进行下一步偶联细胞。
3，细胞表面偶联抗体：
取100μL步骤2中所得的修饰抗体溶液，加入到1mL步骤1所得Cell-N3(细胞密℃105左右)中，37℃孵育2小时，在此过程中，抗体连接化合物末端的活性基团与细胞表面的叠氮基发生生物正交反应，该反应在生理条件下即可进行，并且不会与培养基或者生物体内其它的物质分子发生反应，该反应原理如图2所示。PBS清洗2-3次即得到偶联了抗体的细胞。
四、免疫细胞表面偶联特定抗体实现对肿瘤的治疗
利用上述通用偶联步骤中的方法，本发明实现了免疫细胞表面特定抗体的偶联，本实施例以在NK细胞表面连接乳腺癌细胞表面受体Her2的抗体(anti-Her2)为例进行说明。连接化合物选用linker1，含有叠氮基团的唾液酸衍生物用9N3-SA。
1，抗体的修饰：
用PBS将anti-Her2配制成6mg/mL的溶液，取1mL的抗体溶液里面加入50μLlinker1母液(10mM)。室温条件下偶联30分钟，然后加入50μLTrisbuffer(pH8.0，1M)进行室温淬灭5分钟，即得到偶联上linker1的Her2抗体anti-Her2-1inker1，溶液于4℃存放备用。
2，NK细胞的叠氮化
取正常培养的NK细胞分到24孔板中，然后用含有终浓度为100μM的9N3-SA的NK细胞培养基进行正常培养24小时～48小时，细胞经PBS洗3次后换成正常NK培养基即得到修饰了叠氮基团的NK细胞。为了验证细胞被修饰上叠氮基，本实施例合成了能够于叠氮基发生正交反应并且连接有荧光素的配体分子FITC-Stau(如图3所示)。在上述已经修饰好的NK细胞培养基中加入FITC-Stau，终浓度为100μM，37℃孵育2-4小时，然后用PBS清洗3次后利用激光共聚焦观察细胞表面的荧光。结果如图4所示，与对照组细胞相比，未经叠氮唾液酸修饰的细胞表面没有荧光而经叠氮唾液酸修饰的细胞其表面含有很强的荧光信号，结果说明叠氮唾液酸可以被NK细胞吸收并代谢到糖蛋白末端。
FITC-Stau的合成路线如下：
其中FITC为商业易买产品，Stau合成步骤参考文献(Chang，Pamela V.，etal.Journal of the American Chemical Society.2007，129，8400.)，具体合成方法为：取200mg FITC溶解在5mLDMF中然后加入209mg Stau和200mg DIEA，反应于室温下搅拌5小时，把反应液浓缩然后经高压制备液相纯化得到100mg终产物FITC-Stau。
3，NK细胞表面偶联抗体
取100μL步骤1中所得的抗体溶液，加入到1mL步骤2所得已经修饰了(细胞密℃105左右)中，37℃孵育2-8小时，PBS清洗2-3次即得到偶联了Her2抗体的NK细胞，anti-Her2-NK。为了验证的NK细胞表面确实连接了Her2抗体，本实施例采用带有藻蓝蛋白标记的APC-anti-Fc作为二抗抗Her2抗体，分别处理偶联了Her2抗体的细胞和未经处理空白的NK细胞作为对照，通过流式细胞仪检测藻蓝蛋白的荧光信号。结果如图5所示，偶联了Her2抗体的NK细胞表面可以明显观察到APC的红色荧光信号，而对照组没有偶联抗体的细胞表面则看不到荧光信号，表明通过本发明实施例的方法成功的把Her2抗体偶联到NK细胞表面。
4，体外检测anti-Her2-NK对乳腺癌细胞的杀伤活性
本实验采用稳定表达Her2蛋白的4T1小鼠乳腺癌细胞作为靶细胞进行体外验证anti-Her2-NK对乳腺癌细胞的杀伤活性，将4T1细胞与正常的NK细胞或anti-Her2-NK细胞以数量比1∶5的比例混合，然后在37℃培养箱中共孵育4h后，用乳酸脱氢酶检测试剂盒检测上清液中乳酸脱氢酶的含量，参照空白组计算细胞毒性。结果如图6所示。
5，anti-Her2-NK在小鼠中对乳腺癌细胞的杀伤情况
用表达有Her2的4T1细胞在Balb/c小鼠体内构建乳腺癌模型，在种瘤后第七天时开始尾静脉注射anti-Her2-NK细胞(此时小鼠肿瘤体积约200mm3)，每周注射一次，每次细胞数量为107。对照组小鼠注射正常的NK细胞，空白组注射同等体积的PBS溶液，连续注射三周，记录肿瘤体积变化。结果如图7所示，注射了anti-Her2-NK细胞的实验组小鼠肿瘤体积明显比对照组和空白组小鼠的肿瘤小，说明NK细胞表面偶联了Her2抗体可以增强NK细胞杀死肿瘤细胞的活性，用于癌症的治疗。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (4)
1.一种细胞表面偶联抗体的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)对天然唾液酸进行化学改造，获得含有叠氮基团的唾液酸衍生物，该含有叠氮基团的唾液酸衍生物包括具有如下结构式的化合物：
(2)将上述唾液酸衍生物以100μM的终浓度与细胞共培养24h，通过细胞的唾液酸代谢途径将叠氮基团表达于细胞膜的表面，获得叠氮修饰细胞，该细胞为NK细胞；
(3)用一连接化合物对抗体进行修饰，获得修饰抗体，该连接化合物的一端具有可与巯基或氨基反应的第一活性基团，另一端具有可与叠氮基团发生生物正交反应的第二活性基团，其中第一活性基团与上述抗体上的巯基或氨基反应连接；第一活性基团包括琥珀酰亚胺活性酯基团和马来酰亚胺基团；
(4)将上述修饰抗体与上述叠氮修饰细胞共孵育，使上述修饰抗体的连接化合物的第二基团与叠氮修饰细胞表面的叠氮基团反应连接，即成。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述连接化合物包括如有如下结构式的化合物：
3.一种细胞，其特征在于：该细胞为NK细胞，其表面具有通过吸收含有叠氮基团的唾液酸衍生物而经唾液酸代谢途径表达于表面的叠氮基团，该叠氮基团通过一连接化合物连接抗体，该连接化合物的一端具有可与巯基或氨基反应的第一活性基团，另一端具有可与叠氮基团发生生物正交反应的第二活性基团，其中，第一活性基团与上述抗体上的巯基或氨基反应连接，第二基团与上述叠氮基团反应连接；
含有叠氮基团的唾液酸衍生物包括具有如下结构式的化合物：
上述唾液酸衍生物以100μM的终浓度与细胞共培养24h，通过细胞的唾液酸代谢途径将叠氮基团表达于细胞膜的表面，
第一活性基团包括琥珀酰亚胺活性酯基团和马来酰亚胺基团。
4.如权利要求3所述的细胞，其特征在于：所述连接化合物包括如有如下结构式的化合物：
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