CN113583189B

CN113583189B - 一种多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂、制备方法及其应用

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Publication number: CN113583189B
Application number: CN202110900359.4A
Authority: CN
Inventors: 李全顺; 梁骁; 温凯; 姜伟; 陈英翾; 韩浩博
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2021-08-06
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2041-08-06
Also published as: CN113583189A

Abstract

一种基于酶促化学偶联构建的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂、制备方法及其在转染分子量为10～450kDa蛋白质中的应用，属于生物技术领域。本发明通过酶促开环聚合与缩聚反应相偶联的模式，制备聚氨酯载体材料，利用原子转移自由基聚合反应对聚氨酯材料进一步修饰改性，构建多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂，羟基的引入有利于提升试剂与蛋白质药物的相互作用，进而提升对蛋白质药物的组装及转染能力。以人宫颈癌细胞HeLa为目标细胞，对制备的转染试剂与蛋白质的组装能力与转染效率进行了系统评价。结果显示，转染试剂能够与蛋白质形成稳定的纳米复合物，并成功将不同分子量大小的蛋白质转染至细胞内，同时保持了蛋白质的结构与生物学活性。

Description

一种多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于酶促化学偶联构建的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂、制备方法及其在转染分子量为10～450kDa蛋白质中的应用。

背景技术

随着分子生物学和细胞生物学的快速发展，DNA转染已经逐渐不能满足科研的需求，而蛋白质转染技术是对DNA和RNAi转染的补充，是蛋白质功能研究和细胞路径研究的有力工具。直接将蛋白质转染进入细胞不仅节省时间，而且还可以更便捷地应用于活性蛋白和多肽细胞内相互作用、多肽库筛选以及蛋白质半衰期测定等研究领域。然而，蛋白质作为天然大分子，因其分子量较大、表面负载电荷、高级结构容易破坏等特点成为其胞内转染的障碍，同时蛋白分子进入细胞后易受胞内复杂环境的影响，容易降解或失活。目前，蛋白质转染试剂的缺乏严重制约了蛋白质类药物的研发以及蛋白质胞内功能的研究。

为了更加高效安全地进行蛋白质的胞内转染，亟需开发一类可以转染不同分子量大小以及不同等电点蛋白质的转染试剂，这些试剂要能够对未经修饰的蛋白质进行高效、安全地转染，并且在转染过程中蛋白质的高级结构不被破坏。加拿大Applied BiologicalMaterials公司生产的Proteinfectin转染试剂，是由一套独特的基于阳离子脂类的载体系统组成，可用于将生物学上有活性的蛋白质、肽段或抗体导入活细胞，用于转染从小分子多肽到超过550kDa的蛋白质，市价为3200元/250μL。法国Polyplus Transfection公司开发的PULSin试剂是一种有效转染功能蛋白/抗体到活细胞中的新型转染试剂。PULSin是一类阳离子两性物质，可以通过正电荷外衣包裹许多蛋白质/抗体，利用两性内涵体释放因子成功解决了蛋白质在胞浆中的释放问题，市价为6000元/400μL。到目前为止，基于蛋白质转染的商业化试剂主要依赖国外进口，价格高昂，我国尚缺少自主研发的高性能商业化蛋白质转染试剂。因此，开发一种具有独立知识产权的高转染效率、低成本的蛋白质转染试剂，在蛋白质功能研究及蛋白质药物研发等领域具有重要的意义。

在阳离子聚合物中，聚氨酯材料是一类主链上含有氨基甲酸酯键的载体，其所含有的正电荷很容易与带负电的蛋白质或核酸分子组装形成纳米复合物，并实现高效入胞；同时，其所含有的氨基基团能够促进体系通过独特的“质子海绵”效应实现内涵体逃逸，达到药物在胞质中的快速释放；此外，该类材料具有良好的生物降解能力和安全性，不会引发组织的炎症反应及细胞毒性。因此，聚氨酯及其衍生物材料在生物医学领域，特别是药物/基因控制释放载体、生物医用替代材料等方面得到了广泛的关注。目前，聚氨酯载体材料主要是通过化学催化途径来合成的，合成条件苛刻(高温减压、无水无氧等)，技术路线复杂，而且金属催化剂的痕量残留和潜在毒性限制了其应用范围。与传统的化学聚合反应相比，酶促聚合由于反应条件温和、环境友好及高度立体和区位选择性等优势，已成为生物催化与生物转化领域中的研究热点。不仅如此，酶促聚合还具有如下优势：(1)底物的高度专一性，可以极大地提高底物的转化率，且没有副产物的生成；(2)催化剂可以回收并重复利用，有利于降低合成工艺成本；(3)酶促聚合可以在无溶剂、水相、有机相及多相界面进行；(4)能够有效催化有机金属催化剂难于实现的大环内酯类等化合物的开环聚合；(5)容易实现聚合物末端的结构控制，达到对聚合物修饰和改性的目的。作为一种新兴的聚合方法，酶促聚合为高分子材料的合成开辟了一条全新的、环境友好的途径，是高效合成新型功能高分子材料的有效方法，对于促进化学和材料工业向绿色和清洁化方向发展具有重要的意义。

发明内容

本发明通过酶促开环聚合与缩聚反应相偶联的模式，以己内酯、癸二酸二乙酯、N-甲基二乙醇胺为单体制备聚氨酯载体材料，利用原子转移自由基聚合反应对聚氨酯材料进一步修饰改性，构建多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂，羟基的引入有利于提升试剂与蛋白质药物的相互作用，进而提升对蛋白质药物的组装及转染能力。将多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂与蛋白分子复合得到的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/蛋白质复合物贴附在带负电荷细胞表面，通过胞吞作用进入溶酶体，并通过聚氨酯材料的内涵体逃逸能力，将负载的蛋白质释放到细胞质中。由于蛋白质和多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂是通过非共价作用力形成复合物的，因此该组装策略不会干扰蛋白质的结构与生物学活性。

本发明所制备的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂，能够转染分子量为10～450kDa的蛋白质。以不同分子量大小的超氧化物岐化酶(SOD)、牛血清白蛋白(BSA)、核糖核酸酶A(RNase A)、颗粒酶B(GrB)、β-半乳糖苷酶(β-gal)为模型蛋白，以人宫颈癌细胞HeLa细胞系为模型细胞，对合成的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂的转染能力进行了系统评价。该试剂能够与蛋白质形成稳定的纳米复合物，并成功将不同分子量大小的蛋白质递送到胞浆中，同时保持了蛋白质的生物学活性。将蛋白质成功递送到胞内在疾病治疗、基因工程以及合成生物学等研究领域具有重要的意义。

本发明所涉及的SOD，分子量为32kDa，来源于牛红细胞，购自北京拜尔迪公司。本发明中所涉及的BSA，分子量为66.3kDa，使用热休克法制备，购自北京金泰宏达生物科技有限公司。本发明中所涉及的RNase A，分子量为13.7kDa，来源于牛胰腺，能切割细胞内内的RNA分子，具有抗肿瘤活性，购自美国Sigma公司。本发明所涉及的GrB，分子量为27kDa，在大肠杆菌中表达。在细胞胞浆中，GrB能通过三种不同的途径诱导细胞凋亡，具有抗肿瘤活性，购自美国Cloud-Clone Corp公司。本发明所涉及的β-gal，分子量为430kDa，是细胞溶酶体中的水解酶，可以降解其底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)生成蓝色产物，用于β-gal的胞内检测，购自美国Sigma公司。

本发明所述的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂的制备方法，其步骤如下：

(1)Br-聚酯材料合成：称取己内酯0.4～0.5g、癸二酸二乙酯2～3g、N-甲基二乙醇胺1～2g和Novozym 435 100～300mg溶于5～10mL二苯醚中，在60～70MPa、80～90℃下搅拌12～24h，得到低聚物，防止单体挥发；再在0.1～0.3MPa、80～85℃下反应48～72h得到聚酯；然后加入50～500mg的溴代异丁酸，在200～300MPa、80～90℃条件下反应18～24h，得到粗产物；最后将粗产物在正己烷中沉淀，离心收集沉淀，再用二氯甲烷和正己烷分别洗涤3～5次，真空干燥(35～40℃，100～150min)后得到Br-聚酯；

(2)多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂的合成：称取溴化铜1～2mg，五甲基二乙烯三胺25～30μL和丙烯酸缩水甘油酯0.8～1.0g溶于3～5mL N,N-二甲基甲酰胺；氮气吹扫0.5～1h后密封，然后立即加入0.1～0.2mL、3.5mM抗坏血酸水溶液和100～150mg Br-聚酯，50～60℃油浴反应2～4h，再加入1～2mL乙醇胺继续反应12～24h，过滤去除溴化铜，并将滤液加入过量的乙醚中进行聚合物的沉淀，离心收集聚合物沉淀，二氯甲烷和乙醚分别洗涤3～5次，真空干燥(35～40℃，100～150min)后得到本发明所述的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂。

本发明所述的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂，其由上述方法制备得到。

本发明所述的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂，能够在转染分子量为10～450kDa蛋白质中得到应用。

附图说明

图1：多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂(上)、Br-聚酯(中)和聚酯(下)的400MHz ¹HNMR谱图。¹H NMR(CDCl₃，ppm)：1.94(a，(CH₃)₂-)、3.73(b，HOCH₂-)、3.73(c，HOCH₂-)、3.43(d，CH₂NH-)。

图2：多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂和Br-聚酯的GPC谱图。左：多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂；右：Br-聚酯。

图3：多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂对宫颈癌细胞系HeLa的细胞毒性示意图。纵坐标为细胞存活率。

图4：实施例5制备的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/SOD透射电镜图。

图5：SOD和多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/SOD的圆二色性分析。

图6：荧光显微镜检测不同质量比下的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/FITC-BSA复合物的HeLa细胞胞吞能力。(a)质量比＝0；(b)质量比＝1；(c)质量比＝2；(d)质量比＝4；(e)质量比＝6；(f)质量比＝8；(g)质量比＝10；(h)质量比＝12；(i)质量比＝16；(j)质量比＝20。比例尺为200μm.

图7：激光共聚焦显微镜检测多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/FITC-BSA复合物进入HeLa细胞后不同时间下的定位情况。DAPI：细胞核；FITC：FITC-BSA；LysoTracker Red：溶酶体。

图8：荧光显微镜检测多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/FITC-RNase A复合物的HeLa细胞胞吞能力图。(a)FITC-RNase A；(b)多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/FITC-RNase A。

图9：多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/RNase A复合物对宫颈癌细胞系HeLa增殖抑制能力示意图。纵坐标为细胞存活率。

图10：流式细胞术分析不同质量比多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/FITC-GrB复合物的HeLa细胞胞吞能力定量图。

图11：多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/GrB复合物对宫颈癌细胞系HeLa增殖抑制能力示意图。纵坐标为细胞存活率。

图12：荧光显微镜检测多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/β-gal复合物的HeLa细胞胞吞能力图：(a)β-gal，(b)多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/β-gal。

具体实施方式

下面给出的实施例是对本发明作进一步说明，以便于本专业技术人员更全面地理解本发明。但所给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，因而该专业的技术人员根据上述发明内容所做出的非本质的改进和调整也应属于本发明保护范围。

实施例1

(1)Br-聚酯材料合成：称取己内酯0.45g、癸二酸二乙酯2.5g、N-甲基二乙醇胺1g和Novozym 435(固定化南极假丝酵母脂肪酶B，购自丹麦诺维信公司)200mg溶于7mL二苯醚中，并加入到25mL圆底反应烧瓶中，然后将反应瓶连接到数字真空调节器控制的真空管线上。设定反应条件：第一阶段，在60MPa、85℃下搅拌24h，得到低聚物，防止单体挥发；第二阶段，在0.1MPa、85℃下反应72h得到聚酯；第三阶段，加入200mg溴代异丁酸，在200MPa、85℃条件下反应24h。最后将粗产物在正己烷中沉淀，离心收集沉淀，再用二氯甲烷和正己烷分别洗涤3次，真空干燥(37℃，120min)得到Br-聚酯，产物质量为1.86g。

(2)多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂的合成：称溴化铜1.5mg，五甲基二乙烯三胺25μL和丙烯酸缩水甘油酯1g溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺，并加入至10mL支口烧瓶，氮气吹扫1h后密封。然后立即加入0.1mL、3.5mM抗坏血酸水溶液和100mg Br-聚酯，55℃油浴反应3h，再加入1mL乙醇胺继续反应24h，过滤去除溴化铜，并将滤液加入过量的乙醚中进行聚合物的沉淀。离心收集聚合物，二氯甲烷和乙醚分别洗涤3次，真空干燥(37℃，120min)得到多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂，产物质量为53.26mg。

实施例2

多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂的结构表征，具体过程如下：称取1mg多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂、聚酯材料以及Br-聚酯材料用氘代氯仿溶解，在400MHz下利用¹H NMR(Bruker Avance III NMR spectrometer)对多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂的结构进行表征。结果如图1所示，对于多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂来说，δ＝3.64和1.94ppm的信号对应于与羟基相邻的亚甲基和与Br相邻的甲基，新的峰值δ＝3.43ppm，认为是与羟基相连的甲基质子，以上结果证明了多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂的成功合成。凝胶渗透色谱在马尔文515高效液相色谱仪上进行，仪器配有马尔文410RI检测器和安捷伦PLgel MIXED-D柱，使用四氢呋喃作为洗脱剂，流量为1.0mL/min，温度为35℃，用窄分子量分布的聚苯乙烯标准品对检测进行了校准，结果如图2所示。多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂和Br-聚酯的数均分子量分别为13120和6670g/mol。此外，多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂的多分散性数为1.268，低于Br-聚酯(1.541)，同样证明多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂的成功合成，同时分子量分布更为均一。

实施例3

多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂毒性检测过程如下：按照8×10³/孔的接种量将人宫颈癌细胞HeLa接种到96孔板中，每个孔中的培养基体积用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM细胞培养基(完全培养基)补至200μL，将96孔板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养，待细胞汇合度大于70％时，小心弃去培养基，加入200μL DMEM培养基配制的不同浓度的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂样品(0～100μg/mL)，另设阴性对照组(仅加入DMEM培养基)和空白对照组，每组设6个复孔。加入样品处理后继续培养24h，然后每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，于37℃条件下继续培养4h，小心弃去培养基，然后每孔加入200μL二甲基亚砜，振荡5min，用酶标仪测试每孔490nm下的吸光度值。利用下列公式计算细胞存活率：

细胞存活率(％)＝(A_sample-A_blank)/(A_control-A_blank)×100％

其中，A_sample分别为加入不同浓度多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂后测定的吸光度值，A_control为用DMEM培养基正常培养细胞后测定的吸光度值，A_blank为无细胞仅加入DMEM细胞培养基后测定的吸光度值。

如图3所示，随着多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂浓度的增高，对人宫颈癌细胞HeLa的增殖抑制能力没有显著变化，在试剂浓度为100μg/mL时细胞存活率依然维持在75％以上，上述结果表明多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂细胞毒性较低，具有良好的生物医学应用前景。

实施例4

合成FITC标记的蛋白质分子：分别将100mg的BSA、RNase A、SOD、GrB和25mg异硫氰酸荧光素(FITC)溶于30mL磷酸盐缓冲液(50mM，pH＝8.0)中，样品在4℃避光条件下以180rpm的速度搅拌24h。然后将样品在磷酸盐缓冲液(50mM，pH＝8.0)中透析3天(截留分子量：3500Da)，每12h更换一次透析液，透析完成后冻干，获得FITC标记的蛋白质分子。

实施例5

多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/蛋白复合物的制备：分别将多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂(40μg)和不同蛋白质分子(BSA、RNase A、SOD、GrB，5μg)在无血清DMEM培养基中混合均匀，37℃静置孵育30min，得到多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/蛋白复合物，储存备用。

FITC标记的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂蛋白复合物的制备：分别将多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂(40μg)和FITC标记的多种蛋白质分子(BSA、RNase A、SOD、GrB，5μg)在无血清DMEM培养基中混合，37℃静置孵育30min，得到FITC标记的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/蛋白复合物，储存备用。

实施例6

将实施例5制备的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/SOD复合物涂于300目碳膜覆盖的铜网上，在室温条件自然晾干。将涂好蛋白复合物的铜网用JEM-2100透射电镜(日本电子公司)检测，加速电压为200kV。如图4所示，可以清楚地观察到多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/SOD复合物呈球形，粒径在180nm左右。

实施例7

检测样品二级结构所用到的仪器是J-810型圆二色谱仪，取1mg实施例5制备的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/SOD蛋白复合物溶于1mL超纯水中，充分溶解后，用圆二色谱仪进行二级结构分析，检测190-250nm处蛋白复合物的摩尔椭球率。如图5所示，与游离SOD分子相比，多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/SOD蛋白复合物的SOD分子保留了完整的二级结构，说明多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂和SOD分子的组装不会影响SOD分子的高级结构。

实施例8

荧光显微镜检测FITC标记的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/BSA复合物的胞吞情况:按照2.0×10⁵/孔的接种量将人宫颈癌细胞HeLa细胞接种到6孔板中，每个孔中用完全培养基补至2mL，将6孔板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养12h。小心弃去上清液，按照实施例5的制备方法，制备不同质量比的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/FITC-BSA复合物(质量比从0到20)加入培养体系，继续培养6h后，用磷酸盐缓冲液(50mM，pH＝7.4)清洗2次，用IX73P1F荧光显微镜(奥林巴斯)观察并拍照。如图6所示，随着多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/BSA质量比的增加，BSA的入胞效率也明显提升；在质量比大于8以后，BSA的入胞效率开始下降，这可能是由于试剂本身的高密度正电荷造成。以上结果说明，多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂能够成功介导BSA分子的胞内转染，在多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/BSA质量比为8时，达到最佳转染效率。

实施例9

激光共聚焦显微镜观察FITC标记的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/BSA复合物胞吞进入HeLa细胞后不同时间下的定位情况：人宫颈癌HeLa细胞以2.0×10⁵/孔的密度接种于预先处理并放置于六孔板孔内的盖玻片上(盖玻片先用浓酸液浸泡48h，然后用蒸馏水浸泡，高压灭菌)，37℃孵育24h后换成无血清培养基，加入FITC标记的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/FITC-BSA复合物，分别培养2h、4h、6h和12h后，弃去培养液，加入溶酶体染料LysoTracker Red和细胞核染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色30min，PBS清洗5次后，加入1mL 75％冰乙醇固定30min，PBS清洗三次。使用甘油:磷酸盐缓冲液(v/v:9:1)封片，4℃避光保存。使用LSM710激光共聚焦显微镜(德国卡尔蔡司公司)观察拍照，用于观察LysoTracker Red、FITC和DAPI的激光波长分别为590nm、488nm、461nm。对于每一个通道和视野，重新调节激光强度、光电倍增管增益和补偿，以获得最优信号/噪声比。最后用软件Zen 2009Light Edition(Carl Zeiss，德国)对结果进行分析处理。结果如图7所示，在2-6h时，FITC-BSA的绿色荧光和溶酶体染料的红色荧光完全共定位，说明多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/BSA复合物是通过胞吞作用实现入胞的；在进入HeLa细胞12h后，绿色荧光与红色荧光分离，说明多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/BSA复合物从溶酶体中释放，进入到细胞胞浆中。以上结果说明多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂能介导BSA分子实现溶酶体逃逸，更好地保护蛋白分子免受酸性及酶环境下降解，达到理想的转染效率。

实施例10

荧光显微镜测定FITC标记的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/RNase A复合物的胞吞情况：按照2.0×10⁵/孔的接种量将人宫颈癌细胞HeLa细胞接种到6孔板中，每个孔用完全培养基补至2mL，将6孔板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养12h,，小心弃去上清液，将实施例5制备的FITC标记的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/RNase A复合物加入培养体系，继续培养6h后，用磷酸盐缓冲液(50mM，pH＝7.4)清洗2次，用IX73P1F荧光显微镜(奥林巴斯)观察并拍照。如图8所示，游离FITC-RNase A无法进入细胞，而多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/FITC-RNase A复合物处理细胞后，可以在细胞内部观察到大量的绿色荧光，说明多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂能够成功实现RNase A的组装，并实现RNase A的高效转染。

实施例11

多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/RNase A复合物抑制人宫颈癌细胞增殖检测过程如下：按照8×10³/孔的接种量将HeLa细胞接种到96孔板中，每个孔用完全细胞培养基补至200μL，将96孔板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。待细胞汇合度大于70％时，小心弃去培养基，分别加入200μL DMEM培养基配制的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂、游离RNase A和多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/RNase A复合物。RNase A浓度分别为1μg/mL，2μg/mL，3μg/mL，4μg/mL和5μg/mL，另设阴性对照组(仅加入DMEM培养基)和空白对照组，每组设6个复孔。加入样品处理后继续培养24h，然后每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，于37℃中继续培养4h，小心弃去培养基，然后每孔加入200μL二甲基亚砜，振荡5min，用酶标仪测试每孔492nm下的吸光度值。利用下列公式计算细胞存活率：

细胞存活率(％)＝(A_sample-A_blank)/(A_control-A_blank)×100％

其中，A_sample分别为加入多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂、游离RNase A和多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/RNase A复合物后测定的吸光度值，A_control为用DMEM培养基正常培养细胞后测定的吸光度值，A_blank为无细胞仅加入DMEM细胞培养基后测定的吸光度值。

如图9所示，多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/RNase A复合物能明显抑制人宫颈癌细胞HeLa的增殖抑，而游离RNase A和多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂对HeLa细胞的增殖抑制能力则无明显变化，表明多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂能够实现RNase A分子的高效转染，并保持其生物学活性，发挥杀伤肿瘤细胞的能力。

实施例12

利用流式细胞仪对FITC标记的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/GrB复合物的胞吞情况进行分析：按照2.0×10⁵/孔的接种量将人宫颈癌细胞HeLa细胞接种到6孔板中，每个孔用完全培养基补至2mL，将6孔板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养12h，小心弃去上清液，将实施例5制备的FITC标记的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/GrB复合物加入培养体系，继续培养6h后，用磷酸盐缓冲液(50mM，pH＝7.4)清洗2次，用0.25％胰酶消化2min，收集细胞，以预冷的PBS清洗2次，用流式细胞仪对HeLa细胞内的荧光信号进行检测。如图10所示，随着多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/GrB质量比的逐渐增大，GrB入胞效率显著提升，表明多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂具有良好的介导GrB转染能力。

实施例13

多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/GrB复合物抑制人宫颈癌细胞增殖检测过程如下：按照8×10³/孔的接种量将HeLa细胞接种到96孔板中，每个孔用完全细胞培养基补至200μL，将96孔板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。待细胞汇合度大于70％时，小心弃去培养基，分别加入200μL DMEM培养基配制的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂、游离GrB和多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/GrB复合物，另设阴性对照组(仅加入DMEM培养基)和空白对照组，每组设6个复孔。加入样品处理后继续培养24h，然后每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，于37℃中继续培养4h，小心弃去培养基，然后每孔加入200μL二甲基亚砜，振荡5min，利用酶标仪测试每孔492nm下的吸光度值。利用下列公式计算细胞存活率：

细胞存活率(％)＝(A_sample-A_blank)/(A_control-A_blank)×100％

其中，A_sample分别为加入多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂、游离GrB和多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/GrB复合物后测定的吸光度值，A_control为用DMEM培养基正常培养细胞后测定的吸光度值，A_blank为无细胞仅加入DMEM细胞培养基后测定的吸光度值。如图11所示，游离GrB分子和多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂对HeLa细胞的细胞存活率无明显影响，而多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/GrB复合物对人宫颈癌细胞HeLa的增殖抑制能力显著增加，上述结果表明多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂与GrB组装后能够实现GrB分子的高效转染，并在胞内保持其生物学活性，发挥抗肿瘤作用。

实施例14

荧光显微镜检测多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/β-gal复合物的胞吞情况：按照2.0×10⁵/孔的接种量将人宫颈癌细胞HeLa细胞接种到6孔板中，每个孔中用完全培养基补至2mL，将6孔板置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养12h,，小心弃去上清液，将实施例5制备的多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂/β-gal复合物加入培养体系，继续培养12h后，用磷酸盐缓冲液(50mM，pH＝7.4)清洗2次，加入1mLβ-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定10min。吸除细胞固定液，用磷酸盐缓冲液(50mM，pH＝7.4)洗涤细胞3次，每次3min。每孔加入1mL X-gal工作液，37℃孵育2h，采用IX73P1F荧光显微镜(奥林巴斯)观察并拍照。如图12所示，游离β-gal分子无法进入细胞，在细胞内部观察不到蓝色物质的产生，而多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂与β-gal分子组装后进行转染，在细胞内观察到大量的蓝色物质生成，表明多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂具有良好的蛋白质转染能力，能够实现β-gal分子的高效入胞，并发挥其生物学功能。

Claims

1.一种多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂在转染蛋白质中的应用，其特征在于：该蛋白质转染试剂由如下步骤制备得到，

（1）Br-聚酯材料合成：称取己内酯0.4~0.5 g、癸二酸二乙酯2~3 g、N-甲基二乙醇胺1~2 g和Novozym 435 100~300 mg溶于5~10 mL二苯醚中，在60~70 MPa、80~90℃ 下搅拌12~24 h，得到低聚物，防止单体挥发；再在0.1~0.3 MPa、80~85℃ 下反应48~72 h得到聚酯；然后加入50~500 mg的溴代异丁酸，在200~300 MPa、80~90℃ 条件下反应18~24 h，得到粗产物；最后将粗产物在正己烷中沉淀，离心收集沉淀，再用二氯甲烷和正己烷分别洗涤3~5次，真空干燥后得到Br-聚酯；

（2）多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂的合成：称取溴化铜1~2 mg，五甲基二乙烯三胺25~30 μL和丙烯酸缩水甘油酯0.8~1.0 g溶于3~5 mL N,N-二甲基甲酰胺；氮气吹扫0.5~1 h后密封，然后立即加入0.1~0.2 mL、3.5 mM抗坏血酸水溶液和100~150 mg Br-聚酯，50~60℃油浴反应2~4 h，再加入1~2 mL乙醇胺继续反应12~24 h，过滤去除溴化铜，并将滤液加入过量的乙醚中进行聚合物的沉淀，离心收集聚合物沉淀，二氯甲烷和乙醚分别洗涤3~5次，真空干燥后得到多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂；该蛋白质转染试剂应用的蛋白质为超氧化物岐化酶、牛血清白蛋白、核糖核酸酶A、颗粒酶B或β-半乳糖苷酶，分子量为10~450 kDa。

2.如权利要求1所述的一种多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂在转染蛋白质中的应用，其特征在于：真空干燥的温度为35~40℃ ，真空干燥的时间为100~150 min。