CN113209043B - 一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子及其制备方法 - Google Patents

一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113209043B
CN113209043B CN202010068609.8A CN202010068609A CN113209043B CN 113209043 B CN113209043 B CN 113209043B CN 202010068609 A CN202010068609 A CN 202010068609A CN 113209043 B CN113209043 B CN 113209043B
Authority
CN
China
Prior art keywords
sirna
target gene
gene sirna
pdsa
nano
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010068609.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113209043A (zh
Inventor
许小丁
蔡佩娥
曹舒雯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Original Assignee
Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University filed Critical Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Priority to CN202010068609.8A priority Critical patent/CN113209043B/zh
Publication of CN113209043A publication Critical patent/CN113209043A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113209043B publication Critical patent/CN113209043B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

一种负载靶基因siRNA的新型胞内响应纳米粒子，包括包裹在靶基因siRNA外且在细胞质内谷胱甘肽浓度下分解的高分子聚合物PDSA，纳米粒子至少同时包载MGLL‑siRNA和CB2‑siRNA两种靶基因siRNA。利用能在胞质谷胱甘肽浓度下分解释放siRNA的纳米粒子，解决现有技术中siRNA传递的缺陷，能快速响应胞内谷胱甘肽，提高了siRNA传递效率。而纳米粒子同时包载MGLL‑siRNA和CB2‑siRNA则能实现沉默恶性肿瘤恶性表型基因的同时促进肿瘤相关巨噬细胞向抗癌表型重极化，敲低MGLL表达则能够直接作用于恶性肿瘤进行抑制，敲低CB2则促进肿瘤相关巨噬细胞向M1型重极化协同抗肿瘤。

Description

一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子及其制备方法。
背景技术
RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)近年来发展迅速，在多种疾病的治疗中都得到应用，其中就包括癌症治疗上的应用。与现有肿瘤治疗技术中的小分子靶向药物相比，基于RNA干扰技术的靶基因siRNA对靶点的选择性会更好，能够特异性结合靶基因并下调靶基因表达，且不会影响细胞中其它正常基因的表达，毒副作用小；运用在肿瘤治疗中，就可以通过siRNA特异性下调促进肿瘤发生、进展的基因表达，从而达到治疗的目的。
但现有的RNAi技术在临床转化时存在明显缺陷，即缺少低毒高效的载体将siRNA输送到病灶部位和细胞内。对于基于RNAi技术的癌症治疗，siRNA在输送过程需要克服一系列生理屏障，例如如何靶向肿瘤细胞、穿透肿瘤组织和细胞膜、从内涵体高效逃逸以及在细胞质内有效释放siRNA等；过程复杂、技术难度大、环节多，且成本高昂，并不稳定。虽然能通过传统的病毒载体传递siRNA克服各种生理屏障，但其存在制备困难、siRNA容量小、靶向特异性差、免疫原性强等缺陷，且因其对宿主细胞基因组造成不可逆改变，因而具有极大的生物风险，难以向临床转化实现实际应用。此外，现有技术中往往是利用单一的siRNA沉默某个促进肿瘤的表达基因来达到治疗目的，但肿瘤的发生和进展往往是多种基因协同促进，针对于单一的某个基因进行沉默或仅杀伤肿瘤可能效果并不明显。
MGLL单酰基甘油脂肪酶可将单酰甘油酯分解为游离脂肪酸，为脂代谢通路中的一个重要酶，而脂代谢是影响肿瘤细胞发生和进展的主要代谢过程之一，MGLL在肿瘤细胞中往往呈现特异性高表达状态。此外，现有技术中发现在肿瘤相关巨噬细胞中表达的大麻素信号受体CB2同样呈现特异性高表达，其作为Toll样受体4抑制分子阻断Toll样受体4下游信号激活，从而导致肿瘤相关巨噬细胞向免疫抑制表型（M2表型）极化，而该表型有助于肿瘤的后续进展。MGLL和CB2在肿瘤的生长、侵袭转移等过程中有着重要地位，且现有技术中还发现MGLL的表达与大麻素信号受力CB2的表达存在密切关系，所以同时靶向作用MGLL基因和CB2基因以治疗肿瘤对提高肿瘤治疗效果以及进一步研究肿瘤治疗有着重要的意义。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子，同时包载MGLL-siRNA和CB2-siRNA，能够靶向作用于MGLL、CB2基因，具有较强的靶向性，不易脱靶，毒副作用小，能实现肿瘤生长与迁移的抑制并诱导肿瘤相关巨噬细胞向M1表型重极化以协同抗肿瘤，同时，纳米粒子本身具备易于转化，并能快速响应胞内谷胱甘肽而释放靶基因siRNA，促进MGLL-siRNA、CB2-siRNA的准确靶向运输。
本发明的再一目的在于提供一种制备上述负载靶基因siRNA的胞内响应纳米
载体的制备方法，通过该方法能够制备快速响应谷胱甘肽以分解释放siRNA并能同时包载MGLL-siRNA和CB2-siRNA的靶向性纳米粒子。
本发明采取的技术方案是，一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子，包括包裹在靶基因siRNA外且在细胞质内谷胱甘肽浓度下分解的高分子聚合物PDSA，所述纳米粒子至少同时包载MGLL-siRNA和CB2-siRNA两种靶基因siRNA。所述PDSA是将胱氨酸二甲酯盐酸盐加入至脂肪二酸与三乙胺的混合溶液中合成的高分子聚合物，该高分子聚合物材料在相对较高浓度谷胱甘肽下保持稳定，在较低浓度谷胱甘肽下则分解。如，其在10×10-6M谷胱甘肽溶液中可保持稳定，而在10×10-3M谷胱甘肽溶液中则迅速分解。细胞质内谷胱甘肽浓度(2-10×10-3M)为细胞外谷胱甘肽浓度(2-10×10-6M)的1000倍，PDSA能在胞质谷胱甘肽浓度下分解，所以PDSA能够快速响应包内谷胱甘肽，有助于包含物的快速释放。所述靶基因siRNA即靶基因-siRNA，如MGLL-siRNA、CB2-siRNA，所述靶基因siRNA种类包括能够有效下调靶基因表达的常用siRNA或人工构建的siRNA。
作为一种纳米粒子，其能进入到膜细胞中，并沿神经细胞突触、血管和淋巴血管传播，从而解决了现有技术中siRNA传递缺乏有效载体的技术问题，有助于提高siRNA的靶向作用效率。
所述纳米粒子至少同时包载MGLL-siRNA和CB2-siRNA，能够提高其靶向特异性，作用于特异性高表达MGLL的肿瘤细胞以及特异性高表达CB2的肿瘤相关细胞，减少毒副作用。并对相应的基因进行沉默，下调其表达，通过敲低MGLL的表达能够抑制肿瘤的脂代谢途径，从而抑制肿瘤的生长和转移。而敲低CB2的表达则能诱导肿瘤相关细胞向抗肿瘤表型(M1表型)重极化，通过M1表型的肿瘤相关巨噬细胞进一步释放肿瘤杀伤性细胞因子或直接吞噬肿瘤细胞从而达到协同治疗作用。通过纳米粒子单次传递同时MGLL和CB2，有助于在较短时间内实现同时作用，从而提高治疗效率和效果。
优选的，粒径分布范围为30～400nm，在细胞质内谷胱甘肽浓度下释放包载的靶基因siRNA。粒径分布范围控制在30～400nm有助于应用在生物体上，防止过大而被排除在体外，也防止过小而难表征、难以获取粒子特性。因PDSA本身对胞内高浓度的谷胱甘肽能快速响应，所以当其包载靶基因siRNA时，有助于在胞质内迅速分解并释放其中包载的靶基因siRNA，从而提高靶基因siRNA的作用效率。
优选的，用于靶向作用癌变生物中肿瘤细胞和/或影响肿瘤增殖扩散的相关非肿瘤细胞的特异性基因，以杀伤肿瘤和/或抑制肿瘤生长和转移。具体的，通过siRNA能够靶向作用于对应基因，MGLL-siRNA和CB2-siRNA能分别下调肿瘤细胞中特异性高表达的MGLL基因、肿瘤相关巨噬细胞特异性高表达的CB2基因，通过敲低MGLL基因表达能够抑制脂代谢以及基于脂代谢的其他代谢过程，从而抑制肿瘤细胞的发生、生长、增殖以及转移扩散，而敲低CB2则能促进肿瘤相关巨噬细胞向M1型重极化并释放杀伤因子或吞噬肿瘤细胞，从而同时达到杀伤肿瘤的作用。本发明中的纳米粒子作为一种载体，除了包载MGLL-siRNA和CB2-siRNA之外还能包载其他靶基因siRNA，因癌变生物中存在诸多促进肿瘤增殖扩散的基因，该类基因在肿瘤细胞中和非肿瘤细胞中均有分布，且该类基因在癌变生物上往往呈现特异性高表达状态，所以本发明纳米粒子通过包载特定的靶基因siRNA能够靶向作用于对应的促进肿瘤发生和进展的基因，通过调节基因表达来直接或间接制造杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞生长、增殖、转移的条件，所以本发明的纳米粒子能够靶向作用于癌变生物中肿瘤细胞和非肿瘤细胞中促进肿瘤发生和进展的特异性基因，达到杀伤和抑制肿瘤的目的。
一种制备上述负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子的制备方法，包括步骤：S1、将胱氨酸二甲酯盐酸盐加入至脂肪二酸与三乙胺的混合溶液中，合成PDSA高分子聚合物；本发明在冰盐浴条件下，将胱氨酸二甲酯盐酸盐(Cystine dimethyl esterdihydrochloride)逐滴加入到脂肪二酸和三乙胺的混合溶液中，其中的溶剂为二甲亚砜、二甲基甲酰胺等强极性溶剂，所述脂肪二酸包括丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一碳二酸、十二碳二酸、十三碳二酸等所有脂肪二酸。在室温下搅拌反应15min至4h后，除去反应体系中沉淀物，浓缩滤液，使用乙酸乙酯沉淀出产品。将粗产品溶于强极性溶剂，所述强极性容积包括二甲亚砜或二甲基甲酰胺，并在乙酸乙酯中反复沉淀三次，真空干燥获得纯化的PDSA。PDSA制备过程简单，原材料较为常见，不需要复杂的仪器，有助于其批量生产和应用。
S2、基于纳米沉淀法利用PDSA溶液、靶基因siRNA水溶液制备由PDSA包载靶基因siRNA的纳米粒子；纳米沉淀法是较为常见的纳米粒子制备方法，所以基于此方法能够降低制备难度，方便制备。所述的靶基因siRNA水溶液即待包载靶基因siRNA水溶液，当纳米载体包载一种以上靶基因siRNA则同时加入多种靶基因siRNA水溶液，从而制备由PDSA同时包载多种靶基因siRNA的纳米粒子。
S3、对步骤S2获取的纳米粒子进行检测，包括沉默靶基因检测，以获得具有应用价值的负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子。在获得纳米粒子后，还需对其进行包括物理特征、释放靶基因siRNA以及基于生物体的检测，尤其是沉默靶基因检测，有助于获得有效的、具有实际应用价值的纳米粒子，为后续临床使用提供基础。
优选的，在制备获得PDSA后还进行结构检测分析，有助于获取PDSA的特征，便于基于PDSA制备纳米粒子以及分析PDSA的应用前景；本发明通过核磁共振仪分析检测PDSA结构，利用尺寸排除色谱分析法和多角度激光光散射连用分析检测PDSA的分子量。具体的，通过双检测系统进行检测，双检测系统包括MALLS装置和干涉折射仪。
优选的，在步骤S2获得包载有靶基因siRNA的纳米粒子后还利用粒径仪检测纳米
粒子的尺寸，基于检测获得的纳米粒子尺寸分布图有助于获取当前的纳米粒子性能。优选的，步骤S2具体包括：
S21、选取二甲基甲酰胺作为溶剂，分别配置PDSA和DSPE-PEG3000溶液；
S22、取PDSA溶液、DSPE-PEG3000溶液、靶基因siRNA水溶液，与两亲性阳离子溶液缓和，并在搅拌条件下逐滴加至去离子水中获得纳米溶液；
S23、将纳米溶液转移至超滤膜中，离心分离纳米粒子，使用去离子水洗涤两次后收集纳米粒子并将其分散至PBS缓冲溶液备用。
即基于已有的靶基因siRNA水溶液、PDSA溶液利用纳米沉淀法制备纳米粒子。
优选的，步骤S3中沉默靶基因检测具体包括：加入载有靶基因siRNA的纳米粒子至含有表达靶基因的靶细胞培养液中，检测靶基因的敲低以及不同包载靶基因siRNA纳米粒子浓度下的靶基因敲低效率。本发明先获取癌细胞并接种至多孔板中进行培养，培养癌细胞至充分贴壁；在癌细胞充分贴壁基础上加入骨髓来源的巨噬细胞，并诱导成为肿瘤相关巨噬细胞，然后加入不同浓度的载有MGLL-siRNA和CB2-siRNA的纳米粒子；加入纳米粒子后孵育一定时间提取蛋白进行蛋白质印迹法检测，从而获得MGLL和CB2的表达情况。通过该检测过程实现沉默靶基因检测以及不同纳米粒子浓度下敲低靶基因的效率。
优选的，还对包载靶基因siRNA的纳米粒子进行体内安全性验证，所述体内安全性验证包括步骤：
(1)将预培养的BALb/c小鼠随机分为等数量的三组并分别注入PBS、靶基因siRNA、载有靶基因siRNA的纳米粒子；有助于互相作为对照，验证靶基因siRNA以及包载靶基因siRNA的纳米粒子对生物体的影响。
(2)每天对BALb/c小鼠进行注射一次，并于第3次注射后24h处死，对各组小鼠进行心、肝、脾、肺、肾的HE染色；每次的注射量相同，且通过尾静脉进行注射。
(3)基于显微镜对每个小鼠的器官进行病理组织学分析，验证被注射小鼠的重要器官是否受损。包括对各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾进行HE染色，从而验证包载靶基因siRNA的纳米粒子是否对器官有所损伤，有助于获取实际应用在生物体上的可能性，便于后续基于生物体进行进一步的研究。若各组额重要器官均无损伤，验证了本发明纳米粒子的体内安全性。
优选的，对基于荧光染料标记siRNA制备的包载靶基因siRNA的纳米粒子进行控制释放检测，基于荧光染料标记检测纳米粒子在不同浓度谷胱甘肽下的靶基因siRNA释放能力。通过验证各个浓度下包载靶基因siRNA的纳米粒子释放情况有助于确认以PDSA为重要组分构成的纳米粒子仍保留有PDSA的特性，并通过不同浓度下的释放检测有助于获得纳米粒子在胞质谷胱甘肽浓度下可能出现的释放量，有助于后续对其进行进一步优化以获得更有效的纳米粒子。本发明采用的释放检测过程包括：基于荧光染料标记siRNA以及步骤S1、S2获得载有荧光染料标记siRNA的纳米粒子，将纳米粒子进行多次洗涤后分散至PBS溶液中获取纳米粒子溶液，通过转移纳米粒子溶液至透析管中并将透析管置于含有不同浓度谷胱甘肽的PBS水溶液中进行分解；取样纳米粒子溶液加入至二甲亚砜溶液后通过荧光分光光度计测量荧光强度，从而基于公式：累计释放量(％)＝(Mt/M∞)×100进行计算分析以获取不同浓度谷胱甘肽下释放靶基因siRNA情况，其中，Mt是在指定时间点从纳米粒子里释放出的siRNA，M∞是纳米粒子里负载的siRNA总量。
优选的，步骤S3检测还包括药代动力学检测和体内分布检测，所述药代动力学检测是基于荧光标记通过比较分别被注入裸露siRNA和包载siRNA纳米粒子的BALB/c小鼠中的siRNA血药浓度进行检测，所述体内分布检测是基于荧光标记分别注入裸露siRNA和包载siRNA纳米粒子至BALB/c小鼠并通过活体成像仪检测对应小鼠器官上的分布。所述药代动力检测能够验证纳米粒子包裹的siRNA相比于裸露siRNA的被吸收率以及留存的能力是否提高，有助于确认本发明纳米粒子具有更佳的治疗特性。而体内生物分布检测则能确认纳米粒子相比于常规的裸露siRNA是否分布更加广泛，并确认其靶向作用多个器官的能力，有助于扩大其适用的癌症类型，为提供更有效的治疗方式提供基础。尤其是检测其在肿瘤上的分布，能够确认本纳米粒子能够顺利靶向肿瘤组织并在肿瘤组织中留存，有助于实际应用肿瘤治疗过程。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：利用能在胞质谷胱甘肽浓度下分解释放siRNA的纳米粒子，能够解决现有技术中siRNA传递的缺陷，并能快速响应胞内谷胱甘肽，提高了siRNA传递过程的效率。而纳米粒子同时包载MGLL-siRNA和CB2-siRNA则能实现沉默恶性肿瘤恶性表型基因的同时促进肿瘤相关巨噬细胞向抗癌表型重极化，敲低MGLL表达则能够直接作用于恶性肿瘤进行抑制，敲低CB2则促进肿瘤相关巨噬细胞向M1型重极化协同抗肿瘤。通过载体以及包载的siRNA能够实现快速而有效的靶向作用系统，不仅基于siRNA具有准确的靶向性，毒副作用小，且利用纳米粒子能实现更为广泛的分布，有助于提高肿瘤治疗效果，以及后续应用在不同器官肿瘤上。且包载siRNA的纳米粒子制备过程简单，能够批量化生产，且成本较低，材料较常见，有助于应用于不同消费人群，减小经济负担。
附图说明
图1为PDSA的合成示意图。
图2为载有siRNA的纳米粒子的尺寸分布图。
图3为纳米粒子在不同包载siRNA纳米粒子浓度下敲低目标基因后蛋白印迹实验图。
图4为PDSA的化学结构和核磁共振氢谱示意图。
图5为PDSA的分子量统计图。
图6为各治疗组小鼠心肝脾肺肾的HE染色结果图。
图7为载有siRNA的纳米粒子在不同浓度谷胱甘肽溶液中释放曲线图。
图8为基于荧光标记包载siRNA的纳米粒子及裸露siRNA体内药代动力学曲线图。
图9为裸露siRNA以及包载siRNA的纳米粒子的体内生物分布成像图。
图10为胰腺癌患者肿瘤组织与间质的HE染色结果图。
图11为MGLL表达量与胰腺癌患者预后的关系示意图。
图12为体现CB2分布的胰腺癌患者肿瘤组织与间质的免疫组化染色结果图。
图13为体现敲低CB2后促进肿瘤相关巨噬细胞向M1表型重极化的免疫组化染色结果图。
图14为敲低MGLL影响肿瘤细胞生长的实验图及曲线图。
具体实施方式
本发明附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。为了更好说明以下实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。
实施例1
一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子，包括包裹在靶基因siRNA外且在细胞质内谷胱甘肽浓度下分解的高分子聚合物PDSA，所述纳米粒子至少同时包载MGLL-siRNA和CB2-siRNA两种靶基因siRNA。粒径分布范围为30～400nm，纳米粒子在细胞质内谷胱甘肽浓度下能够释放包载的靶基因siRNA。具体的，本发明中纳米粒子能用于靶向作用癌变生物中肿瘤细胞和/或影响肿瘤增殖扩散的相关非肿瘤细胞的特异性基因，以杀伤肿瘤和/或抑制肿瘤生长和转移。
本实施例中的PDSA是一种在较高浓度谷胱甘肽下分解的高分子聚合物，其制备过程包括：在冰盐浴条件下，将胱氨酸二甲酯盐酸盐逐滴加入到脂肪二酸和三乙胺的混合溶液中。在室温下搅拌反应15分钟至4小时后，除去反应体系中沉淀物，浓缩滤液，使用乙酸乙酯沉淀出产品。粗产品溶于二甲亚砜、二甲基甲酰胺等强极性溶剂，在乙酸乙酯中反复沉淀三次，真空干燥获得纯化的PDSA。如图1所示，为PDSA的合成示意图。
本实施例中的纳米粒子是基于靶基因siRNA、PDSA利用纳米沉淀法制备的。
实施例2
一种制备上述负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子的制备方法，包括步骤：S1、将胱氨酸二甲酯盐酸盐加入至脂肪二酸与三乙胺的混合溶液中，合成PDSA高分子聚合物；本发明在冰盐浴条件下，将胱氨酸二甲酯盐酸盐(Cystine dimethyl esterdihydrochloride)逐滴加入到脂肪二酸和三乙胺的混合溶液中，其中的溶剂为二甲亚砜、二甲基甲酰胺等强极性溶剂，所述脂肪二酸包括丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、十一碳二酸、十二碳二酸、十三碳二酸等所有脂肪二酸。在室温下搅拌反应15min至4h后，除去反应体系中沉淀物，浓缩滤液，使用乙酸乙酯沉淀出产品。将粗产品溶于强极性溶剂，所述强极性容积包括二甲亚砜或二甲基甲酰胺，并在乙酸乙酯中反复沉淀三次，真空干燥获得纯化的PDSA。PDSA制备过程简单，原材料较为常见，不需要复杂的仪器，有助于其批量生产和应用。如图1所示，为PDSA的合成示意图。
S2、基于纳米沉淀法利用PDSA溶液、靶基因siRNA水溶液制备由PDSA包载靶基因siRNA的纳米粒子；具体的，步骤S2具体包括：S21、选取二甲基甲酰胺作为溶剂，分别配置PDSA和DSPE-PEG3000溶液；S22、取PDSA溶液、DSPE-PEG3000溶液、靶基因siRNA水溶液，与两亲性阳离子溶液缓和，并在搅拌条件下逐滴加至去离子水中获得纳米溶液；S23、将纳米溶液转移至超滤膜中，离心分离纳米粒子，使用去离子水洗涤两次后收集纳米粒子并将其分散至PBS缓冲溶液备用。
本实施例中S2步骤为，使用纳米沉淀法制备载有siRNA的纳米粒子。选取二甲基甲酰胺作为溶剂，分别配置PDSA和DSPE-PEG3000溶液。随后取PDSA溶液、DSPE-PEG3000溶液、siRNA水溶液，与两亲性阳离子溶液混合，在搅拌条件下，逐滴加入到去离子水中。随后将纳米溶液转移至超滤膜中(EMD Millipore，MWCO 100K)，离心分离纳米粒子，使用去离子水洗涤两次后，收集纳米粒子并将其分散到1mLPBS缓冲溶液中备用。使用Nano-ZSZEN3600型粒径仪测定纳米粒子的尺寸。如图2所示，为载有siRNA的纳米粒子的尺寸分布。
S3、对步骤S2获取的纳米粒子进行检测，包括沉默靶基因检测，以获得具有应用价值的负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子。沉默靶基因检测具体包括：加入载有靶基因siRNA的纳米粒子至含有表达靶基因的靶细胞培养液中，检测靶基因的敲低以及不同包载靶基因siRNA纳米粒子浓度下的靶基因敲低效率。
本实施例中沉默靶基因检测过程为：将胰腺癌LTPA细胞接种在6孔板(每孔5000个细胞)中，加入2mL含10％胎牛血清的培养基孵育24小时，让其充分贴壁。将小鼠骨髓腔冲出的细胞离心并重悬于含10％胎牛血清及20 ng/ml MCSF的培养基中并接种于6孔板中，隔天半换液培养7天，此时骨髓来源的巨噬细胞基本完全贴壁，其后更换LTPA细胞上清诱导24h，使之成为肿瘤相关巨噬细胞。随后加入不同浓度的载有MGLL-siRNA和CB2-siRNA的前体的纳米粒子。孵育24小时后，将细胞换液再孵育48小时。提蛋白后进行Western Blot检测MGLL或CB2的表达。图3是纳米粒子在不同浓度包载siRNA纳米粒子浓度下，敲低目标基因的效率；从图3可以看出，利用纳米粒子传递的siRNA能够作用于靶基因并沉默靶基因，且随着浓度的增高，MGLL和CB2被敲低越明显，图中CB-2即为CB2。
本实施例中，在制备获得PDSA后还进行结构检测分析，具体的，使用Varian(300MHz)型核磁共振仪分析检测PDSA的结构，使用尺寸排除色谱分析法和多角度激光光散射连用分析(SEC-MALLS)检测PDSA的分子量。使用双检测器系统，包括MALLS装置(DAWNEOS，Wyatt Technology)和干涉折射仪(Optilab DSP，Wyatt Technology)。聚合物的浓度为10mg/mL，DMF作为流动相，流速为0.3 mL/min。图4是PDSA的化学结构及核磁共振氢谱。图5是几种PDSA的分子量统计表。
在步骤S2获得包载有靶基因siRNA的纳米粒子后还利用粒径仪检测纳米粒子的尺寸，基于检测获得的纳米粒子尺寸分布图有助于获取当前的纳米粒子性能。本实施例中使用Nano-ZSZEN3600型粒径仪测定纳米粒子的尺寸，获得图2所示的载有siRNA的纳米粒子的尺寸分布。
获得纳米粒子后还对包载靶基因siRNA的纳米粒子进行体内安全性验证，所述体内安全性验证包括步骤：(1)将预培养的BALb/c小鼠随机分为等数量的三组并分别注入PBS、靶基因siRNA、载有靶基因siRNA的纳米粒子；(2)每天对BALb/c小鼠进行注射一次，并于第3次注射后24h处死，对各组小鼠进行心、肝、脾、肺、肾的HE染色；(3)基于显微镜对每个小鼠的器官进行病理组织学分析，验证被注射小鼠的重要器官是否受损。
本实施例中，把9只BALb/c小鼠分成3组，分别给予(1)PBS 200 μL(Control)、(2)单纯的MGLL-siRNA和CB2-siRNA(即MGLL-siRNA+CB2-siRNA)、(3)载有siMGLL和siCB-2的纳米材料(NPs+MGLL-siRNA+CB2-siRNA)；每天尾静脉注射200 μL(其中两种siRNA总剂量为1nmoL)，注射3次后24h处死小鼠，对各组小鼠进行心，肝，脾，肺，肾进行HE染色，发现各组的重要器官均无损伤。图6为心，肝，脾，肺，肾的HE染色实验图。
本实施例中，还对基于荧光染料标记siRNA制备的包载靶基因siRNA的纳米粒子进行控制释放检测，基于荧光染料标记检测纳米粒子在不同浓度谷胱甘肽下的靶基因siRNA释放能力。本实施例中依据S1、S2制备载有荧光染料标记siRNA的纳米粒子。多次洗涤后，将其分散在1mLPBS中。将该纳米粒子溶液转移至透析管中，随后将透析管放置于37℃含不同浓度谷胱甘肽的PBS水溶液中(GSH为10 μM、1 mM、10 mM)。在指定的时间点，取出5μL纳米粒子溶液并加入到100 μL二甲亚砜溶液，使用荧光分光光度计测量荧光染料的荧光强度。siRNA的累计释放率按以下公式计算：累计释放量(％)＝(Mt/M∞)×100；其中Mt是在指定时间点从纳米粒子里释放出的siRNA，M∞是纳米粒子里负载的siRNA总量。从而获得如图7所示纳米粒子的siRNA的控制释放曲线，从图7可知，包载靶基因siRNA纳米粒子相比于低谷胱甘肽浓度下在较高谷胱甘肽浓度下具有明显释放量，验证了纳米粒子的释放能力以及应用在生物胞内的潜力。
本实施例中，还对包载靶基因siRNA的纳米粒子进行药代动力学检测和体内分布检测。
药代动力学检测中，依据步骤S1、S2制备载有荧光染料标记siRNA的纳米粒子。多次洗涤后，将其分散在1mLPBS中。将该纳米粒子溶液或荧光标记的裸siRNA溶液通过尾静脉注射进6～8周龄BALB/c小鼠体内，注射剂量为每只小鼠1nmolsiRNA。于第0min、5min、15min、30min、1、2、4、8、12h分别取10μl眼眶血溶于100μl双蒸水中，使用荧光分光光度计测量荧光染料的荧光强度，从而获取其血药浓度。其中siRNA的血药浓度按以下公式计算：血药浓度(％)＝(It/I0)×100；其中It是在指定时间点取出眼眶血的荧光强度，I0是零时间点取出眼眶血的荧光强度。如图8所示，为裸露siRNA与包载siRNA的纳米粒子的体内药代动力学曲线，易知相比于裸露siRNA，通过纳米载体包载的siRNA在各个时间点均具有更高的血药浓度。
体内分布检测中，依据步骤S1、S2制备载有荧光染料标记siRNA的纳米粒子。多次洗涤后，将其分散在1mL PBS中。将该纳米粒子溶液或荧光标记的裸siRNA溶液通过尾静脉注射进皮下成瘤的BALB/c小鼠体内，注射剂量为每只小鼠1 nmol siRNA。注射24h后处死小鼠，并取出主要器官如心、肝、脾、肺、肾、肌肉及肿瘤。使用小动物活体成像仪观察荧光标记的siRNA在各组织器官中的分布。并按如下公式计算各组织器官中平均荧光强度：平均荧光强度＝Io/Mo；其中Io为该器官荧光信号强度，Mo为该器官重量。从而获得如图9所示的包载siRNA的纳米粒子的体内生物分布情况。通过图9易知，通过纳米粒子携带传递的siRNA相比于裸siRNA具有明显的分布优势，尤其是肿瘤组织中。
除了上述验证及检测过程外，本发明还对实际MGLL和CB2的特异性表达进行确认，并通过包载MGLL-siRNA和CB2-siRNA的纳米粒子敲低靶向基因的表达，并获取敲低后相关细胞的状况，从而确认纳米粒子实际应用效果。
其中，本实施例，确认MGLL和CB2的特异性表达过程：对在中山大学孙逸仙纪念医院收集的临床病理样本进行HE染色以及免疫组化染色结果显示胰腺癌患者肿瘤组织中的MGLL表达量显著高于癌旁，且通过查询TCGA数据库资料显示，MGLL高表达的胰腺癌患者的总生存期与无病生存期均显著短于MGLL低表达的胰腺癌患者；免疫荧光染色结果显示CB2仅表达于巨噬细胞。图10为MGLL在胰腺癌患者肿瘤组织与间质中的表达情况。图11为MGLL表达量与胰腺癌患者预后的关系。图12为CB2在胰腺癌患者肿瘤组织中的分布情况。
经过MGLL和CB2的特异性表达验证后，可在小鼠细胞模型中进行敲低MGLL基因和CB2基因以获得敲低后的相应细胞的状况。本实施例中通过CB2-siRNA在肿瘤相关巨噬细胞中沉默CB2表达，诱导肿瘤相关巨噬细胞向抗肿瘤表型(M1表型)重极化。发现敲低CB2后，肿瘤相关巨噬细胞向M1表型重极化，如图13所示，图13为敲低CB-2能诱导肿瘤相关巨噬细胞重极化。本实施例中通过siRNA在恶性肿瘤细胞中沉默其表达，发现敲低MGLL后，肿瘤生长与迁移能力受到显著抑制，如图14所示，敲低MGLL能抑制肿瘤细胞生长。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (7)

1.负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子在制备治疗胰腺癌的药物中的用途，其特征在于，胞内响应纳米粒子包括包裹在靶基因siRNA外且在细胞质内谷胱甘肽浓度下分解的高分子聚合物PDSA，所述靶基因siRNA包括用于抑制肿瘤的脂代谢途径的MGLL-siRNA和用于诱导肿瘤相关巨噬细胞向抗肿瘤表现重极化的CB2-siRNA；
所述胞内响应纳米粒子的粒径分布范围为30~400nm，在细胞质内谷胱甘肽浓度下释放包载的靶基因siRNA；
所述的负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子的制备方法包括步骤：
S1、将胱氨酸二甲酯盐酸盐加入至脂肪二酸与三乙胺的混合溶液中，合成PDSA高分子聚合物；
S2、基于纳米沉淀法利用PDSA溶液、靶基因siRNA水溶液制备由PDSA包载靶基因siRNA的纳米粒子；所述靶基因siRNA包括MGLL-siRNA和CB2-siRNA；
S3、对步骤S2获取的纳米粒子进行检测，包括沉默靶基因检测，以获得具有应用价值的负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子；
所述制备方法还对包载靶基因siRNA的纳米粒子进行体内安全性验证，所述体内安全性验证包括步骤：
(1)将预培养的BALb/c小鼠随机分为等数量的三组并分别注入PBS、靶基因siRNA、载有靶基因siRNA的纳米粒子；
(2)每天对BALb/c小鼠进行注射一次，并于第3次注射后24h处死，对各组小鼠进行心、肝、脾、肺、肾的HE染色；
(3)基于显微镜对每个小鼠的器官进行病理组织学分析，验证被注射小鼠的重要器官是否受损。
2.一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括步骤：
S1、将胱氨酸二甲酯盐酸盐加入至脂肪二酸与三乙胺的混合溶液中，合成PDSA高分子聚合物；
S2、基于纳米沉淀法利用PDSA溶液、靶基因siRNA水溶液制备由PDSA包载靶基因siRNA的纳米粒子；所述靶基因siRNA包括MGLL-siRNA和CB2-siRNA；
S3、对步骤S2获取的纳米粒子进行检测，包括沉默靶基因检测，以获得具有应用价值的负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子；
所述胞内响应纳米粒子的粒径分布范围为30~400nm；
步骤S2具体包括：
S21、选取二甲基甲酰胺作为溶剂，分别配置PDSA和DSPE-PEG3000溶液；
S22、取PDSA溶液、DSPE-PEG3000溶液、靶基因siRNA水溶液，与两亲性阳离子溶液缓和，并在搅拌条件下逐滴加至去离子水中获得纳米溶液；
S23、将纳米溶液转移至超滤膜中，离心分离纳米粒子，使用去离子水洗涤两次后收集纳米粒子并将其分散至PBS缓冲溶液备用。
3.根据权利要求2所述的一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤S3中沉默靶基因检测具体包括：加入载有靶基因siRNA的纳米粒子至含有表达靶基因的靶细胞培养液中，检测靶基因的敲低以及多个浓度包载靶基因siRNA纳米粒子下的靶基因敲低效率。
4.根据权利要求2所述的一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子的制备方法，其特征在于，对基于荧光染料标记siRNA制备的包载靶基因siRNA的纳米粒子进行控制释放检测，基于荧光染料标记检测纳米粒子在不同浓度谷胱甘肽下的靶基因siRNA释放能力。
5.根据权利要求2所述的一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤S3检测还包括药代动力学检测和体内分布检测，所述药代动力学检测是基于荧光标记通过比较分别被注入裸露siRNA和包载siRNA纳米粒子的BALB/c小鼠中的siRNA血药浓度进行检测，所述体内分布检测是基于荧光标记分别注入裸露siRNA和包载siRNA纳米粒子至BALB/c小鼠并通过活体成像仪检测对应小鼠器官上的分布。
6.一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子，其特征在于，包括包裹在靶基因siRNA外且在细胞质内谷胱甘肽浓度下分解的高分子聚合物PDSA，所述纳米粒子至少同时包载用于抑制肿瘤的脂代谢途径的MGLL-siRNA和用于诱导肿瘤相关巨噬细胞向抗肿瘤表现重极化的CB2-siRNA两种靶基因siRNA；
所述胞内响应纳米粒子的粒径分布范围为30~400nm，在细胞质内谷胱甘肽浓度下释放包载的靶基因siRNA；
所述的负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子的制备方法包括步骤：
S1、将胱氨酸二甲酯盐酸盐加入至脂肪二酸与三乙胺的混合溶液中，合成PDSA高分子聚合物；
S2、基于纳米沉淀法利用PDSA溶液、靶基因siRNA水溶液制备由PDSA包载靶基因siRNA的纳米粒子；所述靶基因siRNA包括MGLL-siRNA和CB2-siRNA；
S3、对步骤S2获取的纳米粒子进行检测，包括沉默靶基因检测，以获得具有应用价值的负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子；
所述制备方法还对包载靶基因siRNA的纳米粒子进行体内安全性验证，所述体内安全性验证包括步骤：
(1)将预培养的BALb/c小鼠随机分为等数量的三组并分别注入PBS、靶基因siRNA、载有靶基因siRNA的纳米粒子；
(2)每天对BALb/c小鼠进行注射一次，并于第3次注射后24h处死，对各组小鼠进行心、肝、脾、肺、肾的HE染色；
(3)基于显微镜对每个小鼠的器官进行病理组织学分析，验证被注射小鼠的重要器官是否受损。
7.根据权利要求6所述的一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子，其特征在于，用于靶向作用癌变生物中肿瘤细胞和/或影响肿瘤增殖扩散的相关非肿瘤细胞的特异性基因，以杀伤肿瘤和/或抑制肿瘤生长和转移。
CN202010068609.8A 2020-01-19 2020-01-19 一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子及其制备方法 Active CN113209043B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010068609.8A CN113209043B (zh) 2020-01-19 2020-01-19 一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010068609.8A CN113209043B (zh) 2020-01-19 2020-01-19 一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113209043A CN113209043A (zh) 2021-08-06
CN113209043B true CN113209043B (zh) 2023-12-15

Family

ID=77085141

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010068609.8A Active CN113209043B (zh) 2020-01-19 2020-01-19 一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113209043B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009104051A2 (en) * 2007-12-31 2009-08-27 Lu Patrick Y Combinational therapeutics for treatment of prostate cancer using epoxy encapsulated magnetic particles and rnai medicine
WO2018112470A1 (en) * 2016-12-16 2018-06-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Co-delivery of nucleic acids for simultaneous suppression and expression of target genes
CN109762821A (zh) * 2019-02-28 2019-05-17 中山大学孙逸仙纪念医院 抑制afap1-as1表达的干扰rna及在增加乳腺癌放疗敏感性中的应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017173453A1 (en) * 2016-04-01 2017-10-05 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Stimuli-responsive nanoparticles for biomedical applications

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009104051A2 (en) * 2007-12-31 2009-08-27 Lu Patrick Y Combinational therapeutics for treatment of prostate cancer using epoxy encapsulated magnetic particles and rnai medicine
WO2018112470A1 (en) * 2016-12-16 2018-06-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Co-delivery of nucleic acids for simultaneous suppression and expression of target genes
CN109762821A (zh) * 2019-02-28 2019-05-17 中山大学孙逸仙纪念医院 抑制afap1-as1表达的干扰rna及在增加乳腺癌放疗敏感性中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Monoacylglycerol lipase regulates cannabinoid receptor 2-dependent macrophage activation and cancer progression";Wei Xiang，et al;《NATURE COMMUNICATIONS》;第9卷;2574 *
pH敏感基因载体的研究现状;沈银等;《化学学报》;20130315(第03期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113209043A (zh) 2021-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3150651B1 (en) Carbonate polymer with disulfur five-membered ring functional group on side chain and application thereof
CN107661504B (zh) 一种树枝状大分子修饰的金纳米粒子及其制备方法和应用
Yu et al. ATP-exhausted nanocomplexes for intratumoral metabolic intervention and photoimmunotherapy
CN107022516A (zh) 一种在细胞微囊泡表面修饰配体的方法
CN107184987B (zh) 一种硫辛酸修饰的靶向整合素αvβ3纳米多肽载体及其制备方法和应用
CN110882396B (zh) 肿瘤微环境与氧化还原逐级响应性纳米递药系统的制备方法及应用
Zhang et al. Near-infrared BODIPY-paclitaxel conjugates assembling organic nanoparticles for chemotherapy and bioimaging
Cheng et al. Protein stabilized polymeric nanoparticles inspired relay drug delivery for tackling post-chemotherapeutic metastasis
Shao et al. Phenylboronic acid-functionalized polyaminoglycoside as an effective CRISPR/Cas9 delivery system
CN111671897A (zh) 一种两性离子修饰树状大分子包裹金纳米颗粒/HIF-1α siRNA复合物的制备
CN113999846B (zh) 一种抑制afap1-as1表达的干扰rna及在增加乳腺癌放疗敏感性中的应用
Dong et al. pH-responsive Mannose-modified ferrocene Metal-Organic frameworks with rare earth for Tumor-targeted synchronous Chemo/Chemodynamic therapy
CN108743971B (zh) 一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法及其应用
CN101337076A (zh) 靶向恶性脑瘤的功能化树状大分子基因载体系统
CN111249469B (zh) 一种能够溶酶体逃逸的肽纳米颗粒及其制备方法和应用
CN112023061B (zh) 一种功能化树状大分子包裹金纳米颗粒/PD-L1 siRNA复合物及其制备和应用
CN113209043B (zh) 一种负载靶基因siRNA的胞内响应纳米粒子及其制备方法
CN114887061B (zh) 靶向肿瘤的光热基因联合治疗纳米系统的制备方法及应用
Yang et al. AS1411 and EpDT3-conjugated silver nanotriangle-mediated photothermal therapy for breast cancer and cancer stem cells
CN107243000B (zh) 载药杂化纳米粒子及其制备方法
CN114652699B (zh) 一种尺寸转变型纳米递药载体及其制备方法和应用
CN113663086B (zh) 一种树突细胞靶向的杂化树状大分子/YTHDF1 siRNA复合物及其制备和应用
CN114191539B (zh) 一种复合共载送小分子核酸和活性蛋白的外泌体纳米粒子及其制备方法和应用
CN106619569B (zh) 共载化疗药物和核酸的肿瘤靶向纳米粒子及制备方法
CN109550057A (zh) 主动靶向型基因递送纳米粒及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant