CN108743971B - 一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法及其应用，包括：以聚乙烯亚胺为稳定剂制备聚吡咯纳米颗粒；通过聚乙烯亚胺表面氨基进行聚乙二醇修饰；利用聚乙烯亚胺内部空腔对抗癌药物阿霉素进行负载；对所得最终产品进行体外癌细胞治疗性能评价。本发明方法简单易行，制备得到的聚乙二醇化聚乙烯亚胺稳定的聚吡咯/阿霉素复合纳米颗粒具有良好的光热效应、稳定性和生物相容性，针对癌细胞显示良好的联合治疗效果，具有潜在的癌细胞治疗应用前景。

Description

一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于癌细胞治疗剂制备领域，特别涉及一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法及在体外癌细胞化学-光热联合治疗中的应用。
背景技术
近年来恶性肿瘤呈逐渐高发的态势，成为影响人类健康的重要杀手。目前，临床中采用的传统癌症诊断和治疗手段存在突出的问题，面临着日益严峻的挑战。发展毒副作用小且具有良好癌症治疗效果的方法具有迫切的临床需求和重大的现实意义。纳米技术的发展为恶性肿瘤的有效治疗提供了新的巨大契机。相比于传统临床手段，基于纳米颗粒的治疗手段表现出更好的组织特异性和生物相容性，且具有易于功能化的优点，有助于发展针对肿瘤的精准化医疗手段。
相比于化疗、放疗等传统治疗手段，光热治疗（Photothermal therapy，PTT）是近年来新兴的一种癌症治疗手段，其利用具备近红外光（700-950 nm）吸收性能的光热转化剂所产生的热量来致死癌细胞。近红外光极少被生物组织吸收，具有良好的组织穿透性和高度的特异性，因而对正常组织和细胞几乎不会产生伤害和副作用，与传统癌症治疗手段相比具有显著的优势。目前，已有多种光热转化剂被开发和研究，如基于金纳米材料的光热转化剂，基于碳纳米材料的光热转化剂，基于金属硫化物的光热转化剂，以及基于聚合物的光热转化剂等。其中基于聚合物的光热转化剂因其良好的特性而受到广泛的关注。这主要是因为聚合物纳米颗粒具有良好的生物相容性，具有潜在的临床应用价值。
在众多基于聚合物的光热转化剂中，聚吡咯（Polypyrrole，PPy）纳米颗粒因其优良的热稳定性和光热转化效率而成为一种极具潜力的光热治疗平台。聚吡咯纳米颗粒很好地克服了某些其它种类聚合物纳米颗粒光热转化效率较低，具有光漂白效应和需要复杂修饰才可应用于生物医学领域等限制因素。此外，聚吡咯纳米颗粒具有良好的尺寸可控性，并显示依赖尺寸的光热转化性能。这为开发聚吡咯纳米颗粒在纳米生物医学中的应用提供了更多可能性。但目前制备的聚吡咯纳米颗粒普遍缺乏表面活性基团，难以进行表面功能化修饰，且所的产品的治疗手段较为单一。
聚乙烯亚胺（PEI）是一类商业化的有机大分子，是一类比较常见的金属纳米颗粒的模板和稳定剂。但其在聚合物制备领域鲜有使用。本专利采用氨基末端的聚乙烯亚胺为稳定剂，制备聚吡咯纳米颗粒，随后进行聚乙二醇（PEG）化修饰和抗癌药物阿霉素（DOX）的负载，最后研究该复合纳米颗粒的癌细胞治疗效果。
检索国内外有关聚吡咯纳米颗粒用于癌症治疗方面的文献和专利结果发现：在本发明完成之前，还没有发现基于聚乙二醇化聚乙烯亚胺稳定的聚吡咯/阿霉素复合纳米颗粒的制备及其癌细胞化学-光热联合治疗方面的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法，该方法制备过程温和，简单易行，制备得到的聚乙二醇化聚乙烯亚胺稳定的聚吡咯/阿霉素复合纳米颗粒具有良好的光热转化效率、稳定性，以及高效的癌细胞治疗效果，具有潜在的癌细胞治疗应用前景。
本发明以聚乙烯亚胺为稳定剂制备聚吡咯纳米颗粒，随后分别利用聚乙烯亚胺的表面活性氨基和内部空腔进行聚乙二醇修饰和抗癌药物阿霉素的负载。本发明涉及了两个基本原理：
（1）利用超支化聚合物聚乙烯亚胺的三维结构，可对聚吡咯纳米颗粒提供稳定作用。
（2）利用聚乙烯亚胺的内部空腔对抗癌药物阿霉素进行负载，实现化学治疗和光热治疗的有效结合，达到更有效的癌细胞治疗效果。
一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）配制聚乙烯亚胺水溶液，加入吡咯单体，搅拌0.5-2 h后加入盐酸和蒸馏水，将反应体系pH调至0.8-1.0，再次搅拌5-20 min后加入氯化铁水溶液，搅拌反应2.5-5 min，透析纯化后得到聚乙烯亚胺稳定的聚吡咯纳米颗粒PPy-PEI；其中，聚乙烯亚胺和吡咯的比例为8 mg:1µL，氯化铁和吡咯的比例为1 mg:1µL；
（2）配制聚乙二醇mPEG-COOH水溶液，使用活化剂活化其羧基，随后将其加入到上述PPy-PEI水溶液中，搅拌反应1-3天，透析（过程中换水三次），冷冻干燥，得到聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺稳定的聚吡咯纳米颗粒PPy-PEI-PEG；其中，mPEG-COOH和PPy-PEI的摩尔比为15:1；
（3）配制PPy-PEI-PEG纳米颗粒水溶液，加入盐酸阿霉素水溶液，避光搅拌5-20min后，加入三乙胺搅拌反应12-36 h，离心纯化后得到载药的PPy-PEI-PEG/DOX纳米颗粒；其中，阿霉素和PPy-PEI-PEG的质量比为1:5-25；阿霉素和三乙胺的摩尔比为1:5。
进一步，所述步骤（1）中聚乙烯亚胺的Mw= 10000，加入盐酸和蒸馏水后反应体系中聚乙烯亚胺的最终浓度为20 mg/mL。
进一步，所述步骤（1）中所用盐酸的浓度为5 mol/L，所用氯化铁的浓度为250 mg/mL。
进一步，所述步骤（2）中聚乙二醇的Mw= 2000，所用浓度为30-40 mg/mL。
进一步，所述步骤（2）中透析的换水时间分别为反应结束后0.5、1.5、5.5 h。
进一步，所述步骤（3）中PPy-PEI-PEG纳米颗粒水溶液的浓度为0.5-2 mg/mL。
进一步，所述步骤（3）中所用阿霉素的浓度为8 mg/mL。
进一步，根据上述的载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法，得到聚乙二醇化聚乙烯亚胺稳定的聚吡咯/阿霉素（PPy-PEI-PEG/DOX）复合纳米颗粒。
进一步，将制备得到的PPy-PEI-PEG/DOX复合纳米颗粒可作为癌细胞化疗-热疗剂，应用于体外癌细胞化学-光热联合治疗。
该发明的有益效果：
（1）本发明的制备过程温和，简单易行；
（2）本发明方法制备的聚乙二醇化聚乙烯亚胺稳定的聚吡咯纳米颗粒具有良好的光热效应和细胞相容性；
（3）本发明制备得到的聚乙二醇化聚乙烯亚胺稳定的聚吡咯/阿霉素复合纳米颗粒具有增强的癌细胞治疗效果，为新型肿瘤治疗剂的开发打下了良好的基础。
附图说明
图1为聚乙烯亚胺（a）、实施例1制备的PPy-PEI纳米颗粒（b）、实施例2制备的PPy-PEI-PEG纳米颗粒（c），以及实施例3制备的PPy-PEI-PEG/DOX复合纳米颗粒（d）的1H NMR谱图；
图2为聚乙烯亚胺和实施例2制备的PPy-PEI-PEG纳米颗粒的UV-Vis谱图（a）、不同DOX/PPy-PEI-PEG投料比下所得复合纳米颗粒的UV-Vis谱图（b）；实施例2制备的PPy-PEI-PEG纳米颗粒对DOX的负载情况；
图3为实施例3制备的PPy-PEI-PEG/DOX复合纳米颗粒的水动力学粒径；
图4为实施例2制备的PPy-PEI-PEG纳米颗粒的不同浓度水溶液在808 nm激光（1.5W/cm2）照射下的产热结果（a），及其0.6 mg/mL的水溶液在相同激光照射5个循环后的温度变化数据（每个循环激光开10 min+关20 min）（b），所得纳米颗粒激光前后的UV-Vis谱图；
图5为实施例3制备的PPy-PEI-PEG/DOX复合纳米颗粒在不同pH条件下的药物释放曲线（a）和其在不同pH条件下用激光（808 nm，1.5 W/cm2）照射后的药物释放曲线（b）；
图6为实施例2制备的PPy-PEI-PEG纳米颗粒的细胞毒性试验结果（a）和实施例2制备的PPy-PEI-PEG纳米颗粒、实施例3制备的PPy-PEI-PEG/DOX复合纳米颗粒在不同条件下的细胞毒性试验结果（b）；
图7为实施例3制备的PPy-PEI-PEG/DOX复合纳米颗粒的癌细胞吞噬试验结果，其中纳米颗粒与细胞共培养3 h（a）和6 h（b）。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
取聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine，PEI）200 mg溶于5 ml水中，磁力搅拌使之充分混匀。加入吡咯单体25 µl，继续搅拌混匀30 min。加入HCl（5 M）1.12 mL，蒸馏水3.88mL，搅拌5 min混匀。加入FeCl3· 6H2O（250 mg/ml）100 µl搅拌反应5 min后，对所得溶液进行透析（6次，1 L/次）24 h，透析中分别在0.5 h，1.5 h和 5.5 h换水。所得PPy-PEI纳米颗粒保存于4℃备用。
1H NMR图谱表明各个组分氢原子的化学环境和类型。参照说明书附图1。1H NMR图谱显示，与单纯的PEI相比（附图1a），包裹聚吡咯纳米颗粒后（附图1b），PEI的峰型发生了些改变，并有一些向左的移动。
实施例2
取聚乙二醇（Polyethylene glycol ，PEG）259.9 mg，溶于3 ml蒸馏水中。磁力搅拌中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）1.682 mL（74.750 mg/mL）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）1.730 mL（44.100 mg/mL），室温搅拌4 h。
取上述制备的活化后的PEG 6.232 mL（40.469 mg/mL），加入到实施例1制备的PPy-PEI纳米颗粒水溶液（120 mL，0.667 mg/mL）中，磁力搅拌反应48 h。反应结束后，对所得溶液用蒸馏水（6次，1 L/次）进行透析，得到聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺稳定的聚吡咯（PPy-PEI-PEG）纳米颗粒，4℃保存。
1H NMR图谱（附图1c）中出现在3.6 ppm左右的峰为聚乙二醇的质子峰，表明其成功修饰于聚乙烯亚胺末端。UV-Vis图谱（附图2a）显示，与单纯的PEI聚合物相比，PPy-PEI-PEG纳米颗粒在近红外区具有明显的吸收。
实施例3
取实施例2制备的PPy-PEI-PEG纳米颗粒5 mL（2 mg/mL），按照DOX/PPy-PEI-PEG纳米颗粒的质量比为1/10加入DOX的水溶液0.125 mL（8 mg/mL）。室温避光搅拌反应5 min后，分别加入三乙胺1.21 µL。继续搅拌反应24 h后，对产物进行离心（4000 rpm，4 min），以去除未负载的DOX。收集上清溶液即为聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺稳定的聚吡咯/阿霉素（PPy-PEI-PEG/DOX）纳米颗粒。
1H NMR图谱（附图1d）中出现在2.0-1.0 ppm之间的峰为阿霉素的特征峰。UV-Vis图谱（附图2b）显示，负载阿霉素后，在490 nm左右出现了明显的吸收峰。这些数据可以证明阿霉素的成功负载。激光粒度仪（DLS）测试结果显示了所得复合纳米颗粒的水动力学尺寸及均一程度。参照说明书附图3。PPy-PEI-PEG/DOX复合纳米颗粒的平均尺寸为152.6±5.6nm，单分散度为0.228±0.014。
实施例4
取实施例2制备的PPy-PEI-PEG纳米颗粒，配置成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的水溶液，分别置于石英皿中进行激光照射。所用激光波长为808 nm，单位功率密度为1.5 W/cm2。激光过程中每0.5 min记录一次温度，总共记录10 min。
取实施例2制备的PPy-PEI-PEG纳米颗粒，配置成0.6 mg/mL的水溶液，置于石英皿中进行激光照射。所用激光波长为808 nm，单位功率密度为1.5 W/cm2。实验中激光开10min+关20 min，循环5次。测试过程中，每0.5 min记录一次温度。
产热测试结果显示了所得PPy-PEI-PEG纳米颗粒的光热效应。参照说明书附图4。温度变化曲线显示，与纯水相比，所有浓度下的纳米颗粒均可在近红外激光的照射下产生热量。其产热量与纳米颗粒浓度成正比（附图4a）。在纳米颗粒浓度为0.6 mg/mL时，激光（808 nm，1.5 W/cm2）照射10 min可以升高至50 oC以上。在激光开10 min+关20 min的循环中，所得产品显示基本一致的温度变化曲线，证明该产品可以循环产热（附图4b）。UV-Vis谱图显示所得产品在激光前后具有相似的光学性质（附图4c）。这些数据显示所得产品具有良好的光热效应和光热稳定性。
实施例5
取实施例3制备的PPy-PEI-PEG/DOX复合纳米颗粒6 mL（1.233 mg/mL），分为四组（各三个平行），每组为6 mL产品+54 mL缓冲液。各组释放条件分别为：pH 7.4缓冲液、pH5.0缓冲液、pH 7.4缓冲液+激光照射、pH 5.0缓冲液+激光照射。对前两组，分别在0、2、4、6、8、10、12、24 h取0.1 mL样品，测试其吸光度值。对后两组样品，分别在0、60、120、240 min进行激光照射（808 nm，1.5 W/cm2），并在0、10、60、70、120、130、240、250 min取0.1 mL样品，测试其吸光度值。
药物释放实验显示负载于纳米颗粒内部药物的释放情况。参照说明书附图5。实验结果显示，各组样品均显示缓慢的DOX释放曲线，其中pH 5.0和激光照射均可加快DOX的释放速度。这些结果表明该产品在癌症部位会具有较快的释放速度，具有良好的应用潜力。
实施例6
取实施例2制备的PPy-PEI-PEG纳米颗粒，用无菌PBS缓冲液配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的溶液。
取培养好的HeLa细胞种于96孔板中，按照1万细胞/孔的密度接种，每孔体积200 μL。培养过夜后，加入上述各稀释梯度的样品，与细胞共培养24 h或48 h。每个梯度用培养液稀释5倍，即每孔终浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL。每个梯度做5个平行孔，以PBS缓冲液作为空白对照。随后用CCK-8法检测细胞活力。每孔加CCK-8溶液100 µL，37 ℃孵育0.5 h。之后用酶标仪检测450 nm处吸光度值。
细胞毒性试验CCK-8测试结果显示（附图6a），在0.1-0.6 mg/mL范围内，PPy-PEI-PEG纳米颗粒没有对HeLa细胞（人宫颈癌细胞）活力造成影响，这表明该纳米载体具有良好的生物相容性。
实施例7
取实施例2制备的PPy-PEI-PEG纳米颗粒和实施例3制备的PPy-PEI-PEG/DOX复合纳米颗粒，用无菌PBS缓冲液配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的溶液。
取培养好的HeLa细胞种于96孔板中，按照1.5万细胞/孔的密度接种，每孔体积200μL。培养过夜后，加入上述各稀释梯度的样品，与细胞共培养24 h。每个梯度用培养液稀释5倍，即每孔终浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mg/mL。激光组在培养后用808 nm激光（1.5 W/cm2）照射10分钟。每个梯度做5个平行孔，以PBS缓冲液作为空白对照。随后用CCK-8法检测细胞活力。每孔加CCK-8溶液100 µL，37 ℃孵育0.5 h。之后用酶标仪检测450 nm处吸光度值。
细胞毒性试验CCK-8测试结果显示（附图6b），PPy-PEI-PEG+激光组和PPy-PEI-PEG/DOX在实验浓度范围内，均对HeLa细胞的活力造成了一定的降低。这说明化学治疗和光热治疗都有一定的癌细胞治疗效果。更进一步，PPy-PEI-PEG/DOX+激光组显示最低的细胞活力。这表明将化疗和热疗结合起来能有效提高癌细胞治疗效果。
实施例8
取实施例3制备的PPy-PEI-PEG/DOX复合纳米颗粒，用无菌PBS缓冲液配制成1.0、2.0、3.0 mg/mL的溶液。
取培养好的HeLa细胞种于24孔板中，按照10万细胞/孔的密度接种，每孔体积1mL。培养过夜后，加入上述各稀释梯度的样品，与细胞共培养3 h或6 h。每个梯度用培养液稀释5倍，即每孔终浓度分别为0.2，0.4，0.6 mg/mL。以PBS缓冲液作为空白对照。随后，用PBS洗三次，胰酶消化后，悬浮于PBS中，用流式细胞仪进行测试。
体外细胞吞噬实验结果见附图7。当纳米颗粒与细胞共培养后，用流式细胞仪统计DOX标记的细胞百分比，来反映纳米颗粒被细胞内化的情况。流式数据分析显示（附图7a），共培养3 h后荧光标记的细胞个数百分比随着纳米颗粒浓度的提高而明显提高。与同样浓度的纳米颗粒共培养6 h后，其百分比有进一步的提高。这些结果表明提高纳米颗粒的浓度以及延长共培养时间可以提高纳米颗粒的细胞内化水平。
对比例1
取实施例2制备的PPy-PEI-PEG纳米颗粒5 mL（2 mg/mL），分别按照DOX/PPy-PEI-PEG纳米颗粒的质量比为1/25、1/20、1/15、1/5，加入DOX的水溶液0.050、0.063、0.085、0.250 mL（8 mg/mL）。室温避光搅拌反应5 min后，分别加入三乙胺0.48、0.61、0.81、2.42 µL。继续搅拌反应24 h后，对产物进行离心（4000 rpm，4 min），以去除未负载的DOX。收集上清溶液即为聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺稳定的聚吡咯/阿霉素（PPy-PEI-PEG/DOX）复合纳米颗粒。
UV-Vis图谱（附图2b）显示，负载阿霉素后，在490 nm左右出现了明显的吸收峰。吸收峰的强度随着DOX比例的提高而提高。PPy-PEI-PEG纳米颗粒对DOX的上载量[DOX负载质量/DOX投入质量*100%]和上载效率[DOX负载质量/（DOX负载质量+纳米颗粒质量）*100%]可参照说明书附图2c。

Claims (9)

1.一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）配制聚乙烯亚胺水溶液，加入吡咯单体，搅拌0.5-2 h后加入盐酸和蒸馏水，将反应体系pH调至0.8-1.0，再次搅拌5-20 min后加入氯化铁水溶液，搅拌反应2.5-5 min，透析纯化后得到聚乙烯亚胺稳定的聚吡咯纳米颗粒PPy-PEI；其中，聚乙烯亚胺和吡咯的比例为8mg:1µL，氯化铁和吡咯的比例为1 mg:1µL；
（2）配制聚乙二醇mPEG-COOH水溶液，使用活化剂活化其羧基，随后将其加入到上述PPy-PEI水溶液中，搅拌反应1-3天，透析，过程中换水三次，冷冻干燥，得到聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺稳定的聚吡咯纳米颗粒PPy-PEI-PEG；其中，mPEG-COOH和PPy-PEI的摩尔比为15：1；
（3）配制PPy-PEI-PEG纳米颗粒水溶液，加入盐酸阿霉素水溶液，避光搅拌5-20 min后，加入三乙胺搅拌反应12-36 h，离心纯化后得到载药的PPy-PEI-PEG/DOX纳米颗粒；其中，阿霉素和PPy-PEI-PEG的质量比为1:5-25；阿霉素和三乙胺的摩尔比为1:5。
2.根据权利要求1所述的一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中聚乙烯亚胺的Mw= 10000，加入盐酸和蒸馏水后反应体系中聚乙烯亚胺的最终浓度为20 mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中所用盐酸的浓度为5 mol/L，所用氯化铁的浓度为250 mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中聚乙二醇的Mw= 2000，所用浓度为30-40 mg/mL。
5.根据权利要求2所述的一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中透析的换水时间分别为反应结束后0.5、1.5、5.5 h。
6.根据权利要求3所述的一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中PPy-PEI-PEG纳米颗粒水溶液的浓度为0.5-2 mg/mL。
7.根据权利要求3所述的一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中所用阿霉素的浓度为8 mg/mL。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种载药聚吡咯纳米颗粒的制备方法制备得到的聚乙二醇化聚乙烯亚胺稳定的聚吡咯/阿霉素PPy-PEI-PEG/DOX复合纳米颗粒。
9.根据权利要求8所述的PPy-PEI-PEG/DOX复合纳米颗粒作为癌细胞化疗-热疗剂在体外癌细胞化学-光热联合治疗中的应用。
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