CN105169400A - 一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法 - Google Patents

一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，方法包括：EDC和NHS活化的NH2-PEG-COOH滴加到PEI溶液中，搅拌反应，透析后冷冻干燥，得PEI-PEG；EDC和NHS活化的HA滴加到PEI-PEG溶液中，搅拌后透析，冷冻干燥后得PEI-(PEG-HA)；将FI溶液滴加到PEI-(PEG-HA)水溶液中，避光搅拌，透析，冷冻干燥，即得。本发明成本低，方法简单，条件温和，易于操作，具有良好的应用前景。本发明的PEI-FI-(PEG-HA)负载DOX作为纳米药物缓释体系具有良好的药物缓释效果，对CD44受体表达的肿瘤细胞具有显著的靶向性和明显的抑制效果。

Description

一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法
技术领域
本发明属于药物载体的制备方法领域，特别涉及一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法。
背景技术
癌症一直被认为是人类需要攻克的重大难题之一。化学药物治疗作为癌症治疗的重要手段之一，长期以来倍受关注。然而常见的抗肿瘤药物存在着水溶性差、毒副作用大，药物释放快，抗肿瘤药物无法集中于肿瘤部位，造成患者正常组织和器官也受到损害等问题。近年来，利用纳米材料作为载体负载抗肿瘤药物，可显著增加药物水溶性、实现药物缓释，延长药物在肿瘤部位的作用时间；同时通过修饰靶向分子使药物靶向识别肿瘤部位，从而能有效的聚集在肿瘤部位，实现更好的肿瘤治疗效果，减少毒副作用(Wangetal.,Macromol.Biosci.2007,7,1187-1198)。因此，研究一种新型的纳米药物缓释体系是目前纳米医学的研究热点。
支化聚乙烯亚胺(PEI)是一种分子量较大的支链状PEI，内部有疏水的空腔，具有支化的三维结构，表面具有大量带正电荷的氨基，为其进一步化学修饰提供了条件，而且PEI商业化程度高，价格低廉，可以作为一种良好的药物载体。Wen等系统地研究了支化PEI的表面氨基的各种修饰，如乙酰化、羟基化、羧基化及聚乙二醇化(Wenetal.,J.Appl.Polym.Sci.2013,128(6),3807-3813)。聚乙二醇(PEG)是一种具有良好生物相容性的链状聚合物，将其修饰到PEI表面能够提高材料的水溶性和生物相容性，同时能延长药物缓释周期。透明质酸(HA)，是一种具有良好水溶性的高分子聚合物，是脊椎动物组织和体液的主要成分。此外，HA可以作为一种生物靶向分子，能与肿瘤细胞表面过度表达的CD44受体分子特异性结合。通过HA与肿瘤细胞表面CD44受体分子的特异性结合可实现药物缓释体系对肿瘤细胞的特异性识别与主动富集，实现肿瘤的特异性的靶向治疗。
查阅国内外相关文献或专利，合成透明质酸靶向的聚乙烯亚胺作为药物载体用于抗肿瘤药物输送与肿瘤靶向治疗的研究尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，该药物载体负载DOX得到的PEI-FI-(PEG-HA)/DOX纳米药物缓释体系具有良好的药物缓释效果，对CD44受体表达的肿瘤细胞具有显著的靶向性和明显的抑制效果，用于癌细胞的靶向治疗。
本发明的一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，包括：
(1)在聚乙二醇NH2-PEG-COOH的溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液，搅拌，然后加入N-羟基丁二酰亚胺NHS的溶液，搅拌，得到混合溶液；将混合溶液滴加到聚乙烯亚胺PEI溶液中，搅拌反应3天，透析，冷冻干燥，得到末端为氨基的PEG修饰的聚乙烯亚胺PEI-PEG；其中，PEI与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1:20；
(2)在透明质酸HA溶液中加入EDC溶液，搅拌，加入NHS溶液，搅拌，得到混合液；将混合液滴加到步骤(1)中PEI-PEG的溶液中，搅拌3～4天，透析，冷冻干燥，得到HA修饰的聚乙烯亚胺PEI-(PEG-HA)；其中，PEI-PEG与HA的摩尔比为1:30；
(3)将异硫氰酸荧光素FI溶液逐滴加入到步骤(2)中PEI-(PEG-HA)的水溶液中，在避光条件下，搅拌反应20-30小时，透析，冷冻干燥，得到PEI-FI-(PEG-HA)；其中PEI-(PEG-HA)与FI的摩尔比为1:10。
所述步骤(1)中NH2-PEG-COOH的溶液、EDC溶液和NHS溶液的溶剂均为二甲基亚砜。
所述步骤(1)中NH2-PEG-COOH溶液的浓度为10-15mg/mL，EDC溶液的浓度为10-15mg/mL，NHS溶液的浓度为10-15mg/mL，PEI溶液的浓度为2-4mg/mL。
所述步骤(1)中加入EDC后，搅拌的时间为15～30分钟；加入NHS后搅拌的时间为3～4小时。
所述步骤(1)中EDC与NH2-PEG-COOH的摩尔比为10:1；EDC与NHS的摩尔比为1:1。
所述步骤(1)中的透析为采用的膜为纤维素透析膜，截留分子量MWCO为8000-14000，在磷酸盐缓冲溶液PBS中透析2天。
所述步骤(1)中NH2-PEG-COOH的分子量为2000g/mol，PEI的分子量为25000g/mol。
所述步骤(2)中PEI-PEG溶液的浓度为2-4mg/mL，HA溶液的浓度为3-8mg/mL。
所述步骤(2)中加入EDC后搅拌的时间为20～30分钟；加入NHS后搅拌的时间为3～4小时。
所述步骤(2)中EDC与HA的摩尔比为1:3；EDC与NHS的摩尔比为1:1。
所述步骤(2)中HA的分子量为5805g/mol。
所述步骤(2)和步骤(3)中溶液采用的溶剂均为超纯水。
所述步骤(2)和步骤(3)中透析采用的膜为纤维素透析膜，截留分子量MWCO为8000-14000，在去离子水中透析2天。
所述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100-150转/分钟。
所述步骤(3)中得到的PEI-FI-(PEG-HA)作为药物载体用于抗肿瘤药物输送与肿瘤靶向治疗的研究。
所述步骤(3)中得到的PEI-FI-(PEG-HA)负载阿霉素DOX作为纳米药物缓释体系用于癌细胞的靶向治疗。
所述步骤(3)中PEI-FI-(PEG-HA)负载阿霉素DOX作为纳米药物缓释体系具有良好的药物缓释效果，对CD44受体表达的肿瘤细胞具有显著的靶向性和明显的抑制效果。
所述PEI-FI-(PEG-HA)负载阿霉素DOX的方法包括：将盐酸阿霉素(DOX)溶于甲醇溶液中，加入三乙胺，逐滴加入PEI-FI-(PEG-HA)水溶液，搅拌12-24小时，离心，冷冻干燥得到负载阿霉素的透明质酸修饰的聚乙烯亚胺药物缓释体系PEI-FI-(PEG-HA)/DOX；其中PEI-FI-(PEG-HA)与DOX的摩尔比为1:20，搅拌反应时为开放体系。
所述三乙胺与PEI的摩尔比是5:1。
所述离心的速率为8000-10000转/分钟，时间为5-10分钟。
支化聚乙烯亚胺(PEI)内部有疏水的空腔，具有支化的三维结构，表面具有大量带正电荷的氨基，为其进一步化学修饰提供了条件，而且PEI商业化程度高，价格低廉，可以作为一种良好的药物载体。聚乙二醇(PEG)是一种具有良好生物相容性的链状聚合物，将其修饰到PEI表面能够提高材料的水溶性和生物相容性，同时能延长药物缓释周期。透明质酸(HA)，是一种具有良好水溶性的高分子聚合物，是脊椎动物组织和体液的主要成分。此外，HA可以作为一种生物靶向分子，能与肿瘤细胞表面过度表达的CD44受体特异性结合。通过HA与肿瘤细胞表面CD44受体的特异性结合可实现药物缓释体系对肿瘤细胞的特异性识别与主动富集，实现肿瘤的特异性的靶向治疗。
本发明所得到的负载阿霉素的透明质酸靶向的聚乙烯亚胺的纳米药物缓释体系PEI-FI-(PEG-HA)/DOX能够有效控制阿霉素的释放，并且可以通过透明质酸的主动靶向CD44受体，显著提高对特异肿瘤细胞的抑制作用，应用前景广阔。
本发明使用核磁共振氢谱(1HNMR)、紫外－可见光分光光度计(UV-Vis)、Zeta电势测量等方法表征本发明制备的透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的纳米药物缓释体系，同时用MTT法、流式细胞术分析和激光共聚焦显微镜来检验所制备的纳米药物缓释体系对表面高表达CD44受体的子宫颈癌细胞(HeLa细胞)的毒性与靶向性。
本发明采用价廉易得的聚乙烯亚胺分子PEI为载体，HA为靶向试剂，降低了材料的成本，对生物体无不良影响，制备方法简单，条件温和，易于操作，具有良好的应用前景。
有益效果
(1)本发明的PEI-FI-(PEG-HA)负载DOX得到的载药纳米颗粒具有良好的水溶性和生物相容性，较好的药物缓释效果与pH响应性释放特性，对高CD44受体表达的肿瘤细胞具有靶向性和明显的抑制效果，可用于癌细胞的靶向治疗；
(2)本发明制备方法简单，反应条件温和，成本低廉，易于操作，具有产业化实施的前景。
附图说明
图1为本发明制备PEI-FI-(PEG-HA)/DOX合成示意图；
图2为实施例1中PEI-PEG(a)和PEI-(PEG-HA)(b)核磁共振氢谱图；
图3为实施例1中PEI-FI-(PEG-HA)的紫外吸收光谱图；
图4为实施例2中PEI-FI-(PEG-HA)/DOX的紫外吸收光谱图；
图5为实施例3中体外不同pH条件下DOX从PEI-FI-(PEG-HA)/DOX中释放的累积释放曲线；
图6为实施例4中经生理盐水(NS)、PEI-FI-(PEG-HA)、DOX和PEI-FI-(PEG-HA)/DOX处理24小时后的HeLa细胞活力柱状分析图；
图7为实施例5中经NS和PEI-FI-(PEG-HA)/DOX处理4小时后的HeLa细胞流式分析图(纵坐标为细胞内吞DOX后的荧光强度，与吞噬量成正比；***，p<0.001)。对照组为HeLa细胞先经过高浓度自由HA阻断处理，再进一步通过PEI-FI-(PEG-HA)/DOX复合物处理4小时；图8为实施例6中经NS、PEI-FI-(PEG-HA)/DOX处理4小时后的HeLa细胞激光共聚焦显微镜成像图，其中材料DOX浓度为12.5μg/mL。对照组为HeLa细胞先经过高浓度自由HA阻断处理，再进一步通过PEI-FI-(PEG-HA)/DOX复合物处理4小时；
图9为实施例7中经NS、DOX和PEI-FI-(PEG-HA)/DOX处理4小时后，分别用新培养液培养24小时和48小时的细胞活力柱状分析图(**，p<0.005；***，p<0.001；)。对照组为HeLa细胞先经过高浓度自由HA阻断处理，再进一步通过PEI-FI-(PEG-HA)/DOX复合物处理。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)在5mLNH2-PEG-COOH的DMSO溶液(12mg/mL)中，加入5mLEDC的DMSO溶液(7.6mg/mL)，搅拌反应0.5小时，然后加入5mLNHS的DMSO溶液(4.6mg/mL)，继续搅拌反应3小时。然后逐滴滴加到10mLPEI的DMSO的溶液(5mg/mL)中，快速搅拌反应3天。反应产物先用PBS缓冲液透析1天(3×2L)，然后用去离子水透析2天(6×2L)，冷冻干燥得到白色固体粉末PEI-PEG。
(2)在10mLHA的水溶液(9.57mg/mL)中，加入5mLEDC的水溶液(3.0mg/mL)，搅拌反应0.5小时，然后加入3mLNHS的水溶液(2.75mg/mL)，搅拌反应3小时。然后逐滴滴加到上述10mLPEI-PEG的水的溶液(2.5mg/mL)，快速搅拌反应3天。反应产物用去离子水透析3天(6×2L)，冷冻干燥得到白色固体粉末PEI-(PEG-HA)。
(3)将2mLFI的水溶液(0.48mg/mL)逐滴加入10mLPEI-(PEG-HA)水溶液(5mg/mL)中，避光条件下，搅拌反应24小时，反应产物用去离子水透析2天(6×2L)，冷冻干燥得到橘黄色固体粉末PEI-FI-(PEG-HA)。
参见附图2(a)1HNMR谱，2.2-3.5ppm是PEI的亚甲基质子信号，3.5-3.6ppm是PEG的结构单元的亚甲基质子信号，根据它们积分面积之比，计算出每个PEI分子表面修饰上15个PEG(其投料摩尔比为PEI∶NH2-PEG-COOH＝1:20)，由于NH2-PEG-COOH可能发生自连接，PEG可能会成链状连接到PEI上；参见附图2(b)1HNMR谱，在2.2-3.5ppm是PEI的亚甲基质子信号，3.5-3.6ppm是PEG的结构单元的亚甲基质子信号，1.8-2.2ppm是HA的亚甲基质子信号，根据它们积分面积之比，计算出每个PEI分子表面修饰上15个PEG，28个HA(其投料摩尔比为PEI:NH2-PEG-COOH:HA＝1:20:30)，PEI表面和PEG末端均有氨基存在，HA既能和PEI直接连接，也能通过PEG与PEI相连，但主要连接方式是通过PEG与PEI相连成PEI-(PEG-HA)；
FI的紫外吸收峰位于500nm左右，参见附图3，该峰的出现说明成功制备FI标记的多功能化PEI，即为PEI-FI-(PEG-HA)。
修饰前后的表面电势结果如表1所示。PEI-PEG带有正电荷，经HA修饰后，表面电势从23.5mV变为-35.4mV。在表面进一步修饰FI后，表面电势升高到-17.2mV。修饰前后的电势变化说明PEG、HA和FI已经修饰到PEI表面。
表1PEI-PEG、PEI-(PEG-HA)、PEI-FI-(PEG-HA)的表面电势
材料 电势(mV)
PEI-PEG 23.5±1.53
PEI-(PEG-HA) -35.4±1.50
PEI-FI-(PEG-HA) -17.2±1.08
实施例2
在1.7mg/mL的DOX的甲醇溶液中加入10μL三乙胺，将其逐滴加入10mLPEI-FI-(PEG-HA)的水溶液(3.0mg/mL)中，常温开口搅拌反应24小时。反应结束后，将溶液转移到15mL离心管中，在转速为8000rpm条件下离心5分钟，将上清液冻干即可得到反应产物PEI-FI-(PEG-HA)/DOX。参见附图4，上清液用紫外分析，DOX的紫外吸收峰位于480nm，根据所制备的纳米药物缓释体系在480nm的紫外吸光值与DOX标准曲线作比较，可以得出DOX的含量，从而可以计算出DOX的上载率为88％。DOX对PEI-FI-(PEG-HA)的摩尔当量是17.5:1。
实施例3
将实施例2制备的PEI-FI-(PEG-HA)/DOX分别用pH＝7.0和pH＝5.4的缓冲液溶解成浓度为1mg/mL的溶液，取1mL放入透析袋中固定，置于含有9mL不同pH的缓冲液的容器中，放在37℃摇床中振荡。在0.5，1，2，3，5，8，12，16，24，36，48小时时间点取样。每次取透析袋外液体1mL，测量其480nm处吸光度值，再向透析袋外加入对应的缓冲溶液1mL。用此方法得到体外不同pH条件下DOX从PEI-FI-(PEG-HA)/DOX中释放的释放曲线。参见附图5，PEI-FI-(PEG-HA)/DOX中DOX在酸性条件下要比正常条件下释放的快，在释放8小时后DOX的释放量达到稳定。DOX在pH＝5.0的弱酸性环境中从PEI-FI-(PEG-HA)/DOX中释放速度比在pH＝7.4的中性环境中要快。说明这种载药体系具有一定的pH响应性，在肿瘤组织类似的弱酸性环境中的释放速度比正常组织释放速度快，一定程度减少DOX对正常组织的毒性，提高对肿瘤细胞恶性增殖的抑制效果。
实施例4
配制DOX浓度分别为40.0、80.0、100.0、150.0、200.0μg/mL的纯DOX、PEI-FI-(PEG-HA)和PEI-FI-(PEG-HA)/DOX的无菌生理盐水(NS)溶液(材料加入培养液中，其浓度要稀释10倍)，紫外照射过夜杀菌。收集对数生长期HeLa细胞，按照1.0×104cells/孔接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下培养24小时。弃掉培养液后，每孔更换180μL培养液，并加20μL含不同DOX浓度的PEI-FI-(PEG-HA)/DOX、纯DOX或PEI-FI-(PEG-HA)的NS溶液或纯NS(对照组)，每组设5个平行样。将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃条件下培养24小时。然后按20μL/孔加入MTT溶液(5mg/mL)，避光条件下37℃恒温静止培养4小时，然后弃去培养液，加入200μLDMSO，振荡15分钟后用酶标仪测量在490nm处紫外吸收值，并根据此值计算细胞的存活率。参见附图6，与空白对照组相比，经材料PEI-FI-(PEG-HA)处理的实验组细胞活性达到80％以上，细胞存活率变化不大，说明载体材料PEI-FI-(PEG-HA)对HeLa细胞没有表现出明显的细胞毒性；同等DOX浓度条件下，经PEI-FI-(PEG-HA)/DOX处理的实验组比经纯药DOX处理的实验组HeLa细胞存活率高，说明PEI-FI-(PEG-HA)/DOX具有一定的药物缓释效果。
实施例5
配制DOX浓度分别为80.0、100.0、150.0μg/mL的PEI-FI-(PEG-HA)/DOX无菌NS溶液，及500μM的高浓度HA溶液。紫外照射过夜杀菌，收集对数期HeLa细胞，按照2.0×105cells/孔接种在12孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下培养24小时。弃掉培养液后，每孔更换900μL培养液，并添加100μL含不同DOX浓度的PEI-FI-(PEG-HA)/DOX或纯DOX的NS溶液或NS(对照组)，在实验对比组中加入5μLHA溶液([HA]＝500μM)。继续置于5％CO2，37℃条件下培养4小时。倒去培养液，用PBS洗涤3次，加入100μL胰酶消化约3分钟后，立即加入1mL左右PBS吹打并收集细胞，转移到10mL离心管中1000rpm离心5分钟，继续用1mLPBS重悬。以荧光分辨率作为参数，将滤网过滤重悬的细胞液作为样品加入到流式细胞仪中进行检测，得到细胞对药物的吞噬结果。参见附图7，经PEI-FI-(PEG-HA)/DOX处理HeLa细胞比经高浓度自由HA溶液预处理再添加PEI-FI-(PEG-HA)/DOX复合物处理的HeLa细胞表现出更强的荧光(p<0.001)，说明细胞对PEI-FI-(PEG-HA)/DOX吞噬具有特异靶向性。高浓度HA可阻断细胞对PEI-FI-(PEG-HA)/DOX的识别吞噬，说明PEI-FI-(PEG-HA)/DOX增加肿瘤细胞对DOX的吞噬效果是通过载体上链接的HA和肿瘤细胞表面高表达的CD44受体相结合而实现的。因此，本发明的PEI-FI-(PEG-HA)/DOX可以通过受体-配体结合增加肿瘤细胞对DOX的吞噬，从而增强DOX对肿瘤细胞的特异性抑制效果，并且有效的降低正常细胞对DOX的摄取，降低了药物的毒副作用。
实施例6
将大小合适的处理过的圆形盖玻片以每孔1片的密度放入12孔板中，每孔加入1.0mL培养液浸泡过夜。弃掉浸泡培养液后，收集对数生长期HeLa细胞，按照4.0×104cells/孔接种在圆形载玻片上，置于5％CO2，37℃条件下培养24小时。弃掉培养液后，每孔更换900μL培养液，并添加100μL含PEI-FI-(PEG-HA)/DOX的NS溶液或NS(对照组)，在实验对比组中加入5μLHA([HA]＝500μM)溶液。继续置于5％CO2，37℃条件下培养4小时。弃掉培养液，用无菌PBS洗1-2遍，每孔加2.5％戊二醛的PBS溶液800L，静置于4℃条件下固定30分钟。弃掉戊二醛溶液，用无菌PBS洗1-2遍，加Hoechst33342(1ug/ml)，覆盖细胞即可，静置于37℃染色15分钟。将Hoechst33342液吸出，用无菌PBS洗3遍，在载玻片上滴加一滴荧光封闭剂，将盖玻片从12孔板中勾出，将有细胞的一面压到载玻片上，用激光扫描共焦显微镜观察细胞形态及细胞内荧光分布。参见附图8(DOX终浓度为12.5μg/mL)，经PEI-FI-(PEG-HA)/DOX处理过的细胞内荧光强度较高，在细胞内表现出一定的趋核分布特性，而经高浓度的HA阻断处理的细胞对PEI-FI-(PEG-HA)/DOX的识别吞噬大大减弱，说明发明制备的材料能靶向识别肿瘤细胞，测试结果与流式细胞仪检测结果一致。
实施例7
在超净工作台配制DOX浓度为200.0μg/mL的纯DOX和PEI-FI-(PEG-HA)/DOX的无菌NS溶液，及500μM的高浓度HA溶液，紫外照射过夜杀菌。收集对数生长期HeLa细胞，按10000cells/孔接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下培养24小时。弃掉培养液后，每孔更换180μL培养液，并加20μL含PEI-FI-(PEG-HA)/DOX或纯DOX的NS溶液或纯NS(对照组)，在实验对比组中加入5μLHA溶液([HA]＝500μM)，每组设5个平行样。继续置于5％CO2，37℃条件下培养4小时。弃掉培养液，更换新的不含材料的培养液，将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃条件下分别培养24小时和48小时。然后20μL/孔加入MTT溶液(5mg/mL)，避光条件下37℃恒温静止培养4小时。然后弃去培养液，并加入200μLDMSO，振荡15分钟后用酶标仪测量在570nm处紫外吸收值，并根据此值计算细胞的存活率。参见附图9，在两个时间点，经高浓度的HA阻断处理过的细胞明显比PEI-FI-(PEG-HA)/DOX处理过的细胞存活率高，说明本发明制备的PEI-FI-(PEG-HA)/DOX具有明显的靶向治疗作用，说明PEI-FI-(PEG-HA)/DOX对癌细胞具有明显靶向毒性。

Claims (14)

1.一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，包括：
(1)在聚乙二醇NH2-PEG-COOH的溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液，搅拌，然后加入N-羟基丁二酰亚胺NHS的溶液，搅拌，得到混合溶液；将混合溶液滴加到聚乙烯亚胺PEI溶液中，搅拌反应3天，透析，冷冻干燥，得到末端为氨基的PEG修饰的聚乙烯亚胺PEI-PEG；其中，PEI与NH2-PEG-COOH的摩尔比为1:20；
(2)在透明质酸HA溶液中加入EDC溶液，搅拌，加入NHS溶液，搅拌，得到混合液；将混合液滴加到步骤(1)中PEI-PEG的溶液中，搅拌3～4天，透析，冷冻干燥，得到HA修饰的聚乙烯亚胺PEI-(PEG-HA)；其中，PEI-PEG与HA的摩尔比为1:30；
(3)将异硫氰酸荧光素FI溶液逐滴加入到步骤(2)中PEI-(PEG-HA)的水溶液中，在避光条件下，搅拌反应20-30小时，透析，冷冻干燥，得到PEI-FI-(PEG-HA)；其中PEI-(PEG-HA)与FI的摩尔比为1:10。
2.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中NH2-PEG-COOH的溶液、EDC溶液和NHS溶液的溶剂均为二甲基亚砜。
3.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中NH2-PEG-COOH溶液的浓度为10-15mg/mL，EDC溶液的浓度为10-15mg/mL，NHS溶液的浓度为10-15mg/mL，PEI溶液的浓度为2-4mg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中加入EDC后，搅拌的时间为15～30分钟；加入NHS后搅拌的时间为3～4小时。
5.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中EDC与NH2-PEG-COOH的摩尔比为10:1；EDC与NHS的摩尔比为1:1。
6.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的透析为采用的膜为纤维素透析膜，截留分子量MWCO为8000-14000，在磷酸盐缓冲溶液PBS中透析2天。
7.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中PEI-PEG溶液的浓度为2-4mg/mL，HA溶液的浓度为3-8mg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入EDC后搅拌的时间为20～30分钟；加入NHS后搅拌的时间为3～4小时。
9.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中EDC与HA的摩尔比为1:3；EDC与NHS的摩尔比为1:1。
10.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中溶液采用的溶剂均为超纯水。
11.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中透析采用的膜为纤维素透析膜，截留分子量MWCO为8000-14000，在去离子水中透析2天。
12.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中得到的PEI-FI-(PEG-HA)负载阿霉素DOX作为纳米药物缓释体系用于癌细胞的靶向治疗。
13.根据权利要求12所述的一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，其特征在于，所述PEI-FI-(PEG-HA)负载阿霉素DOX的方法包括：将盐酸阿霉素(DOX)溶于甲醇溶液中，加入三乙胺，逐滴加入PEI-FI-(PEG-HA)水溶液，搅拌12-24小时，离心，冷冻干燥得到负载阿霉素的透明质酸修饰的聚乙烯亚胺药物缓释体系PEI-FI-(PEG-HA)/DOX；其中PEI-FI-(PEG-HA)与DOX的摩尔比为1:20，搅拌反应时为开放体系。
14.根据权利要求13所述的一种透明质酸靶向的多功能支化聚乙烯亚胺药物载体的制备方法，其特征在于，所述三乙胺与PEI的摩尔比是5:1。
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