CN103893777A - 一种透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物的制备方法，包括：（1）将多壁碳纳米管和PEI在二甲基亚砜中通过EDC产生化学键合，透析冻干，合成MWCNT/PEI；（2）将透明质酸溶解在水中加入EDC活化；（3）将上述MWCNT/PEI中加入FITC搅拌，再加入活化过的透明质酸，透析冻干，合成MWCNT/PEI-FI-HA；（4）将上述MWCNT/PEI-FI-HA溶解于水中，加入DOX的水溶液，调节pH值，充分搅拌，透析冻干即得载药复合物。本发明的制备过程简单，实验条件为常温常压，易于操作；负载DOX后具有pH敏感型释放及主动定位细胞的作用，有着很好的实用价值。
Description
技术领域
本发明属于负载抗癌药物领域，特别涉及一种透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物的制备方法。
背景技术
抗癌药物的毒副作用和水溶性差一直是肿瘤化学治疗中的瓶颈问题，因此使用药物输送系统受到了广泛的关注。纳米载药系统凭借其独特的尺寸范围（1-100nm）不仅可以降低药物的生物毒性，有效提高药物的溶解度和稳定性，还可以并且可以通过对药物载体的修饰、载体药物的选择以及负载方法的设计来控制药物的缓释与定向输送，从而达到最佳的治疗效果。
作为一种新型的纳米级别材料，碳纳米管在生物应用方面表现出了良好的潜能，由于碳纳米管能够携带药物分子进入细胞，其表面连接靶向分子后，还可以实现特异性地靶向目标细胞，因此碳纳米管很可能成为未来抗肿瘤药物的理想载体，目前在基因、药物、蛋白载体方面已经获得广泛的研究。由于碳纳米管本身一般没有可供反应的基团，不具有化学活性，所以在常见溶剂中存在易团聚、难分散的现象，这在很大程度上限制了碳纳米管的研究与应用。因此，我们期望在保持碳纳米管不被破坏，并保持中空管状结构完整的前提下，使用化学方法对碳纳米管进行一定程度的修饰，将一些活性官能团（羟基，羧基等）引入到碳纳米管的表面。这不仅能够提高碳纳米管在常见溶剂中的溶解性，还能够通过表面修饰的活性基团为碳纳米管赋予新的功能。
聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine，PEI)是一种携带大量氨基的高分子聚电解质材料，分为直链型和超支化型两种，由于氨基的存在，可以连静电吸附许多物质，也可以化学键合一些反应基团。
聚乙烯亚胺同时也是一种高效的非病毒基因载体，它所具有的多个氨基使得PEI具有非常高的转染效率。但是过多的表面氨基也加大了其细胞毒性，因此限制了PEI的应用。因此，有必要对聚乙烯亚胺进行表面改性，一方面降低其细胞毒性；另一方面赋予PEI以新的功能，拓宽其应用范围。
透明质酸（HA）主要分布于机体的组织、体液及细胞间质中。可以与细胞表面受体(CD44)结合，调节细胞的迁移、粘附和增殖.透明质酸在正常组织的含量很低，当机体出现免疫反应、变态反应等才会出现升高.研究结果表明，CD44与HA的特异性结合可促使已进入血流的癌细胞倾向于向HA转移，并且HA特异性受体CD44在多种恶性肿瘤中（Hela，KB等细胞）中均存在过度表达。采用透明质酸-荧光探针技术，可动态观察到CD44在机体内的分布状况，同样也可作为含透明质酸受体肿瘤治疗的靶向位点及对恶性肿瘤判断的依据。
盐酸阿霉素(Doxorubicin，DOX)属蒽环类抗肿瘤抗生素，是一种抑制DNA和RNA合成的抗肿瘤药物。其作用机制主要是嵌入DNA的相邻碱基对使DNA发生错配，从而使DNA链裂解，阻碍DNA和RNA合成，对RNA的抑制作用最强。DOX抗瘤谱比较广，对多种肿瘤均有作用，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用，属于周期非特异性药物。然而，DOX在大剂量时会对正常细胞也会产生强烈的细胞毒性。因此，为了降低DOX对人体的正常组织造成毒副作用，使用药物载体对DOX进行负载，控制其释放是十分必要的。
检索国内外有关DOX靶向运输方面的文献和专利表明：以透明质酸修饰的碳纳米管为载体材料，通过π-π堆积作用负载阿霉素，达到靶向、pH敏感释放的多重功效的研究还没有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物的制备方法，该方法操作简单、反应条件温和；该碳纳米管复合材料可装载抗肿瘤药物DOX，该载药复合物具有pH值敏感释放，并且能够主动对HeLa细胞进行靶向的杀伤作用。
本发明的一种透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物的制备方法，包括：
（1）将多壁碳纳米管分散在二甲基亚砜溶液中，加入EDC活化；加入PEI的二甲基亚砜溶液，于常温下反应1～2天，透析除去未反应杂质，冷冻干燥得到MWCNT/PEI；
（2）将上述MWCNT/PEI溶于水中，加入FITC的二甲基亚砜溶液，得到MWCNT/PEI-FI溶液；将1～2g透明质酸溶解在水中加入EDC活化，加入MWCNT/PEI-FI溶液中，常温下反应1～2天，透析除去未反应杂质，最后冷冻干燥得到MWCNT/PEI-FI-HA；
（3）将上述MWCNT/PEI-FI-HA溶解于水中，加入DOX的水溶液，调节pH值，充分搅拌，透析冻干即得透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物。
所述步骤（1）中的多壁碳纳米管与PEI的质量比为1:1～1:2。
所述步骤（1）中的多壁碳纳米管与EDC的质量比为1:0.5～1:1.2。
所述步骤（2）中的MWCNT/PEI与FITC的质量比为1:0.02～1:0.05。
所述步骤（2）中的透明质酸与EDC的质量比为1:0.05～1:0.1。
所述步骤（2）中的MWCNT/PEI-FI与透明质酸的质量比为1:5～1:10。
所述步骤（2）中的MWCNT/PEI-FI-HA与DOX的质量比为1:0.5～1:2。
所述步骤（1）、（2）、（3）中的透析工艺为采用透析袋，先在pH=6-7的缓冲液中透析，再在水中透析。
对负载抗癌药物的多功能碳纳米管的制备、药物缓释及肿瘤靶向治疗研究，做了一些测试：
（1）TEM测试结果
TEM结果表明：多壁碳纳米管经过多功能修饰过后依然保持其中空管状结构，即修饰仅发生在碳纳米管的表面，并不改变碳纳米管本身的结构。参见图1。
（2）NMR测试结果
NMR测试结果表明：以多壁碳纳米管为模板，PEI及HA分子成功的连接在碳纳米管的表面。参见图2。
（3）UV-Vis测试结果
UV-Vis图谱证明了FITC及PEI成功的连接在碳纳米管的表面：参见图3。
（4）TGA测试结果
TGA的结果表明：选取421℃为计算温度，修饰在碳纳米管表面的PEI约为26%，HA约为47%。参见图4。
（5）药物释放结果
药物释放曲线表明：在72h后，DOX在pH=5.8的缓释液中约释放55%。而在PBS环境中仅释放40%，两者的释放率存在显著差异。参见图5。
（6）MTT细胞活力测定结果
MTT细胞活力测定结果表明：多壁碳纳米管复合物本身生物相容性较好，细胞损伤较小，载药复合物对HeLa细胞杀伤效果明显。参见图6。
（7）流式细胞仪测定结果
流式细胞仪测定结果表明：靶向细胞HeLa对DOX的吞噬能力明显高于非靶向细胞L929，表明载药复合物MWCNT/PEI-FI-HA/DOX对HeLa细胞有着特异的治疗效果。参见图7。
（8）激光共聚焦显微镜测定结果
激光共聚焦显微镜测定结果：用载药复合物MWCNT/PEI-FI-HA/DOX分别作用于HeLa细胞和L929细胞4h后，HeLa细胞有明显的荧光，说明载药复合物MWCNT/PEI-FI-HA/DOX对HeLa细胞具有特异的治疗效果。参见图8。
有益效果
（1）本发明采用化学键合的方法，合成具有靶向性的多壁碳纳米管复合材料，制备方法操作简单、实验条件温和。
（2）本发明的多壁碳纳米管复合材料克服了碳纳米管分散性差的缺陷，有较高的药物负载能力，且有pH敏感型释放的性能。具有应用其做后续相关实验分析的潜力。
（3）透明质酸修饰过的多壁碳纳米管复合材料对CD44受体表达的癌细胞具有靶向杀伤效果。
附图说明
图1为本发明制备的多功能碳纳米管MWCNT/PEI-FI-HA的TEM图谱。
图2为MWCNT/PEI、HA及MWCNT/PEI-FI-HA的1H-NMR图谱；其中2a为MWCNT/PEI、2b为HA、2c为MWCNT/PEI-FI-HA。
图3为MWCNT/PEI、HA及MWCNT/PEI-FI-HA的UV-Vis图谱。
图4为MWCNT/PEI、HA及MWCNT/PEI-FI-HA的TGA分析。
图5为载药复合物CNT/DOX在不同pH值环境下的释放曲线。
图6为MTT法测试的HeLa细胞经过MWCNT/PEI-FI-HA（a）及MWCNT/PEI-FI-HA/DOX（b）处理24h后的细胞活力。
图7分别为不同浓度下的MWCNT/PEI-FI-HA/DOX载药复合物（a，b，c）处理过的L929细胞，及不同浓度下的MWCNT/PEI-FI-HA/DOX载药复合物（d，e，f）处理过的HeLa细胞的流式细胞图，（g）为MWCNT/PEI-FI-HA/DOX载药复合物在两种细胞下的主荧光强度，（h）为两种细胞对MWCNT/PEI-FI-HA/DOX载药复合物中DOX的吞噬能力分析。
图8分别为MWCNT/PEI-FI-HA/DOX载药复合物处理过的L929细胞及HeLa细胞的激光共聚焦显微镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
（1）将羧基化的CNT（344.9mg），溶解在40mL DMSO中，然后加入EDC（354.32mg）活化搅拌反应3h。在搅拌的情况下，逐滴加入10mL含PEI（540.01mg）的DMSO溶液，在室温状态下超声搅拌反应24h。最后将反应溶液放入透析袋（MW=100,000）中，用透析法将未反应的杂质及副产物除去，先用PBS缓冲液透析2次，每次2L，再用蒸馏水透析7次。最后将产物冷冻干燥后获得MWCNT/PEI。
（2）称取360mgMWCNT/PEI于水中加入12.5mgFITC的DMSO溶液，另称取1.8g透明质酸于水中加入120.96mgEDC活化三小时，之后加入MWCNT/PEI溶液中，搅拌反应24h后。最后将反应溶液放入透析袋（MW=100,000）中，用透析法将未反应的杂质及副产物除去，先用PBS缓冲液透析2次，每次2L，再用蒸馏水透析7次。最后将产物冷冻干燥。
（4）对最终产物的TEM表征如图1所示，可以看出多壁碳纳米管经过多功能修饰过后依然保持其中空管状结构，即修饰仅发生在碳纳米管的表面，并不改变碳纳米管本身的结构。
实施例2
（1）将羧基化的CNT（300mg），溶解在30mL DMSO中，然后加入EDC（304mg）活化搅拌反应3h。在搅拌的情况下，逐滴加入10mL含PEI（452.3mg）的DMSO溶液，在室温状态下超声搅拌反应24h。最后将反应溶液放入透析袋（MW=100,000）中，用透析法将未反应的杂质及副产物除去，先用PBS缓冲液透析2次，每次2L，再用蒸馏水透析7次。最后将产物冷冻干燥后获得MWCNT/PEI。
（2）称取200mgMWCNT/PEI于水中加入12.5mgFITC的DMSO溶液，另称取1g透明质酸于水中加入70mgEDC活化三小时，之后加入MWCNT/PEI溶液中，搅拌反应24h后。最后将反应溶液放入透析袋（MW=100,000）中，用透析法将未反应的杂质及副产物除去，先用PBS缓冲液透析2次，每次2L，再用蒸馏水透析7次。最后将产物冷冻干燥。
（4）MWCNT/PEI、HA、MWCNT/PEI-FI-HA的1H-NMR图谱如图2所示，图2a中的化学位移均为透明质酸中葡糖醛酸及N-乙酰氨基葡糖的质子峰。图2b中的化学位移为2.37～3.31ppm的峰为PEI上的氨基质子峰，图2c中相对于图2a，在化学位移为2.31～2.89ppm之间出现了许多小的质子峰，即MWCNT/PEI分子的特征峰。这些结果表明HA与MWCNT/PEI成功连接在一起。
实施例3
（1）将10mg MWCNT/PEI-FI-HA，溶解在10mL水中，在搅拌的情况下，逐滴加入4mL含DOX（4mg）的水溶液，用氢氧化钠调节pH值=8.5，在室温状态下,搅拌4h。最后将溶液放入透析袋（MW=8,000～14,000）中，用透析法将连接的药物除去，先用PBS缓冲液透析3次，每次2L。最后将产物冷冻干燥后获得CNT/DOX载药复合物。
（2）将上述MWCNT/PEI-FI-HA/DOX载药复合物在37℃、两种不同pH的缓冲液（pH=5.8、pH=7.4）下进行缓释，通过UV-Vis检测释放的药量来研究其对DOX的释放效果。
（3）将上述MWCNT/PEI-FI-HA/DOX载药复合物与相同浓度下的纯药DOX及MWCNT/PEI-FI-HA分别作用于人子宫颈癌细胞（HeLa细胞），培养24h后，通过MTT法检测细胞活力来研究MWCNT/PEI-FI-HA/DOX载药复合物对Hela的毒性作用及MWCNT/PEI-FI-HA的生物相容性；其中DOX的浓度为0.5～4μM。
（4）将上述MWCNT/PEI-FI-HA/DOX载药复合物分别作用于含有CD44受体的HeLa细胞及不含有CD44受体的小鼠胚胎成纤维细胞（L929细胞），培养4个小时后，清洗细胞，使培养液中不含有游离的MWCNT/PEI-FI-HA/DOX载药复合物，收集细胞进行流式细胞仪检测。
（5）将上述MWCNT/PEI-FI-HA/DOX载药复合物分别作用于含有CD44受体的Hela细胞及不含有CD44受体的L929细胞，培养4个小时后，清洗、固定并对细胞进行染色，将染色完的盖玻片放入激光共聚焦显微镜中进行检测。
Claims (8)
1.一种透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物的制备方法，包括：
（1）将多壁碳纳米管分散在二甲基亚砜溶液中，加入EDC活化；加入PEI的二甲基亚砜溶液，于常温下反应1～2天，透析除去未反应杂质，冷冻干燥得到MWCNT/PEI；
（2）将上述MWCNT/PEI溶于水中，加入FITC的二甲基亚砜溶液，得到MWCNT/PEI-FI溶液；将1～2g透明质酸溶解在水中加入EDC活化，加入MWCNT/PEI-FI溶液中，常温下反应1～2天，透析除去未反应杂质，最后冷冻干燥得到MWCNT/PEI-FI-HA；
（3）将上述MWCNT/PEI-FI-HA溶解于水中，加入DOX的水溶液，调节pH值，充分搅拌，透析冻干即得透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物。
2.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的多壁碳纳米管与PEI的质量比为1:1～1:2。
3.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的多壁碳纳米管与EDC的质量比为1:0.5～1:1.2。
4.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的MWCNT/PEI与FITC的质量比为1:0.02～1:0.05。
5.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的透明质酸与EDC的质量比为1:0.05～1:0.1。
6.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的MWCNT/PEI-FI与透明质酸的质量比为1:5～1:10。
7.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的MWCNT/PEI-FI-HA与DOX的质量比为1:0.5～1:2。
8.根据权利要求1所述的一种透明质酸靶向的碳纳米管负载抗癌药物的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）、（2）、（3）中的透析工艺为采用透析袋，先在pH=6-7的缓冲液中透析，再在水中透析。
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