CN104208010A - 一种纳米靶向缓控释系统的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种纳米靶向缓控释系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：步骤(a)：制备壳聚糖包裹后的羧基碳纳米管；步骤(b)：制备接枝透明质酸的壳聚糖修饰羧基碳纳米管；步骤(c)：制备最终负载药物的纳米靶向缓控释系统。本发明方法温和简单，所制备的羧基碳纳米管药物纳米缓控释靶向载体水溶性和分散性好，载药率高，在肿瘤环境下释放药物量大且能够持续一段时间，而在正常生理环境下释放药物量非常小。

Description

一种纳米靶向缓控释系统的制备方法

技术领域

本发明涉及药物载体领域，具体是一种碳纳米管纳米靶向缓控释系统的制备方法。

背景技术

目前肿瘤是威胁人类健康的严重疾病，已成为人类死亡的第二大病因。据2013年最新的调查数据，就中国而言，每10万个人中就有286人患癌，而在这286人中就会有181人因为癌症而失去生命。目前对于癌症的治疗，主要有手术治疗、放射治疗和化学治疗。由于肿瘤具有转移性，而相对于手术和放射治疗的定点治疗，化学治疗能够作用于人体整个生命系统，因此化学治疗具有不可或缺的作用。但是由于目前的传统化疗药物存在选择性差，分散性差的缺点，导致在杀死肿瘤细胞的同时也对正常细胞产生毒性，引起各种严重的毒副作用，而其差的水溶性则大大降低其生物利用度，直接影响其应用于人体。同时随着抗肿瘤药物的长期使用，肿瘤细胞也产生了多药耐药性，其多药耐药基因的出现导致抗肿瘤药物的药效相对降低。因此研究一种新型的结合化学治疗的药物传递系统用于减小药物使用限制和对正常细胞的毒副作用和增强其作用效果就显得极其必要了。

随着研究发现，碳纳米管作为一种新型的材料，有着很多独特而优越的性能，包括细胞膜穿透性、高表面积、药物负载性、生物相容性、容易进行表面修饰、无免疫原特性等，而这些特性都特别适合作为纳米药物靶向缓控释系统的核心部分。外来物质进入细胞膜其中一种方式就是胞吞作用，这种方式是需要耗能的，同时也需要通过细胞膜的曲率改变而发生。有研究表明碳纳米管表面能较高，可以为胞吞提供一定的能量，长度在100nm左右的纳米管在改变细胞膜曲率方面更为容易些，另外它的纳米尺寸和疏水性质为其穿透磷脂双分子层提供便利。碳纳米管是有片层的石墨烯结构卷曲成的管状物质，能够与蒽环类的物质通过π-π共轭的方式作用，利用其巨大的表面积和管状空心结构，可以容纳负载更多的抗肿瘤药物，而且这种负载方式是非共价作用，相对于共价作用，其在物理化学环境改变下更容易进行解吸附。不过其水溶性差、容易团聚的缺点也是不容忽视的。

发明内容

本发明针对上述存在的问题，提供一种采用透明质酸、壳聚糖修饰羧基碳纳米管制备纳米靶向缓控释系统的方法，即利用壳聚糖带正电荷与带负电荷的羧基碳纳米管进行物理包裹，然后利用透明质酸的羧基与壳聚糖的氨基进行酰胺化接枝，以改善羧基碳纳米管的水溶性、分散性，以及赋予其缓控释和靶向的功能。

本发明是这样实现的：

一种纳米靶向缓控释系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：

步骤(a)：将羧基碳纳米管分散于超纯水中，加入壳聚糖溶液后进行超声处理，然后进行磁力搅拌处理，将搅拌后的混合液透析，真空干燥透析后的产物，得到壳聚糖包裹后的羧基碳纳米管；

步骤(b)：将壳聚糖包裹后的羧基碳纳米管分散于磷酸缓冲液中，加入经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化后的透明质酸溶液进行超声处理，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行磁力搅拌处理，将搅拌后的混合液透析，真空干燥透析后的产物，得到接枝上透明质酸的壳聚糖修饰羧基碳纳米管；

步骤(c)：将接枝上透明质酸后的壳聚糖修饰羧基碳纳米管分散于磷酸缓冲液中，加入蒽环类药物，超声处理，然后进行磁力搅拌处理，将搅拌后的混合液进行离心处理，用磷酸缓冲液洗涤游离蒽环类药物，最后对负载了药物的接枝上透明质酸的壳聚糖修饰羧基碳纳米管进行真空干燥，得到最终负载药物的纳米靶向缓控释系统。

优选的，所用碳纳米管为单壁羧基碳纳米管或多壁羧基碳纳米管。

优选的，所述羧基碳纳米管水分散液浓度为1～10mg/ml。

优选的，所述壳聚糖溶液浓度要求为1～10mg/ml。

优选的，所述透明质酸溶液浓度要求为1～10mg/ml。

优选的，所述壳聚糖与羧基碳纳米管的质量比为1：1～1：10，所述透明质酸与壳聚糖改性后的羧基碳纳米管质量比为1：1～1：10。

优选的，所述蒽环类药物为阿霉素或者表阿霉素或者盐酸阿霉素，所述蒽环类药物浓度为1～10mg/ml。

优选的，所述步骤(a)、(b)、(c)中超声处理为20KHZ～100KHZ的频率的超声波处理10～60min，所述的搅拌处理是在20～37℃下搅拌12～36小时，所述真空干燥温度为20～40℃。

优选的，所述透析处理用透析袋分子截留量为1000～20000Da。

优选的，所述步骤(c)中离心处理所用转速为1000～5000rpm。

壳聚糖是自然界中的一种带正电的多糖，其优越的生物相容性和生物降解性一直被应用于药物制剂中，它能够通过静电作用与带负电的碳纳米管复合，降低碳纳米管的细胞毒性，同时由于它的pKa在6.5左右，使得它在生理pH下溶解度小，而在肿瘤pH(较酸性环境)下溶解度增加，复合后的材料具备pH敏感性。为了使材料具备靶向功能，因此利用酰胺化反应而接上透明质酸。另外透明质酸中大量的羧基也为材料的亲水性改善提供帮助。通过对这三种材料的研究，以碳纳米管为核心，包裹壳聚糖以及接枝上透明质酸制备的纳米药物靶向缓控释系统，其具有强大的载药能力，定向选择肿瘤细胞，pH敏感性缓控释功能，为肿瘤的有效治疗和减小化疗药物毒副作用提供一种可能性。

本发明方法温和简单，所制备的羧基碳纳米管药物纳米缓控释靶向载体水溶性和分散性好，载药率高，在肿瘤环境下释放药物量大且能够持续一段时间，而在正常生理环境下释放药物量非常小，通过细胞毒性实验可以得出，相同浓度下使用该载药系统对肿瘤细胞的杀害作用大于单纯用药，而对普通细胞的伤害作用则远小于单纯用药。

附图说明

图1不同修饰单壁碳纳米管的透射电镜图:其中(a)单壁碳纳米管，(b)壳聚糖修饰的单壁碳纳米管，(c)、(d)负载DOX(强力霉素)的透明质酸壳聚糖修饰的单壁碳纳米管；

图2不同修饰单壁碳纳米管对DOX(强力霉素)的载药率；

图3不同修饰单壁碳纳米管负载DOX(强力霉素)在不同pH下的释放：其中(A)pH＝7.4，(B)pH＝5.5；

图4不同修饰单壁碳纳米管对3T3成纤维细胞和Hela细胞的毒性图；

图5不同浓度下各种修饰单壁碳纳米管对Hela细胞的毒性图。

具体实施案例

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

以成都有机化学研究所购买的羧基单壁碳纳米管为原料，物理包裹上壳聚糖后，通过接枝透明质酸靶向化，以盐酸阿霉素为模型药物，得到透明质酸靶向的壳聚糖改性羧基单壁碳纳米管盐酸阿霉素靶向药物载体，其具体步骤如下：

步骤(a)：将10mg羧基碳纳米管分散于10ml超纯水中，将10mg壳聚糖溶于5ml醋酸缓冲溶液(稀酸溶液都可以溶解包括醋酸、硫酸、盐酸等)，将两液混合后进行以80kHZ超声处理20min，然后37℃下进行磁力搅拌16小时，将搅拌后的混合液透析3日，24小时换一次超纯水，透析处理用透析袋分子截留量为1000Da，真空干燥透析后的产物，得到壳聚糖包裹后的羧基碳纳米管。

步骤(b)：10mg壳聚糖改性后的羧基碳纳米管分散于20mlpH＝7.4磷酸缓冲液中，加入10mg透明质酸、10mgEDC·HCL与2mgNHS进行以80kHZ超声处理20min，然后37℃下进行磁力搅拌16小时，将搅拌后的混合液透析3日，每24小时换一次超纯水，透析处理用透析袋分子截留量为1000Da，真空干燥透析后的产物，得到纳米靶向缓控释药物载体。

步骤(c)：将10mg接枝上透明质酸后的壳聚糖修饰羧基碳纳米管分散于20mlpH＝7.4磷酸缓冲液中，加入15mg盐酸阿霉素，以80kHZ超声处理20min，然后37℃下进行磁力搅拌16小时，将搅拌后的混合液以5000rpm转速进行离心10min处理，用磷酸缓冲液洗涤游离盐酸阿霉素。最后对负载了盐酸阿霉素的接枝上透明质酸的壳聚糖修饰羧基碳纳米管进行真空干燥，得到最终负载药物的纳米靶向缓控释系统。

实施例2

以成都有机化学研究所购买的羧基单壁碳纳米管为原料，物理包裹上壳聚糖后，通过接枝透明质酸靶向化，以盐酸阿霉素为模型药物，得到透明质酸靶向的壳聚糖改性羧基单壁碳纳米管盐酸阿霉素靶向药物载体，其具体步骤如下：

步骤(a)：将20mg羧基碳纳米管分散于10ml超纯水中，将2mg壳聚糖溶于2ml醋酸缓冲溶液，将两液混合后进行以100kHZ超声处理20min，然后37℃下进行磁力搅拌24小时，将搅拌后的混合液透析3日，24小时换一次超纯水，透析处理用透析袋分子截留量为20000Da，真空干燥透析后的产物，得到壳聚糖包裹后的羧基碳纳米管。

步骤(b)：将20mg壳聚糖改性后的羧基碳纳米管分散于10mlpH＝7.4磷酸缓冲液中，加入5mg透明质酸、5mgEDC·HCL与2mgNHS进行以100kHZ超声处理20min，然后37℃下进行磁力搅拌24小时，将搅拌后的混合液透析3日，每24小时换一次超纯水，透析处理用透析袋分子截留量为20000Da，真空干燥透析后的产物，得到纳米靶向缓控释药物载体。

步骤(c)：将10mg接枝上透明质酸后的壳聚糖修饰羧基碳纳米管分散于20mlpH＝7.4磷酸缓冲液中，加入15mg阿霉素，以100kHZ超声处理20min，然后37℃下进行磁力搅拌24小时，将搅拌后的混合液以2000rpm转速进行离心10min处理，用磷酸缓冲液洗涤游离阿霉素。最后对负载了阿霉素的接枝上透明质酸的壳聚糖修饰羧基碳纳米管进行真空干燥，得到最终负载药物的纳米靶向缓控释系统。

实施例3

以成都有机化学研究所购买的单壁碳纳米管为原料，物理包裹上壳聚糖后，通过接枝透明质酸靶向化，以阿霉素为模型药物，得到透明质酸靶向的壳聚糖改性羧基单壁碳纳米管盐酸阿霉素靶向药物载体，其具体步骤如下：

步骤(a)：将10mg单壁碳纳米管分散于1ml超纯水中，将20mg壳聚糖溶于20ml醋酸缓冲溶液，将两液混合后进行以80kHZ超声处理50min，然后20℃下进行磁力搅拌36小时，将搅拌后的混合液透析3日，24小时换一次超纯水，透析处理用透析袋分子截留量为10000Da，真空干燥透析后的产物，得到壳聚糖包裹后的羧基碳纳米管。

步骤(b)：10mg壳聚糖改性后的单壁碳纳米管分散于20mlpH＝7.4磷酸缓冲液中，加入1mg透明质酸、2mgEDC·HCL与1mgNHS进行以80kHZ超声处理50min，然后20℃下进行磁力搅拌36小时，将搅拌后的混合液透析3日，每24小时换一次超纯水，透析处理用透析袋分子截留量为10000Da，真空干燥透析后的产物，得到纳米靶向缓控释药物载体。

步骤(c)：将10mg接枝上透明质酸后的壳聚糖修饰单壁碳纳米管分散于20mlpH＝7.4磷酸缓冲液中，加入15mg表阿霉素，以80kHZ超声处理50min，然后20℃下进行磁力搅拌36小时，将搅拌后的混合液以1000rpm转速进行离心10min处理，用磷酸缓冲液洗涤游离表阿霉素。最后对负载了表阿霉素的接枝上透明质酸的壳聚糖修饰羧基碳纳米管进行真空干燥，得到最终负载药物的纳米靶向缓控释系统。

将不同修饰的载药单壁碳纳米管用Hela细胞和3T3成纤维细胞粒子进行细胞实验，结果用以分析材料对正常细胞和肿瘤细胞的毒性，从而评价材料的靶向性能、控释性能、抗肿瘤性能和生物相容性等。根据图1～图5可以看出，从单壁碳纳米管、壳聚糖修饰单壁碳纳米管、透明质酸壳聚糖修饰单壁碳纳米管对两种细胞的实验数据可以看出，单壁碳纳米管本身带有微弱毒性，用壳聚糖和透明质酸修饰后，无论对3T3成纤维细胞还是Hela细胞，毒性均明显降低。同一种材料对两种不同细胞的毒性作用也有所不同，材料对Hela细胞的毒性是大于3T3成纤维细胞，所以Hela细胞较之于3T3成纤维细胞，在相同浓度下摄取的材料更多，引起的毒性更大。

实施例4：

以成都有机化学研究所购买的多壁碳纳米管为原料，物理包裹上壳聚糖后，通过接枝透明质酸靶向化，以阿霉素为模型药物，得到透明质酸靶向的壳聚糖改性羧基单壁碳纳米管盐酸阿霉素靶向药物载体，其具体步骤如下：

步骤(a)：将10mg多壁碳纳米管分散于10ml超纯水中，将25mg壳聚糖溶于2.5ml醋酸缓冲溶液，将两液混合后进行以20kHZ超声处理60min，然后25℃下进行磁力搅拌24小时，将搅拌后的混合液透析3天，每天换一次超纯水，透析处理用透析袋分子截留量为8000Da，真空干燥透析后的产物，得到壳聚糖包裹后的羧基碳纳米管；

步骤(b)：10mg壳聚糖改性后的单壁碳纳米管分散于5ml pH＝7.4磷酸盐缓冲液中，加入1mg透明质酸、2mgEDC·HCL与1mgNHS进行以100kHZ超声处理30min，然后25℃下进行磁力搅拌24小时，将搅拌后的混合液透析3天，每天换一次超纯水，透析处理用透析袋分子截留量为8000Da，真空干燥透析后的产物，得到纳米靶向缓控释药物载体；

步骤(c)：将10mg接枝上透明质酸后的壳聚糖修饰多壁碳纳米管分散于30ml、pH＝7.4磷酸缓冲液中，加入20mg盐酸阿霉素，以100kHZ超声处理30min，然后25℃下进行磁力搅拌24小时，将搅拌后的混合液以5000rpm转速进行离心处理20min，用磷酸盐缓冲液洗涤游离盐酸阿霉素。最后对负载了盐酸阿霉素的接枝上透明质酸的壳聚糖修饰羧基碳纳米管进行真空干燥，得到最终负载药物的纳米靶向缓控释系统。

实施例4得到的负载阿霉素后的壳聚糖透明质酸的改性多壁碳纳米管抗癌药物靶向缓控释载体具有较好的水溶性，载药率较单壁碳纳米管稍大，可达121.35±1.64％。

Claims (10)

1.一种纳米靶向缓控释系统的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

步骤(a)：将羧基碳纳米管分散于超纯水中，加入壳聚糖溶液后进行超声处理，然后进行磁力搅拌处理，将搅拌后的混合液透析，真空干燥透析后的产物，得到壳聚糖包裹后的羧基碳纳米管；

步骤(b)：将壳聚糖包裹后的羧基碳纳米管分散于磷酸缓冲液中，加入经1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺活化后的透明质酸溶液进行超声处理，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺进行磁力搅拌处理，将搅拌后的混合液透析，真空干燥透析后的产物，得到接枝上透明质酸的壳聚糖修饰羧基碳纳米管；

步骤(c)：将接枝上透明质酸后的壳聚糖修饰羧基碳纳米管分散于磷酸缓冲液中，加入蒽环类药物，超声处理，然后进行磁力搅拌处理，将搅拌后的混合液进行离心处理，用磷酸缓冲液洗涤游离蒽环类药物，最后对负载了药物的接枝上透明质酸的壳聚糖修饰羧基碳纳米管进行真空干燥，得到最终负载药物的纳米靶向缓控释系统。

2.如权利要求1所述的纳米靶向缓控释系统的制备方法，其特征在于：所述碳纳米管为单壁羧基碳纳米管或多壁羧基碳纳米管。

3.如权利要求1所述的纳米靶向缓控释系统的制备方法，其特征在于：所述羧基碳纳米管水分散液浓度为1～10mg/ml。

4.如权利要求1所述的纳米靶向缓控释系统的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖溶液浓度要求为1～10mg/ml。

5.如权利要求1所述的纳米靶向缓控释系统的制备方法，其特征在于：所述透明质酸溶液浓度要求为1～10mg/ml。

6.如权利要求1所述的纳米靶向缓控释系统的制备方法，其特征在于：所述壳聚糖与羧基碳纳米管的质量比为1：1～1：10，所述透明质酸与壳聚糖改性后的羧基碳纳米管质量比为1：1～1：10。

7.如权利要求1所述的纳米靶向缓控释系统的制备方法，其特征在于：所述蒽环类药物为阿霉素或者表阿霉素或者盐酸阿霉素，所述蒽环类药物浓度为1～10mg/ml。

8.如权利要求1所述的纳米靶向缓控释系统的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)、(b)、(c)中超声处理为20KHZ～100KHZ的频率的超声波处理10～60min，所述的搅拌处理是在20～37℃下搅拌12～36小时，所述真空干燥温度为20～40℃。

9.如权利要求1所述的纳米靶向缓控释系统的制备方法，其特征在于：所述透析处理用透析袋分子截留量为1000～20000Da。

10.如权利要求1所述的纳米靶向缓控释系统的制备方法，其特征在于：所述步骤(c)中离心处理所用转速为1000～5000rpm。