CN103110955A - 纳米药物载体、还原响应的纳米药物颗粒与纳米药物颗粒制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及纳米药物载体、还原响应的纳米药物颗粒与纳米药物颗粒制剂及其制备方法。该纳米药物载体包括多糖形成的主链和形成在所述主链上的由聚乙烯亚胺形成的侧链。这种特性使得使用该纳米药物载体负载药物时，药物通过二硫键（-SS-）与该纳米药物载体连接，二硫键在还原环境的细胞内断键而将药物较好地释放于靶点部位。

Description

纳米药物载体、还原响应的纳米药物颗粒与纳米药物颗粒制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种纳米药物载体、还原响应的纳米药物颗粒与纳米药物颗粒制剂及其制备方法。

背景技术

纳米药物载体通常是指可以负载一种或多种药物的具有纳米级尺寸的体系。由于其具有量子尺寸效应、兼有比表面积大、易于表面修饰等优点，因此在药物传输、控释方面具有诸多优越性。通常纳米药物载体有脂质体、聚合物胶束、树枝状聚合物、碳纳米管、量子点等多种形式。

现有的纳米药物载体仍然存在许多不足，如生物相容性不好、在血液循环中泄露较严重、不能很好的实现溶酶体逃逸、在靶点部位药物释放困难、不能同时负载多种小分子药物、基因和蛋白等，这些缺点的存在很大程度上限制了纳米载体的广泛应用。药物在靶点部位释放是药物发挥药效的关键，如果药物到达靶点部位后不能很好的释放，则会使药物无法发挥药效。因此，刺激响应释放的共价体系受到广泛的关注，其中pH响应和酶响应研究最为广泛，而还原敏感体系则鲜有研究。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够还原条件下使药物在靶点部位较好释放的纳米药物载体。

进一步，提供一种使用该纳米药物载体的还原响应的纳米药物颗粒。

还提供一种还原响应的纳米药物颗粒制剂及其制备方法。

一种纳米药物载体，包括多糖形成的主链和形成在所述主链上的由聚乙烯亚胺形成的侧链。

在其中一个实施例中，所述多糖选自葡聚糖、果胶、普鲁兰多糖、羟乙基纤维素、改性壳聚糖及环糊精中的一种。

在其中一个实施例中，所述聚乙烯亚胺的分子量为600~2000。

在其中一个实施例中，所述多糖与所述聚乙烯亚胺的质量比为1:0.1~0.6。

一种还原响应的纳米药物颗粒，包括阿霉素及上述纳米药物载体，其中，所述聚乙烯亚胺与所述阿霉素形成疏水内核，所述多糖包覆在所述疏水内核的表面形成亲水外壳。

在其中一个实施例中，还包括包裹于所述亲水外壳内部的紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述阿霉素、所述紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种与所述纳米药物载体的质量比为0.05~0.4:0.01~0.2:1。

在其中一个实施例中，还包括吸附于所述聚乙烯亚胺上的基因物质和蛋白质分子中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述阿霉素、所述紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种、所述纳米药物载体与所述基因物质和蛋白质分子中的至少一种的质量比为0.05~0.4:0.01~0.2:1:0.01~0.2。

在其中一个实施例中，所述基因物质选自抑癌基因、自杀基因、小分子干扰核糖核酸、信使核糖核酸及反义核酸中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述还原响应的纳米药物颗粒的粒径为100纳米~200纳米。

一种还原响应的纳米药物颗粒制剂，包括超纯水及分散于所述超纯水中的上述还原响应的纳米药物颗粒，所述还原响应的纳米药物颗粒的浓度为1mg/mL。

一种还原响应的纳米药物颗粒制剂的制备方法，包括如下步骤：

将多糖、对硝基氯甲酸苯酯及4-二甲氨基吡啶溶于二甲基亚砜与吡啶的混合液中，冰浴反应4小时，沉淀、离心收集、真空干燥，得到对硝基氯甲酸苯酯活化多糖；

将所述对硝基氯甲酸苯酯活化多糖溶于超纯水中，滴入聚乙烯亚胺，反应12小时~24小时，透析冻干得到纳米药物载体，所述纳米药物载体为以多糖为主链，聚乙烯亚胺为侧链接枝在所述多糖上；

将阿霉素与二硫代二丙酸酐溶于N,N-二甲基甲酰胺中得到混合物，反应12小时~24小时，向反应后的混合物中加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行活化4小时，然后加入所述纳米药物载体，反应24小时，透析得到浓度为1mg/mL还原响应的纳米药物颗粒制剂。

在其中一个实施例中，还包括加入紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种的步骤，所述步骤为：将紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种溶于二甲基亚砜中得到药物混合液，将所述药物混合液与所述浓度为1mg/mL还原响应的纳米药物颗粒制剂混合后进行超声处理10分钟，透析1~2天；其中，所述紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种与所述还原响应的纳米药物颗粒制剂中的还原响应的纳米药物颗粒的质量比为0.01~0.2:1。

在其中一个实施例中，还包括加入基因物质及蛋白质分子中的至少一种的步骤，所述步骤为基因物质及蛋白质分子中的至少一种加入所述浓度为1mg/mL还原响应的纳米药物颗粒制剂中，于37℃孵育30分钟；其中，所述基因物质及蛋白质分子中的至少一种与所述还原响应的纳米药物颗粒制剂中的还原响应的纳米药物颗粒的质量比为0.01~0.2:1。

上述纳米药物载体为以多糖为主链，聚乙烯亚胺为侧链接枝在多糖上。这种特性使得使用该纳米药物载体负载药物时，药物通过二硫键（-SS-）与该纳米药物载体连接，二硫键在还原环境的细胞内断键而将药物较好地释放于靶点部位。

附图说明

图1为一实施方式的还原响应的纳米药物颗粒的结构示意图；

图2为一实施方式的还原响应的纳米药物颗粒的还原环境和非还原环境下的状态图；

图3为一实施方式的还原响应的纳米药物颗粒制剂的制备方法流程图；

图4为图3所示的还原响应的纳米药物颗粒制剂的制备方法示意图；

图5为实施例1的还原响应的纳米药物颗粒的粒径分布图；

图6为实施例1的还原响应的纳米药物颗粒的TEM图；

图7为实施例1的还原响应的纳米药物颗粒制剂的阿霉素分别在还原剂环境和无还原剂环境下的释放曲线；

图8(a)~图8(d)为实施例1的还原响应的纳米药物颗粒制剂的的共聚焦实验结果图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一实施方式的纳米药物载体，以多糖为主链，以聚乙烯亚胺（PEI）为侧链接枝在多糖主链上，表示为多糖-PEI。

将该纳米药物载体通过化学键连接药物，得到的纳米药物具有还原响应。还原响应是指在还原剂存在的环境下，将该纳米药物载体与药物的连接的化学键发生断键而解离；在没有还原剂存在的环境下，化学键不会发生断键。

多糖为天然多糖。天然多糖具有生物相容性好、安全可靠、来源广泛、价格低廉、可生物降解、易于修饰等众多优点，是一类具有很好应用前景的生物可降解聚合物。

优选地，多糖选自葡聚糖(Dextran)、果胶(Pectin)、普鲁兰多糖(Pulullan)、羟乙基纤维素(hydroxyethyl cellulose)、改性壳聚糖及环糊精（Cyclodextrin）中的一种。这几种多糖均为水溶性多糖，利于制备水溶性制剂。

聚乙烯亚胺用于实现药物快速从溶酶体逃逸到细胞质，使药物免受溶酶体内各种酶及酸性环境的破坏，利于药效发挥。

优选地，聚乙烯亚胺的分子量为600~2000。分子量为600~2000的聚乙烯亚胺的毒性较小。

多糖与聚乙烯亚胺的质量比为1:0.1~0.6。

使用该纳米药物载体负载药物，药物通过二硫键（-SS-）与该纳米药物载体连接。血液循环系统中，还原剂谷胱甘肽（GSH）很微量，浓度很低，这种情况下纳米药物载体负载的药物很稳定；到达靶点部位，进入细胞后，GSH含量比较高，约是血液中的1000倍，二硫键被打断，药物释放于靶向部位。

使用上述纳米药物载体负载药物，可实现在血液循环中药物基本无释放，到达肿瘤部位后通过快速内吞、溶酶体逃逸到达细胞质，然后通过还原响应刺激快速释放药物，使药物在靶点部位较好释放，发挥药效。

上述纳米药物载体在血液循环中不会快速泄露，不会产生明显毒副作用；可实现溶酶体逃逸，保护药物活性，使药物到达靶向部位时具有较高的活性；具有还原响应性，可在细胞浆还原条件下，实现药物的快速释放；可同时负载蛋白、基因等多种物质，进行协调传递；可同时负载两种不同的疏水药物，进行协同治疗。因此，该纳米药物载体是一种性能优良的纳米药物载体。

一实施方式的还原响应的纳米药物颗粒，包括阿霉素（DOX）及上述纳米药物载体。其中，阿霉素与上述纳米药物载体的质量比为0.3:1。请参阅图1，阿霉素通过二硫键（-SS-）与上述纳米药物载体连接，聚乙烯亚胺与阿霉素形成疏水内核，多糖包覆在疏水内核的表面形成亲水外壳。

优选地，还原响应的纳米药物颗粒的粒径为100纳米~200纳米。

优选地，该还原响应的纳米药物颗粒还包括包裹于亲水外壳内部的紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种。这几种药物为疏水性药物。紫杉醇、喜树碱及改性顺铂是具有治疗癌症疗效的物质，紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种通过疏水作用包裹于亲水外壳的内部，可以实现多种药物协调治疗。

阿霉素与紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种及纳米药物载体的质量比为0.05~0.4:0.01~0.2:1。

该多糖-药物共价纳米体系带有很强的正电荷，可同时包载蛋白质分子、基因等物质，实现协同传递。

优选地，该还原响应的纳米药物颗粒还包括吸附于聚乙烯亚胺上的基因物质和蛋白质分子中的至少一种。基因物质和蛋白质分子中的至少一种通过静电吸引吸附于聚乙烯亚胺上，包裹于亲水外壳的内部。图1表示包括基因物质的纳米药物颗粒的结构。

优选地，基因物质选自抑癌基因、自杀基因、小分子干扰核糖核酸（SiRNA）、信使核糖核酸（mRNA）及反义核酸中的至少一种。

蛋白质分子为牛血清蛋白（BSA）、鸡卵白蛋白（OVA）或其他具有治疗效果的蛋白分子。

优选地，阿霉素与紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种、纳米药物载体与基因物质和蛋白质分子中的至少一种的质量比为0.05~0.4:0.01~0.2:1:0.01~0.2。

请参阅图2，在还原剂谷胱甘肽（GSH）存在的环境下，该纳米药物颗粒的二硫键断裂，使还原响应的纳米药物颗粒解离，从而将药物阿霉素和基因物质释放。而在没有还原剂谷胱甘肽（GSH）的环境下，该还原响应的纳米药物颗粒的结构保持完整，药物活性得到最大程度的保持。

因此，该还原响应的纳米药物颗粒中的多糖与阿霉素形成多糖-药物共价纳米体系，可实现在血液循环中药物基本无释放，到达肿瘤部位后通过快速内吞、溶酶体逃逸到达细胞质，然后通过还原响应刺激使还原响应的纳米药物颗粒解离而快速释放药物，能够使药物在靶点部位较好释放，发挥药效。

该多糖-药物共价纳米体系是前药胶束结构，可同时包载其他小分子疏水药物，实现多种药物协同治疗。

一实施方式的还原响应的纳米药物颗粒制剂，包括超纯水及分散于超纯水中的上述还原响应的纳米药物颗粒，还原响应的纳米药物颗粒的浓度为1mg/mL。

经测定，该还原响应的纳米药物颗粒制剂的Zeta电位大小为+30mV~+50mV，说明该还原响应的纳米药物颗粒制剂性质较为稳定。

使用该还原响应的纳米药物颗粒制剂进行治疗，可实现在血液循环中药物基本无释放，到达肿瘤部位后通过还原响应刺激快速释放药物，使药物在靶点部位较好释放，治疗效果好。

并且，该还原响应的纳米药物颗粒制剂可实现多种药物的协调治疗和基因物质和蛋白质分子的协调传递，疗效好。

请参阅图3，一实施方式的还原响应的纳米药物颗粒制剂的制备方法，包括如下步骤：

步骤S110：将多糖、对硝基氯甲酸苯酯及4-二甲氨基吡啶溶于二甲基亚砜与吡啶的混合液中，冰浴反应4小时，沉淀、离心收集、真空干燥，得到对硝基氯甲酸苯酯活化多糖。

多糖选自葡聚糖、果胶、普鲁兰多糖、羟乙基纤维素、改性壳聚糖及环糊精中的一种。

二甲基亚砜与吡啶的混合液中，二甲基亚砜与吡啶的体积比为1:1。

多糖、对硝基氯甲酸苯酯、4-二甲氨基吡啶与二甲基亚砜与吡啶的混合液的固液比为1g:0.7g:0.05g:40mL。

对多糖进行活化，生成对硝基氯甲酸苯酯活化多糖，以便于后续反应，使聚乙烯亚胺接枝于多糖上。

步骤S120：将对硝基氯甲酸苯酯活化多糖溶于超纯水中，滴入聚乙烯亚胺，反应12小时~24小时，透析冻干得到纳米药物载体，纳米药物载体为以多糖为主链，聚乙烯亚胺为侧链接枝在多糖上。

对硝基氯甲酸苯酯活化多糖、超纯水与聚乙烯亚胺的固液比为0.5g:40mL:5g。

步骤S130：将阿霉素与二硫代二丙酸酐溶于溶剂中得到混合物，反应12小时~24小时，向反应后的混合物中加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行活化4小时，然后加入纳米药物载体，反应24小时，透析得到浓度为1mg/mL的还原响应的纳米药物颗粒制剂。

溶剂选自乙醚、丙酮、乙醇、甲醇、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮的一种或两种以上的任意混合。

阿霉素、二硫代二丙酸酐与溶剂的固液比为0.15g:0.05g:30mL。

阿霉素、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）的质量比为5:4:6。加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行活化的目的是活化改性后的阿霉素的羧基，从而跟聚乙烯亚胺的氨基反应。

阿霉素与纳米药物载体的质量比为0.3:1。

用截留分子量为3500的透析袋、用超纯水透析1~2天，充分除去有机溶剂、杂质及游离的阿霉素后，得到浓度为1mg/mL的还原响应的纳米药物颗粒制剂。

请参阅图4，上述还原响应的纳米药物颗粒制剂的制备方法用聚乙烯亚胺（PEI）对多糖进行改性，聚乙烯亚胺接枝于多糖上形成纳米药物载体，然后通过二硫键（-SS-）与抗肿瘤药物阿霉素（DOX）连接，表示为（多糖-PEI(-SS-DOX)），在水中自组装形成粒径均一、性质稳定的还原响应的纳米药物颗粒。该纳米药物颗粒溶于超纯水中，得到浓度为1mg/mL的还原响应的纳米药物颗粒制剂。

该粒径均一、性质稳定的还原响应的纳米药物颗粒中，聚乙烯亚胺与阿霉素形成疏水内核，多糖包覆在疏水内核的表面形成亲水外壳。

上述还原响应的纳米药物颗粒制剂的制备方法工艺简单，反应条件温和。

优选地，上述还原响应的纳米药物颗粒制剂的制备方法还包括加入紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种的步骤。

该步骤具体为：将紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种溶于二甲基亚砜中得到药物混合液，将药物混合液与浓度为1mg/mL还原响应的纳米药物颗粒制剂混合后进行超声处理10分钟，使紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种通过疏水作用包裹于纳米药物载体的亲水外壳内部，然后用超纯水透析1~2天，除去游离的药物、杂质及有机溶剂，得到可以进行多种药物协同的治疗的还原响应的纳米药物颗粒制剂。

其中，紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种与还原响应的纳米药物颗粒制剂中的还原响应的纳米药物颗粒的质量比为0.01~0.2:1。

优选用截留分子量3500的透析袋进行透析，以得到纯净度较高的还原响应的纳米药物颗粒制剂。

优选地，上述还原响应的纳米药物颗粒制剂的制备方法还包括加入基因物质及蛋白质分子中的至少一种的步骤。

该步骤具体为：将基因物质及蛋白质分子中的至少一种加入上述浓度为1mg/mL还原响应的纳米药物颗粒制剂中，于37℃孵育30分钟，使基因物质或蛋白质分子中的至少一种通过静电作用吸附于疏水内核上，得到可以将基因物质与蛋白质分子中的至少一种协同传递，协同治疗的还原响应的纳米药物颗粒制剂，图4表示了基因物质吸附的状态。

其中，基因物质及蛋白质分子中的至少一种与还原响应的纳米药物颗粒制剂中的还原响应的纳米药物颗粒的质量比为0.01~0.2:1。

以下为具体实施例。

实施例1

(1)将1g葡聚糖、0.7g对硝基氯甲酸苯酯及0.05g 4-二甲氨基吡啶溶于40ml二甲基亚砜与吡啶的混合液中（二甲基亚砜与吡啶的体积比为1:1），冰浴反应4h，沉淀、离心收集、真空干燥，得对硝基氯甲酸苯酯活化葡聚糖；

(2)将0.5g对硝基氯甲酸苯酯活化葡聚糖溶于40ml水中，滴入5g聚乙烯亚胺，反应过夜，用超纯水透析，冻干得纳米药物载体—聚乙烯亚胺接枝葡聚糖，表示为dextran-PEI；

(3)将0.15g阿霉素与0.05g二硫代二丙酸酐溶于30mL N,N-二甲基甲酰胺中得到混合物，反应12小时，加入0.12gN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、0.18g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）活化4小时，加入0.6g dextran-PEI，反应24小时，用超纯水透析得到还原响应的纳米药物颗粒制剂，该还原响应的纳米药物颗粒制剂包括超纯水及溶解于超纯水中的还原响应的纳米药物颗粒。还原响应的纳米药物颗粒的浓度为1mg/mL。还原响应的纳米药物颗粒包括阿霉素（DOX）及dextran-PEI，其中，dextran-PEI中的聚乙烯亚胺（PEI）与阿霉素（DOX）形成疏水内核，葡聚糖（dextran）包覆在疏水内核的表面形成亲水外壳。

通过动态光散射表征了该该还原响应的纳米药物颗粒制剂中的还原响应的纳米药物颗粒的平均粒径为110nm，如图5和图6所示。Zeta电位为+30mV。

经测定，纳米药物载体—聚乙烯亚胺接枝葡聚糖（dextran-PEI）对阿霉素包载量高达28%。

以二硫苏糖醇（DTT）作为还原剂，在10mM的DTT环境下，阿霉素（DOX）可快速释放；在没有还原剂的环境下，阿霉素（DOX）基本无释放，如图7所示。

将上述还原响应的纳米药物颗粒制剂进行共聚焦实验，实验表明，还原响应的纳米药物颗粒制剂基本与溶酶体无共定位，如图8（a）~图8（d）所示，表明有效的溶酶体逃逸。

实施例2

(1)将1g葡聚糖、0.7g对硝基氯甲酸苯酯及0.05g 4-二甲氨基吡啶溶于40ml二甲基亚砜与吡啶的混合液中（二甲基亚砜与吡啶的体积比为1:1），冰浴反应4h，沉淀、离心收集、真空干燥，得对硝基氯甲酸苯酯活化葡聚糖；

(2)将0.5g对硝基氯甲酸苯酯活化葡聚糖溶于40ml水中，滴入5g聚乙烯亚胺，反应过夜，用超纯水透析，冻干得纳米药物载体—聚乙烯亚胺接枝葡聚糖，表示为dextran-PEI；

(3)将0.15g阿霉素与0.05g二硫代二丙酸酐溶于30mL N,N-二甲基甲酰胺中得到混合物，反应24小时，加0.12gN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、0.18g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）活化4小时，加入0.6g dextran-PEI，反应24小时，用超纯水透析得到还原响应的纳米药物颗粒制剂，该还原响应的纳米药物颗粒制剂包括超纯水及溶解于超纯水中的还原响应的纳米药物颗粒。还原响应的纳米药物颗粒的浓度为1mg/mL。还原响应的纳米药物颗粒包括阿霉素（DOX）及dextran-PEI，其中，dextran-PEI中的聚乙烯亚胺（PEI）与阿霉素（DOX）形成疏水内核，葡聚糖（dextran）包覆在疏水内核的表面形成亲水外壳；

(4)将紫杉醇溶于二甲基亚砜中得到浓度为2mg/mL的药物混合液，将1mL药物混合液与5mL还原响应的纳米药物颗粒制剂进行混合后超声处理10min，使紫杉醇通过疏水作用包裹于亲水外壳的内部，然后将超声处理后的混合物放入截留分子量为3500的透析袋中，用超纯水透析2天，除去游离的药物、杂质及有机溶剂，得到紫杉醇与阿霉素联合治疗的还原响应的纳米药物颗粒制剂。

实施例3

(1)将1g果胶、0.7g对硝基氯甲酸苯酯及0.05g 4-二甲氨基吡啶溶于40ml二甲基亚砜与吡啶的混合液中（二甲基亚砜与吡啶的体积比为1∶1），冰浴反应4h，沉淀、离心收集、真空干燥，得对硝基氯甲酸苯酯活化果胶；

(2)将0.5g对硝基氯甲酸苯酯活化果胶溶于40ml水中，滴入5g聚乙烯亚胺，反应过夜，用超纯水透析，冻干得纳米药物载体—聚乙烯亚胺接枝果胶，表示为Pectin-PEI；

(3)将0.15g阿霉素与0.05g二硫代二丙酸酐溶于30mL N,N-二甲基甲酰胺中得到混合物，反应20小时，加0.12gN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、0.18g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）活化4小时，加入0.6g Pectin-PEI，反应24小时，用超纯水透析得到还原响应的纳米药物颗粒制剂，该还原响应的纳米药物颗粒制剂包括超纯水及溶解于超纯水中的还原响应的纳米药物颗粒。还原响应的纳米药物颗粒的浓度为1mg/mL。还原响应的纳米药物颗粒包括阿霉素（DOX）及Pectin-PEI，其中，Pectin-PEI中的聚乙烯亚胺（PEI）与阿霉素（DOX）形成疏水内核，果胶（Pectin）包覆在疏水内核的表面形成亲水外壳；

(4)将喜树碱溶于二甲基亚砜中得到浓度为2mg/mL的药物混合液，将1mL药物混合液与5mL上述还原响应的纳米药物颗粒制剂进行混合后超声处理10min，使喜树碱通过疏水作用包裹于亲水外壳的内部，然后将超声处理后的混合物放入截留分子量3500的透析袋中，用超纯水水透析2天，除去游离的药物、杂质及有机溶剂，得到喜树碱与阿霉素联合治疗的还原响应的纳米药物颗粒制剂。

(5)小分子干扰核糖核酸（SiRNA）加入上述喜树碱与阿霉素联合治疗的还原响应的纳米药物颗粒制剂中，小分子干扰核糖核酸（SiRNA）与喜树碱的质量比为1:1，于37℃孵育30分钟，使小分子干扰核糖核酸（SiRNA）通过静电作用吸附于疏水内核的PEI上，得到可以将小分子干扰核糖核酸（SiRNA）、喜树碱及阿霉素协同传递，协同治疗的的还原响应的纳米药物颗粒制剂。

实施例4

(1)将1g普鲁兰多糖、0.7g对硝基氯甲酸苯酯及0.05g 4-二甲氨基吡啶溶于40ml二甲基亚砜与吡啶的混合液中（二甲基亚砜与吡啶的体积比为1:1），冰浴反应4h，沉淀、离心收集、真空干燥，得对硝基氯甲酸苯酯活化普鲁兰多糖；

(2)将0.5g对硝基氯甲酸苯酯活化普鲁兰多糖溶于40ml水中，滴入5g聚乙烯亚胺，反应过夜，用超纯水透析，冻干得纳米药物载体—聚乙烯亚胺接枝普鲁兰多糖，表示为Pullulan-PEI；

(3)将0.15g阿霉素与0.05g二硫代二丙酸酐溶于30mL N,N-二甲基甲酰胺中得到混合物，反应18小时，加0.12gN-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、0.18g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）活化4小时，加入0.6g Pullulan-PEI，反应24小时，用超纯水透析得到还原响应的纳米药物颗粒制剂，该还原响应的纳米药物颗粒制剂包括超纯水及溶解于超纯水中的还原响应的纳米药物颗粒。还原响应的纳米药物颗粒的浓度为1mg/mL。还原响应的纳米药物颗粒包括阿霉素（DOX）及Pullulan-PEI，其中，Pullulan-PEI中的聚乙烯亚胺（PEI）与阿霉素（DOX）形成疏水内核，普鲁兰多糖（Pullulan）包覆在疏水内核的表面形成亲水外壳。

(4)按质量比为5:1分别将喜树碱和紫杉醇溶于二甲基亚砜中得到浓度为2mg/mL的药物混合液，将1mL药物混合液与5mL上述还原响应的纳米药物颗粒制剂进行混合后超声处理10min，使喜树碱和紫杉醇通过疏水作用包裹于亲水外壳的内部，然后将超声处理后的混合物放入截留分子量3500的透析袋中，用超纯水透析2天，除去游离的药物、杂质及有机溶剂，得到喜树碱、紫杉醇与阿霉素联合治疗的还原响应的纳米药物颗粒制剂。

(5)将信使核糖核酸（mRNA）和牛血清蛋白质加入上述浓度为1mg/mL还原响应的纳米药物颗粒制剂中（信使核糖核酸（mRNA）和牛血清蛋白质的质量之和与喜树碱和紫杉醇的质量之和的比值为1∶1），于37℃孵育30分钟，使信使核糖核酸（mRNA）和牛血清蛋白质通过静电作用吸附于疏水内核的PEI上，得到可以将信使核糖核酸（mRNA）、牛血清蛋白质、喜树碱、紫杉醇及阿霉素协同传递，协同治疗的还原响应的纳米药物颗粒制剂。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (15)

1.一种纳米药物载体，其特征在于，包括多糖形成的主链和形成在所述主链上的由聚乙烯亚胺形成的侧链。

2.根据权利要求1所述的纳米药物载体，其特征在于，所述多糖选自葡聚糖、果胶、普鲁兰多糖、羟乙基纤维素、改性壳聚糖及环糊精中的一种。

3.根据权利要求1所述的纳米药物载体，其特征在于，所述聚乙烯亚胺的分子量为600~2000。

4.根据权利要求1所述的纳米药物载体，其特征在于，所述多糖与所述聚乙烯亚胺的质量比为1:0.1~0.6。

5.一种还原响应的纳米药物颗粒，其特征在于，包括阿霉素及如权利要求1~4任一项所述的纳米药物载体，其中，所述聚乙烯亚胺与所述阿霉素形成疏水内核，所述多糖包覆在所述疏水内核的表面形成亲水外壳。

6.根据权利要求5所述的还原响应的纳米药物颗粒，其特征在于，还包括包裹于所述亲水外壳内部的紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的还原响应的纳米药物颗粒，其特征在于，所述阿霉素、所述紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种与所述纳米药物载体的质量比为0.05~0.4:0.01~0.2:1。

8.根据权利要求6所述的还原响应的纳米药物颗粒，其特征在于，还包括吸附于所述聚乙烯亚胺上的基因物质和蛋白质分子中的至少一种。

9.根据权利要求8所述的还原响应的纳米药物颗粒，其特征在于，所述阿霉素、所述紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种、所述纳米药物载体与所述基因物质和蛋白质分子中的至少一种的质量比为0.05~0.4:0.01~0.2:1:0.01~0.2。

10.根据权利要求8或9所述的还原响应的纳米药物颗粒，其特征在于，所述基因物质选自抑癌基因、自杀基因、小分子干扰核糖核酸、信使核糖核酸及反义核酸中的至少一种。

11.根据权利要求5所述的还原响应的纳米药物颗粒，其特征在于，所述还原响应的纳米药物颗粒的粒径为100纳米~200纳米。

12.一种还原响应的纳米药物颗粒制剂，其特征在于，包括超纯水及分散于所述超纯水中的如权利要求5所述的还原响应的纳米药物颗粒，所述还原响应的纳米药物颗粒的浓度为1mg/mL。

13.一种还原响应的纳米药物颗粒制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将多糖、对硝基氯甲酸苯酯及4-二甲氨基吡啶溶于二甲基亚砜与吡啶的混合液中，冰浴反应4小时，沉淀、离心收集、真空干燥，得到对硝基氯甲酸苯酯活化多糖；

将所述对硝基氯甲酸苯酯活化多糖溶于超纯水中，滴入聚乙烯亚胺，反应12小时~24小时，透析冻干得到纳米药物载体，所述纳米药物载体为以多糖为主链，聚乙烯亚胺为侧链接枝在所述多糖上；

将阿霉素与二硫代二丙酸酐溶于N,N-二甲基甲酰胺中得到混合物，反应12小时~24小时，向反应后的混合物中加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行活化4小时，然后加入所述纳米药物载体，反应24小时，透析得到浓度为1mg/mL还原响应的纳米药物颗粒制剂。

14.根据权利要求13所述的还原响应的纳米药物颗粒制剂的制备方法，其特征在于，还包括加入紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种的步骤，所述步骤为：将紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种溶于二甲基亚砜中得到药物混合液，将所述药物混合液与所述浓度为1mg/mL还原响应的纳米药物颗粒制剂混合后进行超声处理10分钟，透析1~2天；其中，所述紫杉醇、喜树碱及改性顺铂中的至少一种与所述还原响应的纳米药物颗粒制剂中的还原响应的纳米药物颗粒的质量比为0.01~0.2:1。

15.根据权利要求13或14所述的还原响应的纳米药物颗粒制剂的制备方法，其特征在于，还包括加入基因物质及蛋白质分子中的至少一种的步骤，所述步骤为基因物质及蛋白质分子中的至少一种加入所述浓度为1mg/mL还原响应的纳米药物颗粒制剂中，于37℃孵育30分钟；其中，所述基因物质及蛋白质分子中的至少一种与所述还原响应的纳米药物颗粒制剂中的还原响应的纳米药物颗粒的质量比为0.01~0.2:1。

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