CN113501889A - 一种三七多糖阳离子衍生物的制备方法及其应用 - Google Patents

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G83/00—Macromolecular compounds not provided for in groups C08G2/00 - C08G81/00

Abstract

本发明涉及三七多糖阳离子衍生物的制备方法及其应用，可有效解决肿瘤基因治疗药物的问题，其解决的技术方案是，该三七多糖阳离子衍生物是经化学键在三七多糖上接枝聚乙烯亚胺或氮丙啶构成，本发明制备方法简便，原料来源广泛，成本低廉，极具开发和应用前景，制备得到的三七多糖阳离子衍生物结构稳定且具有良好的生物相容性，能够高效负载核酸类抗肿瘤药物并携带其进入细胞，从而实现在肿瘤治疗药物递送中的应用，是肿瘤基因治疗药物递送载体上的创新。

Description

一种三七多糖阳离子衍生物的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种三七多糖阳离子衍生物的制备方法及其应用。
背景技术
近年来，基因治疗在临床上取得了很大进展，然而目前基因治疗仍面临着很多挑战，其中最大的挑战就是开发安全高效的基因载体。多糖不仅具有生物安全性好等特点，而且结构中包括大量活性基团（羟基、氨基和羧酸基团等），易于进行结构修饰。因此，以多糖为骨架，经阳离子聚合物修饰的纳米载体是一种安全、高效的基因载体（Advanced DrugDelivery Reviews，2013，65：1123），已被广泛应用在肿瘤基因治疗领域，且被证实能够有效提高肿瘤治疗效果（Current Pharmaceutical Design，2018，24：3303）。因此，开发基于多糖的新型基因载体对于肿瘤基因治疗具有重要意义。
三七多糖是从我国名贵中药材三七中提取分离得到的多糖成分，安全低毒且价格低廉、制备工艺简单易行。三七多糖主要由葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成（食品科学技术学报，2018，2：63），其主链主要由葡萄糖和半乳糖组成；支链由阿拉伯糖和半乳糖组成，具有免疫调节（International Journal of Biological Macromolecules，2020，161：797）、抗氧化（Nat. Prod，2008，71：241）、抗衰老（Process Biochemistry，2019，78：189）及抗炎（Modern Food Science and Technology，2019，09：74）等多种活性。研究报道，三七多糖还具有潜在的抗肿瘤活性（Onco Targets Ther，2016，9：3433）（Carbohydrate Polymers，2015，121：328），这提示了三七多糖应用于肿瘤免疫治疗的巨大潜力。此外，在三七多糖的分子结构中含有大量活性基团-OH、-COOH，可以通过化学改性饰实现其不同的生物学活性及功能。因此，通过对三七多糖进行阳离子化修饰，不仅可以实现基因递送的功能，并且能够保留其良好的免疫活性和潜在的抗肿瘤活性，但是至今未见到有关三七多糖阳离子衍生物的制备及其作为基因递送载体在肿瘤治疗领域的公开报道。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种三七多糖阳离子衍生物的制备方法及其应用，可有效解决肿瘤基因治疗药物的问题。
本发明解决的技术方案是，该三七多糖阳离子衍生物是经化学键在三七多糖上接枝聚乙烯亚胺或氮丙啶构成，三七多糖分子量为2.0×104-3.0×106Da，聚乙烯亚胺分子量为600-2500Da。
该三七多糖阳离子衍生物的制备方法，具体包括以下步骤：
1）活化三七多糖：
将50-250mg三七多糖溶解于10-25mL去离子水或二甲基亚砜中，室温（23℃±2℃），氮气保护条件下与70-350mg活化试剂A避光反应4-48h，将反应液于去离子水中透析2-3d，得活化的三七多糖反应液；所述的活化试剂A为N,N'-羰基二咪唑、高碘酸钾、乙二胺、含有3-5%乙二胺的二磷酸盐缓冲液、三乙胺中一种或两种以上；
或在50℃条件下，将50-250mg三七多糖溶解于10-25mL去离子水或二甲基亚砜中，然后加入100-600mg活化试剂B反应4-24h，得活化的三七多糖反应液；所述的活化试剂B为琥珀酸酐、马来酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺、4-二甲氨基吡啶、1-乙基（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐中的一种或两种以上；
2）三七多糖阳离子衍生物：
将上述活化后的三七多糖反应液溶于15-30mL超纯水中，再加入含有100-500mg聚乙烯亚胺的2-10mL二甲基亚砜溶液，然后在氮气保护下避光反应12-48h，于去离子水中透析2-3d，冷冻干燥，得聚乙烯亚胺修饰的三七多糖，即三七多糖阳离子衍生物；
或向上述活化三七多糖溶液中加入含有0.5-1mL氮丙啶或含有100-500mg聚乙烯亚胺的5-10mL摩尔浓度为1mol/L的HCl溶液，50℃条件下搅拌反应1-3d，于去离子水中透析2-3d，冷冻干燥，得三七多糖阳离子衍生物。
所述的三七多糖阳离子衍生物在制备肿瘤基因治疗药物递送载体中的应用。
所述的肿瘤基因治疗药物为装载有治疗基因的质粒、装载有治疗基因的病毒载体DNA、反义寡核苷酸、小干扰RNA中的一种或几种。
本发明制备方法简便，原料来源广泛，成本低廉，极具开发和应用前景，制备得到的三七多糖阳离子衍生物结构稳定且具有良好的生物相容性，能够高效负载核酸类抗肿瘤药物并携带其进入细胞，从而实现在肿瘤治疗药物递送中的应用，是肿瘤基因治疗药物递送载体上的创新。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本发明在具体实施中，该三七多糖阳离子衍生物制备方法具体包括以下步骤：
1）活化三七多糖：
将50mg三七多糖溶解于10mL二甲基亚砜中，加入70mg N,N'-羰基二咪唑和30μL三乙胺，室温，氮气保护条件下避光反应4h，将反应液于去离子水中透析2d，得活化的三七多糖反应液；
2）三七多糖阳离子衍生物：
将上述活化后的三七多糖反应液溶于15mL超纯水中，再加入含有100mg聚乙烯亚胺的2mL二甲基亚砜溶液，然后在氮气保护下避光反应24h，于去离子水中透析3d，冷冻干燥，得聚乙烯亚胺修饰的三七多糖，即三七多糖阳离子衍生物。
实施例2
本发明在具体实施中，该三七多糖阳离子衍生物制备方法具体包括以下步骤：
1）活化三七多糖：
将100mg三七多糖溶解于15mL去离子水中，搅拌条件下加入80mg高碘酸钾，室温，氮气保护条件下避光反应24h，再缓慢滴加100μL含有3-5%乙二胺的二磷酸盐缓冲液，氮气保护下避光反应24h，将反应液透析3d，得活化的三七多糖反应液；
2）三七多糖阳离子衍生物：
向上述活化三七多糖溶液中加入含有0.5mL氮丙啶的5mL摩尔浓度为1mol/L的HCl溶液，50℃条件下混合搅拌2d，于去离子水中透析3d，冷冻干燥，得三七多糖阳离子衍生物。
实施例3
本发明在具体实施中，还可包括以下步骤：
1）活化三七多糖：
将60mg三七多糖溶解于25mL二甲基亚砜中，加入80mg N,N'-羰基二咪唑和70μL乙二胺，室温，氮气保护条件下避光反应48h，将反应液于去离子水中透析3d，得活化的三七多糖反应液；
2）三七多糖阳离子衍生物：
向上述活化三七多糖溶液中加入含有480mg聚乙烯亚胺的10mL摩尔浓度为1mol/L的HCl溶液，50℃条件下搅拌反应2d，于去离子水中透析3d，冷冻干燥，得三七多糖阳离子衍生物。
实施例4
本发明在具体实施中，还可包括以下步骤：
1）活化三七多糖：
将50mg三七多糖溶解于10mL二甲基亚砜中，依次加入10mg 4-二甲氨基吡啶与200mg琥珀酸酐，在50℃搅拌12h，再依次加入30mg 1-乙基（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和15mg N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应4h，得活化的三七多糖反应液；
2）三七多糖阳离子衍生物：
将上述活化后的三七多糖反应液溶于30mL超纯水中，再加入含有100mg聚乙烯亚胺的2mL二甲基亚砜溶液，然后在氮气保护下避光搅拌24h，于去离子水中透析3d，冷冻干燥，得三七多糖阳离子衍生物。
实施例5
本发明在具体实施中，还可包括以下步骤：
1）活化三七多糖：
将100mg三七多糖溶解于15mL去离子水中，依次加入20mg 4-二甲氨基吡啶与400mg马来酸酐，在50℃搅拌16h，再依次加入60mg 1-乙基（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和30mg N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应8h，将反应液透析3d，得活化的三七多糖反应液；
2）三七多糖阳离子衍生物：
向上述活化三七多糖溶液中加入含有0.6mL氮丙啶的5mL摩尔浓度为1mol/L的HCl溶液中，50℃条件下混合搅拌2d，于去离子水中透析3d，冷冻干燥，得三七多糖阳离子衍生物。
实施例6
本发明在具体实施中，还可包括以下步骤：
1）活化三七多糖：
将60mg三七多糖溶解于25mL二甲基亚砜中，依次加入12mg 4-二甲氨基吡啶与240mg琥珀酸酐，在50℃搅拌12h，再依次加入36mg 1-乙基（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和18mg N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应6h，得活化的三七多糖反应液；
2）三七多糖阳离子衍生物：
向上述活化三七多糖溶液中加入含有480mg聚乙烯亚胺的10mL摩尔浓度为1mol/L的HCl溶液中，50℃条件下混合搅拌3d，于去离子水中透析3d，冷冻干燥，得三七多糖阳离子衍生物。
本发明制备得到的三七多糖阳离子衍生物结构稳定且具有良好的生物相容性，能够高效负载核酸类抗肿瘤药物并携带其进入细胞，从而实现在肿瘤治疗药物递送中的应用，并经多次反复实验，达到了满意的技术效果，有关试验资料如下：
实验1：核酸负载实验
取本发明实施例1-6制备的不同比例的三七多糖阳离子衍生物分别与1μg质粒室温孵育，制备不同的质量比的多糖-核酸纳米复合物。在琼脂糖凝胶上进行电泳，使用凝胶成像仪拍照并观察。结果显示，当加入6μg及以上三七多糖阳离子衍生物时，DNA条带被完全阻滞在孔道内，这说明当三七多糖阳离子衍生物与核酸的比大于或等于6:1时，核酸被完全负载，实验结果表明制备的三七多糖阳离子衍生物具有良好的核酸负载能力。
实验2：细胞毒性实验
将对数生长期RAW264.7细胞接种在96孔板中于37℃、5% CO2培养箱中过夜培养，加入不同质量的三七多糖阳离子衍生物，48h后，四甲基偶氮唑盐比色法测定细胞活力，实验结果显示，随着三七多糖阳离子衍生物含量的增加，RAW264.7细胞活力无显著降低，在0-500μg/mL的范围内细胞活力均在80%以上，表明三七多糖阳离子衍生物具有良好的生物安全性。
实验3：细胞摄取实验
三七多糖阳离子衍生物用荧光染料罗丹明标记，然后负载核酸形成多糖-核酸纳米复合物，将对数生长期乳腺癌4T1细胞及结肠癌SW620细胞分别接种在6孔板中于37℃、5%CO2培养箱中过夜培养，加入相同含量多糖-核酸纳米复合物，流式细胞仪测定于1-8h不同时间点摄取量，实验结果显示，在8h时，多糖-核酸纳米复合物被4T1细胞及SW620细胞的摄取量均高于90%，这说明三七多糖阳离子衍生物能够有效将核酸递送至细胞内。
实验4：体内抗肿瘤实验
按照18:1的比例将三七多糖阳离子衍生物与shPD-L1质粒混合，在室温孵育30min后将次溶液低在铜网上，晾干后进行透射电镜表征，实验结果显示，三七多糖阳离子衍生物/shPD-L1是一种类球形结构的纳米颗粒，粒径在160nm左右；恶性黑色素瘤B16-F10细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基于37℃、5%CO2条件下培养，收集对数期细胞，调整为5.0×106个/mL的细胞悬液，各取0.2mL皮下接种在健康C57BL/6J雌鼠（6-8w，18-22g）右前肢上部，瘤体积增长到60-80mm3时，将上述制备的三七多糖阳离子衍生物/shPD-L1复合物尾静脉注射，每6天给药一次，共给药3次，以注射等量的生理盐水作为空白对照组。给药期间监测小鼠体重及肿瘤体积，实验结果显示，与生理盐水对照组相比，小鼠体重没有显著差异，但肿瘤生长受到显著抑制，体积抑制率达76.95%，显示出强大的肿瘤抑制作用。给药结束后第二天，小鼠牺牲，ELISA法测定各组小鼠血清IL-12及IFN-γ的含量，结果显示，与生理盐水对照组相比，IL-12及IFN-γ含量均显著升高，说明该三七多糖阳离子衍生物/shPD-L1衍生物保持了三七多糖自身的免疫学活性，在体内仍可以发挥良好的免疫调节作用。
在上述实验中，所用到的细胞株，质粒DNA，小动物分别为：
1、细胞株：结肠癌SW620细胞，乳腺癌4T1细胞，恶性黑色素瘤细胞B16-F10，小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，均购自中国科学院细胞库。
2、质粒DNA，靶位点PD-L1（NM_021893.3）鼠源，自上海吉玛制药技术有限公司。
3、SPF级C57BL/6小鼠，体重20±2g，雌性，由北京斯贝福生物技术有限公司提供。
在实验中，除了所述三七多糖阳离子衍生物作为核酸递送载体在制备肿瘤治疗药物中的应用，还包括将抗肿瘤基因治疗药物与三七多糖阳离子衍生物结合，然后进行体内免疫基因治疗抗肿瘤的生物学评价。
所述的抗肿瘤治疗药物为装载有治疗基因的质粒、装载有治疗基因的病毒DNA、反义寡核苷酸、小干扰RNA、基因编辑质粒载体中的一种或几种。
所述肿瘤细胞为人鼠源或人源的各种实体瘤细胞，包括肝癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、舌癌细胞、鼻咽癌细胞、食管癌细胞、白血病细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、阴茎癌细胞、皮肤癌细胞、恶性黑色素瘤细胞中的一种。
所述的肿瘤为人器官表面或内部出现的各种实体瘤，包括肝癌、肺癌、肾癌、胃癌、胰腺癌、舌癌、鼻咽癌、食管癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、阴茎癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤中的一种。
在对实施例1-6实验的同时，还对其余实施例进行了相同实验，均与该结果一致或近似，在此不一一举例。
由上述表明，本发明三七多糖阳离子衍生物通过化学键将聚乙烯亚胺偶联到三七多糖上，合成三七多糖阳离子衍生物，可作为核酸药物递送载体并发挥免疫调节作用，有效解决了制备肿瘤基因治疗药物中的应用问题，且合成原料来源广泛，制备方法简便，制备成本低廉，物理及化学性质稳定，核酸负载能力较强，作为一种良好的肿瘤治疗药物递送载体的同时保持三七多糖自身的免疫学活性，将其用于免疫基因治疗领域，有效实现了三七多糖阳离子衍生物作为核酸递送载体在肿瘤治疗药物中的应用，开辟了肿瘤治疗的药物新途径，具有巨大的医用价值和社会效益。

Claims (9)

1.一种三七多糖阳离子衍生物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）活化三七多糖：
将50-250mg三七多糖溶解于10-25mL去离子水或二甲基亚砜中，室温，氮气保护条件下与70-350mg活化试剂A避光反应4-48h，将反应液于去离子水中透析2-3d，得活化的三七多糖反应液；所述的活化试剂A为N,N'-羰基二咪唑、高碘酸钾、乙二胺、含有3-5%乙二胺的二磷酸盐缓冲液、三乙胺中一种或两种以上；
或在50℃条件下，将50-250mg三七多糖溶解于10-25mL去离子水或二甲基亚砜中，然后加入100-600mg 活化试剂B反应4-24h，得活化的三七多糖反应液；所述的活化试剂B为琥珀酸酐、马来酸酐、N-羟基琥珀酰亚胺、4-二甲氨基吡啶、1-乙基（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐中的一种或两种以上；
2）三七多糖阳离子衍生物：
将上述活化后的三七多糖反应液溶于15-30mL超纯水中，再加入含有100-500mg聚乙烯亚胺的2-10mL二甲基亚砜溶液，然后在氮气保护下避光反应12-48h，于去离子水中透析2-3d，冷冻干燥，得聚乙烯亚胺修饰的三七多糖，即三七多糖阳离子衍生物；
或向上述活化三七多糖溶液中加入含有0.5-1mL氮丙啶或含有100-500mg聚乙烯亚胺的5-10mL摩尔浓度为1mol/L的HCl溶液，50℃条件下搅拌反应1-3d，于去离子水中透析2-3d，冷冻干燥，得三七多糖阳离子衍生物。
2.根据权利要求1所述的三七多糖阳离子衍生物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）活化三七多糖：
将50mg三七多糖溶解于10mL二甲基亚砜中，加入70mg N,N'-羰基二咪唑和30μL三乙胺，室温，氮气保护条件下避光反应4h，将反应液于去离子水中透析2d，得活化的三七多糖反应液；
2）三七多糖阳离子衍生物：
将上述活化后的三七多糖反应液溶于15mL超纯水中，再加入含有100mg聚乙烯亚胺的2mL二甲基亚砜溶液，然后在氮气保护下避光反应24h，于去离子水中透析3d，冷冻干燥，得聚乙烯亚胺修饰的三七多糖，即三七多糖阳离子衍生物。
3.根据权利要求1所述的三七多糖阳离子衍生物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）活化三七多糖：
将100mg三七多糖溶解于15mL去离子水中，搅拌条件下加入80mg高碘酸钾，室温，氮气保护条件下避光反应24h，再缓慢滴加100μL含有3-5%乙二胺的二磷酸盐缓冲液，氮气保护下避光反应24h，将反应液透析3d，得活化的三七多糖反应液；
2）三七多糖阳离子衍生物：
向上述活化三七多糖溶液中加入含有0.5mL氮丙啶的5mL摩尔浓度为1mol/L的HCl溶液，50℃条件下混合搅拌2d，于去离子水中透析3d，冷冻干燥，得三七多糖阳离子衍生物。
4.根据权利要求1所述的三七多糖阳离子衍生物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）活化三七多糖：
将60mg三七多糖溶解于25mL二甲基亚砜中，加入80mg N,N'-羰基二咪唑和70μL乙二胺，室温，氮气保护条件下避光反应48h，将反应液于去离子水中透析3d，得活化的三七多糖反应液；
2）三七多糖阳离子衍生物：
向上述活化三七多糖溶液中加入含有480mg聚乙烯亚胺的10mL摩尔浓度为1mol/L的HCl溶液，50℃条件下搅拌反应2d，于去离子水中透析3d，冷冻干燥，得三七多糖阳离子衍生物。
5.根据权利要求1所述的三七多糖阳离子衍生物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）活化三七多糖：
将50mg三七多糖溶解于10mL二甲基亚砜中，依次加入10mg 4-二甲氨基吡啶与200mg琥珀酸酐，在50℃搅拌12h，再依次加入30mg 1-乙基（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和15mg N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应4h，得活化的三七多糖反应液；
2）三七多糖阳离子衍生物：
将上述活化后的三七多糖反应液溶于30mL超纯水中，再加入含有100mg聚乙烯亚胺的2mL二甲基亚砜溶液，然后在氮气保护下避光搅拌24h，于去离子水中透析3d，冷冻干燥，得三七多糖阳离子衍生物。
6.根据权利要求1所述的三七多糖阳离子衍生物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）活化三七多糖：
将100mg三七多糖溶解于15mL去离子水中，依次加入20mg 4-二甲氨基吡啶与400mg马来酸酐，在50℃搅拌16h，再依次加入60mg 1-乙基（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和30mg N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应8h，将反应液透析3d，得活化的三七多糖反应液；
2）三七多糖阳离子衍生物：
向上述活化三七多糖溶液中加入含有0.6mL氮丙啶的5mL摩尔浓度为1mol/L的HCl溶液中，50℃条件下混合搅拌2d，于去离子水中透析3d，冷冻干燥，得三七多糖阳离子衍生物。
7.根据权利要求1所述的三七多糖阳离子衍生物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1）活化三七多糖：
将60mg三七多糖溶解于25mL二甲基亚砜中，依次加入12mg 4-二甲氨基吡啶与240mg琥珀酸酐，在50℃搅拌12h，再依次加入36mg 1-乙基（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐和18mg N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应6h，得活化的三七多糖反应液；
2）三七多糖阳离子衍生物：
向上述活化三七多糖溶液中加入含有480mg聚乙烯亚胺的10mL摩尔浓度为1mol/L的HCl溶液中，50℃条件下混合搅拌3d，于去离子水中透析3d，冷冻干燥，得三七多糖阳离子衍生物。
8.权利要求1所述的制备方法制备得到的三七多糖阳离子衍生物在制备肿瘤基因治疗药物递送载体中的应用。
9.权利要求2-7任一项所述的制备方法制备得到的三七多糖阳离子衍生物在制备肿瘤基因治疗药物递送载体中的应用。
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