CN102154352A - 阳离子化多糖纳米粒基因传递系统及其制法 - Google Patents
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Abstract
一种阳离子化多糖纳米粒基因递送系统，它是一种用胺类化合物修饰的多糖结合DNA质粒的基因传递系统，其中按质量比计，阳离子化多糖:DNA质粒为=0.5~200:1，阳离子化多糖-DNA质粒纳米复合物的粒径为21-414nm，所述的胺类化合物为精胺、乙二胺或数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺。中药多糖普遍具有免疫调节、抗衰老和抗凝血等多种生物活性，与传统的病毒载体和其他非病毒载体基因传递系统相比，本发明的阳离子化多糖纳米粒基因递送系统安全、无免疫原性、生物可降解，制备工艺简单，经济。阳离子化多糖具有良好的DNA质粒结合作用及基因传递表达作用。与糖链结合的胺基所带有的正电荷能有效地与带有负电荷的DNA质粒结合，从而保护质粒免受细胞内外各种酶的降解。
Description
技术领域
本发明涉及植物功能性多糖领域并涉及基因传递系统，具体涉及一种阳离子化多糖纳米粒基因传递系统。
背景技术
基因治疗已打开了其在生物医药领域的广阔应用前景，可用于治疗遗传性疾病和后天性疾病如血友病、囊性纤维病、妇科疾病等[参见：Jay Lozier. Gene therapy of the hemophilias. Seminars in Hematology, 2004, 41 (4) :287~296. Uta Griesenbach, A. Christopher Boyd. Pre-clinical and clinical endpoint assays for cystic fibrosis gene therapy. Journal of Cystic Fibrosis, 2005, 4 (2) :89~100.Memy H, Hassan, Essam E, Othman, Daniela Hornung, Ayman A1-Hendy. Gene therapy of benign gynecological diseases. Advanced Drug Delivery Reviews, 2009,61(10) :822~835.]。基因治疗技术的关键在于能够有效地将外源基因传递进细胞核并使其高效的表达[参见：I.Yudovin-Farber, A.J.Domb. Cationic polysaccharides for gene delivery. Materials Science and Engineering: C, 2007, 27 (3) :595~598.]。目前，基因传递技术被分为三大类：电穿孔、显微注射和载体介导的基因传递系统（gene delivery systems，GDS）[参见：Patrick Wunderbaldinger, Alexei BogdanovJr, Ralph Weissleder. New approaches for imaging in gene therapy. European Journal of Radiology, 2000, 34 (3) :156~165.Mari Dezawa, Masahiko Takano, Hisanari Negishi, Xiaofen Mo, Toshiyuki Oshitari, Hajime Sawada. Gene transfer into retinal ganglion cells by in vivo electroporation: a new approach. Micron, 2002, 33 (1) : 1~6. Yoichiroh Hosokawa, Seriya lguchi, Ryohel Yasukuni, Yuji Hiraki, Chisa Shukunami, Hiroshi Masuhara. Gene delivery process in a single animal cell after femtosecond laser microinjection. Applied Surface Science, 2009, 255 (24) : 9880~9884.]，而后者已成为基因治疗技术的研究热点。
常用的GDS包括病毒载体和非病毒载体两大类，虽然前者表现出较高的转染效率但其潜在的致瘤性、诱导宿主免疫反应、装载容量有限、代价高等局限性制约了其在基因治疗领域的广泛应用。而非病毒载体的安全、低毒、无免疫原性、特异性和装载容量大等特点已受到该技术领域广大研究者的青睐。
常见的非病毒载体有阳离子聚合物和阳离子脂质体[参见：Maureen D. Brown, Andreas G.. Schatzlein, ljeoma F. Uchegbu. Gene delivery with synthetic (non viral) carriers. International Journal of Pharmaceutics, 2001, 229 (1~2) :1~21.]。目前人们研究较多的阳离子聚合物是聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI），精胺修饰的复合物，和乙二胺及其衍生物交联的复合物[参见：Stephanie Werth, Beata Urban-Klein, Lige Dai, Sabrina H?bel, Marius Grzelinski, Udo Bakowsky, Frank Czubayko, Achim Aigner. A low molecular weight fraction of polyethylenimine (PEI) displays increased transfection efficiency of DNA and siRNA in fresh or lyophilized complexes. Journal of Controlled Release, 2006, 112 (2) : 257~270. Lane V. Christensen, Chien-Wen Chang, James W. Yockman, Rafe Conners, Heidi Jackson, Zhiyuan Zhong, Jan Feijen, David A. Bull, Sung Wan Kim. Reducible poly(amido ethylenediamine) for hypoxia-inducible VEGF delivery. Journal of Controlled Release, 2007, 118 (2) : 254~261. Toshihiro Kushibiki, Natsuki Nagata-Nakajima, Manabu Sugai, Akira Shimizu, Yasuhiko Tabata. Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-β type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release, 2006, 110 (3) :610~617.]等。PEI具有较为广泛的分子量，从25KD的大分子量支链PEI到400K的小分子量直链PEI都已成为众多学术者研究的热点[参见：Rui Deng, Yanan Yue, Fan Jin, Yangchao Chen, Hsiang-Fu Kung, Marie C. M. Lin, Chi Wu. Revist the complexation of PEI and DNA - How to make low cytotoxic and highly efficient PEI gene transfection non-viral vectors with a controllable chain length and structure? Journal of Controlled Release, 2009, 140 (1) : 40~60. Stephanie Werth, Beata Urban-Klein, Lige Dai, Sabrina H?bel, Marius Grzelinski, Udo Bakowsky, Frank Czubayko, Achim Aigner. A low molecular weight fraction of polyethylenimine (PEI) displays increased transfection efficiency of DNA and siRNA in fresh or lyophilized complexes. Journal of Controlled Release, 2006, 112 (2) :257~270.]。通过化学修饰方法，使载体分子带上正电荷，通过静电作用与带有负电荷的DNA质粒络合，形成稳定的阳离子聚合物-质粒复合物，通过细胞内吞作用，将外源基因导入靶向细胞核参与遗传物质的复制和表达。
随着基因传递技术的深入发展，阳离子多糖已逐渐成为非病毒载体基因传递系统的强有力竞争者。中药多糖天然、无毒、生物相容、生物可降解以及其易于修饰，便于优化理化性质等特点为其在基因治疗领域的发展提供了独特的优势[参见：Igor A. Schepetkin, Mark T. Quinn. Botanical polysaccharides: Macrophage immunomodulation and therapeutic potential. International Immunopharmacology, 2006, 6 (3) :317~333.]。然而，除了壳聚糖之外，其它的天然植物多糖几乎都不带正电荷，无法直接作为基因的载体，必须先将天然多糖阳离子化进行修饰以提高其电位，才能成功结合DNA质粒。目前，研究得比较多的阳离子多糖聚合物，除壳聚糖及其衍生物[参考：Tae Hee Kim, Hu Lin Jiang, Dhananjay Jere et al. Chemical modification of chitosan as a gene carrier in vitro and in vivo. Progress in polymer science, 2007, 32(7):726-753.]之外的阳离子多糖基因载体主要是精胺-葡聚糖[参考：Hagit Eliyahua,b, Aviva Josepha,c, Tony Azzam et al. Dextran-spermine-based polyplexes-Evaluation of transgene expression and of local and systemic toxicity in mice. Biomaterials 27 (2006) 1636-1645.]、精胺-淀粉[参考：Yuichiro Kido, Jun-ichiro Jo, Yasuhiko Tabata. A gene transfection for rat mesenchymal stromal cells in biodegradable gelatin scaffolds containing cationized polysaccharides. Biomaterials 2010 ]、精胺-聚甘露糖[参考：Jo Jun-ichiro，Okazaki Arimichi, Nagane Kentaro et al. Preparation of Cationized Polysaccharides as Gene Transfection Carrier for Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Journal of Biomaterials Science, PolymerEdition, 2010,21(2):185-204. ]、PEI修饰的多糖聚合物[参考：Soma Patnaik, Anita Aggarwal, Surendra Nimesh et al. PEI-alginate nanocomposites as efficient in vitro gene transfection agents. Journal of Controlled Release 114 (2006) 398-409]以及其它以环糊精[参考：Forrest ML, Gabrielson N, Pack DW. Cyclodextrin-polyethylenimine conjugates for targeted in vitro gene delivery. Biothechnolgy Bioengineering, 2005, 89(4)：416- 423. ]、海藻酸[参考：Soma Patnaik, Anita Aggarwal,, Surendra Nimesh. PEI-alginate nano- composites as efficent in vitro gene transfection agents. Journal of controlled release, 2006,114(3): 398-409.]等为骨架而进行氨基化修饰的聚合物。
中药多糖具有良好的药用疗效，其免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、降血脂等生物活性已受到医药界的广泛重视和关注，其生物相容和生物可降解的特性为其在生物技术领域奠定了良好的应用基础。
发明内容
本发明从中药中提取具有生物活性的多糖，经分离纯化，以及胺化修饰得到带有正电荷的阳离子化多糖，通过静电作用，使其与带有负电荷的DNA质粒络合形成稳定的纳米粒复合物。电泳、电镜、干细胞粘附性以及干细胞转染实验表明，阳离子化多糖纳米粒基因传递系统能安全、有效的将外源基因传递入细胞核参与靶向细胞的遗传物质复制与表达，具有较高的转染效率。
本发明采用化学修饰的方法，提供了一种基于阳离子化多糖的高效无毒的基因递送系统。
本发明的技术方案如下：
一种阳离子化多糖纳米粒基因递送系统，它是一种用胺类化合物修饰的多糖结合DNA质粒的基因传递系统，其中按质量比计，阳离子化多糖:DNA质粒=0.5~200:1，阳离子化多糖-DNA质粒纳米复合物的粒径为21-414nm，所述的胺类化合物为精胺、乙二胺或数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺。
一种制备阳离子化多糖纳米粒基因载体的方法，它的流程如图1所示，包括以下步骤：
步骤1.阳离子化多糖的制备：
A. 氧化多糖的制备：
取0.2~1g精制多糖，溶解于20~100ml双蒸水中，加入0.1~4g KIO4，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h；反应液加入1~20ml 乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30min；将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到氧化多糖0.1~1.5g。
B. 阳离子化多糖的制备：
1) 精胺修饰的阳离子化多糖的制备：
取0.1~0.5g A步骤制得的氧化多糖，溶解于10~50ml 双蒸水中；称取精胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9），精胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为0.5~5:1；将含有精胺的硼酸盐溶液缓慢加入到多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；之后，向反应液中加入0.1~1g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.1~1g 硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为：0.5~4:1，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋（截取分子量>3500Da），在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到精胺修饰的阳离子化多糖0.1~0.8g。
2）乙二胺修饰的阳离子化多糖的制备
取0.1~0.5g B步骤制得的氧化多糖，溶解于10~30ml 双蒸水中；取0.1~2ml乙二胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9），乙二胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为0.5~5:1；将含有乙二胺的硼酸盐溶液缓慢滴加入多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；然后，向反应液中加入0.1~1.0g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.1~1.0g 硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为：0.5~4:1，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋（截取分子量>3500Da），在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到乙二胺修饰的阳离子化多糖0.1~0.7g。
3）小分子量聚乙烯亚胺修饰的阳离子化多糖的制备
取0.1~1g精制多糖，溶于5~20ml磷酸盐缓冲液（pH=7）；将活化羟基的连接剂，如：N，N’-羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、羰基咪唑、N,N’-二琥珀酰亚胺基硫酸酯中的任一种，溶解于5ml二氯甲烷中，多糖与连接剂的质量比为：0.5~4:1，在氮气的保护下，首先在多糖液中加入催化剂三乙胺，再将羟基连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，匀速搅拌，在20~100min内加完，加完之后，室温反应90~150min，获得活化的多糖溶液；将数均分子量为600-2000Da的聚乙烯亚胺（PEI）溶于1-20ml磷酸盐缓冲液中，PEI与多糖的摩尔比为：0.5~4:1，加入催化剂三乙胺，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到活化的多糖溶液中，在90~150min内加完，避光、室温下反应10h，整个反应在匀速搅拌下进行；反应完成之后的溶液经透析（截取分子量>3500Da）、冻干之后，得到PEI 修饰的多糖。
步骤2.分别配制浓度为0.01~10mg/ml的三种阳离子化多糖水溶液，取10~20μl阳离子多糖水溶液和10~20μl 含0.1~2μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热30~60min；立即混合，涡旋10~60s，即得到阳离子化多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
有益效果
1.中药多糖普遍具有免疫调节、抗衰老和抗凝血等多种生物活性，与传统的病毒载体和其他非病毒载体基因传递系统相比，其安全、无免疫原性、生物可降解，制备工艺简单，经济、简便。
2.电泳实验和干细胞转染实验说明，阳离子化多糖具有良好的DNA质粒结合作用及基因传递表达作用。与糖链结合的伯、肿、叔胺基基团所带有的正电荷能够有效地与带有负电荷的DNA质粒通过静电作用结合，从而保护质粒免受细胞内外各种酶的降解。
3.精胺修饰的杏鲍菇多糖、乙二胺修饰的桑叶多糖、PEI修饰的当归多糖和乙二胺修饰的枸杞多糖具有较佳的干细胞转染效果，电泳、电镜、黏附性、转染实验说明其对干细胞有较强的增殖作用，并对DNA具有很好的包裹和释放效果，适宜的粒径分布易于被细胞吞噬，生物可降解，使外源基因更为有效的释放和参与靶向细胞的蛋白表达，无免疫原性、安全、高效等多重优势，为阳离子化当归多糖基因传递系统开拓了广泛的应用前景。
附图说明
图1. 阳离子化多糖制备工艺流程方框图。
图2A 精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米粒电泳图。其中：
孔道1：裸pTGFβ-1；
孔道2~8，精胺-杏鲍菇多糖:pTGFβ-1质量比依次为：1:1；1:5；1:10；1:20；1:40；1:60；1:100。
图2B 乙二胺修饰的阳离子化桑叶多糖-DNA质粒纳米粒电泳图。其中：
孔道1：裸pTGFβ-1；
孔道2~8：乙二胺-桑叶多糖与pTGFβ-1（质量）比为：1:1；1:2；1:5；1:10；1:30；1:50；1:70。
图2C 乙二胺修饰的阳离子化枸杞多糖-DNA质粒纳米粒电泳图。其中：
孔道1：裸pTGFβ-1；
孔道2：精制枸杞多糖：pTGFβ-1质量比为80:1.；
孔道3~7：乙二胺-枸杞多糖:pTGFβ-1质量比依次为：30:1；50:1；80:1；120:1；150:1。
图2D PEI修饰的阳离子化当归多糖-DNA质粒纳米粒电泳图。其中：
孔道1~8：PEI-当归多糖:pTGFβ-1质量比依次为： 1:1；5:1；10:1；20:1；30:1；50:1；70:1；100:1。
图3A 阳离子化杏鲍菇多糖-DNA纳米粒的透射电镜图。
图3B 阳离子化桑叶多糖-DNA纳米粒的透射电镜图。
图3C 阳离子化枸杞多糖-DNA纳米粒的透射电镜图。
图3D 阳离子化当归多糖-DNA纳米粒的透射电镜图。
图4A 阳离子化杏鲍菇多糖-DNA纳米粒的粒径分布图
图4B 阳离子化桑叶多糖-DNA纳米粒的粒径分布图。
图4C 阳离子化枸杞多糖-DNA纳米粒的粒径分布图。
图4D 阳离子化当归多糖-DNA纳米粒的粒径分布图。
图5A 阳离子化杏鲍菇多糖-DNA纳米粒转染干细胞效果图。
图5B 阳离子化桑叶多糖-DNA纳米粒转染干细胞效果图。
图5C 阳离子化枸杞多糖-DNA纳米粒转染干细胞效果图。
图5D 阳离子化当归多糖-DNA纳米粒转染干细胞效果图。
具体实施方式
以下实施例所采用的材料和仪器：
实验材料：桑叶、当归、枸杞和杏鲍菇（中药材，镇江市芝林大药房）；95%乙醇（山东广源医药有限公司）；无水乙醇、丙酮、乙醚、乙二醇、三氯乙酸、硼氢化钠（国药集团化学试剂有限公司）；AB-8大孔吸附树脂（安徽三星树脂有限公司）；SephadexG-100 凝胶树脂（Shanghai RiChu Bioscience有限公司）；KIO4（国药集团化学试剂有限公司）；精胺（Biosharp公司，美国），乙二胺（Sigma~Aldrich, USA）, PEI（Sigma~Aldrich, USA）；无内毒素质粒大提试剂盒（康为世纪）；Rat TGF~β1 ELISA Kit（烟台赛尔斯生物技术有限公司）。
实验器材：磁力搅拌器（金坛大中仪器厂）；透析袋（截取分子量>3500Da）（Biosharp公司，美国）；超低温高速离心机（Heareus，德国）；CHRIST冷冻干燥干机（BMH公司，德国），DY602S稳流稳压电泳仪（南京新校园生物技术研究所）； JEM~2100透射电子显微镜（日本电子）；旋转蒸发仪（Heidolph公司，德国）。
实施例一：精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备
称0.5g精制的杏鲍菇多糖，溶解于30ml双蒸水中，加入0.75g KIO4，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h；反应液加入10ml 乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30min；将反应液装入透析袋（截取分子量>3500Da），在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到氧化杏鲍菇多糖。
取0.15g 上述的氧化杏鲍菇多糖，溶解于10ml 双蒸水中；称0.3g 精胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9）；将精胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到杏鲍菇多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；之后，向反应液中加入0.2g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.2g 硼氢化钠，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋（截取分子量>3500Da），在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖。
配制浓度为0.6mg/ml的精胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖水溶液；取10μl上述溶液和10μl 含0.2μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热60min；再将二者混合，涡旋30s，即得到精胺修饰的杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
实施例二：乙二胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖- DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备
称0.6 g精制的杏鲍菇多糖，溶解于50ml双蒸水中，加入0.89g KIO4，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h；反应液加入12ml 乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30min；将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h（截取分子量>3500Da）；透析液冻干，得到氧化杏鲍菇多糖。
取0.4 g 氧化杏鲍菇多糖，溶解于30ml 双蒸水中；取0.7 ml乙二胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9）；将乙二胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到杏鲍菇多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；之后，向反应液中加入0.4g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.4g 硼氢化钠，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋（截取分子量>3500Da），在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到乙二胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖。
配制浓度为0.8mg/ml的乙二胺修饰的阳离子化杏鲍菇多糖水溶液；取10μl上述溶液和10μl 含0.2μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热40min；再将二者混合，涡旋30s，即得到乙二胺修饰的杏鲍菇多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
实施例三：乙二胺修饰的阳离子化桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备
称0.8g精制的桑叶多糖，溶解于50ml双蒸水中，加入1.2g KIO4，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h；反应液加入12ml 乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30min；将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h（截取分子量>3500Da）；透析液冻干，得到氧化桑叶多糖。
取0.5g 氧化桑叶多糖，溶解于30ml 双蒸水中；取0.28ml乙二胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9）；将乙二胺的硼酸盐溶液用一次性注射器缓慢加入到桑叶多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；之后，向反应液中加入 0.5g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入 0.5g 硼氢化钠，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋（截取分子量>3500Da），在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到乙二胺修饰的阳离子化的桑叶多糖。
配制浓度为0.2mg/ml的乙二胺修饰的阳离子化桑叶多糖水溶液；取10μl上述溶液和10μl 含0.4μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热30min；再将二者混合，涡旋30s，即得到乙二胺修饰的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
实施例四：PEI修饰的阳离子化桑叶多糖- DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备
称取0.1g精制的桑叶多糖，溶解于20ml 磷酸盐缓冲液（Ph=7）中; 将活化羟基的连接剂N，N’-羰基二咪唑0.15g溶解于5ml二氯甲烷中，在氮气的保护下，首先在多糖液中加入催化剂三乙胺0.1ml，再将羟基连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，边加边搅拌，在30~100min内加完，加完之后，室温反应90~150min，获得活化的多糖溶液；将2.0g数均分子量为600-2000Da 的PEI溶于10ml磷酸盐缓冲液中，加入催化剂三乙胺0.1ml，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到活化的多糖液中，边加边搅拌，在120~150min加完，加完之后避光、室温下反应10h，反应完成之后的溶液经透析（截取分子量>3500Da）冻干之后，得到PEI 修饰的阳离子化桑叶多糖。
配制浓度为0.2mg/ml的PEI修饰的阳离子化桑叶多糖水溶液；取10μl上述溶液和10μl 含0.2μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热35min；再将二者混合，涡旋30s，即得到PEI修饰的桑叶多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
实施例五：乙二胺修饰的阳离子化枸杞多糖- DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备
取0.8g精制的枸杞多糖，溶解于50ml双蒸水中，加入2.4g KIO4，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h；反应液加入10ml 乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30min；收集反应液于双蒸水中透析48h（截取分子量>3500Da）；冷冻干燥，得到氧化枸杞多糖。
取0.5g 氧化枸杞多糖，溶解于10ml 双蒸水中；称2ml乙二胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9）；将含有乙二胺的硼酸盐溶液缓慢滴加入枸杞多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；之后，向反应液中加入0.8g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.8g 硼氢化钠，相同条件下继续反应24h；收集反应液于双蒸水中透析48h（截取分子量>3500Da），冷冻干燥，得到乙二胺修饰的阳离子化枸杞多糖。
配制浓度为8mg/ml的乙二胺修饰的阳离子化枸杞多糖水溶液，取20μl上述溶液和20μl 含1μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热60min；立即混合，涡旋45s，即得到乙二胺修饰的阳离子化枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
实施例六：PEI修饰的阳离子化枸杞多糖- DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备
取0.2g精制的枸杞多糖，溶于10ml磷酸盐缓冲液（pH=7）；将活化羟基的连接剂苯并三唑碳酸酯0.2g溶解于5ml二氯甲烷中，在氮气的保护下，首先在多糖液中加入催化剂三乙胺0.1ml，再将羟基连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，匀速搅拌，在60min内加完，加完之后，室温反应120min，获得活化的多糖溶液；将3g数均分子量为600-2000Da 的PEI溶于10ml磷酸盐缓冲液中，加入催化剂，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到活化的多糖溶液中，在120min内加完，避光、室温下反应10h，整个反应在匀速搅拌下进行；反应完成之后的溶液经透析（截取分子量>3500Da）、冻干，得到PEI 修饰的阳离子化枸杞多糖。
配制浓度为0.1mg/ml的PEI修饰的阳离子化枸杞多糖水溶液，取20μl上述溶液和20μl 含2μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热45min；立即混合，涡旋45s，即得到PEI修饰的枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
实施例七：PEI修饰的阳离子化当归多糖- DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备
取0.2g精制的当归多糖，溶于10ml磷酸盐缓冲液（pH=7）；将活化羟基的连接剂羰基咪唑0.2g溶解于5ml二氯甲烷中，在氮气的保护下，首先在多糖液中加入催化剂三乙胺0.05ml，再将活化羟基连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，匀速搅拌，在60min内加完，加完之后，室温反应120min，获得活化的多糖溶液；将3g数均分子量为600-2000Da 的PEI溶于10ml磷酸盐缓冲液中，加入催化剂三乙胺，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到活化的多糖溶液中，在120min内加完，避光、室温下反应10h，整个反应在匀速搅拌下进行；反应完成之后的溶液经透析（截取分子量>3500Da）、冻干，得到PEI 修饰的阳离子化当归多糖。
配制浓度为0.1mg/ml的PEI修饰的阳离子化当归多糖水溶液，取20μl上述溶液和20μl 含2μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热45min；立即混合，涡旋45s，即得到PEI修饰的当归多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
实施例八：乙二胺修饰的阳离子化当归多糖- DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备
取0.8g精制的当归多糖，溶解于50ml双蒸水中，加入2.5g KIO4，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h；反应液加入10ml 乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30min；收集反应液于双蒸水中透析48h；冷冻干燥，得到氧化当归多糖。
取0.5g 氧化当归多糖，溶解于20ml 双蒸水中；称2ml乙二胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9）；将含有乙二胺的硼酸盐溶液缓慢滴加入当归多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；之后，向反应液中加入0.7g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.7g 硼氢化钠，相同条件下继续反应24h；收集反应液于双蒸水中透析48h，冷冻干燥，得到乙二胺修饰的阳离子化当归多糖。
配制浓度为5mg/ml的乙二胺修饰的阳离子化当归多糖水溶液，取20μl上述溶液和20μl 含1μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热60min；立即混合，涡旋45s，即得到乙二胺修饰的阳离子化当归多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
实施例九
1.制备1%琼脂糖凝胶，加入0.5μg/ml 溴化乙啶，铺板，加样，在80V电泳1.5h后采用凝胶成像系统观察结果。结果显示阳离子化当归多糖能够稳定的滞留DNA质粒，有效的结合质粒。
琼脂糖DNA电泳步骤：
步骤1. 制备1%琼脂糖凝胶:称取0.4g 琼脂糖置于锥形瓶中，加入40ml 0.5×TBE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即得到1.0%琼脂糖凝胶液。
步骤2. 胶板制备：将电泳槽内的有机玻璃内槽和制胶槽洗干净，晾干，放入制胶玻璃板，将内槽放入卡槽内，并在固定位置放好梳子。待琼脂糖凝胶溶液冷却到65℃左右，向其中加0.5μg/ml溴化乙锭，混匀，小心地倒入有机玻璃内槽，是凝胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下，静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。
步骤3. 加样：在点样板上混合 DNA复合物样品和上样缓冲液，用10μl微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内。
步骤4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压70-100V，样品由正极（红色）向负极（黑色）方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板前沿约1cm处时，停止电泳。
步骤5. 电泳完毕后，取出凝胶，清水漂洗10min。
步骤6. 观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出橙红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。可见阳离子化当归多糖对DNA质粒具有明显的结合包裹作用。
实施例十
以TGFβ-1质粒为报告基因，按照实施例一、二、三所述制备三种阳离子化当归多糖-DNA质粒纳米粒基因传递系统。96孔板中培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，细胞浓度达到2×105/ml 完全培养基/孔，孵育24-48h后，用无血清培养基置换原培养基，分别加入阳离子化多糖-DNA质粒纳米复合物、脂质体LipofectamineTM 2000-DNA质粒复合物、游离质粒，使每孔质粒DNA量均为0.2μg，并以空白细胞为阴性对照，孵育4h后，将无血清培养基置换成新鲜的含血清培养基，继续孵育72h，Rat TGF-β1 ELISA Kit检测转染效果。分别以空白细胞组和游离质粒组为阴性对照，以PEI（25KD）和LipofectamineTM 2000-DNA质粒复合物为阳性对照，评价阳离子化多糖-DNA纳米复合物对干细胞的转染效果。结果显示：精胺修饰的杏鲍菇多糖、乙二胺修饰的桑叶多糖、PEI修饰的当归多糖和乙二胺修饰的枸杞多糖具有较佳的干细胞转染效果，其TGF-β1的表达水平明显高于PEI（25KD）和LipofectamineTM 2000-DNA质粒复合物的表达水平。由此可见，阳离子多糖是种具有较高转染效率非病毒基因转运载体。
细胞转染实验步骤：
步骤1. 干细胞分离及培养：将SD大鼠拉颈处死，体积分数为75%的乙醇浸泡3-5min, 无菌条件下取出胫骨和股骨；将其两端干骺端切除，露出骨髓腔，用无菌注射器吸取适量PBS彻底冲洗骨髓腔；反复吹打冲出骨髓；使骨髓细胞充分分散；所获得的骨髓单细胞悬液沿管壁缓慢滴加于预置的Percoll分离液（相对体积质量1.073）的离心管中，骨髓单细胞悬液与分离液的体积比为1：1；2000rpm，离心20min，吸取中间云雾状细胞层，用PBS洗涤3次；用完全培养基（含体积分数为10%胎牛血清的DMEM）重悬细胞，置于培养瓶中，于37℃含有体积分数为5%的CO2培养箱中培养。
步骤2. 细胞转染
取阳离子化多糖-DNA复合物（质粒含量为0.2μg/孔）分别加至96孔板中（2×105/ml 完全培养基/孔）并轻轻摇晃使其均匀混合；放置37℃，5%CO2培养箱孵育72h，以LipofectamineTM 2000-DNA质粒复合物作为阳性对照，Rat TGF-β1 ELISA Kit检测转染效果。其结果见图5。
Claims (2)
1.一种阳离子化多糖纳米粒基因递送系统，其特征是：它是一种用胺类化合物修饰的阳离子化多糖结合DNA质粒的基因传递系统，其中按质量比计，阳离子化多糖:DNA质粒为=0.5~200:1，阳离子化多糖-DNA质粒纳米复合物的粒径为21-414nm，所述的胺类化合物为精胺、乙二胺或数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺。
2.一种制备权利要求1所述的阳离子化多糖纳米粒基因传递系统的方法，其特征是包括以下步骤：
步骤1.阳离子化多糖的制备：
A. 氧化多糖的制备：
取0.2~1g精制多糖，溶解于20~100ml双蒸水中，加入0.1~4g KIO4，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h；反应液加入1~20ml 乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30min；将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到氧化多糖0.1~1.5g；
B. 阳离子化多糖的制备：
1) 精胺修饰的阳离子化多糖的制备：
取0.1~0.5g A步骤制得的氧化多糖，溶解于10~50ml 双蒸水中；称取精胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9），精胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为0.5~5:1；将含有精胺的硼酸盐溶液缓慢加入到多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；之后，向反应液中加入0.1~1g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.1~1g 硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为：0.5~4:1，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋（截取分子量>3500Da），在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到精胺修饰的阳离子化多糖0.1~0.8g；
2）乙二胺修饰的多糖的制备
取0.1~0.5g A步骤制得的氧化多糖，溶解于10~30ml 双蒸水中；取0.1~2ml乙二胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9），乙二胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为0.5~5:1；将含有乙二胺的硼酸盐溶液缓慢滴加入多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；然后，向反应液中加入0.1~1.0g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.1~1.0g 硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为：0.5~4:1，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋（截取分子量>3500Da），在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到乙二胺修饰的阳离子化多糖0.1~0.7g；
3）小分子量聚乙烯亚胺修饰的多糖的制备
取0.1~1g精制多糖，溶于5~20ml磷酸盐缓冲液（pH=7）；将活化羟基的连接剂，如：N，N’-羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、羰基咪唑、N,N’-二琥珀酰亚胺基硫酸酯中的任一种，溶解于5ml二氯甲烷中，多糖与连接剂的质量比为：0.5~4:1，在氮气的保护下，首先在多糖液中加入催化剂三乙胺，再将羟基连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，匀速搅拌，在20~100min内加完，加完之后，室温反应90~150min，获得活化的多糖溶液；将数均分子量为600-2000Da的聚乙烯亚胺（PEI）溶于1-20ml磷酸盐缓冲液中，PEI与多糖的摩尔比为：0.5~4:1，加入催化剂三乙胺，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到活化的多糖溶液中，在90~150min内加完，避光、室温下反应10h，整个反应在匀速搅拌下进行；反应完成之后的溶液经透析（截取分子量>3500Da）、冻干之后，得到PEI 修饰的多糖；
步骤2.分别配制浓度为0.01~10mg/ml的三种阳离子化多糖水溶液，取10~20μl阳离子多糖水溶液和10~20μl 含0.1~2μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热30~60min；立即混合，涡旋10~60s，即得到阳离子化多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
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