CN102154350B - 阳离子化枸杞多糖纳米粒基因传递系统及其制法 - Google Patents
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Abstract
一种阳离子化枸杞多糖纳米粒基因传递系统，它是一种用胺类化合物修饰的枸杞多糖结合DNA质粒的基因传递系统，枸杞多糖的分子量分布为：20KD~40KD，其中按质量比计，阳离子化枸杞多糖:DNA质粒=1~200:1，阳离子化枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的粒径为351-414nm，所述的胺类化合物为精胺、乙二胺或数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺。经电泳实验及干细胞转染实验说明，本发明的三种阳离子化枸杞多糖均有良好的DNA质粒结合作用及基因传递表达作用。同时，适宜的分子粒径、生物可降解性和无免疫原性为阳离子化枸杞多糖基因传递系统奠定了广泛的应用基础。
Description
技术领域
本发明涉及枸杞多糖，并涉及基因传递系统，具体涉及一种阳离子化枸杞多糖纳米粒基因传递系统。
背景技术
基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗的目的。基因转移技术的成功的关键是将遗传物质有效的传递进入细胞，并使其高效的参与靶向细胞的遗传物质复制与表达。
基因传递系统（gene delivery system，GDS）在基因治疗方面起着非常重要的作用。通常GDS分为两大类：病毒载体类和非病毒载体类。虽然前者具有较高的转染效率，但其诱导宿主免疫反应、潜在致瘤性、装载容量有限、代价高等特点限制了其在基因传递技术领域的发展。非病毒载体已逐渐成为该领域广大研究者关注的热点，其安全、低毒、装载容量大等特点为其提供了广泛的应用空间。
常见的非病毒载体由阳离子聚合物和阳离子脂质体组成[参见：Maureen D. Brown, Andreas G.. Schatzlein, ljeoma F. Uchegbu. Gene delivery with synthetic (non viral) carriers. International Journal of Pharmaceutics, 2001, 229(1~2):1~21]。聚合物中带有正电荷的胺基基团与遗传物质中带有负电荷的磷酰基团在静电作用下络合形成稳定的阳离子聚合物-质粒复合物，通过细胞的内吞作用，将外源基因传递入靶向细胞，并实现该遗传物质的复制与表达[参见：Stefano Persiani, Wei-Chiang Shen. Increase of poly(L-lysine) uptake but not fluid phase endocytosis in neuraminidase pretreated Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells. Life Sciences, 1989, 45 (26) :2605~2610. Sabine I. Weiss, Nathalie Sieverling, Maren Niclasen, Christof Maucksch, Andreas F. Thünemann, Helmuth M?hwald, Dietrich Reinhardt, Joseph Rosenecker, Carsten Rudolph. Uronic acids functionalized polyethyleneimine {PEI} – polyethyleneglycol (PEG) – graft – copolymers as novel synthetic gene carriers. Biomaterials. 2006, 27 (10) : 2302~2312]。常见的阳离子化聚合物修饰方法是使聚合物带上伯胺、仲胺、叔胺基团[参加：Hagit Eliyahu, Shahar Siani, Tony Azzam, Abraham J. Domb, Yechezkel Barenholz. Relationships between chemical composition, physical properties and transfection efficiency of polysaccharide–spermine conjugates. Biomaterials, 2006, 27 (8): 1646~ 1655.]。目前，研究较多的阳离子聚合物有多聚赖氨酸（poly-L-lysine）及其衍生物[参见：Han Chang Kang, Sungwon Kim, Minhyung Lee, You Han Bae. Polymeric gene carrier for insulin secreting cells: Poly(l-lysine)-g-sulfonylurea for receptor mediated transfection. Journal of Controlled Release, 2005, 105 (1~2) :164~176.]，聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）[参见：W. T. Godbey, A. G. Mikos. Recent progress in gene delivery using non-viral transfer complexes. Journal of Controlled Release, 2001, 72 (1~3) :115~125. Rui Deng, Yanan Yue, Fan Jin, Yangchao Chen, Hsiang-Fu Kung, Marie C. M. Lin, Chi Wu. Revist the complexation of PEI and DNA – How to make low cytotoxic and highly efficient PEI gene transfection non-viral vectors with a controllable chain length and structure? Journal of Controlled Release, 2009, 140 (1) : 40~60. Stephanie Werth, Beata Urban-Klein, Lige Dai, Sabrina H?bel, Marius Grzelinski, Udo Bakowsky, Frank Czubayko, Achim Aigner. A low molecular weight fraction of polyethylenimine (PEI) displays increased transfection efficiency of DNA and siRNA in fresh or lyophilized complexes. Journal of Controlled Release, 2006, 112 (2) : 257~270],乙二胺及其衍生物交联形成的复合物和精胺修饰的复合物[参见：Lane V. Christensen, Chien-Wen Chang, James W. Yockman, Rafe Conners, Heidi Jackson, Zhiyuan Zhong, Jan Feijen, David A. Bull, Sung Wan Kim. Reducible poly(amido ethylenediamine) for hypoxia-inducible VEGF delivery. Journal of Controlled Release, 2007, 118 (2) : 254~261. Hossein Hosseinkhani, Yasuhiko Tabata. In vitro gene expression by cationized derivatives of an artificial protein with repeated RGD sequences, Pronectin. Journal of Controlled Release, 2003, 86 (1) :169~182. Toshihiro Kushibiki, Natsuki Nagata-Nakajima, Manabu Sugai, Akira Shimizu, Yasuhiko Tabata. Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-β type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds. Journal of Controlled Release, 2006, 110 (3) : 610~617.]。
随着基因传递技术的深入发展，阳离子多糖已在非病毒载体基因传递系统领域占有一席之地。多糖的天然、无毒、生物相容、生物可降解、易于修饰，便于优化理化性质以及其自身的有益的生物学活性等特点为其在基因治疗领域的发展提供了独特的优势[参见：Marina A. Dergunova, Tatyana V. Alexeenko, Svetlana Ya. Zhanaeva, Elena E. Filyushina, Irina I. Buzueva, Olga P. Kolesnikova, Grigorij Kogan, Tatyana A. Korolenko. Characterization of the novel chemically modified fungal polysaccharides as the macrophage stimulators. International Immunopharmacology, 2009, 9 (6) : 729~733. X.M. Li, Y.L. Ma, X.J. Liu. Effect of the Lycium barbarum polysaccharides on age-related oxidative stress in aged mice. Journal of Ethnopharmacology, 2007, 111 (3) : 504~511. Lee Chi-Jen. Bacterial capsular polysaccharides- biochemistry, immunity and vaccine. Molecular Immunology, 1987, 24 (10) : 1005~1019.]
枸杞多糖具有较强的药理活性，其免疫调节、延缓衰老、抗肿瘤、抗疲劳、降血脂等多种生物学活性已受到医药界的广泛重视和关注。
发明内容
本发明从茄科植物枸杞（Lycium chinense Mill.）的果实中提取出具有天然生物学活性的多糖，经分离纯化，以及胺化修饰得到三种带有正电荷的阳离子化枸杞多糖，通过静电作用，使其与带有负电荷的DNA质粒络合形成稳定的纳米粒复合物。电泳、电镜、干细胞粘附性以及干细胞转染实验表明，三种阳离子化枸杞多糖纳米粒基因传递系统均能安全、有效的将外源基因传递入细胞核参与靶向细胞的遗传物质复制与表达，乙二胺修饰的阳离子化枸杞多糖效果最佳。
本发明采用化学修饰的方法，提供了一种基于阳离子化枸杞多糖的安全高效的新型基因传递系统。
本发明的技术方案如下：
一种阳离子化枸杞多糖纳米粒基因传递系统，它是一种用胺类化合物修饰的枸杞多糖结合DNA质粒的基因传递系统，枸杞多糖的分子量分布为：20 KD~40 KD，其中按质量比计， 阳离子化枸杞多糖:DNA质粒=1~200:1，阳离子化枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的粒径为351-414nm，所述的胺类化合物为精胺、乙二胺或数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺。
一种制备上述的阳离子化枸杞多糖纳米粒基因传递系统的方法，其制备的流程如图1所示，它包括以下步骤：
步骤1. 氧化枸杞多糖的制备：
取0.2~1 g精制的枸杞多糖，溶解于10~100 ml双蒸水中，加入KIO4，，KIO4与多糖中单糖单位的摩尔比为：0.5~5:1，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72 h；反应液加入1~20 ml 乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30 min；收集反应液，于双蒸水中透析48 h（截取分子量>3500Da）；冷冻干燥，得到氧化枸杞多糖0.1~1.2g；
步骤2. 阳离子化枸杞多糖的制备：
A. 乙二胺修饰的阳离子化枸杞多糖的制备：
取0.1~0.5 g 步骤1制得的氧化枸杞多糖，溶解于10~30 ml 双蒸水中；取乙二胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9），乙二胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为0.5~5:1；将含有乙二胺的硼酸盐溶液缓慢滴加入氧化枸杞多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24 h；然后，向反应液中加入0.1~0.5 g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48 h；再向反应液中加入0.1~1.0 g 硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为：0.5~4:1，相同条件下继续反应24 h；将反应液装入透析袋，在双蒸水中透析48 h（截取分子量>3500Da）；透析液冻干，得到乙二胺修饰的阳离子化枸杞多糖0.1~0.7g；
B. 精胺修饰的阳离子化枸杞多糖的制备：
称取0.1~0.5g 步骤1制得的氧化枸杞多糖，溶解于10~50ml 双蒸水中；称取精胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9），精胺与氧化多糖的醛基的摩尔比为0.5~5:1；将含有精胺的硼酸盐溶液缓慢加入到枸杞多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；之后，向反应液中加入0.1~1g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.1~1g 硼氢化钠，加入硼氢化钠的总质量与氧化多糖的质量之比为：0.5~4:1，相同条件下继续反应24h；将反应液装入透析袋（截取分子量>3500Da），在双蒸水中透析48h；透析液冻干，得到精胺修饰的阳离子化枸杞多糖0.1~0.7g；
C. 聚乙烯亚胺修饰的阳离子化多糖的制备：
取0.1~1g精制的枸杞多糖，溶于5~20ml磷酸盐缓冲液（pH=7）；将活化羟基的连接剂，如：N，N’-羰基二咪唑、苯并三唑碳酸酯、羰基咪唑、N,N’-二琥珀酰亚胺基硫酸酯中的任一种，溶解于5ml二氯甲烷中，多糖与连接剂的质量比为：0.5~4:1，在氮气的保护下，首先在多糖液中加入催化剂三乙胺，再将羟基连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，匀速搅拌，在20~100min内加完，加完之后，室温反应90~150min，获得活化的多糖溶液；将数均分子量为600-2000Da的聚乙烯亚胺（PEI）溶于1~20ml磷酸盐缓冲液中，多糖与聚乙烯亚胺的质量比为0.5~4:1，加入催化剂三乙胺，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到活化的多糖溶液中，在90~150min内加完，避光、室温下反应10h，整个反应在匀速搅拌下进行；反应完成之后的溶液经透析（截取分子量>3500Da），冻干之后，得到PEI 修饰的枸杞多糖；
步骤3. 阳离子化枸杞多糖纳米粒基因传递系统的制备：
分别配制浓度为0.01~10mg/ml的上述步骤2制得的三种阳离子化枸杞多糖水溶液，取10~20μl阳离子枸杞多糖水溶液和10~20μl 含0.1~2μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热30~60min；立即混合，涡旋10~60s，即得到三种阳离子化枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
有益效果
1. 经电泳实验及干细胞转染实验说明，三种阳离子化枸杞多糖均有良好的DNA质粒结合作用及基因传递表达作用。与糖链结合的伯胺基、仲胺基、叔胺基基团所带的正电荷能够很好的与带有负电荷的DNA质粒通过静电作用结合，从而保护质粒免受细胞内外各种酶的降解。同时，适宜的分子粒径、生物可降解性和无免疫原性为阳离子化枸杞多糖基因传递系统奠定了广泛的应用基础。
2. 乙二胺修饰的阳离子化枸杞多糖具有最佳的干细胞转染效果，电泳、电镜、黏附性、转染实验说明其对干细胞有良好的增殖作用、并对DNA具有很好的包裹和释放效果，适宜的粒径分布易于被细胞吞噬，使外源基因更为有效的参与靶向细胞的蛋白表达。
3. 枸杞是具有良好生物活性的天然多糖，其安全、无毒、生物可降解，原料来源广泛，制备工艺简单，经济、简便。与病毒载体和其他非病毒载体基因传递系统相比，阳离子化枸杞多糖基因传递系统更为安全、高效，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1 枸杞阳离子多糖制备工艺流程图。
图2A 乙二胺-枸杞多糖-DNA质粒纳米粒电泳图，其中：
孔道1：裸pTGFβ-1；
孔道2：精制枸杞多糖：pTGFβ-1质量比为80:1.；
孔道3~7：乙二胺-枸杞多糖:pTGFβ-1质量比依次为：30:1；50:1；80:1；120:1；150:1。
图2B 精胺-枸杞多糖-DNA质粒纳米粒电泳图，其中：
孔道1：裸pTGFβ-1；
孔道2~8：精胺-枸杞多糖:pTGFβ-1质量比依次为：1:1；5:1；10:1；30:1；50:1；70:1；100:1。
图2C PEI-枸杞多糖-DNA质粒纳米粒电泳图，其中：
孔道1~8：PEI-枸杞多糖:pTGFβ-1质量比依次为：0.5:1；1:1；5:1；10:1；30:1；50:1；70:1；100:1。
图3 实施例二制得的枸杞阳离子多糖-DNA纳米粒的透射电镜图。
图4 实施例二制得的枸杞阳离子多糖-DNA纳米粒的粒径分布图。
图5 枸杞阳离子多糖-DNA纳米粒转染干细胞结果，其中：PEI代表PEI与DNA结合的纳米粒基因传递系统，作为阳性对照；枸杞-PEI代表PEI修饰的阳离子化枸杞多糖与DNA结合的纳米粒基因传递系统；枸杞-精胺代表精胺修饰的阳离子化枸杞多糖与DNA结合的纳米粒基因传递系统；枸杞-乙二胺代表乙二胺修饰的阳离子化枸杞多糖与DNA结合的纳米粒基因传递系统。
具体实施方式
以下实施例所采用的材料和仪器：
实验材料：枸杞子（镇江市芝林大药房）；95%乙醇（山东广源医药有限公司）；无水乙醇、丙酮、乙醚、乙二醇、三氯乙酸（国药集团化学试剂有限公司）；DEAE-52纤维素树脂（Whatman公司，英国）；SephadexG-100 凝胶树脂（Shanghai RiChu Bioscience有限公司）；KIO4（国药集团化学试剂有限公司）；乙二胺（Sigma-Aldrich, 美国）；精胺（Biosharp公司，美国）；PEI（Sigma-Aldrich, 美国）；无内毒素质粒大提试剂盒（康为世纪）；Rat TGF-β1 ELISA Kit（烟台赛尔斯生物技术有限公司）。
实验器材：磁力搅拌器（金坛大中仪器厂）；旋转蒸发仪（Heidolph公司，德国）；透析袋（Biosharp公司，美国）；超低温高速离心机（Heareus，德国）；CHRIST冷冻干燥干机（BMH公司，德国）；H66025超声清洗机（无锡超声电子设备厂）；DY602S稳流稳压电泳仪（南京新校园生物技术研究所）； JEM-2100透射电子显微镜（日本电子）。
精制的枸杞多糖的制备
多糖的提取和纯化： 取枸杞子，粉碎，水提醇沉（按如下工艺热水浸提：料液比：1：5~20，提取温度：50~80℃，提取时间0.5~4h/次，提取次数：2次。合并两次提取液之后，旋转蒸发浓缩至原提取液体积的1/5-1/10，再将95%的乙醇加入到浓缩液中，至乙醇终浓度为65%-85%），冷冻干燥，得枸杞粗多糖，三氯乙酸法去除蛋白，透析(截取分子量>3500Da)；依次使用DEAE-52纤维素树脂（洗脱液：双蒸水和0.05~0.5mol/LNaCl）和SephadexG-100葡聚糖凝胶树脂（洗脱液：0.1mol/LNaCl）对其进行分离纯化，分离产物用凝胶色谱法测定分子量分布，得到数均分子量为20KD~40KD的具有生物学活性的枸杞多糖。
实施例一、氧化枸杞多糖的制备
取0.2g精制的枸杞多糖，溶解于30ml双蒸水中，加入0.3g KIO4，迅速放到暗室，磁力搅拌，室温反应72h；反应液加入15ml 乙二醇终止反应，按前述条件继续反应30min；收集反应液于双蒸水中透析48h，截取分子量>3500Da；冷冻干燥，得到氧化枸杞多糖0.15g。
实施例二、乙二胺修饰的枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备
取0.1g 氧化枸杞多糖，溶解于20ml 双蒸水中；称0.14ml乙二胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9）；将含有乙二胺的硼酸盐溶液缓慢滴加入氧化枸杞多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；之后，向反应液中加入0.1g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.1g 硼氢化钠，相同条件下继续反应24h；收集反应液于双蒸水中透析48h，截取分子量>3500Da，冷冻干燥，得到乙二胺修饰的阳离子化枸杞多糖。
配制浓度为5mg/ml的乙二胺修饰的阳离子化枸杞多糖水溶液，取20μl上述溶液和20μl 含1μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热45min；立即混合，涡旋30s，即得到乙二胺修饰的枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
实施例三、精胺修饰的枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备：
取0.2g 氧化枸杞多糖，溶解于20ml 双蒸水中；称0.5g 精胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9）；将含有精胺的硼酸盐溶液缓慢加入到氧化枸杞多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；之后，向反应液中加入0.3g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.3g 硼氢化钠，相同条件下继续反应24h；收集反应液于双蒸水中透析48h，截取分子量>3500Da，冷冻干燥，得到精胺修饰的阳离子化枸杞多糖。
配制浓度为6mg/ml的精胺修饰的阳离子化枸杞多糖水溶液，取20μl上述溶液和20μl 含1μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热30min；立即混合，涡旋30s，即得到精胺修饰的枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
实施例四、精胺修饰的枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备：
取0.5g 氧化枸杞多糖，溶解于20ml 双蒸水中；称0.6g 精胺溶解于5ml的硼酸盐缓冲液（pH=9）；将含有精胺的硼酸盐溶液缓慢加入到氧化枸杞多糖溶液中，同时进行磁力搅拌；加完之后，磁力搅拌，室温反应24h；之后，向反应液中加入0.4g 硼氢化钠，相同条件下继续反应48h；再向反应液中加入0.4g 硼氢化钠，相同条件下继续反应24h；收集反应液于双蒸水中透析48h，截取分子量>3500Da，冷冻干燥，得到精胺修饰的阳离子化枸杞多糖。
配制浓度为2mg/ml的精胺修饰的阳离子化枸杞多糖水溶液，取20μl上述溶液和20μl 含1μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热30min；立即混合，涡旋20s，即得到精胺修饰的枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
实施例五、PEI修饰的枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备：
取0.2g精制的枸杞多糖，溶于10ml磷酸盐缓冲液（pH=7）；将活化羟基的连接剂N，N’-羰基二咪唑（ Aldrich, 美国）0.2g溶解于5ml二氯甲烷中，在氮气的保护下，首先在多糖液中加入催化剂三乙胺0.1ml，再将羟基连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，匀速搅拌，在60min内加完，加完之后，室温反应120min，获得活化的多糖溶液；将3g小分子量PEI溶于10ml磷酸盐缓冲液中，加入催化剂三乙胺0.1ml，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到活化的多糖溶液中，在120min内加完，避光、室温下反应10h，整个反应在匀速搅拌下进行；反应完成之后的溶液经透析冻干，得到PEI 修饰的枸杞多糖。
配制浓度为0.1mg/ml的PEI修饰的阳离子化枸杞多糖水溶液，取20μl上述溶液和20μl 含2μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热45min；立即混合，涡旋45s，即得到PEI修饰的枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
实施例六、PEI修饰的枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统的制备：
取0.8g精制的枸杞多糖，溶于10ml磷酸盐缓冲液（pH=7）；将活化羟基的连接剂羰基咪唑（ Aldrich, 美国）3.0g溶解于5ml二氯甲烷中，在氮气的保护下，首先在多糖液中加入催化剂三乙胺0.8 ml，再将羟基连接剂的二氯甲烷溶液缓慢加入多糖溶液中，匀速搅拌，在60 min内加完，加完之后，室温反应120min，获得活化的多糖溶液；将32 g小分子量PEI溶于10ml磷酸盐缓冲液中，加入催化剂三乙胺0.8ml，在避光、氮气保护、室温条件下缓慢加入到活化的多糖溶液中，在120 min内加完，避光、室温下反应10 h，整个反应在匀速搅拌下进行；反应完成之后的溶液经透析冻干，得到PEI 修饰的枸杞多糖。
配制浓度为8mg/ml的PEI修饰的阳离子化枸杞多糖水溶液，取20μl上述溶液和20μl 含1μg DNA质粒溶液，分别在55℃加热30min；立即混合，涡旋60s，即得到PEI修饰的枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的基因传递系统。
以苯并三唑碳酸酯（ Aldrich, 美国）或N,N’-二琥珀酰亚胺基硫酸酯（ Aldrich, 美国）替代羰基咪唑重复上述实验，得到相同的结果。
实施例七、电泳检测：
1．制备1%琼脂糖凝胶，加入0.5μg/ml 溴化乙啶，铺板，用实施例二至实施例六制得的产品加样，在80V电泳1.5h后采用凝胶成像系统观察结果。结果显示阳离子化枸杞多糖能够稳定的滞留DNA质粒，有效的结合质粒，其结果见图2。（图2A、2B、2C中分别有6、7、8个不同多糖与DNA的比例，相对应的多糖与DNA比例未在实施例中全部列出，每种多糖各举1~2个实施例为代表）
琼脂糖DNA电泳步骤：
步骤1. 制备1%琼脂糖凝胶:称取0.3g 琼脂糖置于锥形瓶中，加入30ml 0.5×TBE，瓶口倒扣小烧杯。微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即得到1.0%琼脂糖凝胶液。
步骤2. 胶板制备：将电泳槽内的有机玻璃内槽和制胶槽洗干净，晾干，放入制胶玻璃板，将内槽放入卡槽内，并在固定位置放好梳子。待琼脂糖凝胶溶液冷却到65℃左右，向其中加0.5μg/ml溴化乙锭，混匀，小心地倒入有机玻璃内槽，是凝胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下，静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。
步骤3. 加样：在点样板上混合 DNA复合物样品和上样缓冲液，用10μl微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内。
步骤4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压70~100V，样品由正极（红色）向负极（黑色）方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板前沿约1cm处时，停止电泳。
步骤5. 电泳完毕后，取出凝胶，清水漂洗10min。
步骤6. 观察照相：在紫外灯下观察，DNA存在则显示出橙红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。可见阳离子化枸杞多糖对DNA质粒具有明显的结合包裹作用。
2. 以TGFβ-1质粒为报告基因，按照实施例一、二、三所述制备三种阳离子化枸杞多糖-DNA质粒纳米粒基因传递系统。96孔板中培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，细胞浓度达到2×105/ml 完全培养基/孔，孵育24-48h后，用无血清培养基置换原培养基，分别加入三种阳离子化枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物、脂质体LipofectamineTM 2000-DNA质粒复合物、游离质粒，使每孔质粒DNA量均为0.2μg，并以空白细胞为阴性对照，孵育4h后，将无血清培养基置换成新鲜的含血清培养基，继续孵育72h，Rat TGF-β1 ELISA Kit检测转染效果。结果显示，游离质粒孔TGF-β1表达水平最低，精胺及小分子量PEI修饰的枸杞多糖-DNA纳米复合物孔TGF-β1表达效果显著高于游离质粒孔，并与LipofectamineTM 2000-DNA质粒复合物的表达水平相近，而乙二胺修饰的阳离子枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物转染效率最高，TGF-β1的表达水平明显高于PEI（25KD）和LipofectamineTM 2000-DNA质粒复合物的表达水平。由此可见，乙二胺修饰的阳离子枸杞多糖是上述基因传递载体的最佳选择。
实施例八、细胞转染效果的检测：
步骤1. 干细胞分离及培养：将SD大鼠拉颈处死，体积分数为75%的乙醇浸泡3-5min, 无菌条件下取出胫骨和股骨；将其两端干骺端切除，露出骨髓腔，用无菌注射器吸取适量PBS彻底冲洗骨髓腔；反复吹打冲出骨髓；使骨髓细胞充分分散；所获得的骨髓单细胞悬液沿管壁缓慢滴加于预置的Percoll分离液（相对体积质量1.073）的离心管中，骨髓单细胞悬液与分离液的体积比为1：1；2000rpm，离心20min，吸取中间云雾状细胞层，用PBS洗涤3次；用完全培养基（含体积分数为10%胎牛血清的DMEM）重悬细胞，置于培养瓶中，于37℃含有体积分数为5%的CO2培养箱中培养。
步骤2. 细胞转染
取乙二胺修饰的阳离子枸杞多糖-DNA复合物（质粒含量为0.2μg/孔）分别加至96孔板中（2×105/ml 完全培养基/孔）并轻轻摇晃使其均匀混合；放置37℃，5%CO2培养箱孵育72h，以LipofectamineTM 2000-DNA质粒复合物作为阳性对照，Rat TGF-β1 ELISA Kit检测转染效果。
取精胺修饰的阳离子枸杞多糖-DNA复合物（质粒含量为0.2μg/孔）分别加至96孔板中（2×105/ml 完全培养基/孔）并轻轻摇晃使其均匀混合；放置37℃，5%CO2培养箱孵育72h，以LipofectamineTM 2000-DNA质粒复合物作为阳性对照，Rat TGF-β1 ELISA Kit检测转染效果。
取小分子量PEI修饰的阳离子枸杞多糖-DNA复合物（质粒含量为0.2μg/孔）分别加至96孔板中（2×105/ml 完全培养基/孔）并轻轻摇晃使其均匀混合；放置37℃，5%CO2培养箱孵育72h，以LipofectamineTM 2000-DNA质粒复合物作为阳性对照，Rat TGF-β1 ELISA Kit检测转染效果。
其结果见图5。
Claims (1)
1. 一种阳离子化枸杞多糖纳米粒基因传递系统，其特征是：它是一种用胺类化合物修饰的枸杞多糖结合DNA质粒的基因传递系统，枸杞多糖的分子量分布为：20 KD~40 KD，其中按质量比计， 阳离子化枸杞多糖:DNA质粒=1~200:1，阳离子化枸杞多糖-DNA质粒纳米复合物的粒径为351-414nm，所述的胺类化合物为精胺、乙二胺或数均分子量为600Da-2000Da的聚乙烯亚胺。
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