CN103665384A - 新型阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体制备方法和应用 - Google Patents
新型阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及新型阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体的制备方法和应用。通过开环共聚和酰胺化反应合成新型阳离子接枝共聚物聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺(PCL-g-LPEI)，其多重复合非病毒基因载体的组成包括：(A)载质粒DNA的聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺阳离子复合物作为多重基因复合物的内核；(B)肿瘤靶向配体透明质酸(HA)通过正负电荷相互作用包裹阳离子复合物，作为多重基因复合物的外壳。该新型非病毒基因载体构建的多重复合基因具有细胞毒性低，血液相容性好，转染效率高，肿瘤靶向作用等优势，期望在临床基因治疗中获得应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和药物制剂领域，涉及新型阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体制备方法。具体涉及新型阳离子接枝共聚物PCL-g-LPEI的合成；本发明还涉及构建PCL-g-LPEI/DNA复合物和载透明质酸(HA)多重基因复合物的制备方法，作为低毒高效基因载体在基因治疗中应用。
背景技术
近年来，新型基因治疗方法为癌症治疗、遗传疾病等提供良好的发展前景。研制安全有效、细胞毒性低和肿瘤靶向性非病毒基因传递系统，将成为基因治疗成功的重要因素。基因载体是目前基因治疗的关键难点，主要包括病毒载体和非病毒载体。尽管病毒载体转染效率较高，但存在免疫原性、致瘤性、细胞毒性，制备复杂，对外源基因容量有限(Collin SA，Guinn BA，Harrison PT，et al.Viral vectors in cancer immunotherapy：which vector for which strategy.Current Gene Therapy.2008，8：66-78.)等自身难以克服的隐患，临床应用受到限制。非病毒基因载体转染效率较病毒载体低，但易于制备生产，无免疫原性，无传染性，载基因容量大，具有良好生物相容性(Schatzlein AG.Non-viral vectors in cancer gene therapy：principles and progress.Anti-Cancer Drugs.2001，12：275-304.)，已成为基因治疗领域的研究热点。
聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是迄今为止研究得最为广泛的阳离子聚合物非病毒基因载体。PEI易于逃离内涵体，在体内外均有较高的转染效率，但细胞毒性大，不能应用于临床。有研究报道PEI的转染效率随分子量的增加而提高(Kunath K，Harpe A，Fischer D，et al.Low-molecular-weight polyethylenimine as a non-viral vectors for DNA delivery：comparison of physicochemical properties，transfection efficiency and in vivo distribution with high-molecular-weight polyethylenimine.Journal of Controlled Release.2003，89：113-125.)，细胞毒性也随之增大。PEI的细胞毒性，主要是由其正电性对细胞膜具有较好的亲和力所致，也是其携载基因进入细胞的作用原理。如何改造阳离子聚合物PEI，降低细胞毒性、提高转染效率成为基因载体研究亟待解决的问题。
治疗基因成功进入靶细胞进行表达，需要克服一系列生理障碍：血液循环稳定性，细胞膜，内涵体，胞浆传递以及细胞核膜。带大量正电荷PEI与基因形成带正电的复合体，内吞进入细胞形成内含体，通过质子海绵效应成功从内含体逃逸，进入细胞质。苏靖采用酰胺键交联小分子量PEI衍生物作为基因载体，细胞毒性降低，转染效率提高，在多种细胞中具有 较好的生物活性，但形成的PEI-基因复合物多带有正电荷，易与血液中带负电分子如血清蛋白等凝聚，甚至引起补体活化和血细胞凝固(中国专利，申请号：201110327084.6.)。PEG通过共价键或离子键修饰PEI，可提高生物相容性，遮蔽表面正电荷，降低与血清蛋白等物质的结合，延长体内循环时间(中国专利，申请号：200880023048.7.)，但形成基因复合物稳定性差，粒径过大，不易被细胞摄取。采用疏水性材料修饰PEI，可改善基因复合物的稳定性，降低粒子平均粒径。将超支化PEI与疏水性聚(γ-苯甲基L-谷氨酸盐)片段(PBLG)反应生成水溶性PP，可有效包载pDNA，避免核酸酶的降解，形成平均粒径为96nm的纳米粒，细胞毒性降低，且在HeLa细胞、Vero细胞和293T细胞的体外转染效率明显高于PEI(Tiana H，Xiong W，Wei J，et al.Gene transfection of hyperbranched PEI grafted by hydrophobic amino acid segment PBLG.Biomaterials.2007，28：2899-2907.)。
靶向药物传递系统能将药物或基因最大限度地运送到靶部位或靶细胞，降低对非靶部位的影响，从而提高疗效降低毒副作用。靶向制剂主要分为被动靶向制剂和主动靶向制剂。细胞表面存在大量受体，主动靶向制剂含相应配体，对靶部位有特异亲和作用，靶向效率高，成为最具有应用前景的一类靶向制剂。目前，国内外报道用于主动靶向制剂设计的配体主要有：叶酸，整合素，细胞生长因子，半乳糖，转铁蛋白，RGD多肽，白介素-2等。研究表明靶向基团修饰的基因载体能够提高对某些细胞的特异性，进而提高转染效率(Liang B，He ML，Chan CY，et al.The use of folate-PEG-grafted-hybranched-PEI nonviral vector for the inhibition of glioma growth in the rat.Biomaterials.2009，30：4014-4020.)。
多数恶性肿瘤及其周围基质组织有高浓度的透明质酸(HA)，过度表达HA受体CD44。HA是由单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的带负电荷的粘多糖，作为抗肿瘤药物的靶向载体，能够将较小的药物分子黏附在网状结构中或者将药物分子接枝到透明质酸类药物载体上，形成的粒子或复合物与肿瘤细胞表面受体靶向结合，使更多的药物分子进入肿瘤组织，增加在肿瘤和淋巴结中的吸收和滞留时间，提高药物的疗效，降低毒副作用(Saravanakumar G，Ki Young Choi KY，et al.Hydrotropic hyaluronic acid conjugates：Synthesis，characterization，and implications as a carrier of paclitaxel.International Journal of Pharmaceutics.2010，394：154-161.)。HA修饰DNA/PEI复合物，可改变表面性质，减少与血清蛋白等的非特异性结合，作为靶向配体与细胞受体特异性结合，提高基因转染效率。
针对阳离子聚合物PEI细胞毒性大，转染效率低和在转染过程中引起血细胞凝固等问题，合成一种新型阳离子接枝聚合物，选用亲脂性材料聚己内酯(PCL)连接亲水端聚乙烯亚胺(LPEI)，使得阳离子LPEI覆盖于纳米粒表面，使纳米粒带正点荷，构建质粒DNA复合物，再利用透明质酸(HA)包裹基因复合物，构建多重复合物，从而提高其细胞转染效率和肿瘤主动靶向性，以期望该非病毒基因载体多重复合物在临床基因治疗中具有潜在应用价值。
发明内容
本发明目的在于提供一种新型阳离子接枝共聚物，尤其发明了具有肿瘤靶向的多重复合非病毒基因载体及其制备方法，为提供低毒、转染率高和高靶向性基因药物的应用提供科学思路和理论基础。首先采用开环共聚合成端基为羧基的PCL，通过酰胺化反应接枝到LPEI上，制备阳离子接枝共聚物(PCL-g-LPEI)；再与质粒DNA复合形成复合物，作为多重基因复合物得内核，利用靶向自装新技术，将带负电HA通过静电作用包裹在复合物外层，作为多重基因复合物的外壳。本发明提供的多重复合非病毒基因载体，具有细胞毒性显著降低，转染效率提高，血液相容性好等优势，具有潜在的临床应用价值。
本发明提供一种新型阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体，其特征是，该阳离子接枝共聚物通过开环共聚合成端基为羧基的聚己内酯，利用酰胺化反应接枝到L聚乙烯亚胺上，合成阳离子接枝共聚物聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺(PCL-g-LPEI)；所述多重复合非病毒基因载体的组成包括：(A)载质粒DNA的PCL-g-LPEI阳离子复合物作为多重基因复合物的内核；(B)肿瘤靶向配体透明质酸通过正负电荷相互作用包裹阳离子复合物，作为多重基因复合物的外壳；阳离子接枝共聚物PCL-g-LPEI的结构式为：
阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体组装多重基因复合物示意图如图1。
其中，L聚乙烯亚胺为线性结构，分子量为10000～25000Da；聚己内酯分子量为 1000～4500Da，透明质酸分子量为4000～45000Da；通过控制聚合反应的单体投料比，聚合反应时间以及聚合反应温度，控制聚己内酯的分子量和接枝率；按照质量计算：聚己内酯与L聚乙烯亚胺的比例为1∶2.5～1∶40，接枝率为5～35％。
阳离子复合物中聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺与质粒DNA的N/P(即氨基氮摩尔数/DNA的PO3 -摩尔数)比为10～40∶1；多重基因复合物中透明质酸与聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺的COO-/N(透明质酸的羧基摩尔数/聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺的氨基氮摩尔数)比为1～12∶1。
本发明提供一种新型阳离子接枝共聚物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以纯化水为引发剂，将ε-己内酯和纯化水加入三口瓶，摩尔比为20∶0.5～1.5，加催化剂Sn(Oct)2，120℃反应2～4h，冷却至室温，加入氯仿溶解，加甲醇沉淀，滤取沉淀，40℃真空干燥4h，即得聚己内酯(PCL)；
(2)将聚己内酯加入三口瓶，加N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加二甲亚砜(DMSO)溶解，氮气保护25℃反应12h，加L聚乙烯亚胺(LPEI)，搅拌溶解，80℃反应48h，过滤，置透析袋在去离子水中透析72h，透析袋截止分子量8000，冷冻干燥，即得聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺(PCL-g-LPEI)。
本发明提供一种新型阳离子接枝聚合物及多重复合非病毒基因载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺(PCL-g-LPEI)溶于纯化水中，超声溶解，探针超声10min，过滤除菌，用0.22μm Milipore膜过滤除菌；取质粒DNA适量，配制成0.2μg/μL DNA水溶液，用0.22μm Milipore膜过滤除菌；按照选定N/P比，将PCL-g-LPEI溶液滴加至DNA水溶液，涡旋30s，37℃孵育0.5h，即得阳离子基因复合物；
(2)取透明质酸(HA)适量，加纯化水溶解，用0.22μm Milipore膜过滤除菌，按照选定的COO-/N比，将透明质酸溶液缓慢滴加至阳离子基因复合物中，混匀，37℃继续孵育0.5h，得多重基因复合物。
多重基因复合物平均粒径在20～350nm，是靶细胞胞吞摄取复合物的适当大小分布。
本发明提供的多重复合基因载体和多重基因复合物，其特征是，所述多重基因复合物，其中核酸为含有编码遗传标记的质粒DNA序列，包括报告基因和治疗基因两种，所述报告基因是绿色荧光蛋白质粒DNA选自EGFP-C1、EGFP-C2、EGFP-C3，EGFP-N1，虫荧光素酶质粒DNA选自pGL3、pGL4，优选PGL4.74，；治疗基因选自血管内皮生长因子、p53、干扰素、肿瘤坏死因子、白介素-12、白介素-2及其组合；多重基因复合物的平均粒径为20～250nm。
本发明提供的多重复合基因复合物，其特征是，体外转染细胞方法，包括使细胞与多重 复合基因复合物接触，在允许多重基因复合物进入细胞及DNA在细胞中表达的条件下培养细胞。
本发明提供的多重复合基因载体的应用，其特征在于，多重复合物或复合物可用于体外细胞递送DNA的用途，更重要作为肿瘤靶向非病毒基因载体，在生物技术、药物制剂领域具有潜在治疗肿瘤的应用。
本发明的新型阳离子接枝共聚物及多重复合基因复合物，其特征在于，所述多重复合物在临床给药剂型为纳米粒、胶束，给药方式为静脉注射、黏膜给药。
本发明新型阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体，具有转染效率高，细胞毒性小，安全高效，肿瘤细胞靶向等优势，将在基因治疗中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体组装多重基因复合物示意图
图2是阳离子聚合物PCL-g-LPEI和LPEI25K的细胞毒性图
图3是阳离子聚合物PCL-g-LPEI与DNA复合物电泳迁移率图
图4是绿色荧光蛋白荧光显微镜图
图5是细胞转染荧光素酶质粒效率图
具体实施方案
实施例1：阳离子聚合物PCL-g-LPEI的合成
采用开环共聚法，将ε-己内酯(106.7mL，1.0mol)和纯化水(1mL，55.6mmol)注入三口瓶，加入催化剂Sn(Oct)2(1.8mL，5mmol)，120℃反应2h，冷却至25℃，加入适量氯仿溶解，加到过量甲醇中沉淀，滤取沉淀，40℃真空干燥4h，即得聚己内酯(PCL)。
经红外FT-IR和核磁共振氢谱1H NMR对PCL结构进行表征，解谱如下：
FT-IRIR(KBr)：3426.2(vOH(COOH))，2946.2(vas CH2)，2866.4(Vs CH2)，1739.1(vs C=O(COOH))，1471.6(βCH2)，1419.8(βOH(COOH))，1398.1(βoH(CH2OH))，1295.4(vC-O-C)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.35～1.41(H1，CH2)，δ1.62～1.68(H2，CH2)，δ2.28～2.31(H3，CH2)，δ4.05～4.07(H4，CH2)。
PCL的产率为58.3％，分子量为2392Da。
通过酰胺反应，将PCL(12.0g，5mmol)溶于DMSO中，加DCC(1.0g，5mmol)，NHS(0.6g，5mmol)，氮气保护25℃反应12h，加LPEI(2.2g，50mmol)，搅拌，溶解，在80℃反应48h，滤取溶液，在去离子水中透析72h(分子量是8000)，冷冻干燥，即得PCL-g-LPEI。
经红外FT-IR和核磁共振氢谱1H NMR对PCL-g-LPEI结构进行表征，解谱如下：
FT-IR(KBr)：3439.4(vOH和vNH(分子间多聚缔合))，2946.6(vas CH2)，2892.3(vs CH3)，2741.2(vs CH2)，1725.7(vs C=O(COO))，1642.8(vs C=O(CONH)，1469.4(βCH2)，1398.4(βOH)。
1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ1.36～1.41(2H，COCH2CH2CH 2，PCL)，δ1.60～1.68(4H，CH 2CH2CH 2CH2O，PCL)，δ2.28～2.33(2H，CH 2O，PCL)，δ2.55～3.10(brd，NHCH 2CH 2，LPEI)，δ4.04～4.08(2H，COCH 2，PCL)。
LPEI的分子量是10000Da，PCL-g-LPEI的产率为51.3％，PCL接枝率为9.6％。
实施例2：阳离子聚合物PCL-g-LPEI的合成
采用开环共聚法，将ε-己内酯(106.7mL，1.0mol)和纯化水(1mL，55.6mmol)注入三口瓶，加入催化剂Sn(Oct)2(1.8mL，5mmol)，120℃反应2h，冷却至室温，加入适量氯仿溶解，加到甲醇中沉淀，滤取沉淀，40℃下真空干燥，即得聚己内酯(PCL)。
PCL的产率为58.3％，分子量为2392Da。
通过酰胺反应，将PCL(12.0g，5mmol)溶于适量DMSO中，加DCC(1.0g，5mmol)，NHS(0.6g，5mmol)，氮气保护25℃反应12h，加LPEI(1.1g，25mmol)，搅拌，溶解，在80℃反应48h，滤取溶液，在去离子水中透析72h(透析袋截止分子量8000)，冷冻干燥，即得PCL-g-LPEI。
LPEI的分子量是10000Da，PCL-g-LPEI的产率为47.4％，PCL接枝率为19.2％。
实施例3：阳离子聚合物PCL-g-LPEI的合成
通过开环共聚反应，将ε-己内酯(106.7mL，1.0mol)和纯化水(0.9mL，50.0mmol)注入三口瓶，加入催化剂Sn(Oct)2(1.8mL，5mmol)，120℃反应4h，冷却至室温，加入适量氯仿溶解，滴加到过量甲醇中沉淀，滤取沉淀，40℃真空干燥4h，即得聚己内酯(PCL)。
PCL的产率为51.8％，分子量为2996Da
采用酰胺反应，将PCL(15.0g，5mmol)溶于适量DMSO中，加DCC(1.0g，5mmol)，NHS(0.6g，5mmol)，氮气保护25℃反应12h，加LPEI(2.2g，25mmol)，搅拌，溶解，在80℃下反应48h，滤取溶液，在去离子水中透析72h(透析袋截止分子量8000)，冷冻干燥，即得PCL-g-LPEI。
LPEI的分子量是10000Da，PCL-g-LPEI的产率为52.8％，PCL接枝率为8.9％。
实施例4：阳离子聚合物PCL-g-LPEI的合成
采用开环共聚反应，将ε-己内酯(106.7mL，1.0mol)和纯化水(0.9mL，50.0mmol)注入三口瓶，加入催化剂Sn(Oct)2(1.8mL，5mmol)，120℃反应4h，冷却至室温，加入适量氯仿溶解，滴加到过量甲醇中沉淀，滤取沉淀，40℃真空干燥，即得聚己内酯(PCL)。
PCL的产率为51.8％，分子量为2996Da
通过先胺反应，将PCL(15.0g，5mmol)溶于适量DMSO中，加DCC(1.0g，5mmol)，NHS(0.6g，5mmol)，氮气保护25℃反应12h，加LPEI(1.1g，25mmol)，搅拌，溶解，在80℃下反应48h，滤取溶液，在去离子水中透析72h(透析袋截止分子量8000)，冷冻干燥，即得PCL-g-LPEI。
LPEI的分子量是10000Da，PCL接枝率为18.8％，PCL-g-LPEI的产率为49.3％。
实施例5：多重复合基因载体的制备
(1)取1mg PCL-g-LPEI，加纯化水2mL，超声15min，探针超声10min，溶解，得浓度为0.5mg/mL聚合物溶液，过0.22μm的Milipore膜除菌；取质粒DNA50μg，加纯化水，配制成0.2μg/μL DNA溶液，过0.22μm的Milipore膜除菌；按照选定的N/P(1∶1～40)比，将PCL-g-LPEI溶液滴加至DNA水溶液，涡旋30s，37℃孵育0.5h，得阳离子基因复合物。
(2)取HA1mg，加纯化水溶解，得浓度为1mg/mL HA溶液，用0.22μm的Milipore膜过滤除菌，按照选定的COO-/N(1～12∶1)比，将HA溶液缓慢滴加至阳离子基因复合物中，混匀，37℃继续孵育0.5h，得多重基因复合物。
实施例6：细胞毒性试验
将SGC-7901细胞接种于96孔培养板中，密度为8x103个/孔，置于37℃、5％CO2孵箱中培养24h，分别加入浓度1、10、50、100、250μg/mL PCL-g-LPEI(实施例1)无血清培养基溶液100μL，以相同浓度PEI25K作阳性对照，同时设空白对照，每组设定三个复孔，孵育24h，每孔加入0.5mg/mL MTT有血清培养液100μL，继续孵育3h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加DMSO150μL，静止15min，然后放入酶标仪，振荡20s，在酶标仪上测定每孔OD值，测定波长为570nm，试验平行操作三次。细胞生存率按下列公式计算：
细胞生存率(％)＝实验组细胞OD均值/对照组细胞OD均值×100％
如图2所示PCL-g-LPEI的细胞毒性试验结果。浓度为1μg/mL时，PCL-g-LPEI的细胞存活率为100％，高于PEI25K的细胞存活率88％。浓度增大，PCL-g-LPEI的细胞存活率稍有降低。在研究浓度范围内，PCL-g-LPEI的细胞平均存活率显著高于阳性对照组PEI25K(P＜0.05)，细胞毒性降低，生物相容性提高。
实施例7：琼脂糖凝胶电泳实验
称取PCL-g-LPEI适量，加纯化水，超声15min，探针超声10min，溶解，过0.22μm Milipore膜除菌；取质粒DNA(EGFP-C2)1μg，加纯化水，配制成0.2μg/μL DNA溶液，过0.22μm膜除菌；按照选定N/P(1∶1，1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶30)比，将PCL-g-LPEI溶液滴加至DNA水溶液，涡旋30s，37℃孵育0.5h，得阳离子基因复合物样品。采用移液器量取30μL样品，加入loading buffer2μL混匀，加到10％琼脂糖加样孔中，选择电压90V，时间30min进行电泳。电泳结束后取出凝胶，采用凝胶成像仪观察并拍照，记录实验结果。
如图3所示不同N/P比PCL-g-LPEI阳离子复合物凝胶电泳照片。N/P比小于15时，与对照DNA相同位置出现亮带，DNA未被缩合，体系中有大量游离DNA；N/P比大于15时，游离DNA亮带消失，DNA被完全压缩。PCL-g-LPEI与DNA复合的最佳N/P为15～20∶1。
实施例8：体外转染定性试验
按照实施例8制备阳离子基因复合物样品，将SGC-7901细胞接种到24孔板中，密度为4×104个/孔，在37℃，5％CO2条件下培养24h。吸去旧培基，每孔加新鲜不含FBS DMEM培养基500μL。培养4小时，加入多重基因复合物溶液(含有质粒DNA2μg)，37℃，5％CO2细胞培养箱内继续培养6h后，吸去培养液，用PBS缓冲液冲洗细胞2次，加入含10％FBS的DMEM培养液500μL，继续培养18h，使进入细胞内的基因得以表达，利用倒置荧光显微镜观察。同时采用裸DNA作为阴性对照，用阳离子聚合物PEI25K作为阳性对照，操作按试剂盒说明书进行，转染试验平行进行三次。
如图4所示多重复合基因载体的体外转染试验荧光照片。多重基因复合物转染24h，细胞中有很强的荧光强度，表明多重复合基因载体能够体外转染基因，用于向细胞递送DNA。
实施例9：体外转染定量试验
按照实施例8制备阳离子基因复合物，取1mg HA，加纯化水溶解，得浓度为1mg/mL HA溶液，用0.22μm膜过滤除菌，按照COO-/N比6∶1，将HA溶液缓慢滴加至阳离子基因复合物中，混匀，37℃继续孵育0.5h，得多重基因复合物。
将SGC-7901细胞接种到24孔板，密度为1×105个/孔，置于细胞培养箱内37℃，5％CO2条件下培育24h。吸去培养液，加入多重基因复合物(含有质粒DNA2μg)，细胞培养箱内继续培养6h后，去除培养液，用PBS缓冲液冲洗细胞2次，每孔加入含10％FBSDMEM培养液500μL，继续培养44h。采用荧光素酶报告基因检测试剂盒测定荧光值。
如图5所示不同N/P多重复合基因载体细胞转染荧光素酶质粒效率。N/P低于20时，多重复合基因载体的转染效率随N/P增大而增大，高于20时，随N/P增大，转染效率下降。N/P为20是多重复合基因载体的最佳转染条件，且高于阳性对照组PEI25K转染效率。
Claims (7)
1.一种新型阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体，其特征是，该阳离子接枝共聚物通过开环共聚合成端基为羧基的聚己内酯，利用酰胺化反应接枝到L聚乙烯亚胺上，合成阳离子接枝共聚物聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺；所述多重复合非病毒基因载体的组成包括：(A)载质粒DNA的聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺阳离子复合物作为多重基因复合物的内核；(B)肿瘤靶向配体透明质酸通过正负电荷相互作用包裹阳离子复合物，作为多重基因复合物的外壳；阳离子接枝共聚物聚己内酯-g-线性聚乙烯亚胺的结构式为：
阳离子接枝共聚物及多重复合非病毒基因载体组装多重基因复合物示意图如图1；
其中，L聚乙烯亚胺为线性结构，分子量为10000～25000Da；聚己内酯分子量为1000～4500Da，透明质酸分子量为4000～45000Da；通过控制聚合反应的单体投料比，聚合反应时间以及聚合反应温度，控制聚己内酯的分子量和接枝率；按照质量计算：聚己内酯与L聚乙烯亚胺的比例为1∶2.5～1∶40，接枝率为5～35％；
阳离子复合物中聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺与质粒DNA的N/P(即氨基氮摩尔数/DNA的PO3 -摩尔数)比为10～40∶1；多重基因复合物中透明质酸与聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺的COO-/N(透明质酸的羧基摩尔数/聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺的氨基氮摩尔数)比为1～12∶1。
2.根据权利要求1所述新型阳离子接枝共聚物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以纯化水为引发剂，将ε-己内酯和纯化水加入三口瓶，加催化剂Sn(Oct)2，120℃反应2～4h，冷却至室温，加入氯仿溶解，加甲醇沉淀，滤取沉淀，40℃真空干燥4h，即得聚己内酯；
(2)将聚己内酯加入三口瓶，加N，N’-二环己基碳二亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺，加二甲亚砜溶解，氮气保护25℃反应12h，加L聚乙烯亚胺，搅拌溶解，80℃反应48h，过滤，置透析袋在去离子水中透析72h，透析袋截止分子量8000，冷冻干燥，即得聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺。
3.根据权利要求1～2所述的新型阳离子接枝聚合物及多重复合非病毒基因载体的制备方 法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺溶于纯化水中，超声溶解，探针超声10min，过滤除菌，用0.22μm Milipore膜过滤除菌；取质粒DNA适量，配制成0.2μg/μL DNA水溶液，用0.22μm Milipore膜过滤除菌；按照选定N/P比，将聚己内酯-g-L聚乙烯亚胺溶液滴加至DNA水溶液，涡旋30s，37℃孵育0.5h，即得阳离子基因复合物；
(2)取透明质酸适量，加纯化水溶解，用0.22μm Milipore膜过滤除菌，按照选定的COO-/N比，将透明质酸溶液缓慢滴加至阳离子基因复合物中，混匀，37℃继续孵育0.5h，得多重基因复合物。
4.根据权利要求1～3所述的多重复合基因载体和多重基因复合物，其特征是，所述多重基因复合物，其中核酸为含有编码遗传标记的质粒DNA序列，包括报告基因和治疗基因两种，所述报告基因是绿色荧光蛋白质粒DNA选自EGFP-C1、EGFP-C2、EGFP-C3，EGFP-N1，虫荧光素酶质粒DNA选自pGL3、pGL4，优选PGL4.74，；治疗基因选自血管内皮生长因子、p53、干扰素、肿瘤坏死因子、白介素-12、白介素-2及其组合；多重基因复合物的平均粒径为20～350nm。
5.根据权利要求4所述的多重复合基因复合物，其特征是，体外转染细胞方法，包括使细胞与多重复合基因复合物接触，在允许多重基因复合物进入细胞及DNA在细胞中表达的条件下培养细胞。
6.根据权利要求1～5所述多重复合基因载体的应用，其特征在于，多重复合物或复合物可用于体外细胞递送DNA的用途，更重要作为肿瘤靶向非病毒基因载体，在生物技术、药物制剂领域具有潜在治疗肿瘤的应用。
7.根据权利要求1所述阳离子接枝共聚物及多重复合基因复合物，其特征在于，所述多重复合物在临床给药剂型为纳米粒、胶束，给药方式为静脉注射、黏膜给药。
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