CN102675677A - PCL-g-PGMA/明胶复合材料在细胞转染中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PCL-g-PGMA/明胶复合材料在细胞转染中的应用。由于本发明使用的PCL-g-PGMA/明胶复合材料既可以直接吸附细胞，也可以吸附PEI/DNA或其他阳离子转染试剂/DNA复合物。因此本发明在国内外首次提出如图所示的新型转染方法：A方式为材料上粘附细胞后直接进行转染；B方式为材料上吸附PEI/pDNA复合物后再粘附细胞实现细胞的被动转染；C方式为材料上吸附PEI/pDNA复合物后再粘附细胞实现细胞的第一次转染，一天后再进行第二次转染。通过获得GMA功能化修饰聚合物支架，可以实现细胞的两次转染，大大提高了基因转染的效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种PCL-g-PGMA/明胶复合材料在细胞转染中的应用。
背景技术
自从Matyjaszewsk(Szwarc，M.；Levy，M.；Milkovich，R.Journal of the AmericanChemical Society 1956，78，2656-2657)和王锦山提出了一种活性/可控的自由基聚合方法以来，原子转移自由基聚合(简称ATRP)一直都在聚合物材料的制备及改性上发挥着极其重要的作用。与此同时，表面接枝作为一种简单、高效的改性方法在功能性材料的制备中也应用甚广。在此启发下，表面引发的原子转移自由基聚合方法很快吸引了材料学研究者的目光，并很快将大量的研究工作投入到利用表面引发原子转移自由基聚合法制备环境敏感(Friebe，A.；Ulbricht，M.Macromolecules 2009，42，1838-1848.)、抗菌(Yao，F.；Fu，G.-D.；Zhao，J.；Kang，E.-T.；Neoh，K.G.Journal ofMembrane Science 2008，319，149-157)、抗污染(Xu，F.J.；Zhao，J.P.；Kang，E.T.；Neoh，K.G.；Li，J.Langmuir 2007，23，8585-8592)、细胞粘附(Xu F J，Wang Z H，Yang W T.Biomaterials，2010(31)：3139-3147)等功能膜中。聚己内酯(PCL)支架具有一定的功能特性和力学性能，但为了实现基因转染等研究还必须满足医用功能性和细胞粘附性等严峻的基本要求。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。目前非病毒介导的转染技术中，转染效率最高的方法当属阳离子聚合物。该类转染物质介导的细胞转染具有广谱、细胞毒性小、性能稳定等特点，而且不受培养液中的血清和抗生素的干扰，比脂质体介导的转染方法更方便，因而在转染技术领域逐渐占据主流地位。但是目前的瓶颈在于如何进一步提高阳离子聚合物介导的细胞转染效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种PCL-g-PGMA/明胶复合材料在细胞转染中的应用。
由于PCL-g-PGMA/明胶复合材料既可以直接吸附细胞，也可以吸附PEI/DNA或其他阳离子转染试剂/DNA复合物，因此本发明提供了一种新型细胞转染方法：将转染试剂/核酸复合物与待转染细胞混合置于PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，培养，得到目的转染细胞。
具体分为下述三种方法(如图3所示)：
A方式为PCL-g-PGMA/明胶复合材料上粘附细胞后直接进行转染；包括下述步骤：将细胞于转染前12-24小时接种到PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，培养，再将转染试剂/核酸复合物滴加在所述细胞上，室温至37℃孵育24-48小时使细胞转染，得到目的转染细胞。
B方式为PCL-g-PGMA/明胶复合材料上吸附待转染核酸(如PEI/pDNA复合物)后再粘附细胞实现细胞的被动转染；包括下述步骤：将包含待转染核酸的溶液滴加在PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜，孵育1-6小时；接着将细胞滴加在所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，室温-37℃孵育24-48小时，得到目的转染细胞。
C方式为PCL-g-PGMA/明胶复合材料上吸附待转染核酸(如PEI/pDNA复合物)后再粘附细胞实现细胞的第一次转染，12-24小时后再进行第二次转染；包括下述步骤：1)将转染试剂/核酸复合物滴加在PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，孵育1-6小时；接着将细胞滴加在所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，孵育使细胞进行第一次转染；2)弃去原培养基，加入新鲜的培养基，再将包含待转染核酸的溶液滴加在细胞上，孵育使细胞进行第二次转染。
第一次转染中，孵育的温度为室温至37℃，时间12-24小时。第二次转染中，孵育的温度为室温至37℃，时间12-24小时。
在上述转染中，所述转染试剂/核酸复合物中的转染试剂为聚乙烯亚胺，核酸为DNA片段或重组质粒；所述细胞为真核细胞。
通过获得PCL-g-PGMA/明胶复合材料支架，可以实现细胞的两次转染，大大提高了基因转染的效率。
本发明中所用的PCL-g-PGMA/明胶复合材料是按照下述方法制备得到的：
1)制备聚ε-己内酯(PCL)膜；
2)将所述聚ε-己内酯膜置于1，6己二胺的丙醇溶液中浸泡，得到部分端基为氨基的聚ε-己内酯膜PCL-NH2；将膜取出，依次用乙醇、水、乙醇进行清洗并干燥；
3)将步骤2)得到的干燥膜PCL-NH2置于由2-溴-异丁基酰溴(BIBB)、三乙胺和正己烷组成的混合溶液中进行酯化反应，得到表面溴化的聚ε-己内酯膜PCL-Br；将膜取出，依次用乙醇、水、乙醇进行清洗并干燥；
4)在无氧条件下，以步骤3)得到的干燥膜PCL-Br为引发剂、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为接枝单体、溴化铜(CuBr2)和溴化亚铜(CuBr)为催化剂、2，2联吡啶(Bpy)为配位剂，甲醇与水的混合溶液为溶剂，进行原子转移自由基聚合反应，得到聚ε-己内酯/甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝共聚物，即PCL-g-PGMA；将PCL-g-PGMA膜取出，依次用乙醇、水、乙醇进行清洗并干燥；
5)将PCL-g-PGMA膜在明胶水溶液中浸泡，取出后用去离子水清洗并干燥，即得。
其中，步骤1)中聚ε-己内酯膜具体可按照下述方法制备：a)将聚ε-己内酯颗粒溶于二氯甲烷中，完全溶解并在超声装置中振荡除去溶液内所含气泡；b)将聚ε-己内酯溶液倒于培养皿中，用锡纸包覆并在上表面留若干针孔，置于水平台上挥发至干燥成膜。使用时，可根据需要剪切成(1cm×1cm-2cm×2cm)大小。
步骤2)中所述1，6己二胺的丙醇溶液中1，6己二胺的质量浓度可为10-11％。聚ε-己内酯膜在1，6己二胺的丙醇溶液中浸泡的时间可为18-24小时。
步骤3)中所述混合溶液中2-溴-异丁基酰溴、三乙胺和正己烷的体积比依次为(1-1.2)∶(1-1.2)∶(20-20.5)；所述酯化反应的反应温度为20-25℃，反应时间为2-3小时。
步骤4)所述原子转移自由基聚合反应中，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯、溴化铜、溴化亚铜、2，2-联吡啶、甲醇、水的配比依次为(5-5.2)ml∶(0.0084-0.0090g)∶(0.044-0.050)g∶(0.0446-0.0448)g∶(10-10.2ml)∶(2-2.2ml)。
所述原子转移自由基聚合反应的反应温度为25-28℃，反应时间为5-60分钟。
步骤5)中所述明胶水溶液中明胶的浓度为10-12.5mg/ml。PCL-g-PGMA在明胶水溶液浸泡的温度为37-37.5℃，浸泡的时间为24-72小时。
用于固定生物分子的常见官能团包括羧基、环氧、巯基、醛基、羟基以及伯胺等。环氧基团很容易与亲核基团(比如-NH2，-SH，以及-COOH)进行开环反应。特别是PGMA，其具有丰富的环氧基团，很容易与生物分子的-NH2或-COOH官能基团进行开环反应直接耦合功能分子，同时羟基伴随形成，可为生物分子提供一个较亲水的微环境。
本发明方法先将PCL支架进行胺化，再与BIBB反应，得到表面溴化的PCL，接着在水相中ATRP聚合得到亲水性表面PCL-g-PGMA，最后将明胶沉积在该表面得到高细胞吸附性的聚合物支架材料。在该聚合物支架上可以实现细胞的两次转染，大大提高了基因转染的效率。
附图说明
图1为PCL、胺化的PCL以及溴化的PCL的X射线光电子能谱。
图2为不同聚合时间制备的PCL-g-PGMA/明胶复合材料的X射线光电子能谱，其中，(a)PCL-g-PGMA1，(b)PCL-g-PGMA 1-gelatin，(c)PCL-g-PGMA2，(d)PCL-g-PGMA 2-gelatin。
图3为三种转染的示意图；其中，A、PCLPGG介导的先铺细胞后加PEI/pDNA复合物的基因转染；B、PCLPGG介导的先加PEI/pDNA复合物后铺细胞的基因转染；C、PCLPGG介导的先加PEI/pDNA后铺细胞再加PEI/pDNA的基因转染。
图4为正置荧光显微镜下PCL及两种PCL-g-PGMA/明胶复合材料的细胞粘附情况。
图5为正置荧光显微镜下PCL及两种PCL-g-PGMA/明胶复合材料的细胞粘附计数后量化结果。
图6为正置荧光显微镜下PCL及两种PCL-g-PGMA/明胶复合材料的细胞转染。
图7为流式细胞术检测PCL及两种PCL-g-PGMA/明胶复合材料的细胞转染。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中所用的PCL、BIBB、GMA的结构式如下所示：
PCL结构式：
1，6己二胺结构式：NH2(CH2)6NH2
BIBB结构式：
DMAEMA结构式：
实施例1、制备PCL-g-PDMAEMA/明胶复合材料
1、将一定数量(6g)的PCL(Mn：70000-90000)颗粒溶于二氯甲烷中，完全溶解并在超声装置中振荡除去溶液内所含气泡。
2、将PCL溶液倾倒于培养皿中，用锡纸包覆并在上表面留若干针孔，置于水平台上挥发(24-36)小时至干燥成膜。
3、将PCL膜剪成(1cm×1cm-2cm×2cm)大小，待用。
4、将一定数量(4g)1，6己二胺溶于异丙醇中配成质量浓度为10％的溶液，然后将膜放入1，6己二胺溶液汇总浸泡24小时，得到PCL-NH2膜。将膜取出，按照乙醇、水、乙醇的顺序清洗三次，在真空干燥箱中干燥待用。
5、在锥形瓶中配置BIBB(1ml)、三乙胺(1ml)、正己烷(20ml)，将干燥的膜放入BIBB溶液中浸泡反应2小时，得到PCL-Br。将膜取出，按照乙醇、水、乙醇的顺序清洗三次，在真空干燥箱中干燥待用。
6、在三口圆底烧瓶中放入2，2联吡啶(0.0446g)、甲醇(10ml)、水(2ml)、GMA(5ml)，通氮气排氧半小时，将溴化铜(0.0090g)、溴化亚铜(0.050g)放入烧瓶后再将之前干燥的膜(2-3片)放入烧瓶中，在室温25℃、通氮气下反应若干时间(10min-30min)，得到PCL-g-PGMA。反应结束，取出膜，按照乙醇、水、乙醇的顺序清洗三次，在真空干燥箱中干燥待用。
7、在锥形瓶中加明胶0.2g于20ml去离子水中，将反应好的PCL-g-PGMA膜放入锥形瓶中，在37℃浸泡24小时，用去离子水清洗三次，干燥得到PCL-g-PGMA/明胶复合膜。
接枝率和接触角结果见表1。
表1
a在1，6己二胺中浸泡24h制备成的PCL-NH2膜溴化后所得的PCL-Br膜[Br]/[C]＝4.1×10-3
bPCL-Br膜在水相中聚合的条件：在室温甲醇/水(5/1，v/v)中[GMA]∶[CuBr]∶[CuBr2]∶[Bpy]＝100∶1∶0.2∶2(mol/mol)
c将PCL-g-P(GMA)1，PCL-g-P(GMA)2浸泡在10mg/ml的明胶水溶液中后制得。
d接枝率(GY)通过公式(Wa-Wb)/A，其中Wa和Wb分别代表干燥膜在接枝前和接枝后的质量，A是膜的表面积。
e通过X射线光电子能谱所得的相关参数。
PCL、胺化的PCL以及溴化的PCL的X射线光电子能谱如图1所示。由图可知在PCL表面成功固定了NH2，在PCL-NH2膜表面也成功固定了-Br制备出含有引发剂R-Br的PCL表面。
所制备的PCL-g-PGMA以及PCL-g-PGMA-gelatin的X射线光电子能谱如图2所示。由图可知随着接枝时间的增长，接枝聚合物PGMA的量增多，所吸附的明胶量也显著增多。
实施例2、PCL-g-PGMA/明胶复合材料的功能性实验
一、细胞系及培养
正常人胚肾细胞系HEK293，使用DMEM培养基(Hyclone)进行培养，其中添加了10％的胎牛血清(Hyclone)和浓度为0.2％的青链霉素(Invitrogen)。
二、细胞粘附
1、选取处于指数生长期的细胞，以常规方法消化，制备成单细胞悬液。收集悬液，离心(1000转/分钟，8分钟)。
2、弃上清，用新鲜培养基重悬细胞，调整细胞浓度至8×104/0.5mL。
3、将上述0.5mL细胞悬液滴加到每孔的膜上。
4、37℃培养24小时后，弃去上清，PBS洗涤未结合细胞。加入1ml 70％冰乙醇，4℃固定过夜。
5、弃去冰乙醇，PBS洗涤三次。加入50ug/ml PI(碘化丙啶)室温避光染色15分钟。
6、PBS洗涤后，置于正置荧光显微镜下，检测其细胞粘附情况。
三、细胞转染
转染过程中使用的PEI/pDNA复合物：将2.4μl PEI(聚乙烯亚胺)和2.1μl(0.8μg)pEGFP-C1(clontech，目录号：6084-1)加入50μl DMEM培养基(无血清无抗生素)中混匀，室温下温育30分钟。按以下三种方式进行转染：
A、生长良好的细胞(8×104)于转染前一天接种到24孔板中的PCL-g-P(GMA)-gelatin膜上(正常培养)，转染时弃去原培养液，加入新鲜的正常培养基，将PEI/pDNA复合物滴加在细胞上。37℃培养48小时后，然后置于荧光倒置显微镜下，检测其表达情况。
B、将PEI/pDNA复合物直接滴加在24孔板中的PCL-g-P(GMA)-gelatin膜上，室温孵育4小时。将生长良好的细胞(8×104)滴加在膜上。37℃培养48小时后，然后置于荧光倒置显微镜下，检测其表达情况。
C、将PEI/pDNA复合物直接滴加在24孔板中的PCL-g-P(GMA)-gelatin膜上，室温孵育4小时。将生长良好的细胞(8×104)滴加在膜上。37℃培养24小时后，弃去原培养液，加入新鲜的正常培养基，再将PEI/pDNA复合物滴加在细胞上。37℃培养24小时后，然后置于荧光倒置显微镜下，检测其表达情况。
功能性实验结果：
1、PCLPGG(即PCL-g-P(GMA)-gelatin)细胞粘附结果
将8万HEK293细胞分别滴加在PCL，功能化修饰的PCLPGG(即PCL-g-PGMA1-gelatin，接枝10min)、PCLPGG(即PCL-g-PGMA2-gelatin，接枝30min)上。培养24小时后，70％冰乙醇固定PI染色后置于正置荧光显微镜下观察，随机选择5个视野进行计数，结果如图4、5所示。由图可知：相比较未经修饰的PCL，PCL-g-PGMA1-gelatin和PCL-g-PGMA2-gelatin的细胞粘附能力分别提高了20.5倍和25倍。
2、在PCLPGG(即PCL-g-P(GMA)-gelatin)上细胞转染结果
将8万HEK293细胞分别滴加在PCL，功能化修饰的PCLPGG(即PCL-g-PGMA1-gelatin，接枝10min)、PCLPGG(即PCL-g-PGMA2-gelatin，接枝30min)上，分别采用ABC三种转染方式，利用PEI介导pEGFP-C1的转染。A方式为材料上粘附细胞后直接进行转染；B方式为材料上吸附PEI/pDNA复合物后再粘附细胞实现细胞的被动转染；C方式为材料上吸附PEI/pDNA复合物后再粘附细胞实现细胞的第一次转染，一天后再进行第二次转染。分别通过正置荧光显微镜和流式细胞术检测3种材料的细胞转染情况，结果如图2图3显示：以A方式进行转染时，未经修饰的PCL的细胞转染效率为0.2％，PCLPGG 10min和PCLPGG 30min的细胞转染效率分别为32.25％和40％。以B方式进行转染时，未经修饰的PCL的细胞转染效率为0.2％，PCLPGG 10min和PCLPGG30min的细胞转染效率分别为32.25％和43.2％。以C方式进行转染时，未经修饰的PCL的细胞转染效率为0.66％，PCLPGG 10min和PCLPGG 30min的细胞转染效率分别为67.15％和66.3％。常规在24孔板(康宁生产)上进行PEI介导pEGFP-C1的转染，其效率为44.1％。而PCLPGG 10min、PCLPGG 30min两种材料的使用，使得对同一批细胞进行两次转染成为可能(即以C方式进行转染)，因而大大提高了转染效率。
Claims (9)
1.PCL-g-PGMA/明胶复合材料在细胞转染中的应用；
所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料是按照包括下述步骤的方法制备得到的：
1)制备聚ε-己内酯膜；
2)将所述聚ε-己内酯膜置于1，6己二胺的丙醇溶液中浸泡，得到部分端基为氨基的聚ε-己内酯膜PCL-NH2；将膜取出，依次用乙醇、水、乙醇进行清洗并干燥；
3)将步骤2)得到的干燥膜PCL-NH2置于由2-溴-异丁基酰溴、三乙胺和正己烷组成的混合溶液中进行酯化反应，得到表面溴化的聚ε-己内酯膜PCL-Br；将膜取出，依次用乙醇、水、乙醇进行清洗并干燥；
4)在无氧条件下，以步骤3)得到的干燥膜PCL-Br为引发剂、甲基丙烯酸缩水甘油酯为接枝单体、溴化铜和溴化亚铜为催化剂、2，2联吡啶为配位剂，甲醇与水的混合溶液为溶剂，进行原子转移自由基聚合反应，得到聚ε-己内酯/甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝共聚物，即PCL-g-PGMA；将PCL-g-PGMA膜取出，依次用乙醇、水、乙醇进行清洗并干燥；
5)将步骤4)得到的干燥PCL-g-PGMA膜在明胶水溶液中浸泡，取出后用去离子水清洗并干燥，得到PCL-g-PGMA/明胶复合材料。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤2)中所述1，6己二胺的丙醇溶液中1，6己二胺的质量浓度为10-11％；所述浸泡的时间为18-24小时；
步骤3)中所述混合溶液中2-溴-异丁基酰溴、三乙胺和正己烷的体积比依次为(1-1.2)∶(1-1.2)∶(20-20.5)；所述酯化反应的反应温度为20-25℃，反应时间为2-3小时；
步骤4)所述原子转移自由基聚合反应中，所述甲基丙烯酸缩水甘油酯、溴化铜、溴化亚铜、2，2-联吡啶、甲醇、水的配比依次为(5-5.2)ml∶(0.0084-0.0090)g∶(0.044-0.050)g∶(0.0446-0.0448)g∶(10-10.2)ml∶(2-2.2)ml；
步骤4)中所述原子转移自由基聚合反应的反应温度为25-28℃；反应时间为5-60分钟，优选10-30分钟；
步骤5)中所述明胶水溶液中明胶的浓度为10-12.5mg/ml；所述浸泡的温度为37-37.5℃，浸泡的时间为24-72小时。
3.一种细胞转染的方法，包括下述步骤：将转染试剂/核酸复合物与待转染细胞混合置于权利要求1所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，培养，得到目的转染细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法包括下述步骤：将细胞于转染前接种到所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，培养；再将转染试剂/核酸复合物滴加在所述细胞上，孵育，得到目的转染细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：将所述细胞于转染前12-24小时接种到PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上；所述孵育的温度为室温至37℃，时间24-48小时。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法包括下述步骤：将转染试剂/核酸复合物滴加在所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜，孵育1-6小时；接着将细胞滴加在所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，室温至37℃孵育24-48小时，得到目的转染细胞。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法包括下述步骤：
1)将转染试剂/核酸复合物滴加在所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜，孵育1-6小时；接着将细胞滴加在所述PCL-g-PGMA/明胶复合材料膜上，孵育使细胞进行第一次转染；
2)弃去原培养基，加入新鲜的培养基，再将包含待转染核酸的溶液滴加在细胞上，孵育使细胞进行第二次转染。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述孵育使细胞进行第一次转染中，孵育的温度为室温至37℃，时间12-24小时；所述孵育使细胞进行第二次转染中，孵育的温度为室温至37℃，时间12-24小时。
9.根据权利要求3-8中任一项所述的方法，其特征在于：所述转染试剂/核酸复合物中的转染试剂为聚乙烯亚胺，核酸为DNA片段或重组质粒；所述细胞为真核细胞。
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