CN102137924A - 细胞培养制品和筛选 - Google Patents

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Abstract

一种制备具有供培育细胞的合成聚合物层的细胞培养制品的方法，包括用溶剂稀释一种或多种(甲基)丙烯酸酯单体，将稀释的单体分散在细胞培养制品的表面上。除去一些或基本上所有溶剂，然后在制品表面上聚合单体以形成连接于该制品表面的合成聚合物层。

Description

细胞培养制品和筛选
相关申请
本申请要求2008年1月30日提交的，名为“Synthetic Surfaces forCulturing Undifferentiated Stem Cells in Chemically Defined Media(用于在化学成分确定的培养基中培养未分化干细胞的合成表面)”的美国临时申请序列号61/062,890和2008年1月30日提交的，名为“Stem Cell Article andScreening(干细胞制品和筛选)”的美国临时申请序列号61/062,937的优先权。
领域
本发明涉及细胞培养制品和在其上产生表面的方法，更具体地说是产生用于细胞培养，包括干细胞粘附和生长的表面的方法。
背景
多能干细胞，如人类胚胎干细胞(hESC)具有分化为三种胚层中的任一种的能力，从而在人体中形成任何成人细胞类型。这种独特的性能为开发大量严重的细胞退化疾病，如糖尿病、脊髓损伤、心脏病等的新治疗方法提供了可能性。此外，衍生自hESC的细胞可用于药物开发和毒理学研究。几个组织机构已证明hESC分化成不同的细胞类型。然而，开发这种hESC治疗的主要障碍包括(i)在细胞和组织培养中获得并维持足够量的未分化hESC和(ii)控制其分化以产生特定细胞类型。干细胞培养，如hESC细胞培养通常用细胞库或细胞储备物的少量细胞接种，然后在未分化的状态下扩增直至给定的治疗用途需要分化。为达到这点，目前的方法是在有含动物衍生的成分(如滋养层、胎牛血清或购自加利福尼亚州圣何塞BD生物科学公司(BD BiosciencesSan Jose，CA)的MATRIGELTM)的表面或培养基存在下培养hESC或其分化细胞。向培养环境添加这些东西使得细胞接触可能有害的病毒或其它传染性物质，这些有害的病毒或其它传染性物质会转移到患者或损害未分化hESC的常规培养和维持。此外，这些生物产品也易产生批次差异、免疫反应和存储寿命有限。
合成表面可能提供明显的益处以防止上述顾虑。然而，尚未详细研究合成表面对干细胞，特别是hESC行为的影响。已有人提出纳升规模(nanoliter-scale)阵列式合成生物材料的合成以便进行hESC培养应用的高通量筛选。然而，此类小规模培养存在几个问题。例如，由于阵列中各点的尺寸(不一)，各点中细胞的数量受到限制，而相应的细胞反应(cell response)是可疑的。
较大规模地利用此类筛选系统，例如利用传统细胞培养玻璃器皿或塑料器皿也存在问题。例如，难以获得均匀的、无毒的表面以供可靠的培养和筛选，特别是用高粘度的聚合混合物。例如，高粘度可降低产生表面的速度，因此对于高通量筛选可能效率太低。其它高粘度液体可导致大表面积上的涂层不均匀，从而妨碍可靠测定细胞反应的能力。
简述
本发明提供一种涂布方法，该方法(i)能高通量(throughput)筛选供干细胞培养的合成表面和(ii)提供均匀的表面以供可靠检测针对该合成表面的细胞反应。此外，本发明提供一种涂布方法，该方法提供适合于大规模细胞培养的表面。
在一个实施方式中，描述了制备具有供培育细胞的合成聚合物层的细胞培养制品的方法。该方法包括用溶剂稀释一种或多种(甲基)丙烯酸酯单体并将该稀释的单体分散在细胞培养制品的表面。通过，例如蒸发除去约80％或更多的溶剂。该方法还包括除去约80％或更多的溶剂后在制品的表面聚合单体以形成附着于该制品的表面的合成聚合物层(原位聚合)。
在一个实施方式中，描述了筛选细胞-合成聚合物层相互作用的方法。该方法包括用溶剂稀释选择的文库成员(包括一种或多种(甲基)丙烯酸酯成员)并将稀释的所选成员分散入一个或多个细胞培养制品的孔中。分散诸成员从而将给定的稀释所选成员分散在指定的孔中。该方法还包括从孔中除去约80％或更多的溶剂，然后将所选成员的单体在孔中聚合以形成合成的聚合物层。该方法还包括将孔中的合成聚合物层与细胞在细胞培养基中培育并表征预定细胞(例如，干细胞)对与细胞一起培育的各合成聚合物层的行为。
就筛选合成表面支持细胞培养的能力而言，本文的一种或多种实施方式相比于目前提出的方法提供了一种或多种优势。例如，在合成表面制备方法中利用溶剂降低了单体粘度，从而能利用自动化设备，省时省力。其还促进单体铺展从而获得薄或更均匀的涂层，减小单体消耗并提高确定表面是否适于支持所选细胞培养的可靠性。此外，利用溶剂易于降低涂布的表面与基材脱层的可能性。利用某些选择的溶剂，例如乙醇或2-丙醇还提供几种优势，包括毒性低、与大量单体和细胞培养器皿的相容性、与自由基聚合的相容性，等等。此外，利用原位聚合形成聚合网络，该网络不是相互渗透的网络，并可提供耐受脱层并适于细胞培养的表面。当结合附图阅读时，不难从以下详述理解这些和其它优势。
附图简述
图1A-1C是涂布合成聚合物层的制品的侧视图。
图2A是多孔细胞培养平板的顶视图。
图2B和2C是沿图2A中线2b-2b的截面的多孔平板的侧视图。图2B所示孔未涂布。图2C所示孔涂布有合成聚合物。
图3是制备具有合成聚合物层的细胞培养制品的代表性方法的流程图。
图4是筛选细胞与合成聚合物层相互作用的流程图。
图5A-5B是利用Fusion UV传送带系统(A)和Xenon脉冲UV系统(B)测得在组织培养处理的(TCT)聚苯乙烯96孔细胞培养平板的诸孔上固化的二丙烯酸四(乙二醇)酯的相对比图像(phase contrast image)。
图6A是聚苯乙烯基材上(甲基)丙烯酸涂层(二甲基丙烯酸三(乙二醇)酯)截面的共焦拉曼显微镜图像(Confocal Raman Microscopy image)和相应基材与涂布聚合物的拉曼光谱。
图6B是环状烯烃共聚物基材上(甲基)丙烯酸涂层(二甲基丙烯酸三(乙二醇)酯)截面的共焦拉曼显微镜图像和相应基材与涂布聚合物的拉曼光谱。
图7A-7B是显示利用不同UV固化参数；Fusion UV传送带系统(A)和Xenon+UV系统(B)，在基材上形成的合成聚合物层的MRC5细胞增殖(CellTiter，普罗迈格公司(Promega))试验结果的柱状图。
图8A-8B是采用1/1(A)或9/1(B)乙醇/单体工艺，从二丙烯酸四(乙二醇)酯合成的(甲基)丙烯酸涂层的相对比图像。
图9A-9B是采用1/1(A)或9/1(B)乙醇/单体工艺，从甘油1，3-二甘油酸酯二丙烯酸酯(Glycerol 1，3-diglycerolate diacrylate)合成的(甲基)丙烯酸涂层的相差图像。
图10是显示采用用乙醇工艺的(甲基)丙烯酸表面的MRC5细胞增殖(CellTiter，普罗迈格公司)试验结果的柱状图。分别用两种不同单体的混合物聚合物涂层，混合物的主要组分和次要组分为50∶50、70∶30和90∶10。
图11A-11B是粘附于(甲基)丙烯酸酯表面的结晶紫染色的MRC5细胞的图像。(A)用(甲基)丙烯酸聚合物涂布的6-孔板。(甲基)丙烯酸聚合物的单体组成为：(1)二甲基丙烯酸甘油酯；(2)二甲基丙烯酸三甘醇酯；(3)二甲基丙烯酸1，4-丁二醇酯；(4)聚二丙烯酸(乙二醇)酯；(5)二甲基丙烯酸三甘醇酯(70％)、二甲基丙烯酸甘油酯(30％)；(6)二丙烯酸四(乙二醇)酯(70％)、二甲基丙烯酸甘油酯(30％)。(B)TCT对照表面。
图12是不同基材上H1人胚胎干细胞的碱性磷酸酶表达的柱状图。
图13是显示在利用不同溶剂涂布的聚合物层上进行MRC5细胞增殖试验的结果的柱状图。
图14A-14F是MRC-5细胞培养并用结晶紫染色后涂布表面的显微图像。用以下单体形成涂层：TEGDA(a，b)、GDMA(c，d)、BDMA(e，f)，利用乙醇作为溶剂(a，c，e)或DMF作为溶剂(b，d，f)。
图15A-15D是96-孔板的诸孔中结晶紫染色的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的显微图像，在制备可溶胀(甲基)丙烯酸酯表面工艺中利用乙醇(a)、2-丁醇(b)、水(c)和DMF(d)作为溶剂。
图16是显示在用不同溶剂制备并偶联(conjugate)于肽LysGlyGlyAsnGlyGluProArg GlyAspThrTyrArgAlaTyr(SEQ ID NO：1)(BSP肽)的可溶胀(甲基)丙烯酸基材上，未分化H7 hESC的AttoPhosz在化学成分确定的培养基中培养48小时后的荧光强度的柱状图。将所得结果对MATRIGELTM(MG)表面上hESC的AttoPhos荧光强度进行归一化(normalize)。
附图不一定按比例。附图中所用的类似数字指类似的组分、步骤等。然而，应该知道在给定附图中用某数字指代某组分并非限制另一附图中用相同数字标记的组分。此外，利用不同数字指代诸组分并非表示不同编号的组分不能是相同或相似的。
详述
以下详述参考构成其一部分的附图，显示的附图说明了装置、系统和方法的数个具体实施方式。要理解，也考虑了其它实施方式，可作出其它实施方式而不偏离本发明的范围或构思。因此，以下详述并非限制性的。
除非另有规定，本文使用的所有科学和技术术语具有本领域常规使用的含义。本文提供的定义有助于理解本文经常使用的某些术语，并不意味着限制本发明的范围。
除非文中另有明确表述，本说明书和随附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。除非文中另有明确表述，本说明书和随附权利要求书中使用的术语“或”通常按其包括“和/或”的意义使用。
本文所用的“单体”表示能与另一单体聚合的化合物(无论该“单体”是与另一单体相同还是不同的化合物)，该化合物的分子量低于约1000道尔顿。在许多情况中，单体的分子量低于约400道尔顿。
术语“水凝胶”已用于描述细胞培养表面。“水凝胶”定义各异，包括吸水量大于或等于其干重的30％或最高10,000％的凝胶或明胶。当接触水时，水凝胶溶胀但不溶解。术语“水凝胶”是极为宽泛的术语，描述了具有宽泛的水溶胀和吸水特征的各种材料。
本文所用的“可溶胀的(甲基)丙烯酸酯”或“SA”表示用至少一种烯键式不饱和单体(丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯单体)制备的合成聚合物层，该单体具有至少一定的交联程度，还具有吸水或水溶胀特征。可溶胀的(甲基)丙烯酸酯可以是合成的。即，它们不含有衍生自动物或动物提取物的成分。可溶胀的(甲基)丙烯酸酯可偶连于肽或蛋白质(“可溶胀的(甲基)丙烯酸酯-肽”或“SAP”)。可通过重组技术合成或获得肽或蛋白质，从而将它们制成合成的、非动物来源的材料。该SA和SAP材料可以指层、涂层、表面、材料或本领域已知指代适合细胞培养的表面的任何其它术语。可进一步鉴定具体的肽序列。例如，SAP表面可偶连于BSP或波形蛋白肽序列，可标识为SAP-BSP或SAP-VN。在本发明的实施方式中，术语“可溶胀的(甲基)丙烯酸酯”代表了吸水、在水中溶胀但不在水中溶解的各种交联的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯材料。可通过式1所示的平衡水含量(EWC)描述和检测该吸水特征：
式1：EWC(％)＝(W凝胶-W干)/(W凝胶*100)
本发明可溶胀(甲基)丙烯酸酯的实施方式的EWC为5％-70％，并且可以是pH依赖性的。还可检测接触其它液体，例如缓冲液(如磷酸缓冲液，pH 7.4)后的EWC。在各种实施方式中，本发明SA的EWC(水中)可以是5％-70％、5％-50％、5％-40％、10％-40％、5％-35％、10％-35％或15％-35％。在一些实施方式中，可溶胀(甲基)丙烯酸酯与肽(SAP)偶连后，本发明各种实施方式的SAP在水中的EWC可以是，例如10-40％。
在细胞培养中，制备的表面长期接触水性环境。明显吸水的表面、高度水凝胶样的表面在接触水性环境时可能易与基材脱层。当这些材料长期接触水性环境，例如细胞培养5天或更多天时，可能尤其如此。因此，SA和SAP层的EWC检测值最好较低，因而不会吸收太多的水以降低脱层可能性。例如，EWC低于40％的SA表面可能尤其适合支持hES细胞培养。
本文所用的“环状烯烃共聚物”表示由多于一种单体形成的聚合物，其中至少一种单体是环状烯烃单体，至少一种其它单体不是环状烯烃单体。在许多实施方式中，由乙烯和降冰片烯(norbonene)单体形成环状烯烃共聚物。环状烯烃共聚物树脂可以商品名
Figure BPA00001234413900061
自波戴克塑料公司(Boedeker Plastics，Inc)商业购得。
除非另有表述，组合物，例如溶液中化合物的比例以体积基准计。
本文所用的“具有”、“包括”、“包含”等以其开放含义使用，通常表示“包括，但不限于”。
本发明描述了用于培养细胞的制品、制备用于培养细胞的制品的方法和筛选表面负载培养细胞的能力的方法。本文的各种实施方式能产生均匀的、无毒的合成聚合物涂层以便用于高通量筛选，从而鉴定与培养的细胞有利相互作用的合成涂层。
1.细胞培养制品
参看图1，示出了用于培养细胞的制品100的示意图。该制品100包括具有表面15的细胞培养基材或基底材料基材10。将合成聚合物涂层20设置在细胞培养基材或基底材料10的表面15上。尽管未示出，但要理解，合成聚合物涂层20可设置在细胞培养基材或基底材料10的一部分上。细胞培养基材或基底材料10可以是适于培养细胞的任何材料，包括陶瓷物质、玻璃、塑料、聚合物或共聚物，它们的任意组合，或者一种材料在另一种材料上的涂层。所述基底材料10包括玻璃材料，如钠钙玻璃、耐火玻璃、高硼硅酸耐热玻璃、石英玻璃；硅；塑料或聚合物，包括树枝状聚合物如聚(氯乙烯)、聚(乙烯醇)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙酸乙烯酯-马来酸酐)、聚(二甲基硅氧烷)单甲基丙烯酸酯、环状烯烃聚合物、氟碳聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯亚胺；共聚物如乙酸乙烯酯-马来酸酐共聚物、苯乙烯-马来酸酐共聚物、乙烯-丙烯酸共聚物或者它们的衍生物等。
适于细胞培养的制品100的例子包括单孔和多孔板，如6、12、96、384和1536孔板、罐、培养皿、烧瓶、多层烧瓶、
Figure BPA00001234413900071
烧杯、平板、滚瓶、载玻片(如有室和多室培养载玻片)、试管、盖玻片、袋、膜、中空纤维、珠和微载体、杯、旋转瓶、灌注室、生物反应器和发酵罐。
合成聚合物涂层20提供了可在其上培养或筛选细胞的表面25。合成聚合物涂层可以称作合成聚合物层、合成聚合物涂层、合成聚合物表面或任何其它合适的术语。在许多实施方式中，从聚合的(甲基)丙烯酸酯单体形成合成聚合物表面20。当然合成聚合物表面20可从任何其它合适的生物相容聚合物形成，例如聚酰胺、聚膦腈(polyphosphazene)、聚延胡索酸丙酯、合成的聚(氨基酸)、聚醚、聚缩醛、聚氰基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚氨酯、聚碳酸酯、聚酐、聚(原酸酯)、多羟酸、聚酯、乙烯-乙酸乙烯酯聚合物、醋酸纤维素、聚苯乙烯、聚(氯乙烯)、聚(氟乙烯)、聚(乙烯基咪唑)、聚(乙烯醇)、氯磺化聚烯烃和它们的组合或它们与聚(甲基)丙烯酸酯的组合。在各种实施方式中，合成聚合物层20是可溶胀(甲基)丙烯酸酯层。在一些实施方式中，从亲水性单体、含羧基单体和交联单体形成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层。可从甲基丙烯酸羟乙基酯、丙烯酸2-羧基乙基酯和二甲基丙烯酸四(乙二醇)酯形成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的一个例子。例如，可利用以下单体的液体试样(以体积计)配制可溶胀(甲基)丙烯酸酯：甲基丙烯酸羟乙酯(70-90)、2-羧乙基丙烯酸酯(10-30)和二甲基丙烯酸四(乙二醇)酯(1-10)。合适可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的其它细节描述于美国专利申请序列号______________，名为“Synthetic Surfaces forCulturing Undifferentiated Stem Cells in Chemically Defined Media(用化学成分已知的培养基培养未分化干细胞的合成表面)”，Zhou等为发明人，在本文同一日期提交，该申请通过引用全文纳入本文，其纳入程度以不与本发明冲突为限。
如图1B所示，中间层30可置于细胞培养基材或基底材料10的表面15和合成聚合物涂层20之间。配置中间层30以改善涂层20与基材10的粘合，以促进单体铺展，使得细胞培养表面或基底材料10的一部分未涂布且不粘合以确保细胞在涂布区域生长，提供与单体或溶剂相容的基材，但其中所述单体或溶剂与基底材料10不相容，在需要时，例如通过图案印刷等提供结构特征。例如，如果基材10是玻璃基材，优选用环氧涂层处理玻璃基材的表面。对于各种聚合物基底材料10，优选提供聚酰胺、聚酰亚胺、聚丙烯、聚乙烯或聚(甲基)丙烯酸酯的中间层30。尽管未示出，但要理解，可将合成聚合物涂层20设置在中间层30的一部分上。还要理解，可将中间层30设置在基底材料10的一部分上。
现参看图1C，可将其它材料，例如多肽70加入或偶连在合成聚合物表面20，例如以产生仿生表面。在多肽70偶联于合成聚合物表面20的各种实施方式中，合成聚合物表面20是水凝胶层或可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层。可利用连接基团或间隔基团80，例如重复的聚乙二醇连接基团或任何其它合适的连接基团增大多肽70与合成聚合物层20的表面25的距离。多肽70的全部、一些可通过连接基团80偶连于合成聚合物层20或者都没有通过连接基团80偶联于合成聚合物层20。
多肽70可以任何密度，优选适合为所需目的而负载细胞培养的密度，偶联于合成聚合物层20。例如，多肽70偶联于合成聚合物层20的密度可以是约1pmol/mm2-约50pmol/mm2的合成聚合物层20的表面25，可通过合成聚合物层20均匀涂布表面15的实施方式中涂布的基底材料基材10的表面15的面积估算。例如，多肽的密度可以大于5pmol/mm2、大于6pmol/mm2、大于7pmol/mm2、大于8pmol/mm2、大于9pmol/mm2、大于10pmol/mm2、大于12pmol/mm2、大于15pmol/mm2或大于20pmol/mm2的合成聚合物层20的表面。应该知道，多肽70的存在量可根据合成聚合物层20的组成、合成聚合物层20的厚度和多肽70本身的性质而变化。
在各种实施方式中，通过物理或化学方法处理基底材料10的表面15以赋予表面15所需特性或特征。例如，如下所述，可电晕处理或等离子体处理表面15。真空或大气压等离子体的例子包括射频RF和微波等离子体(原发的和次生的)、介电势垒放电和分子或混合气体中产生的电晕放电，所述气体包括空气、氧气、氮气、氩气、二氧化碳、一氧化二氮或水蒸气。
合成聚合物涂层20，无论处于中间层30或基底材料10上，优选均匀涂布其下的基材。“均匀涂布”表示在给定区域，如培养皿的孔的表面中，层20以约5nm或更大的厚度完全涂布该区域。在诸多实施方式中，虽然表面上均匀涂布表面的厚度可以不同，但均匀涂布的表面中没有区域暴露出其下层(中间层30或基底材料10)。与均匀表面的细胞反应相比，非均匀表面的细胞反应更易变。
合成聚合物涂层20可具有任何所需厚度。但是，已经发现，较厚的涂层，如大于约10微米的涂层在涂层的周边会因表面张力而不均匀。在各实施方式中，涂层20的厚度小于约10微米。例如，厚度可以小于约5微米，小于约2微米，小于约1微米，小于约0.5微米或小于约0.1微米。
形成合成聚合物层20的聚合物材料可有任何合适的交联度。低交联度可导致合成的聚合物层部分或完全溶解和聚合反应效率较低。在各种实施方式中，合成聚合物层20的交联密度为约0.9％-约9％。
在许多实施方式中，制品100是传统细胞培养器皿，如培养皿、多孔板、载玻片、烧瓶、多层烧瓶、珠、生物反应器、袋和烧杯或具有适合于细胞培养的物品。现在参看图2，由基底材料10形成的制品100可包括一个或多个孔50。孔50包括侧壁55和表面15。合成聚合物涂层20可设置在表面15上(或者，如以上看图1所述，一个或多个中间层30可置于表面15和合成聚合物涂层20之间)。虽然未显示，但应知道可用合成聚合物层20涂布侧壁55。虽然处于说明目的在图2中示出了孔，但应知道合成聚合物层20可以在适合细胞培养的任何表面上。
在各种实施方式中，制品100包括均匀涂布的层20，其具有面积大于约5mm2的表面25。表面25当然可以具有任何合适的尺寸。然而，当表面15的面积太小时，可靠的细胞反应不易观察到，因为一些细胞如人胚胎干细胞可接种作为细胞集落或簇(例如，具有约0.5mm的直径)，并且需要足够的表面以确保足量的集落粘附以产生定量的细胞反应。在大量的实施方式中，制品100具有孔50，该孔具有均匀涂布的表面15，其中表面15的面积大于约0.1cm2，大于约0.3cm2，大于约0.9cm2，或者大于约1cm2。
当制品100用于筛选目的时，例如下文所详述的，制品100优选含有多个孔50。不同的孔50可包括从不同单体或单体组合等形成的，具有不同厚度的合成聚合物涂层20，从而促进筛选细胞对不同层20的反应。一些孔50当然可以不含合成聚合物层20或可含有其它细胞培养物质，例如MATRIGELTM等，以便用作阴性或阳性对照。
在诸实施方式中，合成聚合物层可以是可溶胀的(甲基)丙烯酸酯(SA)层。在各种实施方式中，合成聚合物层可以连接于细胞培养制品的表面。出于本发明的目的，“连接于”表示在基底材料或基材上涂布或为层状，从而合成聚合物层在接触包括水性培养基在内的正常细胞培养条件后不从基底材料脱层。合成聚合物层可通过共价或非共价相互作用与基材连接。可将合成SA表面与基材缔合的非共价相互作用的例子包括化学吸附、氢键、表面互相渗透、离子键、范德华力、疏水性相互作用、偶极子-偶极子相互作用、机械联锁和它们的组合。
2.合成聚合物层的涂布
以下讨论参看图1-2的上述制品100及其组件。然而，应该知道任何合适的制品可用于以下方法。
现在参看图3，图3显示制备细胞培养制品的方法的流程图。该方法包括(1000)用溶剂稀释一种或多种单体和(1010)将稀释的单体分散在细胞培养制品100的表面15上。然后在步骤(1020)中除去约80％或更多的溶剂。除去溶剂后，在步骤(1030)中将单体原位聚合在制品100的表面15上。在一些实施方式中，先除去约90％或更多、约95％或更多、约99％或更多、大致上全部、或者基本上全部的溶剂，再聚合单体。
图3所述方法可利用任何合适的溶剂。在各种实施方式中，溶剂是挥发性溶剂。本文所用的挥发性溶剂是沸点低于约120℃、低于约100℃、低于约90℃、或低于约85℃的溶剂。例如，挥发性溶剂的沸点可以为约34℃-约120℃、约50℃-约100℃、或约70℃-约85℃。挥发性溶剂的例子包括丙酮、甲醇、乙酸乙酯、乙醇、丁酮、乙腈、2-丙醇和2-丁醇。挥发性溶剂最好在室温下易挥发，与用于产生合成聚合物表面的单体相容，不干扰自由基聚合，并且对待培养的细胞无毒性。挥发性溶剂可包含非挥发性组分，例如二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。当挥发性溶剂包含非挥发性组分时，该非挥发性组分的含量优选维持在低于约10体积％。本文所述方法使用的溶剂优选是对培养器皿制品100的基底材料10的不良溶剂。
挥发性溶剂的合适类别的代表性例子是乙醇溶剂。本文所用的“乙醇溶剂”表示具有超过约75％乙醇的溶剂。例如，乙醇溶剂可含有超过80％、超过90％、超过95％、超过97％或超过99％的乙醇。在各种实施方式中，乙醇溶剂基本上由乙醇构成。在一些实施方式中，乙醇溶剂基本上由乙醇和水构成。使用乙醇溶剂相对于不使用溶剂可能有一种或多种优势。例如，使用乙醇溶剂降低单体粘度，从而能在配制过程中利用自动化设备。相比于不使用溶剂，效率增加10倍，从而能进行高通量物质筛选。利用乙醇溶剂促进单体铺展从而能用自动化液体操控仪器获得小或大表面区域的薄而均匀的涂层，并提高涂布效率。利用乙醇溶剂还减少了涂布方法所用的单体量，还可降低最终涂层厚度。这样减少了单体消耗而降低了成本，同时降低聚合期间和接触培养基后的溶胀期间涂层中的应力，并最终减轻涂层脱层。与其它溶剂相比，乙醇溶剂对于制造用于治疗性细胞或组织的细胞培养器皿可能更安全，因为乙醇溶剂已用于生物医药和药学方法中。此外，可商品化购得USP级的乙醇溶剂，其在涂布过程中易于蒸发或除去而无需极端的条件，例如极端的真空或加热，对于大多数(甲基)丙烯酸酯单体是良好溶剂，而对于用于细胞培养器皿基底材料中的许多聚合物是不良溶剂。此外，乙醇在自由基聚合期间表现为相对惰性。因此，发现乙醇溶剂对涂层的后续聚合的副作用很小。2-丙醇溶剂与乙醇溶剂共享很多上述优点。
单体可用任何合适量的溶剂稀释以达到所需的粘度和单体浓度。根据本文揭示的内容，所用的单体组合物通常含有约0.1％-约99％的单体。例如，可用乙醇溶剂稀释单体以提供具有约0.1％-约50％单体、约.01体积％-约10体积％单体、约0.1体积％-约5体积％单体、或约0.1体积％-约1体积％单体的组合物。可用溶剂稀释单体，使聚合物层20达到所需厚度。如上所述，如果沉积的单体太厚，可能产生不均匀的表面，涂层可能在接触水性介质后发生脱层。如实施例中进一步详细描述的，当单体-溶剂组合物沉积在孔50的表面15上，沉积量为在每平方厘米的表面15上大于约8微升的体积时，可观察到不均匀的表面。在各种实施方式中，单体-溶剂组合物在孔50的表面15上的沉积量为每平方厘米的表面15上为小于或等于约15微升。例如，单体-溶剂组合物在孔50的表面15上的沉积量为每平方厘米的表面15上小于或等于约7微升，或在孔50的表面15上沉积量为每平方厘米的表面15上小于或等于约3微升。
在各种实施方式中，通过将一种或多种单体沉积在基底材料10的表面15上，然后原位聚合所述一种或多种单体来制备合成聚合物表面20。在此类实施方式中，本文将基底材料10称为“基材”，在其上沉积合成聚合物材料20。合成聚合物表面20可通过共价或非共价相互作用与基底材料表面15缔合(associate)。将合成聚合物表面与基材缔合的非共价相互作用的例子包括化学吸附、氢键合、表面相互渗透、离子键合、范德华力、疏水相互作用、偶极子-偶极子相互作用、机械联锁及它们的组合。
在各种实施方式中，将合成聚合物表面20设置在中间层30的表面上，该中间层通过共价或非共价相互作用，直接或者通过一个或多个附加的中间层(未示出)与基底材料10缔合。在此类实施方式中，本文将中间层30称为“基材”，在其上设置合成聚合物表面20。
在各种实施方式中，处理基底材料10的表面15。对表面15进行处理以改进合成聚合物表面10对基底材料表面15的结合，以促进单体在基底材料表面15上的铺展等。当然可因为与中间层30类似的目的处理基底材料10。在各种实施方式中，表面进行电晕放电处理或真空等离子体处理。此类处理获得的高表面能可促进单体铺展和均匀涂布。
现已发现与对由环状烯烃共聚物形成的基材进行电晕处理相比，等离子体处理获得更好的单体可湿性(wettability)(参见，表1)，从而促进单体铺展。此外，现已发现等离子体处理对可湿性的作用比电晕处理持久(数据未显示)。例如，等离子体处理的表面在处理后能使用一周以上，而电晕处理的表面除非在处理后即刻使用，否则通常无效。
表1.等离子体或电晕放电处理的环状烯烃表面上所选的(甲基)丙烯酸酯单体的相关润湿特性.
Figure BPA00001234413900131
对于表1所示的数据，环状烯烃表面如以下实施例1中所述进行真空等离子体处理(TEGDA：二丙烯酸四(乙二醇)酯；GDM：二甲基丙烯酸甘油酯；TriEGDM：二甲基丙烯酸三甘醇酯；BDM：二甲基丙烯酸1，4-丁二醇酯；PEGDA：聚二丙烯酸(乙二醇)酯，Mn约258)。
为了形成合成聚合物表面，原位聚合一种或多种单体。如果使用一种单体，所述聚合物称为单体的均聚物。如果使用两种或更多种不同的单体，所述聚合物称为单体的共聚物。使用的单体可以是单官能的、二官能的或更高官能的。当使用两种或更多种单体时，可以改变单体的比例。在各种实施方式中，使用两种单体，第一种单体与第二种单体的比约为5∶95至95∶5。例如，第一种单体与第二种单体的体积比约为10∶90至约90∶10，约为20∶80至约80∶20，约为30∶70至约70∶30。在一些实施方式中，第一种单体与第二种单体的比约为50∶50、30∶70或10∶90。如果一种或多种单体在室温下不是液体，使用重量基准的以上比例。
除了形成聚合物层的单体，形成所述层的组合物可包括一种或多种其它化合物，如表面活性剂、湿润剂、光引发剂、热引发剂、催化剂、活化剂和交联剂。
在许多实施方式中，合成聚合物表面20是聚(甲基)丙烯酸酯表面。可采用任何合适的(甲基)丙烯酸酯单体或单体组合形成聚(甲基)丙烯酸酯以形成合成层20。本文所用的“(甲基)丙烯酸酯单体”表示具有至少一个烯键式不饱和部分(丙烯酸酯部分或甲基丙烯酸酯部分)的化合物。本文所用的“聚(甲基)丙烯酸酯”表示由包括至少一种(甲基)丙烯酸酯单体的一种或多种单体形成的聚合物。可用于形成聚(甲基)丙烯酸酯的单体的例子包括表2所列的那些单体。
表2：一些示例性(甲基)丙烯酸酯单体的列表
Figure BPA00001234413900141
Figure BPA00001234413900151
Figure BPA00001234413900161
当然可利用任何其它合适的(甲基)丙烯酸酯单体。使用一种或多种(甲基)丙烯酸酯单体形成合成聚合物层。许多(甲基)丙烯酸酯聚合物商品化购自，例如聚合科学公司(Polysciences，Inc.)、西格玛阿尔得里奇公司(Sigma Aldrich，Inc.)和斯托默公司(Sartomer，Inc.)。
在各种实施方式中，由包含一种或多种(甲基)丙烯酸酯单体的组合物形成合成层，其中所述一种或多种单体中的至少一种是二甲基丙烯酸甘油酯。
无论使用何种单体，可以调整所得聚合物的特性。例如，酯和醚基团对所得聚合物的亲水性贡献不同，因此可改变此类基团的含量来改变亲水性。此外，可利用所需量的氨基、巯基或氧合基团以改变所得聚合物的电子密度。此外，通过改变单体中醚基团的数量和酯连接键之间的距离，不难改进聚合物的电子密度。支链单体也可通过在一定长度掺入多个醚基团或通过改变所得聚合物的填充密度来改变电子密度。利用环状部分和芳族部分也影响电子密度。此外，可通过改变多官能，例如双官能或三官能单体与单官能单体的比例来调节聚合物的交联密度。
可通过改变储备液中单体的浓度或双官能或更高官能单体与单官能单体的比例来控制聚合物的分子量。增加双官能或更高官能单体的浓度会增加链中的交联度。可通过使单官能单体与连接基团链反应来修饰它们从而形成双官能单体。本领域技术人员知道合适的连接基团和化学反应。例如，二羧酸与通常掺入乙烯基单体的各种官能团起反应，包括醇、胺和酰胺。
优选利用本文所述的挥发性溶剂。当利用挥发性溶剂，通过链式聚合反应聚合的单体优于通过分步聚合反应聚合的单体。然而，在各种实施方式中可利用分步聚合单体。
对于通过链聚合反应聚合的单体，例如(甲基)丙烯酸酯，可使用任何合适的引发剂并将其加入单体混合物。本领域技术人员不难根据用于形成合成聚合物基材的单体选择合适的引发剂，例如自由基引发剂、阴离子引发剂或阳离子引发剂。对于(甲基)丙烯酸酯，可利用自由基引发剂或阳离子引发剂。在各种实施方式中，使用UV光以产生自由基单体来引发链式聚合。
可使用任何合适的引发剂。聚合引发剂的例子包括有机过氧化物、偶氮化合物、醌、亚硝基化合物、酰基卤、腙、巯基化合物、吡喃鎓(pyrylium)化合物、咪唑、氯三嗪、苯偶姻、苯偶姻烷基醚、二酮、苯基酮或其混合物。合适的市售紫外活化和可见光活化的光引发剂的例子例如IRGACURE 651、IRGACURE 184、IRGACURE 369、IRGACURE 819、DAROCUR 4265和DAROCUR 1173，商品化购自纽约州塔利顿希巴特殊化学品公司(CibaSpecialty Chemicals)，以及LUCIRIN TPO和LUCIRIN TPO-L，商品化购自巴斯夫公司(BASF，北卡罗来纳州夏洛特)。
在合适的引发剂体系中也可以包含光敏剂。代表性的光敏剂具有羰基或叔氨基或其混合物。具有羰基的光敏剂包括二苯甲酮、苯乙酮、苯偶酰、苯甲醛、邻氯苯甲醛、呫吨酮、噻吨酮、9，10-蒽醌和其它芳族酮。具有叔胺的光敏剂包括甲基二乙醇胺、乙基二乙醇胺、三乙醇胺、苯基甲基乙醇胺和二甲基氨基乙基苯甲酸酯。可商品化购得的光敏剂包括购自比德尔索尔公司(Biddle SawyerCorp.)的QUANTICURE ITX、QUANTICURE QTX、QUANTICURE PTX、QUANTICURE EPD。
光敏剂或光引发剂体系的用量通常可在约0.01-10重量％范围不等。
阳离子引发剂的例子包括鎓阳离子的盐，如芳基锍盐，以及有机金属盐如离子芳烃体系。
所选单体稀释后，可将稀释的单体沉积在基材上。当进行高通量筛选时，优选采用自动化过程将稀释的单体沉积在基材上。合适的自动化分配器的例子是生物技术仪器公司的BioTek PRECISIONTM微板移液系统(BioTekPRECISIONTM Microplate Pipetting System，BioTek Instruments，Inc.)。一旦制备了稀释单体的储备组合物，可将它们加载入机器人液体操控装置的不同储器。
无论是否采用自动化工艺和设备，应该知道可控制施用于基材表面的稀释单体组合物的用量和浓度来控制最终合成聚合物层的厚度。还应知道，通过稀释降低单体的粘度可产生更薄的均匀层，使所用的单体材料更少。
将单体沉积在基材表面后，可先除去溶剂再进行聚合。可通过任何合适的机制或方法除去溶剂。优选通过蒸发除去溶剂。在各种实施方式中，室温和环境压力下，在空气或氮气气氛中通过蒸发除去溶剂。对于沸点约低于或等于80℃的挥发性溶剂，在此类条件下约1小时或更长的时间通常能除去显著量的溶剂。在一些实施方式中，可采用温和的真空或高温以加速蒸发过程。在一些实施方式中，例如无需等待蒸发的情况下，可省去固化前除去溶剂的额外步骤。在此类情况中，一些溶剂可在固化过程中蒸发。
通过在固化前除去基本上全部溶剂，可更好地控制固化动力学和单体的转化量。除去约80％或更多溶剂通常应能足以更好地控制固化。在一些实施方式中，在固化之前除去约90％或更多、约95％或更多或约99％或更多的溶剂。当单体的转化率提高时，降低废物产生和细胞毒性。
在各种实施方式中，将单体喷涂在基材表面上。可使用本领域通常已知的气压喷雾器或电喷雾器进行喷涂。喷涂能更快蒸发溶剂并提供均匀而薄的合成聚合物表面。在其它实施方式中，可通过液体施加、浸渍涂布或旋涂(spincoating)将单体施加于基材表面.
除去基本上全部溶剂后，通过合适的引发机制聚合单体。例如，可升高温度以活化热引发剂，可通过接触合适波长的光来活化光引发剂，等等。按照许多实施方式，利用紫外光固化单体或单体混合物。优选在惰性气体保护下进行固化，例如氮气保护以防氧抑制。联用合适的紫外光与气体保护可提高聚合物转化率，确保涂层完整性并降低细胞毒性。当使用光引发剂与(甲基)丙烯酸酯单体时，剂量＞0.2J/cm2、功率为5～100mW/cm2和持续10秒以上的紫外光是合适固化条件的一个实例。固化光的功率太高或太低都可能影响涂层均匀性或固化的转化率。温和的固化过程还减少聚合过程中的热量，而基材也可能对热敏感。在各种实施方式中，利用脉冲光源或通过在受控的时间间隔开关紫外源来以提供脉冲式紫外光。例如，与利用能够在3秒内递送1.4J/cm2的较高功率的紫外系统相比，利用在氮气保护下以13mW/cm2的功率递送0.8J/cm2剂量的脉冲紫外光提供更均匀的涂层并且细胞毒性较低(参见实施例)。在各种实施方式中，以约0.5J/cm2-约1.1J/cm2的剂量，约5mW/cm2-约100mW/cm2，例如约10mW/cm2的功率递送脉冲紫外辐射。在其它实施方式中，利用紫外源固化合成聚合物层20，其中剂量为＞0.2J/cm2，功率为5～100mW/cm2，持续10秒以上。
可用溶剂洗涤固化的合成聚合物层20一次或多次以除去杂质，例如未反应的单体或低分子量聚合物。在各种实施方式中，用乙醇溶剂，例如高于约70％乙醇、高于约90％乙醇或高于约99％乙醇洗涤层20。用乙醇溶剂洗涤不仅用于除去可能有毒的杂质，还可用于在培育细胞之前使表面灭菌。
可通过任何合适的技术将多肽偶联于合成聚合物层20。可通过氨基端基的氨基酸、羧基端基的氨基酸或内部氨基酸将多肽偶联于合成聚合物层20。将多肽偶联于合成聚合物层的一种适当技术包括本领域通常知晓的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学方法。EDC和NHS或N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)可与水凝胶或可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的羧基反应，从而产生胺反应活性NHS酯。EDC与可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层或合成聚合物层20的羧基反应从而产生易水解的胺-反应活性邻-酰基异脲(O-acylisourea)中间体。胺-反应活性邻-酰基异脲中间体因加入NHS或磺基-NHS将其转化为胺反应活性NHS或磺基-NHS酯而得到稳定，从而能进行两步过程。合成聚合物层20活化后，然后可加入多肽70，多肽70的氨基末端胺可与胺反应活性酯反应，以形成稳定的酰胺键，因而将多肽70偶联于合成聚合物层20。当采用EDC/NHS化学方法将多肽20偶联于合成聚合物层20时，N-末端氨基酸优选是含胺的氨基酸，例如赖氨酸、高赖氨酸(homolysine)、鸟氨酸、二氨基丁酸或二氨基丙酸。此外，可利用多肽的N-末端α胺偶联于羧基，如果N-末端胺未封端的话。当然，可利用任何可接受的亲核试剂，例如羟胺、肼、羟基等。
EDC/NHS化学方法导致多肽70与合成聚合物层20零长度交联。可将含末端胺的连接基团80或间隔基团，例如聚乙二醇连接基团(例如，量子生物设计公司(Quanta Biodesign，Ltd.))加入肽70的N-末端氨基酸。当将连接基团加入N-末端氨基酸，该连接基团优选N-PG-酰氨基-PEGX-酸，其中PG是保护基团，例如Fmoc基团、BOC基团、CBZ基团或适合肽合成的任何其它基团，X是2、4、6、8、12、24或可用的任何其它不连续PEG。
在各种实施方式中，将1μM-2500μM多肽液体组合物，例如溶液、悬液等与活化的合成聚合物层接触以偶连该多肽。例如，多肽浓度可以是约100μM-约2000μM、约500μM-约1500μM、或约1000μM。应该知道可改变多肽组合物的体积和浓度以实现偶联于合成聚合物层的多肽的所需密度。
多肽可以环化或包括环状部分。可采用形成环状多肽的任何合适方法。例如，通过环化合适氨基酸侧链上的游离氨基官能团与合适氨基酸侧链的游离羧基可产生酰胺键。或者，可在肽序列中侧链合适氨基酸的游离巯基之间产生二硫键。可采用任何合适的技术形成环状多肽(或其诸部分)。例如，可采用例如WO1989005150所述的方法形成环状多肽。在各种实施方式中，多肽是具有肽树枝状聚合体(dendrimer)的多抗原多肽。
可采用任何合适的连接基团和任何合适技术将连接基团或间隔基团，例如聚(环氧乙烷)连接基团偶联于或加入多肽以使该多肽突出离开表面。
在各种实施方式中，多肽衍生自天然细胞粘着多肽，例如纤连蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白等。在一些实施方式中，多肽含有RGD氨基酸序列。一些合适的含RGD多肽的例子描述于美国专利申请序列号_____________，名为“Synthetic Surfaces for Culturing UndifferentiatedStem Cells in Chemically Defined Media(用化学成分已知的培养基培养未分化干细胞的合成表面)”，Zhou等为发明人，在本文同一日期提交。
3.用于所需的细胞相互作用的合成聚合物层的筛选
以下讨论参考以上图1-2所述的制品100及其组件。然而，应该知道以下方法可使用任何合适的制品。
现在参看图4，描述了筛选方法的流程图。所述方法在许多方面类似于以上图3所述的方法。该方法包括用溶剂稀释单体文库的所选成员的(2000)步骤。在诸实施方式中，溶剂可以是挥发性溶剂，例如乙醇溶剂。该方法包括将稀释的所选成员分散在用于细胞培养的制品100的基材上的(2010)步骤。本文所用的“稀释单体文库的所选成员”等表示用溶剂稀释一种或多种单体，稀释成单一组合物或多种组合物，其中所选成员的一种或多种不同单体稀释成独立的组合物。文库的成员可包括一种单体或可包括两种或更多种单体。当用溶剂分别稀释所选成员的一种或多种单体作为独立的组合物时，分散到基材上之时或之前可混合各独立组合物。优选产生用溶剂稀释的各单体的储备组合物，然后在基材上混合储备组合物或在分散在基材上之前进行。当利用自动化设备在，例如用于筛选的多孔平板中产生阵列时，可能优选此类储备溶液。
虽然图4描述了(甲基)丙烯酸酯单体文库，但应该知道还可利用任何其它合适单体的文库。
图4所示方法包括在所选的文库成员分散在基材上后除去约80％或更多溶剂的(2020)步骤。在一些实施方式中，除去基本上所有溶剂。本文所用的“除去基本上所有溶剂”等表示除去足够量的溶剂从而能聚合单体。如果为获得薄而均匀的涂层而对单体进行高度稀释，例如约99％溶剂与1％单体(以体积计)，最好除去足够量的溶剂以提供足够高浓度的单体从而能充分聚合。即，单体浓度越高，单体彼此越接近，从而能更多聚合。残留溶剂也可能有助于单体在聚合期间向附近的自由基运动，从而促进聚合完成并提高最终的转化率。
本发明的实施方式提供筛选细胞-合成聚合物层相互作用的方法，包括：用溶剂稀释一种或多种(甲基)丙烯酸酯单体以形成溶液；将该溶液分散在细胞培养基材的一个或多个表面上；从分散的溶液除去约80％或更多的溶剂；除去约80％或更多的溶剂后聚合(甲基)丙烯酸酯单体以在所述一个或多个表面上形成合成聚合物层；在细胞培养基中培育该合成聚合物层与细胞；和表征与细胞一起培育的各合成聚合物层的预定细胞特性。在诸实施方式中，除去溶剂的步骤包括从一个或多个表面蒸发溶剂。在诸实施方式中，细胞可以是任何细胞类型，可以是干细胞、人胚胎干细胞、多能细胞或成人干细胞。在诸实施方式中，可先对基材或表面进行等离子体处理再分散溶液。在诸实施方式中，聚合单体包括使单体接触紫外辐射，包括脉冲紫外辐射。在诸实施方式中，以约0.5J/cm2-约1.1J/cm2的剂量，约5mW/cm2-约100mW/cm2的功率递送脉冲紫外辐射。在诸实施方式中，单体接触紫外辐射包括在氮气气氛中使单体接触辐射。在诸实施方式中，在一个或多个表面上聚合单体以形成合成聚合物层的步骤包括形成可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层。在诸实施方式中，该方法还包括使多肽偶联于可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层。在诸实施方式中，所选单体中的至少一种是二甲基丙烯酸甘油酯。
图4所述的方法还包括除去约80％或更多溶剂后，聚合分散在基材上的单体的(2030)步骤，从而产生合成聚合物层，如上所述。然后可在步骤(2040)中培育细胞，例如干细胞与合成聚合物层，在步骤(2050)中表征与细胞一起培育的各合成聚合物层20的细胞预定特性。
A.在合成聚合物层上培育细胞
上述合成聚合物层20涂布的基材可用细胞接种。细胞可以是任何细胞类型。例如，细胞可以是结缔组织细胞，如上皮细胞和内皮细胞、肝细胞、骨骼或平滑肌细胞、心肌细胞、肠细胞、肾细胞或其它器官的细胞、干细胞、胰岛细胞、血管细胞、淋巴细胞、癌细胞等。细胞可以是哺乳动物细胞，优选人细胞，但还可以是非哺乳动物细胞，例如细菌、酵母菌或植物细胞。
在许多实施方式中，细胞是干细胞。本文所用的“干细胞”表示能连续分裂(自我更新)并能分化成各种专门细胞类型的细胞。在一些实施方式中，干细胞可以是多能、全能或多潜能干细胞。干细胞可以存在于对象的器官或组织中。此类细胞能产生完全分化或成熟的细胞类型。干细胞可以是骨髓衍生的干细胞(自体或其它的)、神经元干细胞或胚胎干细胞。干细胞可以是干蛋白阳性的。干细胞可以是造血干细胞。干细胞可以是衍生自上皮和脂肪组织、脐带血、肝脏、脑或其它器官的多谱系细胞。
由于人胚胎干细胞(hESC)能以未分化状态连续培养生长，可从已建立的细胞系获得本发明所用的hESC。已建立的人胚胎干细胞系的例子包括但不限于：H1、H7、H9、H13或H14(得自威斯康星大学建立的WiCell)(Thompson(1998)Science 282：1145)；hESBGN-01、hESBGN-02、hESBGN-03(BG公司(BresaGen，Inc.)，雅典，佐治亚州)；HES-1、HES-2、HES-3、HES-4、HES-5、HES-6(EC国际公司(ES Cell International，Inc.)，新加坡)；HSF-1、HSF-6(加利福尼亚大学旧金山分校)；I 3、I 3.2、I 3.3、I 4、I 6、I 6.2、J 3、J 3.2(以色列工学院(Technion-Israel Institute of Technology)衍生的，海法，以色列)；UCSF-1和UCSF-2(Genbacev等.，Fertil.Steril.83(5)：1517-29，2005)；细胞系HUES 1-17(Cowan等.，NEJM 350(13)：1353-56，2004)；和细胞系ACT-14(Klimanskaya等.，Lancet，365(9471)：1636-41，2005)。还可从原代胚胎组织直接获得本发明所用的胚胎干细胞。通常使用其它情况下要弃去的胚泡阶段的体外冷冻受精卵来进行。
其它合适的干细胞包括诱发的灵长类多能干(iPS)细胞。本发明的OPC还可从诱发的灵长类多能干(iPS)细胞分化。iPS细胞指得自青少年或成年哺乳动物如人的细胞，其是遗传修饰的，例如通过用一种或多种合适的载体转染，从而它们经重新编程获得多能干细胞如hES细胞的表型。由这些重新编程细胞获得的表型特点包括分离自胚泡的形态类似干细胞，以及表面抗原表达、基因表达和端粒酶活性类似的胚泡衍生的胚胎干细胞。iPS细胞通常具有从各原生胚层：外胚层、内胚层和中胚层分化成至少一种细胞类型的能力，因此适于分化成各种细胞类型。iPS细胞如hESC在注入免疫缺陷小鼠如SCID小鼠中时也形成畸胎瘤(Takahashi等，(2007)Cell131(5)：861；Yu等，(2007)Science 318：5858)。
接种细胞之前，可收集细胞并悬浮在合适的介质，例如生长培养基中，细胞一旦接种在表面上即在其中培养。例如，可将细胞在含血清培养基、条件化培养基或化学成分确定的培养基中悬浮并培养。本文所用的“化学成分确定的培养基”表示不含组成未知的组分的细胞培养基。在各实施方式中，化学限定的培养基可不含蛋白质、水解物或组成未知的肽。在一些实施方式中，化学成分限定的培养基含有组成已知的多肽或蛋白质，例如重组生长激素。由于化学成分确定的培养基的所有组分具有已知的化学结构，培养条件和由此的细胞反应的可变性降低，从而提高了再现性。另外，减少了污染的可能性。此外，至少因为上述原因而更易于放大。化学成分确定的细胞培养基可购自英杰公司(Invitrogen Corporation，1600法拉第大街，PO Box 6482，卡尔斯巴德，加州92008)，商品名为
Figure BPA00001234413900241
其一种完全确定的，不含血清和饲养物的培养基(SFM)，特别为人胚胎干细胞(hESC)的生长和扩增而配制；以及干细胞技术公司(StemCell Technologies，Inc.)，商品名为mTeSRTM1维持培养基，用于人胚胎干细胞和隆萨公司(Lonza)的XVivo-10，其可补充生长因子。
可将一种或多种生长或其它因子加入培育细胞与合成聚合物层20的培养基中。这些因子可有助于细胞增殖、粘着、自我更新、分化等等。可加入或包含在培养基中的因子的例子包括肌肉形态发生因子(MMP)、血管内皮生长因子(VEGF)、α或β转化生长因子(TGF)、白介素、神经生长因子(NGF)、促红细胞生成素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、人活化素(activin)A(ACT)，例如人活化素A，造血生长因子、视黄酸(RA)、干扰素、成纤维细胞生长因子(FGF)，例如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、肽生长因子、肝素聚合生长因子(HBGF)、肝细胞生长因子(HGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、胰岛素-样生长因子(IGF)I和II、转化生长因子(TGF)，例如转化生长因子-β1(TGFβ1)和集落刺激因子。
可采用任何合适的浓度接种细胞。通常，以约10,000-500,000个细胞/平方厘米基材接种细胞。例如，可以约40,000-150,000个细胞/平方厘米基材接种细胞。然而，不难采用更高和更低的浓度。培育时间和条件，如温度、CO2和O2水平、生长培养基等将取决于所培养细胞的性质并且不难改进。可根据所研究的细胞反应或所需的细胞反应来改变调节细胞在表面上培育的时间量。
B.表征预定的特性
可表征能产生关于细胞与合成表面相互作用的所需信息的任何细胞特性。例如，可研究以下细胞形态或程度或数量以确定细胞与合成基材之间相互作用的性质：(i)细胞粘着；(ii)增殖；(iii)分化；(iv)多能性；(v)代谢特性，例如活性水平、代谢状态、DNA合成、凋亡、收缩、有丝分裂、胞吐作用、合成、胞吞作用和迁移；(vi)基因表达；或(vii)蛋白质表达。
可采用任何合适的试验表征细胞的预定特性。例如，可采用本领域已知的任何细胞试验筛选合成聚合物层20与给定的细胞类型之间的所需相互作用。检验时，细胞可以是固定的或活的。检验活细胞通常涉及荧光或化学发光指示剂。或者，还可采用利用分子靶标在分子水平筛选相互作用的分子试验。
可利用各种蛋白标记来测定与合成聚合物层20培育的细胞类型或特性。例如，干蛋白和GFAP是用于鉴定分化成神经细胞的细胞的蛋白标记，细胞角蛋白是表皮细胞的标记，结蛋白是肌肉细胞的标记，可利用Oct3/4、Tra-1-60、SSEA4、碱性磷酸酶和其它肝细胞特异性标记评估干细胞的未分化状态。当然可利用任何其它已知的或进一步鉴定的蛋白标记来鉴定细胞的类型或特性。或者，可利用特定细胞类型或细胞特性相关的遗传标记表征与合成聚合物层20培育的细胞。
可用于表征细胞的预定特性的细胞试验的例子包括涉及采用显微术的试验，例如相对比和荧光显微术或任何其它方法来定性或定量评估细胞特性，例如用自动或手动装置检测或观察具体细胞反应或酶活性的光密度、荧光或发光测量值。显微术可单独进行或与以下方法联用，例如细胞染色；利用荧光标记抗体的细胞化学、免疫细胞化学方法；核酸的荧光原位杂交(FISH)；涉及编码荧光或化学发光报道蛋白的融合启动子/报道序列的基因表达试验；利用标记的寡核苷酸引物的原位PCR；探测两种或更多种分子标记物接近性的荧光共振能量转移(FRET)试验；和能使感兴趣蛋白质细胞定位的融合基因试验。本领域熟知进行此类细胞试验所包括的步骤。仅出于澄清而非限制的目的，以下附图更详细地考虑了这些细胞试验中一些的某些特性和实际方面。
在许多实施方式中，采用自动化装置分析各合成聚合物层20的细胞试验。自动化装置可以手动或自动操作。
在各种实施方式中，测定了未分化干细胞在合成聚合物层20上附着和生长的能力。测定培养物中是否存在未分化干细胞的一种试验是碱性磷酸酶(AP)试验。碱性磷酸酶(AP)是未分化hESC的标记。AP表达随细胞分化而丢失或明显降低。一种合适的碱性磷酸酶试验包括在实验表面培育细胞所需的时间(例如，约48小时)后固定它们，培育固定的细胞与可溶性碱性磷酸酶底物，例如
Figure BPA00001234413900261
底物(磷酸2′-[2-苯并噻唑基]-6′-羟基苯并噻唑[BBTP])并利用合适的平板读数计，例如PE公司的维克多3微板读数计(Victor 3microplate reader，Perklin Elmer)获得在485/535nm的AttoPhos荧光强度。实验表面的AttoPhos荧光强度可表达为阳性对照％，例如MATRIGELTM对照％。
测定合成聚合物层20上的培养物中是否存在未分化干细胞的另一种方法包括比较在合成聚合物层20上培养的hESC的形态与在已知允许未分化hESC生长的表面，例如MATRIGELTM上培养的hESC。适合比较形态的染料的一个实例是沉淀的碱性磷酸酶底物，BCIP/NPT(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)/四唑氮蓝(NBT)。固定细胞后，可用BCIP/NPT染色它们并比较形态。
下文提供了描述上述制品和方法的各种实施方式的非限制性例子。
实施例
实施例1：温和紫外固化和环状烯烃底物增加层均匀性并降低毒性
引言：
在本实施例中，单体沉积在处理的聚合物基材上，聚合获得细胞毒性低或没有细胞毒性的均匀涂层。涂布基材是聚合物制成的细胞培养容器，其适用于细胞培养并在接触涂布单体时稳定。基材表面用氧进行真空等离子体处理以促进单体铺展。利用(甲基)丙烯酸酯均聚物和共聚物在培养容器表面上产生合成聚合物涂层。单体在惰性气体的保护下固化以防氧-抑制作用。测定了合成聚合物层的均匀性和所得层的细胞毒性。
材料、方法和结果：
在组织培养处理(TCT)的聚苯乙烯(康宁公司(Corning，Inc.))上涂布二丙烯酸四(乙二醇)酯的均聚物层。简言之，首先将二丙烯酸四(乙二醇)酯(西格玛-阿尔得里奇公司(Sigma-Aldrich Inc.))与1％(w/w)光引发剂Irgacure 819(CSC公司(Ciba Specialty Chemicals，Inc.))混合。然后利用
Figure BPA00001234413900271
多通道移液管将5μl制备的制剂(单体与光引发剂)沉积在TCT处理96-孔聚苯乙烯平板的各孔中。将该平板水平放置30分钟以便制剂铺展。利用传送带FusionUV传送带固化系统(带速10米/分钟，用N2吹扫)以总共1.4J/cm2通过三次来固化涂层。所得层的照片示于图5A。
在TCT处理的聚苯乙烯上涂布二丙烯酸四(乙二醇)酯的均聚物层。简言之，首先将二丙烯酸四(乙二醇)酯与1％(w/w)光引发剂Irgacure 819混合。然后利用
Figure BPA00001234413900272
多通道移液管将5μl制备的制剂(单体与光引发剂)沉积在TCT处理的96-孔聚苯乙烯平板的各孔中。将该平板水平放置30分钟以便制剂铺展。在N2吹扫的盒中(具有熔凝二氧化硅窗)，用13mW/cm2脉冲(100Hz)的紫外光(Xenon RC-700)固化涂层1分钟。所得层的照片示于图5B。为比较聚苯乙烯基材与环状烯烃共聚物的稳定性，在TCT处理的聚苯乙烯和真空等离子体处理的环状烯烃共聚物基材上涂布二甲基丙烯酸三(甘醇)酯的均聚物层。简言之，在以下条件下利用MARCHPLASMOD(玛吉仪器公司(March Instruments，Inc))处理环状烯烃共聚物基材：0.4托O2、50瓦，1分钟。首先混合二甲基丙烯酸三(甘醇)酯(斯托默公司)与1％(w/w)光引发剂Irgacure 819。然后在TCT处理的聚苯乙烯和真空等离子体处理的环状烯烃共聚物
Figure BPA00001234413900274
基材上沉积该制剂(单体和光引发剂)以形成涂层。随后，在N2吹扫的盒中(具有熔凝二氧化硅窗)，用13mW/cm2脉冲(100Hz)紫外光(Xenon)固化涂层1分钟。利用WT科学仪器和技术股份公司的共焦拉曼显微镜(Confocal Raman Microscope，WiTecWissenschaftliche Instrumente und Technololgie GmbH，CRM 200)获得涂层截面的光谱图像，而无需切割样品。图6A和6B分别是聚苯乙烯和环状烯烃共聚物上涂层的相应图谱图像。在图6A中，从表面获得的图谱(黑色的图谱，箭头所示)代表聚苯乙烯基材和聚合物涂层(灰色纯对照的峰)的峰的组合。这表明在聚合前单体溶解聚苯乙烯基材。因此，目测观察表面图谱图像显示涂层和基材之间没有明显界限。在图6B中，获得表面上不同深度的图谱，发现与聚二甲基丙烯酸三(甘醇)酯和环状烯烃基材的对照相同。目测观察这些图谱显示在涂层和环状烯烃基材之间有明显界限，提示基材能抵抗单体的溶解作用。
对于细胞毒性研究，如下所示制备利用UV Fusion UV系统固化的5种不同(甲基)丙烯酸光聚合物。简言之，首先混合以下5种不同单体与1％(w/w)光引发剂Irgacure 819：二丙烯酸四(甘醇)酯(TEGDA)(西格玛-阿尔得里奇公司)；二甲基丙烯酸甘油酯(GDM)(西格玛-阿尔得里奇公司)；二甲基丙烯酸三甘醇酯(TriEGDM)(斯托默公司)；二甲基丙烯酸1，4-丁二醇酯(BDM)(西格玛-阿尔得里奇公司)；和聚二丙烯酸(乙二醇)酯，Mn约258(PEGDA)(西格玛-阿尔得里奇公司)。然后，利用
Figure BPA00001234413900281
多通道移液管将5μl制剂(单体和光引发剂)沉积到经TCT处理的96-孔聚苯乙烯平板的各孔中。每一制剂是在一块平板中一式六个孔中的涂层。将该平板水平放置30分钟以便制剂铺展。利用传送带Fusion UV固化系统(带速10米/分钟，用N2吹扫)以总共1.4J/cm2通过三次来固化涂层。
对于细胞毒性研究，如下所示制备利用Xenon脉冲紫外系统固化的5种不同(甲基)丙烯酸均聚物。简言之，首先混合以下5种不同单体与1％(w/w)光引发剂Irgacure 819：二丙烯酸四(甘醇)酯(TEGDA)；二甲基丙烯酸甘油酯(GDM)；二甲基丙烯酸三甘醇酯(TriEGDM)；二甲基丙烯酸1，4-丁二醇酯(BDM)；和聚二丙烯酸(乙二醇)酯，Mn约258(PEGDA)。然后，利用
Figure BPA00001234413900282
多通道移液管将5μl制剂(单体和光引发剂)沉积到经等离子体处理的96-孔环状烯烃平板的各孔中。96-孔环状烯烃平板由康宁生命科学公司内部开发组(Corning Life Science internal development group)提供。涂布前，在以下条件下利用MARCH PLASMOD(玛吉仪器公司)处理环状烯烃共聚物平板：0.4托O2、50瓦，1分钟。每一制剂是一块平板中一式六个孔中的涂层。将该平板水平放置30分钟以便制剂铺展。在N2吹扫的盒中(具有熔凝二氧化硅窗)，用13mW/cm2脉冲(100Hz)的紫外光(Xenon RC-700)固化涂层1分钟。
细胞毒性分析之前，用25-35kGyγ射线对96-孔板灭菌。在标准细胞培养条件下，用补加了10％胎牛血清的Iscove的改进Dulbecco培养基将人肺成纤维细胞(MRC5，ATCC编号CCL-171)培养至汇合。利用0.05％胰蛋白酶/EDTA收集细胞，以15,000个细胞/孔的密度接种。在标准细胞培养条件下(5％CO2，37℃)培养细胞。采用CellTiter
Figure BPA00001234413900291
水性单溶液细胞增殖试验(CellTiter
Figure BPA00001234413900292
AQueous One Solution Cell Proliferation Assay，G3581，普罗迈格公司)来测定培养72小时后各表面上活细胞的相对数量。根据生产商的方案进行试验。简言之，吸出培养基后，直接向细胞中加入磷酸缓冲盐水中配制的MTS四唑
Figure BPA00001234413900293
试剂的1∶5稀释液。37℃和5％CO2下培育1小时后，记录490nm的吸光度。康宁超低粘附(Corning Ultra Low Attachment)和未涂布的TCT表面分别用作阴性和阳性对照表面。利用该数据测定(甲基)丙烯酸制剂细胞毒性。如图7所示，Fusion UV固化方法得到高度细胞毒性层，而利用Xenon脉冲紫外固化系统制备的涂层的细胞活力类似于可市售购得的TCT-处理的聚苯乙烯表面阳性对照。
讨论：
为固化(甲基)丙烯酸酯单体，通常相信高功率的紫外光有利于较高的聚合转化率(Decker，C.(1998)。″The use of UV irradiation in polymerization.(紫外辐射在聚合中的应用)″Polymer International 45(2)：133-141)。然而，当用高密度紫外光固化另一聚合物表面上的单体涂层时，发现它们均匀性低(图5A和5B)，不受控聚合和固化不完全产生的低分子量片段导致细胞毒性高(图7A和7B)。该问题显著干扰细胞粘附和增殖。
许多单体可溶解广泛用于细胞培育器皿的聚苯乙烯，会影响聚合物涂层特性和相应涂层上细胞筛选结果的可靠性。相比之下，发现环状烯烃基材在接触各种单体后更稳定。在测试的所有单体中，无一观察到单体制剂与基材之间有相互作用。环状烯烃共聚物还具有非常好的紫外透过性，已广泛用作药物产品的容器。因此，本发明的诸实施方式提供聚合物涂布工艺的合适材料和不同细胞筛选试验。
本文提供的数据显示合适功率和接触时间长度的脉冲紫外固化提供了均匀涂层，而对细胞培育没有显著细胞毒性。该固化工艺还减少聚合期间的热量。这对于热塑下性聚合物基材至关重要。该涂布和固化工艺可应用于各种光可聚合的单体。因此，可能利用各种单体提供多种材料特性以便符合不同细胞培养和生物医学领域的需要。
结论：
可利用合适功率和接触时间长度的脉冲或连续紫外光系统来固化涂层。这样减少了许多聚合物基材对之敏感的热量。其还提供更好的固化动力学控制、更高的转化和更低的收缩，从而提供更均匀而毒性更低的涂布表面。可在氮气保护下进行固化以防氧抑制并进一步提高聚合物转化率。发现两种条件一起(受控UV和氮气保护)降低了所得(甲基)丙烯酸涂层的细胞毒性。
转化率较高可以免除额外的洗涤步骤，从而能简化制备工艺并减少洗涤过程中的废料产生。
环状烯烃可作为涂布基材提供合适的细胞培养容器。接触各种单体时，其稳定并适合各种紫外-荧光生物测定以及紫外固化。
所选的固化工艺对单体结构不敏感。这为有效产生各种生物材料涂层以供不同细胞培养应用提供了平台。
实施例2：高通量筛选光聚合物方法以供细胞培养
本实施例为从各种单体产生合成聚合物表面的高效溶剂方法提供了基础，该方法适用于大面积细胞培养器皿。
材料、方法和结果：
采用不同的乙醇方法在96-孔环状烯烃共聚物平板中涂布二丙烯酸四(甘醇)酯的均聚物层。简言之，首先根据实验设计，混合二丙烯酸四(甘醇)酯(西格玛-阿尔得里奇公司)与1％(w/w)(光引发剂/单体)的Irgacure 819(CSC公司)和1/1或9/1(乙醇[体积]/单体[体积])的乙醇。利用BioTek精密微板移液系统(BioTek Precision Microplate Pipetting System)将5微升制备的制剂(单体、光引发剂和乙醇)沉积在等离子体处理的96-孔环状烯烃共聚物平板的各孔中。制剂溶液立即铺展，将平板在通风橱中水平放置3小时以使乙醇蒸发。这样除去＞99％的乙醇。然后在N2吹扫的盒中(具有熔凝二氧化硅窗)，用13mW/cm2脉冲(100Hz)的紫外光(Xenon RC-801)固化涂层1分钟。所得层的边缘的相对比照片示于图8A(1/1乙醇方法)、图8B(9/1乙醇方法)。厚涂层(1/1乙醇方法)导致单体制剂因制剂表面张力的弯月面效应(meniscus effect)而累积在孔周围。薄涂层(9/1乙醇方法)在孔中产生更均匀的涂层(没有弯月面效应)。接触角度还证实采用同时两种方法，诸孔完全被设计的(甲基)丙烯酸涂层覆盖。
采用上述1/1或9/1乙醇方法将甘油1，3-二甘油酸酯二丙烯酸酯的均聚物层涂布在96-孔环状烯烃共聚物平板中。
固化后，向平板的各孔中加入200微升水，然后在37℃温育该平板过夜。最后，除去水，获得涂层的相对比图像。所得层中心的相对比照片示于图9A(1/1乙醇方法)、图9B(9/1乙醇方法)。如图9A所示厚涂层(采用1/1浓乙醇方法)中的褶皱提示接触水性介质后的脱层。同时在9/1稀乙醇方法的薄涂层中未观察到脱层，如图9B所示。
测定乙醇方法产生的96-孔形式中(甲基)丙烯酸表面的细胞毒性。简言之，如以上均聚物所述制备两种不同单体的掺混物的共聚物。单体如表3所示。掺混3种体积比(90∶10、70∶30和50∶50)的主要和次要组分的各种组合，并与1％w/v(光引发剂/总单体)的光引发剂819和9/1(v/v)乙醇混合。然后利用BioTek精密微板移液系统将5微升制备的制剂(单体、光引发剂和乙醇)沉积在等离子体处理的96-孔环状烯烃共聚物平板的各孔中。制剂溶液立即铺展，将平板在通风橱中水平放置3小时以使乙醇蒸发。然后在N2吹扫的盒中(具有熔凝二氧化硅窗)，用13mW/cm2脉冲(100Hz)的紫外光(XenonRC-801)固化涂层1分钟。固化后，进行洗涤步骤。简言之，96-孔板的各孔表面与200微升＞99％乙醇温育1小时，然后与200微升水温育过夜以除去可能的可提取物。最后，先进行空气干燥，然后表面再灭菌。
表3.制剂组成
  制剂编号   主要组分   次要组分
  48-3   1，6-己二醇丙氧基化二丙烯酸酯   三羟甲基丙烷乙氧基化(1EO/OH)甲基
  48-5   1，6-己二醇丙氧基化二丙烯酸酯   1，6-己二醇乙氧基化二丙烯酸酯
  53-3   二甲基丙烯酸新戊二醇酯   二甲基丙烯酸三甘醇酯
  53-4   二甲基丙烯酸新戊二醇酯   二甲基丙烯酸1，4-丁二醇酯
  53-7   三羟甲基丙烷苯甲酸酯二丙烯酸酯   二甲基丙烯酸甘油酯
  53-9   三羟甲基丙烷苯甲酸酯二丙烯酸酯   二甲基丙烯酸1，4-丁二醇酯
  53-10   三羟甲基丙烷苯甲酸酯二丙烯酸酯   聚二丙烯酸(乙二醇)酯
  55-3   1，6-己二醇乙氧基化二丙烯酸酯   二甲基丙烯酸三甘醇酯
细胞毒性分析之前，用25-35kGyγ射线对所有96-孔板进行灭菌。在标准细胞培养条件下，用补加了10％胎牛血清的Iscove的改进Dulbecco培养基将人肺成纤维细胞(MRC5，ATCC编号CCL-171)培养至汇合。利用0.05％胰蛋白酶/EDTA收集细胞，以15,000个细胞/孔的密度接种。在标准细胞培养条件下(5％CO2，37℃)培养细胞。采用CellTiter
Figure BPA00001234413900321
水性单溶液细胞增殖试验(G3581，普罗迈格公司)来测定培养72小时后各表面上活细胞的相对数量。根据生产商的方案进行试验。简言之，吸出培养基后，直接向细胞中加入磷酸缓冲盐水配制的MTS四唑
Figure BPA00001234413900322
试剂的1∶5稀释液。37℃和5％CO2下培育1小时后，记录490nm的吸光度。利用该数据测定(甲基)丙烯酸制剂细胞毒性，如图10所示。
测定乙醇方法产生的6-孔形式中(甲基)丙烯酸表面的细胞毒性。利用等离子体处理的环状烯烃共聚物平板(6-孔)。如上所述制备两种不同单体的掺混物的均聚物和共聚物。那些聚合物的单体组成如下所示。1.二甲基丙烯酸甘油酯；2.二甲基丙烯酸酯三乙二醇酯；3.二甲基丙烯酸1，4-丁二醇酯；4.聚二丙烯酸(乙二醇)酯；5.二甲基丙烯酸三甘醇酯(70％)、二甲基丙烯酸甘油酯(30％)；6.二丙烯酸四(甘醇)酯(70％)、二甲基丙烯酸甘油酯(30％)。对于所有制剂，制备1/0.01/9比例的单体[体积]/光引发剂[重量]/乙醇[体积]。将80微升制剂加入各孔。制剂开始向外铺展1分钟，将平板在通风橱中水平放置3小时以使乙醇蒸发。这样除去＞99％的乙醇。然后在N2吹扫的盒中(具有熔凝二氧化硅窗)，用13mW/cm2脉冲(100Hz)的紫外光(Xenon RC-801)固化涂层1分钟。固化后，进行洗涤步骤。简言之，6-孔板的各孔表面与4毫升＞99％乙醇温育1小时，然后与4毫升水温育过夜以除去可能的可提取物。最后，先进行空气干燥再进行表面灭菌。
细胞毒性分析之前，用25-35kGyγ射线对所有6-孔板进行灭菌。在标准细胞培养条件下，用补加了10％胎牛血清的Iscove的改进Dulbecco培养基将人肺成纤维细胞(MRC5，ATCC编号CCL-171)培养至汇合。利用0.05％胰蛋白酶/EDTA收集细胞，以100,000个细胞/孔的密度接种。在标准细胞培养条件下(5％CO2，37℃)培养细胞。采用CellTiter
Figure BPA00001234413900323
水性单溶液细胞增殖试验(G3581，普罗迈格公司)来测定培养72小时后各表面上活细胞的相对数量。根据生产商的方案进行试验。简言之，吸出培养基后，直接向细胞中加入磷酸缓冲盐水中配制的MTS四唑
Figure BPA00001234413900324
试剂的1∶5稀释液。37℃和5％CO2下培育1小时后，记录490nm的吸光度。通过CellTiter试验发现6-孔形式的所有(甲基)丙烯酸表面无毒。此外，为更好地目测观察细胞形态或均匀细胞粘附的任何改变，吸出孔中的MTS试剂，加入水配制的1毫升结晶紫染色剂的1∶5稀释液。染色5分钟后，用水洗涤各孔3次。干燥平板，获得的代表照片如图11A-B所示。图11A-B：6-孔形式(甲基)丙烯酸表面的结晶紫试验与TCT处理的对照表面。(甲基)丙烯酸涂层表面与TCT对照上未观察到细胞铺展或形态有干扰。
讨论：
配制或涂布期间，高粘度单体可造成自动化液体操控困难。涂布过程中，高粘度还阻碍单体铺展。这些问题可能阻碍用于大面积细胞培养器皿的薄而均匀涂层的高通量材料筛选。这些问题的一种解决方法是引入溶剂。然而对大多数聚合物的常规溶剂通常对细胞有毒性，还可能难以除去。由于我们的基材是聚合物，其在涂布过程中也能溶解于溶剂。在本实施例中，我们利用乙醇作为配制和涂布期间的单体溶剂。然后在固化过程之前先除去乙醇。这样还因涂层较薄而减少了单体消耗，从而对大量材料的文库筛选更有效。
该方法提高了配制效率。在该方法之前，依据重量制备了24种单体的二元掺混物的576-制剂文库。整个过程需要40-50小时/人。在该方法中通过使用乙醇，利用依据体积的液体操控仪器进行掺混。同样的576种制剂可以约4小时/人进行配制，效率提高了10倍。
该方法提高了涂布效率。在涂布过程中，乙醇降低单体粘度并促进单体铺展。这还能将自动化仪器应用于涂布方法中。采用乙醇方法，在96-孔微板中涂布512种不同表面的文库需要2-3小时，相比之下只用单体需要50小时以上。在涂布中应用乙醇还提高了筛选系统的高通量。
该方法还提高涂布均匀性并减少可能的涂层脱层。以前实验显示单体粘度是决定涂布过程中单体制剂铺展的主要因素。因此，不得不在同一表面积上涂布大体积的单体，从而产生较厚的涂层。例如，不用溶剂，涂层约是20-50微米。发现厚涂层因弯月面效应而导致不均匀性，如图8A所示，以及接触水性溶液或细胞培养基后造成脱层，如图9A所示。此外，常需要手工铺展以确保完全覆盖。利用乙醇，制剂粘度较低且能立即铺展。通过降低乙醇中单体的浓度，可使用较少的单体覆盖相同的表面积。发现涂层厚度在＜10μm范围。显著改善了涂层均匀性和脱层问题，如图8B和图9B所示。
还采用细胞活力试验，在72小时内评估采用该方法产生的化学结构各异的丙烯酸表面的细胞毒性，发现其无毒(图10)。此外，注意到对细胞铺展或形态没有干扰(通过结晶紫染色)(图11平板图像)。此外，该乙醇方法在较大的6-孔板形式中保持(甲基)丙烯酸-涂层的一致性，细胞铺展和增殖均匀。
乙醇为该方法带来几种优势。(1)其降低单体粘度，使得在配制过程中可能利用自动化设备并通过效率最多10倍。这样能进行高通量材料筛选。(2)其促进单体铺展从而能用自动化液体操控设备获得小表面积或大表面积的薄而均匀的涂层。(3)其减少涂布方法的单体用量和减小最终的涂层厚度。这样可通过减少单体消耗而降低成本，同时减小聚合期间和接触培养基后的溶胀期间涂层中的应力，并最终减少涂层脱层。
与其它溶剂相比，乙醇还能提供额外的益处：(1)将乙醇用于生物医学或药学过程中，因此对于制造用于治疗性细胞或组织的细胞培养器皿应是安全的；(2)可以USP级购得；(3)其易于蒸发，涂布过程后可除去而无需极端条件，例如真空或加热；(4)废料管理或安全保护的顾虑最少；(5)其是大多数(甲基)丙烯酸单体的良好溶剂，但对于在细胞培养器皿中用作基材的大多数聚合物是不良溶剂；和(6)其在固化前能方便地除去，在自由基聚合期间为惰性，因此对后续涂层聚合的副作用应很低。
实施例3：人胚胎干细胞筛选
材料与方法：
筛选用于人胚胎干细胞粘附和生长的使用乙醇作为溶剂制备的丙烯酸酯表面。简言之，按照70∶30的体积比掺混表4所示的主要和次要单体，并与1％w/v(光引发剂/总单体)的光引发剂Irgacure 819和9/1(乙醇[体积]/总单体[体积])的乙醇混合。然后利用BioTek精密微板移液系统将5微升制备的制剂(单体、光引发剂和乙醇)沉积在经等离子体处理的96-孔环状烯烃共聚物平板的各孔中。制剂立即铺展，将平板在通风橱中水平放置3小时以使乙醇蒸发。然后在N2吹扫的盒中(具有熔凝二氧化硅窗)，用13mW/cm2脉冲(100Hz)的紫外光(Xenon RC-801)固化涂层1分钟。固化后，进行洗涤步骤。简言之，96-孔板的各孔表面用200微升＞99％乙醇温育1小时，然后与200微升水温育过夜以除去可能的可提取物。最后，进行空气干燥再进行表面灭菌。
表4.制剂组成
  制剂编号 主要单体   次要单体
  22-1 二甲基丙烯酸甘油酯   二甲基丙烯酸二(甘醇)酯
  24-5 二丙烯酸四(甘醇)酯   1，6-己二醇乙氧基化二丙烯酸酯，Mn约314
  27-1 二丙烯酸四(甘醇)酯   新戊二醇乙氧基化二丙烯酸酯
  53-3 二甲基丙烯酸新戊二醇酯   二甲基丙烯酸三甘醇酯
  53-4 二甲基丙烯酸新戊二醇酯   二甲基丙烯酸1，4-丁二醇酯
  53-7 三羟甲基丙烷苯甲酸酯二丙烯酸酯   二甲基丙烯酸甘油酯
  53-9 三羟甲基丙烷苯甲酸酯二丙烯酸酯   二甲基丙烯酸1，4-丁二醇酯
  53-10 三羟甲基丙烷苯甲酸酯二丙烯酸酯   聚二丙烯酸(乙二醇)酯
细胞培养之前，用25-35kGyγ射线对所有96-孔板进行灭菌。MATRIGELTM涂布孔用作阳性对照。按照Geron方案培养H1 hES细胞(杰龙公司(Geron Corporation))。简言之，在MATRIGELTM涂布的TCT烧瓶或6-孔板上用化学成分确定的培养基(补加了人重组生长因子的X-Vivo10基础培养基，可购自杰龙公司)培养细胞。利用杰龙公司的子培养方法(胶原酶IV，然后用DPBS洗涤，刮下并重悬在化学成分确定的培养基中)每5天传代细胞，接种密度为0.5-1×106个细胞/6-孔板的每孔(约50,000-100,000个细胞/cm2)。
对于实验，利用MultidropCombi(TF公司(ThermoFisher))自动分配器在实验表面或作为阳性对照的MATRIGELTM涂布的孔上接种细胞，接种密度为35,000/96-孔板的每孔(116,000个细胞/cm2)。在标准细胞培养条件下(37℃，5％CO2)培养细胞48小时，如下所述进行AttoPhos试验。
采用AttoPhos定量试验检测各孔内碱性磷酸酶-阳性(未分化)集落的数量。碱性磷酸酶(AP)是未分化hES细胞的标记。随着细胞分化AP表达丧失或显著降低。
温育结束时，用150微升Dulbecco的磷酸缓冲盐水(DPBS)清洗细胞，室温下用4％低聚甲醛固定10分钟(70微升/96-孔板的每孔)。用150微升DPBS洗涤细胞一次，用100微升AttoPhos荧光底物(DPBS作1∶3稀释)避光处理10分钟。利用PE公司的维克多3微板读数计获得485/535nm的AttoPhos荧光强度。
结果和讨论：
在本实施例中，在采用乙醇涂布方法的诸多实施方式所产生的不同(甲基)丙烯酸表面，合成聚合物表面上筛选短期生长的H1 hES细胞。利用含血清的培养基Xvivo10(含20％FBS+80ng/ml bFGF+0.5ng/ml TGFβ1)将细胞以35,000/孔的密度接种入涂布(甲基)丙烯酸聚合物或MATRIGELTM(作为阳性对照)的96孔板。48小时后，如在材料与方法中所述固定细胞并进行AttoPhos染色加工以检测是否存在未分化(碱性磷酸酶阳性)的hES细胞。在含血清培养基条件下，表面53-3、53-4、53-7、53-9、53-10的AttoPhos荧光非常类似于MATRIGELTM对照(图12)。进行BCIP染色以证实这些表面上正常未分化干细胞集落的形态(数据未显示)。在没有偶联于合成聚合物涂层的肽存在下，无血清培养基条件不支持H1细胞(数据未显示)。这些数据提示采用乙醇涂布方法产生的表面可用于筛选未分化hES细胞在含血清培养基条件下的附着和短期生长。进而为hES细胞培养的表面的培养基优化提供有力的筛选平台。
实施例4：不同溶剂产生合适的涂层
在以上实施例中，我们描述了利用乙醇的溶剂方法，不仅能高通量涂布材料文库以供细胞培养，还提供具有各种物理特性的材料，从高度交联的硬聚合物到可溶胀的(甲基)丙烯酸酯聚合物。利用以上方法获得的表面，我们能偶连生物活性分子，例如肽，并且首次提供能支持用化学成分确定的培养基培养未分化人干细胞的合成聚合物表面。在本实施例中，我们将溶剂选择铺展为表5所列以供测试。
表5.所测试溶剂的列表
  溶剂   Bp   Mp   评论
  乙醚   34.6   -116.3
  丙酮   56.2   -94.3
  甲醇   64.6   -98
  己烷   69   -95   低极性溶剂对照
  乙酸乙酯   77   -83.6
  乙醇   78.5   -114.1
  丁酮   79.6   -86.3
  乙腈   81.6   -46
  2-丙醇   82.4   -88.5
  2-丁醇   98   -115
  水   100   0   高极性溶剂对照
  二甲基甲酰胺   153   -61
还选择了一系列单体制剂以涵盖在聚合后提供各种物理特性的各种单体。高度交联聚合物的制剂包括TEGDA、GDMA和BDMA。可溶胀(甲基)丙烯酸酯聚合物的制剂是SA02。这些制剂示于表6。4种制剂在12种所选溶剂中的溶解性列于表7。结果提示己烷和水不适合于会成为高度交联(甲基)丙烯酸酯聚合物的制剂，而乙醚和己烷不适合于可溶胀(甲基)丙烯酸酯制剂。除己烷外，所有溶剂对于用作细胞培养容器基底材料的环状烯烃共聚物也是惰性的。
为制备高度交联的聚合物涂层，混合1毫升相应单体(TEGDA、GDMA或BDMA)与30微升光引发剂Irgacure 2022作为储备制剂。然后将250微升储备制剂溶解于250微升选自表5的溶剂来制备50％制剂溶液。由于混溶性问题，该测试不选择己烷和水。然后将2微升50％制剂溶液沉积到96-孔环状烯烃平板的各孔。先采用真空等离子体处理平板再进行制剂沉积。具体地说，真空等离子体处理是康宁细胞结合处理(Corning CellBindtreatment)。然后在干燥环境，例如氮气中蒸发溶剂3小时以便除去大部分的溶剂并防止水份在涂层表面冷凝。最后，在氮气中(防止氧抑制)利用Xenon 800脉冲紫外固化系统固化平板60秒，剂量为10-15mW/cm2。表6中的所有制剂含有30微升Irgacure 2022(80％Darocur 1173，20％Irgacure819)作为光引发剂。
表6.所测试制剂列表
Figure BPA00001234413900371
表7.所选制剂对不同溶剂的溶解性
  溶剂   TEGDA   GDMA   BDMA   SA02
  乙醚   √   √   √   ○
  丙酮   √   √   √   √
  甲醇   √   √   √   √
  己烷   ×   ×   √   ×
  乙酸乙酯   √   √   √   √
  乙醇   √   √   √   √
  丁酮   √   √   √   √
  乙腈   √   √   √   √
  2-丙醇   √   √   √   √
  2-丁醇   √   √   √   √
  水   ×   ×   ×   √
  DMF   √   √   √   √
×-溶剂与制剂比例为1∶10到1∶1时不可溶
√-溶剂与制剂比例为1∶10到100∶1比例时可溶
○-溶剂与制剂比例为100∶1比例时不可溶
为与传统溶液聚合作比较，还将375微升储备制剂溶解于125微升DMF中以获得75∶25的制剂溶液。然后将2微升制剂溶液沉积入96-孔环状烯烃平板的各孔。平板已如上所述经细胞结合(CellBind)处理-真空等离子体处理。不进行溶剂蒸发，在氮气环境中(防止氧抑制自由基聚合)利用XenonRC-800脉冲紫外固化系统立即固化平板60秒，剂量为10-15mW/cm2。
为评估所选涂层和方法的可提取物，将200微升乙醇注入各孔，然后室温下振荡平板1小时，再收集乙醇以供HPLC分析。HPLC系统由装配有96Waters光电二极管阵列检测器和Nova Pak C18(4μ)柱的Waters Alliance 2695层析系统组成。流速为1毫升/分钟。采用乙腈和水的梯度流动。该梯度始于95/05水/乙腈，在45分钟内进展至0/100水/乙腈。柱温维持于35℃。分析215nm处的所有数据。最终结果列于表8。在所有测试溶剂中，只有DMF可自本体聚合或溶液聚合方法检测，特别是溶液聚合。采用此类溶液聚合方法或DMF可能需要额外的步骤，例如大量洗涤或长期真空以除去溶剂。相比之下，利用沸点较低的其它溶剂，例如乙醚、丙酮、甲醇、乙酸乙酯、乙醇、丁酮、乙腈、2-丙醇、2-丁醇，溶剂残留不应是问题。
表8.
Figure BPA00001234413900381
细胞毒性分析之前，用25-35kGyγ射线对所有96-孔板进行灭菌。在标准细胞培养条件下，用补加了10％胎牛血清的Iscove的改进Dulbecco培养基将人肺成纤维细胞(MRC5，ATCC编号CCL-171)培养至汇合。利用0.05％胰蛋白酶/EDTA收集细胞，以15,000个细胞/孔的密度接种。在标准细胞培养条件下(5％CO2，37℃)培养细胞。采用CellTiter
Figure BPA00001234413900392
水性单溶液细胞增殖试验(G3581，普罗迈格公司)来测定培养72小时后各表面上活细胞的相对数量。根据生产商的方案进行试验。简言之，吸出培养基后，直接向细胞中加入磷酸缓冲盐水配制的MTS四唑
Figure BPA00001234413900393
试剂的1∶5稀释液。37℃和5％CO2下培育1小时后，记录490nm的吸光度。
Figure BPA00001234413900394
处理的TOPAS表面用作未涂布的基材对照。利用该数据确定(甲基)丙烯酸制剂细胞毒性，如图13所示。归一化吸光度为80％或更高的表面认为无毒性。根据这些结果，认为所有测试的表面无毒。随后用结晶紫染色测试表面，获得图14所示的光学显微图像。诸涂层由以下单体形成：TEGDA(a，b)、GDMA(c，d)、BDMA(e，f)，利用乙醇作为溶剂(a，c，e)或DMF作为溶剂(b，d，f)。结晶紫染色图像显示DMF溶液聚合导致制剂GDMA和BDMA破裂(参见表6)。
为制备交联较低的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层，将100微升表6所列的储备制剂SA02溶解于9.9毫升表3所列的选择溶剂中以获得约1％制剂溶液。由于混溶性问题，该测试不选择乙醚和己烷。然后将1微升制剂溶液沉积入96-孔环状烯烃平板的各孔。先采用真空等离子体处理平板再进行制剂沉积。具体地说，真空等离子体处理是康宁
Figure BPA00001234413900395
处理(Corning
Figure BPA00001234413900396
treatment)。然后在氮气环境中蒸发溶剂3小时以便除去大部分的溶剂并防止水份在涂布表面冷凝。最后，在氮气环境中(防止氧抑制自由基聚合)利用Xenon RC-800脉冲紫外固化系统固化平板60秒，剂量为10-15mW/cm2。作为比较，还用DMF将制剂SA02溶解成1％以供涂布。在每一孔中分布1微升制剂。然后，使涂层接触相同剂量的Xenon RC-800脉冲紫外光而无需干燥步骤以进行溶液聚合。用结晶紫染色一式两份的平板。结晶紫结合到可溶胀(甲基)丙烯酸酯中的带负电基团以在显微镜下提供反差。
图15显示96-孔板的诸孔中结晶紫染色的可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的显微图像，在制备可溶胀(甲基)丙烯酸表面的方法中利用乙醇(a)、2-丁醇(b)、水(c)和DMF(d)作为溶剂。结晶紫染色显示利用丙酮、甲醇、乙酸乙酯、乙醇、丁酮、乙腈、2-丙醇、2-丁醇作为溶剂可提供均匀的可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层，如图15中乙醇和2-丁醇的实例所示。相比之下，水和DMF显示基材可能有大面积的暴露。DMF溶液聚合所得的涂层未显示结晶紫染色，提示未能涂布或被洗掉。
聚合后，采用EDC/NHS方法将肽LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr(SEQ ID NO：1)偶联于可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层表面(SA02)。简言之，将50μL DMF配制的0.1mM EDC和0.05mM NHS溶液分配在各孔中，使之反应1.5小时。然后，将在25mM磷酸缓冲液(pH 7.4)中配制的50μL 1mM肽溶液分配到孔中，使之反应1.5小时。随后用调节至pH 8.0-8.5的1M乙醇胺溶液替代肽溶液。最后用磷酸缓冲液和水洗涤诸孔。
为测试干细胞培养，所有实验平板在进行细胞接种之前先通过喷雾70％乙醇，层流罩中干燥并用200微升Dulbecco的磷酸缓冲盐水(DPBS)洗涤两次进行灭菌。用100微升化学成分确定的培养基[(隆萨公司的Xvivo10)、80ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、研发系统公司(R&DSystems)的0.5ng/ml转化生长因子-β1(TGFβ1)]将H7hES细胞接种在肽偶连的可溶胀(甲基)丙烯酸酯表面，接种密度为35,000个细胞/孔(96-孔板)。MATRIGELTM-涂布的诸孔用作未分化hES细胞附着和生长的阳性对照。在标准细胞培养条件下(37℃，5％CO2)培养细胞48小时，然后固定和加工以供AttoPhos试验来基材碱性磷酸酶活性，其是未分化hES细胞的已知标记。
如下所示进行AttoPhos试验：简言之，温育结束时，用150微升DPBS清洗细胞，室温下用4％低聚甲醛固定10分钟(70微升/96-孔板的每孔)。用150微升DPBS洗涤细胞一次，用100微升碱性磷酸酶的AttoPhos荧光底物(普罗迈格公司)(DPBS中1∶3稀释)避光处理10分钟。利用PE公司的维克多3微板读数计获得485/535nm的AttoPhos荧光强度。实验表面的AttoPhos荧光强度表示为MATRIGELTM对照上细胞培养物的荧光强度％。
AttoPhos结果示于图16。用以下溶剂加工的肽偶连可溶胀(甲基)丙烯酸酯SA02涂层在支持未分化干细胞培养方面类似于或优于MATRIGELTM：丙酮、甲醇、乙酸乙酯、乙醇、丁酮、乙腈、2-丙醇、2-丁醇。进行BCIP染色以证实这些表面上正常的未分化干细胞集落形态(数据未显示)。相比之下，利用水和DMF加工的涂层支持hESC培养较差。
结果和讨论：
除乙醇外，各种溶剂可用于所述的本体相聚合(原位聚合)方法中。在诸多实施方式中，使得组合物在制剂中溶解性良好的溶剂和对所选基材呈惰性的溶剂能提供良好的聚合特征。溶剂的表面能低有助于制剂铺展。低沸点溶剂可在聚合前完全或几乎完全除去。如本文所述的结果所示，对于高度交联的涂层，溶液聚合可能导致涂层破裂，并可导致基材上有未涂布的小块。本文所述方法可用的合适溶剂的例子包括但不限于丙酮、甲醇、乙酸乙酯、乙醇、丁酮、乙腈、2-丙醇、2-丁醇。所用溶剂优选具有约34℃到约120℃、约50℃到约100℃或约70℃到约85℃的沸点。乙醇和2-丙醇因其对单体的溶解性、与塑料树脂的相容性、低表面能、危险废料管理以及安全考虑而成为商品化生产的良好候选对象。
因此，公开了细胞制品和筛选的诸多实施方式。本领域技术人员应知道，可采用除所公开以外的实施方式实施本文所述的阵列、组合物、试剂盒和方法。公开的实施方式是出于说明而非限制的目的。

Claims (30)

1.一种制备具有合成聚合物层的细胞培养制品的方法，该方法包括：
用溶剂稀释一种或多种(甲基)丙烯酸酯单体；
将稀释的单体分散在细胞培养基材的表面上；
除去约80％或更多的溶剂；和
除去约80％或更多的溶剂后在该细胞培养基材的表面上聚合单体以形成连接于该细胞培养基材表面的合成聚合物层。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，除去溶剂的步骤包括蒸发溶剂。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂的沸点为约50℃-约100℃。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂的沸点为约70℃-约85℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂选自下组：丙酮、甲醇、乙酸乙酯、乙醇、丁酮、乙腈、2-丙醇和2-丁醇。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂包括乙醇或2-丙醇。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶剂包含大于95％的乙醇。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用聚合材料形成所述细胞培养基材。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基材包括环状烯烃共聚物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该方法还包括等离子体处理所述细胞培养基材表面，再将稀释的单体分散到所述细胞培养基材的表面上。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，聚合所述单体包括使所述单体接触紫外辐射。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，使所述单体接触紫外辐射的步骤包括使所述单体接触脉冲式紫外辐射。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述脉冲式紫外辐射的递送剂量为约0.5J/cm2-约1.1J/cm2，功率为约5mW/cm2-约100mW/cm2。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，使所述单体接触紫外辐射的步骤包括使所述单体在氮气保护下接触辐射。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括用含溶剂的溶液洗涤所述合成聚合物层。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一种或多种(甲基)丙烯酸酯单体选自下组：多-官能(甲基)丙烯酸酯单体及多-官能和单-官能(甲基)丙烯酸酯单体的组合。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述细胞培养基材表面上聚合所述单体以形成合成聚合物层的步骤包括形成可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，该方法还包括将多肽偶联于所述可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层。
19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，一种或多种(甲基)丙烯酸酯单体包括二甲基丙烯酸甘油酯。
20.一种筛选细胞-合成聚合物层的相互作用的方法，该方法包括：
用溶剂稀释一种或多种(甲基)丙烯酸酯单体以形成溶液；
将该溶液分散在细胞培养基材的一个或多个表面上；
除去该分散溶液中的约80％或更多的溶剂；
除去约80％或更多的溶剂后聚合该(甲基)丙烯酸酯单体，以在该一个或多个表面上形成合成聚合物层；
在细胞培养基中温育该合成聚合物层与细胞；和
表征与细胞一起温育的各合成聚合物层的预定细胞特性。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，除去溶剂的步骤包括从所述一个或多个表面蒸发溶剂。
22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述细胞是干细胞。
23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，该方法还包括等离子体处理所述一个或多个表面，再分散所述溶液。
24.如权利要求20所述的方法，其特征在于，聚合所述单体的步骤包括使所述单体接触紫外辐射。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，使所述单体接触紫外辐射的步骤包括使所述单体接触脉冲式紫外辐射。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述脉冲式紫外辐射的递送剂量为约0.5J/cm2-约1.1J/cm2，功率为约5mW/cm2-约100mW/cm2。
27.如权利要求24所述的方法，其特征在于，使所述单体接触紫外辐射的步骤包括使所述单体在氮气保护下接触辐射。
28.如权利要求20所述的方法，其特征在于，在所述一个或多个表面上聚合所述单体以形成合成聚合物层的步骤包括形成可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，该方法还包括将多肽偶联于所述可溶胀的(甲基)丙烯酸酯层。
30.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所选单体中的至少一种是二甲基丙烯酸甘油酯。
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