JP2007536936A - 幹細胞集団および使用方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、増殖CD34発現細胞の集団、および使用方法を提供する。特定の実施形態は、これらの細胞を成長させるのに有用な特定培地、およびこれらの細胞を含む移植体を提供する。本発明は、損傷組織を復元、修復、再生するための方法に使用される。
Description
本発明は、幹細胞集団、およびこれらの幹細胞集団を増殖させる方法に関する。本発明は、増殖された幹細胞集団を使用する方法にも関する。
一生を通じて、小集団の自己再生幹細胞は、身体の細胞および組織を連続的に補充する。骨髄(BM)、動員末梢血(MPB)、胎児肝臓、胎盤、胚芽幹細胞および臍帯血(UCB)などの幹細胞供給源はいずれも、様々な細胞系統を再構成することが可能な様々な幹細胞及び前駆細胞(SPC)を含む。これらのSPCは、特定の生物シグナルが分化および増殖を誘発するまで静止状態にとどまる。しかし、それらの特定シグナルは希にしか知られていない。
造血は、成体骨髄に存在する幹細胞からの血球発生のプロセスである(非特許文献1)。成体における造血幹細胞(HSC)は、典型的には、骨髄、および身体の長骨(胸骨、頭蓋骨、臀部、骨盤、肋骨および脊椎)の内部の腔を埋める結合組織に存在する(非特許文献2および非特許文献3)が、臍帯血(UCB)、動員末梢血および胎盤にも見られ、それらは胚芽幹細胞から誘導されたものである。結合組織は、洞様構造(sinusoids)によって分離された複雑な固体帯網からなる。それらの帯は、間質および造血細胞で構成され、大規模かつ繁殖性の細胞外基質(ECM)によって接合されている(非特許文献1)。骨内の動脈および毛細血管は、骨髄の細胞に血液および栄養素を与える。
造血幹細胞は、それらの自己再生能力、および特定の細胞系統への拘束に基づいて、(i)無限の自己再生能力を有する多能性幹細胞、(ii)やはり無限の自己再生能力を有するが、リンパ細胞系統または非リンパ細胞系統へと拘束される多分化前駆細胞、(iii)自己再生能力が制限され、個別の血液細胞系統へと拘束される単分化前駆細胞、および(iv)自己再生能力のない分化前駆細胞の4つの範疇に基づいて分類することができる(非特許文献1及び非特許文献4)。
造血幹細胞は、一般には、細胞表面抗原(表面マーカー)の存否によって分類される。造血幹細胞に対する最も広く受け入れられているマーカーであるCD34は、HSC、ならびに大多数の拘束前駆体(committed projenitor)上に発現されると考えられる。例えば、非特許文献5を参照されたい。したがって、骨髄、末梢血または臍帯血からCD34+細胞を選択すると、原生HSCのみならずより成熟な系統特異的前駆体を含む異種細胞混合物が得られることになる(同上)。ヒト造血幹細胞でのCD34発現は可逆的である。例えば、非特許文献6を参照されたい。bnxマウスにおける長期間(7〜8カ月間)の移植後のヒトCD34+CD38−細胞は、深い静止状態になるとCD34を発現しなくなった(同上)。長期間のCD34+CD38−細胞の移植後にマウスの骨髄から回収されたCD45+CD34−系統−細胞集団は、コロニー形成単位含有長期培養誘発細胞(LTC−IC)を形成することができ、二次免疫不全マウスにおいてCD34発現の上方制御を伴う多系統移植を誘発させた(同上)。CD34+CD38−細胞は、今日までに同定された幹細胞および前駆細胞の最も原始的な集団の一つであると考えられる。例えば非特許文献6を参照されたい。HLA−DR(ヒト白血球抗原−DR領域)の発現の欠如、またはそのレベルが非常に低いことは、広範な生体外(in vitro)増殖能力および生体内(in vivo)幹細胞機能に対応付けられた。例えば特許文献5を参照されたい。成体の骨髄または末梢血誘導細胞上のHLA−DR発現の増加は、系統拘束(lineage commitment)に関連することが確認された(同上)。対照的に、胎児ならびに臍帯血HSCは、HLA−DRを発現することが報告された(同上)。低レベルで発現されるThy−1は、幹細胞機能を有するCD34+の部分集合体(subset)を特徴付ける(同上)。AC133と呼ばれることもあるCD133は、造血幹細胞と広く対応付けられる他の細胞表面マーカーである。
何人かの研究者は、動物由来の血清を有する、または有さない、かつ細胞供給層を有する、または有さない限定されたサイトカインカクテルを使用して生体外(ex vivo)で幹細胞を増殖させることを試みた。例えば非特許文献2、非特許文献3、非特許文献7および非特許文献8を参照されたい。間質のないサイトカイン補充培養物を使用すると大規模な成熟細胞の増殖が生じることが広く認められている。実際、たいていの場合において、長期培養誘発細胞(LTC−IC)の数が着実に減少し、増殖された幹細胞が培養においてその発育能力を失うことを示唆すること、およびこの能力は究極的には投入レベル未満に低下することが確認されている。例えば非特許文献5を参照されたい。動物由来の血清または外生供給細胞を必要とする系は、受容体における有害な免疫原性反応および感染の発生のリスクを高める。したがって、当該技術分野では、細胞の量が投入レベル未満に低下しないように、HSCを長時間にわたって支えるサイトカイン補充培養物の如き、化学的に明確な培養物が必要とされる。
特定の系統を再生することが可能な幹細胞を生体外で(in vitro)で増殖させ、発育能力を維持することができれば、治療に必要な供与体物質の量を減少させることによって治療を向上させることができる。増殖されたSPCは、癌治療における幹細胞移植に使用される潜在性がある。加えて、糖尿病、心臓病、肝臓再生および神経変性等の他の細胞治療におけるSPCの潜在的使用が実証された。
増殖されたSPCに対する他の潜在的応用分野は組織工学である。培養増殖細胞を使用して、任意の大きさまたは形状の特製の移植片を作製して、損傷または疾患組織を再生、修復、交換することができる組織工学分野で遭遇する共通の課題は、一定の大きさを上回る培養固形組織の内部に存在する細胞に十分な栄養素を供給することである。内皮前駆細胞の如き特定のSPCは、血管新生を誘発することが最近証明された。血管新生(新しい血管の形成)は、2つの異なるプロセス、すなわち血管形成および脈管形成の一方に起因しうる。血管形成は、胚形成中に内皮前駆細胞(EPC)を内皮細胞に分化させることを含む。脈管形成は、既存の血管からの毛細血管の出芽を含む。血管新生を誘発させるための一般的に用いられる手法は、成長因子またはDNAの放出を制御して、脈管形成を促進させることが中心であり、内皮前駆細胞を成長因子送達と併用することを試みた研究はわずかであった。重要なことは、幹細胞培養系は、幹細胞を凍結させ、次いで使用前に増殖させることができるため、新鮮な供与体物質に伴う実用性の制限を回避することになる。したがって、SPCを増殖させるための方法が必要とされる。
巨大核細胞は、骨髄に存在し、血小板に対する前駆体である。骨髄(BM)および動員末梢血幹細胞(mPBSC)移植と比較すると、臍帯血幹細胞移植では血小板に対する移植は著しく遅く、mPBSCでは9日間であるのに対して、56から200日間もかかる。この時間中、患者は出血し、血小板輸血を受けて、この問題を緩和する。したがって、臍帯血幹細胞移植を受ける患者に対する血小板移植の時間を短くすることで、出血のリスク、すなわち長時間にわたる血小板輸血の必要性を低減し、究極的には移植後の入院期間を縮めることが必要とされる。
本発明は、造血幹細胞および前駆細胞の増殖を促進するための組成物および方法を提供する。好ましい実施形態において、これらの細胞の増殖は、6つの異なる培地組成物(サイトカインカクテル)、すなわちG2、F2、D6、F2N、F4またはG8の1つを使用することによる。これらのカクテルを使用して細胞を増殖させると、細胞の大部分はCD34発現を維持する。本発明は、さらに、高レベルのCD34発現によって特徴付けられる、増殖された造血幹細胞および前駆細胞集団に関する。高レベルのCD34発現を含む細胞は、CD34br細胞と称する。G2、F2、D6、F2N、F4またはG8媒体中の造血幹細胞および前駆細胞を増殖させることによって、CD34を高レベルで発現する細胞(たとえばCD34br)の数が著しく増加する。CD34発現のレベルは、典型的には、造血幹細胞および前駆細胞の体外(in vitro)での発現の結果として低下するため、この知見は有意である。CD34がHSCおよび多くの拘束前駆体上で発現されるとき、多数のCD34+細胞を含む体外(in vitro)での培養物から生じる細胞集団は望ましい。該集団は様々な細胞を表し、そのため細胞治療にとって理想的であるからである。また、本発明のCD34br細胞は、新たに単離されたCD34+細胞と同様の高い平板効率を維持する。これは、CD34br集団は、新たに単離されたCD34+細胞に匹敵する多くのの幹細胞および前駆細胞を含むという結論を裏付けるものである。加えて、コロニー形成試験において、CD34br細胞は、多数の混合コロニーを発生させ、そのことは、多分化幹細胞及び前駆細胞の存在をさらに示唆する。増殖された細胞を移植すると、巨大核細胞および好中球細胞を含む多くの細胞型を再生することができる。
本発明の好ましい実施形態において、多数の成熟細胞を除去し、より未成熟のCD34+細胞の濃度を高くすることによって、臍帯血(UBC)細胞から細胞培養の初期集団を得る。純度は、一般的に75%より高い。骨髄および末梢血細胞または胎児肝臓の如き他のCD34+細胞源を使用することができる。あるいは、これらの細胞源からのCD133+細胞を使用してもよい。
本発明は、CD34+HSCおよび前駆細胞を増殖、濃縮させるための方法をも包括する。当該技術分野で知られている直接的かつ/または間接的単離方法により、それらの細胞を濃縮することができる。次いで、流動細胞計測法(flow cytometry)の如き当該技術分野で知られている方法によって、それらの細胞の純度を測定することができる。次いで、濃縮細胞を、細胞増殖を支える媒体に接種し、培養する。場合によっては、血管内皮成長因子(VEGF)の如き成長因子を添加してもよい。あるいは、最初に培養中でHSCおよび前駆細胞を増殖させ、次いで単離および精製法によりCD34+またはCD34brの濃度を高くすることができる。あるいは、これらの細胞源からのCD133+を使用してもよい。
シート、スライド、皿(例えばペトリ皿)、培養フラスコ、袋、およびウェルの数および形状が任意のマルチウェル培養皿(multiwell cluster dishes)の使用を含む様々な培養方法を本発明の方法に採用できる。本発明の好ましい実施形態において、これらの細胞を培養するのに際して三次元構造[3−D;一般的には骨格(scaffolds)と呼ばれる]が使用される。細胞を新たに単離し、増殖させ、増殖させて内皮前駆細胞(EPC)または内皮細胞へと分化させ、CD34+、CD34+/CD133+、CD34+/CD31+等の表現型に基づいて予め分類することができる。VEGFまたはbFGFの如き成長因子を使用して、または使用せずに細胞を増殖または分化させることができる。3−D骨格は生体細胞により近く、該骨格は細胞治療において適合性を有する故に本発明において特に興味深い。
本発明はまた、増殖細胞およびアルギン酸塩またはヒアルロン酸の如き任意の骨格物質を含む、血管組織を形成するための組成物に関し、また島細胞、インシュリン生成細胞、肝細胞、骨、腎臓および心臓等の治療細胞と組み合わせた、微小球をベースとした到達法、または繊維をベースとした到達法に関する。
本発明のさらなる態様において、治療細胞、脈管形成細胞または血管形成細胞を用いて細胞/骨格構造体を生成する方法、これらの構造体を培養する方法、および移植にこの組成物を使用できる。
本発明の他の態様は、濃縮され増殖された細胞集団を、高用量の放射線または化学療法後の造血系の再生、骨髄切除治療後の巨大核細胞(およびそれによる血小板)の再生、生体内での骨格の血管形成の誘発のような種々の細胞治療のために用いる方法及び使用、および虚血性心筋症、および糖尿病治療における該細胞の応用に関する。
一実施形態において、増殖された幹細胞集団、およびそれらの使用方法が提供される。増殖された細胞集団は、クローン原性の潜在力を維持し、そのことは、それらの細胞集団が、未成熟および成熟前駆細胞および多分化造血幹細胞を含むことを示唆する。したがって、本発明の方法は、細胞の発育能力を低下させることなく、培養における長期間の再増殖細胞を生成するのに用いられる。増殖された細胞集団は、癌、糖尿病、心臓病、神経変性病、肝臓再生および組織工学の治療における治療用途に有用である。特に、増殖された細胞集団は、癌および貧血症の如き疾病を緩和するのに使用できるとともに、虚血性心筋症および糖尿病の如きより多くの拘束細胞型を得ることが望ましい状況において使用することができる。組織移植片または虚血性心臓組織の血管形成の促進を含めて、血管形成を改善または促進するのにそれらの細胞集団を使用することができる。同様に、損傷器官または組織を再生または修復するのに、それらの細胞を使用することができる。増殖された細胞集団を遺伝子改質して、対象となる外来遺伝子を発現させることができる。遺伝子改質された細胞を使用して、対象となる遺伝子、例えば治療剤を発現する形質転換、形質移入または形質導入幹細胞、を安定的に生成することができる。当該細胞は、疾病、特に患者における遺伝子病の治療に有用である。
一態様において、本発明は、造血幹細胞および前駆細胞の増殖に好適な成長因子の組合せおよび培地を提供する。好ましい実施形態において、それらの成長因子の組合せおよび培地は、臍帯血由来CD34+、CD133+またはLin−細胞の増殖に有効であり、それを使用することで、高レベルのCD34発現を特徴とするCD34+細胞の集団が得られる。骨髄および末梢血細胞を使用してもよい。G2、F2、D6、F2N、F4およびG8で示される6つの培地組成物(サイトカイン・カクテル)を開示する。すべてのサイトカイン・カクテルは、栄養培地に添加されると、CD34+細胞の増殖を支持または維持し、あるいは支持かつ維持することが可能である。実際、それらのカクテルは、造血幹細胞、ならびに成熟および未成熟前駆細胞を増殖させることが可能である。
増殖された幹細胞集団、およびそれらの使用方法を提供する。サイトカインの混合物を含む異なる培地で幹細胞を増殖させる。増殖された幹細胞集団は、様々な造血および間葉細胞型を生成する能力によって特徴付けられ、該細胞型は、これらの細胞を、必要とする患者に対して移植することにより、損傷器官を復元、修復、かつ再生することができる。「増殖される」という用語は、生じる細胞集団が、サイトカインの混合物を含む培地組成物における幹細胞の生体外(ex vivo)培養に由来することを意味し、該培養では出て行く細胞数(outgoing number)(培養数)が入ってくる細胞数(ingoing)(非培養数)を上回る。「増殖される」という用語は、細胞由来の何らかのメカニズムまたは理論によって解釈または限定されることはなく、培養において新たに発生する細胞、CD34抗原の発現が単に高められた細胞、またはそれらの組合せを含むことができる。
いくつかの実施形態において、増殖された幹細胞集団は、細胞型の混合物を含むものとして特徴付けられ、該細胞型にはBFU−E/CFU−E[群発(burst)形成単位−赤血球系/コロニー形成単位赤血球系、例えば赤血球前駆細胞に対して特徴的なコロニー]、CFU−GM(コロニー形成単位−顆粒球/マクロファージ、例えば好中球/単球前駆体)、CFU−G(好中球前駆細胞)、CFU−GEMM(コロニー形成単位−顆粒球、−赤血球、単球および巨大核細胞、例えばより未成熟な骨髄幹細胞に対して特徴的なもの)、内皮前駆細胞の如き間葉前駆体、およびそれらの組合せを含むが、それらに限定されない。さらに他の実施形態において、増殖された前駆細胞は、T細胞(CD3)、B細胞(CD19)、成熟顆粒球、NKリンパ球またはマクロファージ(CD16)が実質的に存在しない。
「実質的に存在しない」という用語は、細胞集団内の5%未満、4%未満、3%未満、2%未満または1%未満の細胞が、対象となるマーカーを発現することを意味するものである。少数の単球(CD14)および血小板または巨大核細胞(CD42a)が集団内に存在していてもよい。実質的な割合の細胞が、内皮細胞、血小板、白血球及びそれらの前駆体(CD31)、骨髄前駆細胞(CD33)、造血幹細胞及び前駆細胞(CD34)、増殖細胞および赤血球前駆体(CD71)、ならびにCD34br幹細胞及び前駆細胞または神経もしくは造血幹細胞(CD133)に特徴的な表面マーカーを発現することができる。「実質的な割合」という用語は、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または100%以下の細胞が、対象となるマーカーを発現することを意味するものである。CD38、すなわち典型的には分化造血細胞上に発現されるマーカーは、培養後に実質的に低下する。「実質的に低下」という用語は、少なくとも10%未満または5%未満の細胞が、対象となるマーカーを発現することを意味するものである。
これらの増殖細胞は、また、自己再生の能力によって特徴付けられるため、クローン原性である。「クローン原性」とは、単一細胞の子孫を識別できることを意味するものである。さらに、それらの細胞は、多系統発生へと拘束する能力によって特徴付けられる。「多系統発生」とは、細胞が、造血または内皮起源の細胞型に分化することが可能であることを意味するものである。自己再生多系統幹細胞は、長期間の移植が可能である。「長期間の移植」とは、宿主に移植されると、幹細胞は6週間を上回る期間にわたって移植され続けることを意味するものである。例えば、非特許文献9、非特許文献10、非特許文献11、非特許文献12および非特許文献1を参照されたい。逆に、短期移植幹細胞は、「前駆細胞」と呼ばれる。これらの細胞は、限定された自己再生の能力を有し、様々なリンパおよび骨髄細胞へと拘束された発生に限定される。
「血管芽細胞」という用語は、造血幹細胞および内皮前駆細胞の双方を生成する多能性幹細胞を意味し、これら細胞はそれぞれ、さらに内皮細胞はもちろんのこと、あらゆる造血系統(骨髄およびリンパ)の細胞に分化することができる。「造血幹細胞」という用語は、骨髄およびリンパ細胞の両方を生成する幹細胞を意味するものである。「骨髄」という用語は、赤血球、血小板、好中球、単球、好酸球および好塩基球の如き細胞を意味するものである。「リンパ」という用語は、T細胞、B細胞およびNK細胞のような細胞を意味するものである。「内皮前駆体」という用語は、血管内皮細胞を生成する前駆細胞を意味するものである。本明細書に用いられているように、「間葉幹または前駆細胞」という用語は、前駆体が、間葉系統の細胞を生成することを意味するのに対して、「造血幹または前駆細胞」は、細胞が、造血系統の細胞を生成することを意味するものである。
増殖された幹細胞集団は、CD34細胞表面マーカーを発現する細胞をさらに含む。「細胞表面マーカー」という用語は、細胞の表面に発現されるタンパク質を意味し、該タンパク質は特定の抗体を使用して検出できる。細胞表面マーカーCD34の発現は、幹細胞及び前駆細胞集団と関連付けられる。CD34+CD38−細胞は、初期のの幹細胞及び前駆細胞であると考えられる。例えば、非特許文献5を参照されたい。したがって、一実施形態において、細胞の集団は、CD34+細胞を含み、少なくとも90%から100%の細胞は、CD38を発現しない。
さらに、本発明の増殖された幹細胞集団に含まれる細胞の部分集合体は、細胞表面に増加した量のCD34を発現する。CD34発現が増加した細胞は、流動細胞計測分類および抗体パンニング等を含む任意の手段によって検出、単離されうることを当業者は認識している。いずれの検出方法にも限定されないが、細胞表面に多量のCD34を発現する細胞は、蛍光標識抗体で着色されると明るい蛍光を発する傾向があるため、「CD34br」細胞と呼ばれる。「bright」または「br」という用語は、対象となる標識細胞表面マーカーが、そのマーカーを発現する他の細胞より多くの蛍光を発する(流動細胞計測法、または当業者に知られている任意の他の手段を用いる場合)ことを意味するものである。一般には、流動細胞計測分析において、当業者は、最初に蛍光に対する検出閾値を設定しなければならない。次いで、97%以上の細胞が蛍光を発しないように、検出閾値を調整する。検出閾値が設定されると、対象となる細胞集団の蛍光が記録される。本明細書に用いられているように、「bright」または「br」という用語は、対象となる細胞集団が、対照細胞集団と比較して、約2倍、約5倍、約10倍、約20倍、約30倍、約40倍、約50倍、約60倍、約70倍、約80倍、約90倍、約100倍、約200倍、約300倍、約400倍、約500倍、約600倍、約700倍、約800倍、約900倍、約1000倍、またはそれ以上を超える蛍光を発することを意味するものである。「dim」または「dim」という用語を用いることにより、対象となる細胞集団は、マーカーを発現するが、「bright」または「br」集団のレベルでの蛍光は発しないことを意味するものである。細胞は、タンパク質であっても遺伝子であっても、対象となるマーカーを発現すると「発現に対して陽性である」と見なされる。遺伝子発現プロファイル、および蛍光活性化細胞分類(FACS)等の任意の方法を用いて発現を測定することができる。「+」という用語は、前述したように細胞が発現に対して陽性であることを示す。「−」という用語は、細胞が、流動細胞計測法で測定される場合に、対象となるマーカーの検出可能なレベルの発現を有しないことを示す。本発明の目的では、CD34br細胞集団は、増殖培養を誘導するのに使用される新たに単離されたCD34+細胞集団の大多数(CD34発現レベルのピーク)、または他の実施形態では、CD34dim集団の大多数、よりも実測蛍光が高い集団と定義付けられる。
様々な系統を検出するのに使用される抗体を、異なる蛍光色素に結合させることができる。これらは、例えばフィコエリスリンおよびアロフィコシアニンのようなフィコビリンタンパク質、フルオロセイン、およびテキサスレッドを含む。選択的に死細胞に蓄積する染料(例えばヨウ化プロピジウムおよび7−アミノアクチノミシンD)を使用して、死細胞を検出することもできる。任意の適切な培地[約2%のウシ胎児血清(FCS)または0.2%のウシ血清アルブミン(BSA)など]で細胞を回収することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれている非特許文献13を参照されたい。
本発明の増殖された幹細胞及び前駆細胞は、対象となる細胞マーカーの組合せを発現することもできる。対象となるマーカーとしては、CD31、CD33、CD34、CD42a、CD71、CD90、CD117(c−キット)、CD133、CD135、HLA−DR、VEGF受容体、アルデヒド脱水素酵素(ALDH)、vWF(フォンウィレブランド因子受容体)、およびこれらのマーカーの任意の組合せが挙げられる。いくつかの実施形態において、実質的な割合の細胞が、対象となる細胞表面マーカーを発現する。場合によっては、細胞表面マーカーの発現の欠如は、幹細胞集団、例えばCD3、CD14、CD19、CD16、CD38、CD42a、およびこれらのマーカーの任意の組合せの範囲を定める。
したがって、一実施形態において、細胞の集団は、本明細書に開示されているサイトカインカクテルの如き特定培地にて増殖されたCD34br細胞を含み、少なくとも10%から100%の細胞が、CD31、CD133、CD117、またはそれらの組合せから選択される少なくとも1つのマーカーを発現する。成体骨髄細胞または末梢血誘導細胞におけるHLA−DR発現の増加は、一般には、発現が高い臍帯血造血幹細胞と対照的に、骨髄および末梢血誘導細胞における系統拘束(lineage commitment)と関連付けられる。例えば、非特許文献5を参照されたい。したがって、0.1%から100%の細胞においてHLA−DRを発現することができる。
いくつかの実施形態において、増殖された細胞の集団は少なくともCD34br細胞を含み、該CD34br細胞は臍帯血から誘導され、本明細書に開示されているような特定培地で増殖される。CD34br細胞は造血系統細胞を生成することができ、該造血系統細胞として骨髄細胞(顆粒球、樹状細胞、単球、血小板、巨大核細胞および赤血球等)、リンパ球(T細胞、B細胞、NK細胞および抗原提示細胞等)および内皮細胞(内皮細胞前駆体および内皮組織を含む)を挙げることができるが、これらに限定されない。また、CD34br細胞は恐らくは肝臓および膵臓の細胞を生成することもできる。
一実施形態において、増殖された細胞の集団は、較正された標準フィコエリスリン(PE)接合ビーズおよび試薬[Becton Dickinson Immunocytochemistry Systems(カリフォルニア州San Jose)から市販されている]を使用する流動細胞計測法による蛍光定量によって定められる。これらのビーズ標準品を使用して、細胞当たりの結合する蛍光体量を測定することができる。このように、PEの既知量を基準としたPEビーズの蛍光を蛍光光度計で測定することができる。
1つの当該実施形態において、蛍光定量に関するBecton−Dickinson QuantiBRITE(商標)システムが使用される(非特許文献14に記載)。QuantiBRITE(商標)システムは、QuantiBRITE(商標)PEビーズおよびQuantiQuestソフトウェアからなる。QuantiBRITE(商標)PEビーズは、PE分子に換算してFL2軸を較正するための凍結乾燥ペレットの形の4つの較正済ビーズレベル一式を含む。QuantiQuestは、蛍光をPE分子に関係付ける一次関数を計算するCellQuest(商標)[Becton−Dickinson(カリフォルニア州San Jose)]取得ソフトウェア(バージョン3.1以降)内の定量較正機能である。PE着色細胞に対するPEコピー数は、細胞のFL2値および線形回帰方程式から求められる。
抗体接合体のPE:抗体の比が知られている場合は、細胞当たりのPE分子の数を細胞当たりの接合抗体(ABC)値に変換することができる。「細胞当たりの接合抗体」または「ABC」とは、選択された細胞集団における細胞に結合した対象となる選択抗体の数を意味するものである。一実施形態において、細胞当たりのPE分子数がABC値に等しくなるように、PE:mAb比は1:1になる。当該技術分野で知られている任意の好適な方法を用いて抗体結合のレベルを検出することができる。一実施形態において、QuantiBRITE(商標)システム[Becton Dickinson Immunocytochemistry Systms(カリフォルニア州San Jose)から市販]を使用して、CD34br集団に対するABC値および全CD34+集団を検出する。
ABC値を決定してしまえば、抗原に対する抗体の結合化学量論比により細胞当たりの抗原数を求めることができる。したがって、例えば、抗原に対する抗体の結合化学量論比がPE接合抗CD34抗体について1:1である場合は、CD34抗原の数はABC値に等しくなる。
一実施形態において、増殖された細胞の集団はCD34br細胞の集団を含み、該CD34br細胞の集団は、全CD34+集団に対して測定されたABC値の少なくとも約1.5倍であるABC値を有する(すなわち、CD34br/全CD34+ABC比が約1.5である)。したがって、いくつかの実施形態において、本発明はCD34br細胞を含む増殖細胞の集団を提供し、該CD34br細胞は全CD34+集団に対して測定されたABC値の少なくとも約1.5倍、1.6倍、約1.7倍、約1.8倍、約1.9倍、約2.0倍、約2.1倍、約2.2倍、約2.3倍、約2.4倍、約2.5倍、約2.6倍、約2.7倍、約2.8倍、約2.9倍、約3.0倍または約3.1倍のABC値を有する。
体外法および生体内法の双方を用いて、幹細胞機能を検定することができる。体外試験は、半固形培地中で幹細胞および前駆細胞を培養し、得られたコロニーを調べることを含む。例えば、非特許文献15、非特許文献16および非特許文献17を参照されたい。生体内試験は、一般には、照射マウスに対象となる幹細胞を移植することを含む。細胞をこれらの動物から回収し、表現型について調べることができる。一般に、より多くの細胞系統を復元する細胞はより原始的であるため、より大きな発育潜在性を有する。例えば、非特許文献9、非特許文献10、非特許文献11、非特許文献12および非特許文献1を参照されたい。
本発明の増殖された細胞を遺伝子発現プロファイルに基づいて分析することができる。このようにして、多系統への拘束潜在能力を測定することができる。本明細書に用いられているように、「発現プロファイル」は、遺伝子発現生成物の相対的存在量の測定値に対応する1つまたは複数の値を含む。当該値は、RNAレベルまたはタンパク質存在量の測定値も含むことができる。したがって、発現プロファイルは、遺伝子の転写状態または翻訳状態の測定値を表す値を含むことができる。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている特許文献1、特許文献2、特許文献3、特許文献4および特許文献5を参照されたい。
試料の転写状態は、RNA種、特に試料中に存在するmRNAの個性および相対的存在量を含む。好ましくは、試料中のすべての構成RNA種の実質的な部分が測定されるが、少なくとも試料の転写状態を特徴付けるのに十分な部分が測定される。いくつかの既存の遺伝子発現技術のいずれかにより転写物存在量を測定することによって、転写状態を簡便に測定することができる。翻訳状態は、試料中の構成タンパク質種の個性および相対的存在量を含む。当業者に知られているように、転写状態と翻訳状態は関連している。
いくつかの実施形態において、本発明の増殖された細胞は、表現型と関連する遺伝子の発現を変化させる。例えば、一実施形態において、遺伝子の発現は、増殖されたCD34br細胞とCD34dim細胞との間で異なる。いくつかの実施形態において、15,000を上回る遺伝子転写レベルが変化せず、500以上のレベルが上方に調節され、200以上のレベルが下方に調節され、700の「署名」遺伝子プロファイルを生成する。いくつかの実施形態において、署名遺伝子(sugnature genes)の発現のレベルは、CD34br細胞とCD34dim細胞との間で2倍を超えて異なることになる。例えば、いくつかの実施形態において、幹細胞転写マーカーであるCD133は、CD34dim集団に対してCD34br集団では2倍を超えて増加する。他の実施形態において、Delta−like1ホモローグ(HSC分化の阻害に関与)は、CD34dimと比較してCD34brでは2倍を超えて増加する。さらに他の実施形態において、発生段階の胚血管系での平滑筋細胞増殖の促進および脱分化に関与するCSRP2は、CD34dimと比較してCD34brでは2倍を超えて増加する。いくつかの実施形態において、恒常性を調節するDLK1は、CD34dimと比較してCD34brでは少なくとも2倍増加する。いくつかの実施形態において、細胞増殖において役割を担うSTMN3は、CD34dimと比較してCD34brでは少なくとも2倍増加する。他の実施形態において、増殖および脱分化を促進する転写因子であるCSRP2は、CD34dimと比較してCD34brでは2.6倍を超えて増加する。これらの遺伝子の単独または組合せのいずれか1つの発現の増強は、細胞が初期段階の前駆細胞である可能性が高いことを示す。
いくつかの実施形態において、CD34dim集団に対するCD34br集団の遺伝子転写物の相対的減少は、初期段階の多分化性幹または前駆細胞集団であることを示す。例えば、いくつかの実施形態において、CEBPD(脂肪細胞分化マーカー)は、CD34dim集団に対してCD34br集団では2分の1未満に減少し、EMP2(上皮細胞分化マーカー)は、CD34dim集団に対してCD34br集団では2分の1未満に減少し、CSFIR(骨髄細胞分化マーカー)は、CD34dim集団に対してCD34br集団では3分の1未満に減少し、DCNP1(樹状細胞分化マーカー)は、CD34dim集団に対してCD34br集団では3分の1未満に減少し、PRG1(造血細胞分化マーカー)は、CD34dim集団に対してCD34br集団では4分の1未満に減少し、CXCR4(白血球形成に関与するSDF1受容体)は、CD34dim集団に対してCD34br集団では2分の1未満に減少し、IL−10RA(T細胞およびマクロファージ増殖の阻害の媒介物質)は、CD34dim集団に対してCD34br集団では3分の1未満に減少し、EB12(EBVリンパ球機能によって誘発される受容体)は、CD34dim集団に対してCD34br集団では3分の1未満に減少し、またはそれらの何らかの組合せが挙げられる。
いくつかの実施形態において、CD34dim細胞は、CD34brと比較して2倍を超えて増加するHCK(造血分化に関与する)、CD34brと比較して9倍を超えて増加するLYZ(単球マクロファージ・マーカー)、CD34brと比較して2倍を超えて増加するIL−8(単球マーカー)、CD34brと比較して3倍を超えて増加するLGALS1(分化およびアポトーシス・マーカー)、CD34brと比較して4倍を超えて増加するPLA2G7(血小板調節マーカー)、CD34brと比較して4倍を超えて増加するCLC(好酸球および好塩基球マーカー)、CD34brと比較して3倍を超えて増加するRNASE2(好酸球マーカー)、CD34brと比較して2倍を超えて増加するPNASE3(好酸球マーカー)、CD34brと比較して3倍を超えて増加するS100A12またはカルグラヌリン(calgranulin、好中球)、CD34brと比較して3倍を超えて増加するAOAH(好中球マーカー)、CD34brと比較して3倍超えて増加するMPO(好中球マーカー)、CD34brと比較して2倍以上のCTSG(好中単球マーカー)、CD34brと比較して9倍を超えて増加するS100A9またはカルグラヌリンB(マクロファージ・マーカー)、CD34brと比較して5倍を超えて増加するSCYA13(単球化学誘引タンパク質4)、CD34brと比較して5倍超えて増加するSCYA2(マクロファージ誘導マーカー)、CD34brと比較して4倍超えて増加するSCYB13(Bリンパ球化学誘引物質)、CD34brと比較して5倍超えて増加するCD14、またはそれらの組合せのような遺伝子の転写に対する上方への調節を示す。
いくつかの実施形態において、本発明の増殖された細胞は、培養において経時的に特異的に遺伝子を発現する。例えば、いくつかの実施形態において、CD34br細胞は、CD164転写物質、SELL転写物質、SDFR1転写物質、およびそれらの組合せの量が経時的に減少する。他の実施形態において、CD34br細胞は、発現するFADDの量が経時的に増加する。いくつかの実施形態において、CD34dim細胞は、発現するFADD転写物質、ITGB2転写物質、S100A9転写物質、およびそれらの組合せが経時的に増加する。
本発明の一実施形態において、発現プロファイルに含められる値を測定するのにマイクロアレイ(microarray)が使用される。マイクロアレイは、異なる実験の間の再現性があるため、この目的には特に好適である。DNAマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルの同時測定のための1つの方法を提供する。各アレイは、固体の担体に結合した捕捉プローブの再現可能パターンからなる。標識RNAまたはDNAをアレイ上の相補的プローブにハイブリッド形成させ、次いでレーザ走査により検出する。アレイ上の各プローブに対するハイブリッド形成強度を測定し、相対的な遺伝子発現レベルを表す定量値に変換する。実験のセクションを参照されたい。また、参照により本明細書に組み込まれている特許文献1、特許文献2、特許文献3、特許文献5および特許文献4を参照されたい。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、試料中の多数のRNAに対する遺伝子発現を測定するのに特に有用である。
「アレイ」とは、ペプチドまたは核酸プローブが結合した固体の担体または基体を意味するものである。アレイは、典型的には、基体の表面の異なる既知の個所に結合する複数の異なる核酸またはペプチド捕捉プローブを含む。「マイクロアレイ」または口語的に「チップ」とも表現されるこれらのアレイは、当該技術分野において、例えばそれぞれが全面的に本明細書に組み込まれている特許文献6、特許文献7、特許文献8、特許文献9、特許文献10、特許文献11、特許文献12、特許文献13および非特許文献18を参照されたい。
統計的に設計された実験の使用を通じて、特定の薬剤の組合せを、本発明の幹細胞及び前駆細胞の生体外増殖について識別した。一実施形態において、特定の組合せは、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15または少なくとも16のサイトカインを含む。本発明の特定の組合せは、フィブロネクチン、間質細胞由来因子1α(SDF−1α)、IL−6、幹細胞因子(SCF)、IL−5、脳由来神経栄養因子(BDNF)、血小板由来内皮細胞成長因子(PD−ECGF)、IL−11、IL−3、エリスロポイエチン(EPO)、Flt3−/Flk−2リガンド、骨形成タンパク質(BMP−4)、トロンボスポンジン、インシュリン類似成長因子(IGF−1)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、アンギオテンシン、A鎖およびB鎖ヘテロダイマーを有する血小板由来成長因子(PDGF−AB)、形質転換成長因子(TGF−ベータ1)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、血管内皮成長因子(VEGF)、表皮成長因子(EGF)、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、単球化学走性タンパク質−1/CCL2(MCP−1)、胎盤成長因子(PlGF)、アミノ酸配列VTCGを含む造血接着ペプチド、TNF関連活性誘発サイトカイン(TRANCE)および顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)を含むことができる。
一実施形態において、特定のサイトカインカクテルは、「G2」と呼ばれ、フィブロネクチン、SDF−1α、IL−6、SCF、IL−5、BDNF、PD−ECGF、IL−11、IL−3、EPO、Flt−3/Flk−2リガンド、BMP−4、トロンボスポンジン、IGF−1およびbFGFの組合せを含む。
1%未満のG2増殖集団が、増殖後にT細胞(CD3)、B細胞(CD19)または成熟顆粒球、NKリンパ球またはマクロファージ(CD16)を含み、10%未満の集団が、増殖後に単球(CD14)、分化造血細胞(CD38)および血小板または巨大核細胞(CD42a)を含む。25%を超える集団が、内皮細胞、血小板、白血球またはそれらの前駆体(CD31)、骨髄前駆細胞(CD33)、造血幹細胞及び前駆細胞(CD34)、増殖細胞および赤血球前駆体(CD71)を含む。10%を超える細胞が、神経幹細胞(CD133)、およびCD34br幹細胞及び前駆細胞を含む。一実施形態において、G2増殖細胞集団は、幹細胞集団を含み、1%未満の細胞がCD3を発現し、10%未満の細胞がCD14を発現し、1%未満の細胞がCD16を発現し、1%未満の細胞がCD19を発現し、80%を超える細胞がCD31を発現し、60%を超える細胞がCD33を発現し、25%を超える細胞がCD34を発現し、5%未満の細胞がCD38を発現し、10%未満の細胞がCD42aを発現し、40%を超える細胞がCD71を発現し、15%を超える細胞がCD133を発現し、10%を超える細胞がCD34brを発現し、そしてそれらの組合せが挙げられる。
他の実施形態において、特定のサイトカインカクテルは、「F2」と呼ばれ、アンギオテンシン、IL−6、SCF、BDNF、IL−3、PDGF−AB、BMP−4、TGF−ベータ1、トロンボスポンジン、GM−CSF、VEGF、EGF、bFGF、M−CSFおよびMCP−1を含む。
F2増殖集団の1%未満が、増殖後にT細胞(CD3)、B細胞(CD19)または成熟顆粒球、NKリンパ球、またはマクロファージ(CD16)を含み、集団の15%未満が、増殖後に単球(CD14)、分化造血細胞(CD38)、および血小板または巨大核細胞(CD42a)を含み、集団の10%を超える細胞が、内皮細胞、血小板、白血球またはそれらの前駆体(CD31)、骨髄前駆細胞(CD33)、造血幹細胞及び前駆細胞(CD34)、増殖細胞および赤血球前駆体(CD71)を含み、2%を超える細胞が、神経幹細胞(CD133)、およびCD34br幹細胞及び前駆細胞を含む。一実施形態において、F2増殖細胞集団は、幹細胞集団を含み、1%未満の細胞がCD3を発現し、15%未満の細胞がCD14を発現し、1%未満の細胞がCD16を発現し、1%未満の細胞がCD19を発現し、50%を超える細胞がCD31を発現し、50%を超える細胞がCD33を発現し、15%を超える細胞がCD34を発現し、5%未満の細胞がCD38を発現し、10%未満の細胞がCD42aを発現し、40%を超える細胞がCD71を発現し、1%を超える細胞がCD133を発現し、7%を超える細胞がCD34brを発現し、そしてそれらの組合せが挙げられる。
さらなる実施形態において、特定のサイトカインカクテルは、「D6」と呼ばれ、PlGF、SDF−1アルファ、IL−6、SCF、IL−5、BDNF、IL−11、IL−3、EPO、PDGF−AB、Flt−3/Flk−2リガンド、アミノ酸配列VTCGを含む造血接着ペプチド、TRANCE、GM−CSF、VEGFおよびG−CSFを含む。
D6増殖集団の1%未満が、増殖後にT細胞(CD3)、B細胞(CD19)または成熟顆粒球、NKリンパ球、またはマクロファージ(CD16)を含み、集団の10%未満が、増殖後に単球(CD14)、分化造血細胞(CD38)、および血小板または巨大核細胞(CD42a)を含み、集団の20%を超える細胞が、内皮細胞、血小板、白血球またはそれらの前駆体(CD31)、骨髄前駆細胞(CD33)、造血幹細胞及び前駆細胞(CD34)、増殖細胞および赤血球前駆体(CD71)を含み、5%を超える細胞が、神経幹細胞(CD133)、およびCD34br幹細胞及び前駆細胞を含む。一実施形態において、D6増殖細胞集団は、幹細胞集団を含み、1%未満の細胞がCD3を発現し、10%未満の細胞がCD14を発現し、1%未満の細胞がCD16を発現し、1%未満の細胞がCD19を発現し、80%を超える細胞がCD31を発現し、60%を超える細胞がCD33を発現し、20%を超える細胞がCD34を発現し、5%未満の細胞がCD38を発現し、5%未満の細胞がCD42aを発現し、50%を超える細胞がCD71を発現し、10%を超える細胞がCD133を発現し、5%を超える細胞がCD34brを発現し、そしてそれらの組合せが挙げられる。
さらなる実施形態において、特定のサイトカインカクテルは、「F2N」と呼ばれ、BDNF、bFGF、EPO、フィブロネクチン、Flt−3/Flk−2リガンド、IGF−1、IL−11、IL−3、IL−5、SCF、TGF−ベータ1、G−CSFおよびGM−CSFを含む。
さらなる実施形態において、特定のサイトカインカクテルは、「F4」と呼ばれ、bFGF、EPO、Flt−3/Flk−2リガンド、IL−11、IL−6、PD−ECGF、トロンボスポンジンおよびトロンボポイエチン(Tpo)を含む。
さらなる実施形態において、特定のサイトカインカクテルは、「G8」と呼ばれ、BDNF、bFGF、Flt−3/Flt−2リガンド、IL−3、IL−6、PD−ECGF、SCF、G−CSF、白血病阻害因子(LIF)および幹細胞成長因子−アルファ(SCGF−アルファ)を含む。
これらの特定のサイトカイン混合物(cytokine combination)を基本栄養培地に添加して、臍帯血由来細胞および/または他の細胞を維持または増殖させるのに好適な培地を提供することができる。哺乳類細胞、特に幹細胞の培養に好適な任意の栄養培地、例えばStemline(商標)[Sigma−Aldrich(ミズーリ州)]を使用することができる。栄養培地におけるこれらのサイトカインの最終濃度は、1フェムトグラム/ml〜1ピコグラム/ml〜1ナノグラム/ml〜1ミリグラム/mlの範囲でありうる。いくつかの実施形態において、サイトカインのいずれか1つの濃度は、1pg/ml、5pg/ml、10pg/ml、15pg/ml、20pg/ml、25pg/ml、30pg/ml、35pg/ml、40pg/ml、45pg/ml、50pg/ml、55pg/ml、60pg/ml、65pg/ml、70pg/ml、75pg/ml、80pg/ml、85pg/ml、90pg/ml、95pg/ml、100pg/ml、110pg/ml、120pg/ml、130pg/ml、140pg/ml、150pg/ml、160pg/ml、170pg/ml、180pg/ml、190pg/ml、200pg/ml、210pg/ml、220pg/ml、230pg/ml、240pg/ml、250pg/ml、260pg/ml、270pg/ml、280pg/ml、290pg/ml、300pg/ml、310pg/ml、320pg/ml、330pg/ml、340pg/ml、350pg/ml、360pg/ml、370pg/ml、380pg/ml、390pg/ml、400pg/ml、410pg/ml、420pg/ml、430pg/ml、440pg/ml、450pg/ml、460pg/ml、470pg/ml、480pg/ml、490pg/ml、500pg/ml、510pg/ml、520pg/ml、530pg/ml、540pg/ml、550pg/ml、560pg/ml、570pg/ml、580pg/ml、590pg/ml、600pg/ml、610pg/ml、620pg/ml、630pg/ml、640pg/ml、650pg/ml、660pg/ml、670pg/ml、680pg/ml、690pg/ml、700pg/ml、710pg/ml、720pg/ml、730pg/ml、740pg/ml、750pg/ml、760pg/ml、770pg/ml、780pg/ml、790pg/ml、800pg/ml、810pg/ml、820pg/ml、830pg/ml、840pg/ml、850pg/ml、860pg/ml、870pg/ml、880pg/ml、890pg/ml、900pg/ml、910pg/ml、920pg/ml、930pg/ml、940pg/ml、950pg/ml、960pg/ml、970pg/ml、980pg/ml、990pg/ml、1ng/ml、1.5ng/ml、2ng/ml、2.5ng/ml、3ng/ml、3.5ng/ml、4ng/ml、4.5ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、7ng/ml、8ng/ml、9ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml、60ng/ml、65ng/ml、70ng/ml、75ng/ml、80ng/ml、85ng/ml、90ng/ml、95ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、160ng/ml、170ng/ml、180ng/ml、190ng/ml、200ng/ml、210ng/ml、220ng/ml、230ng/ml、240ng/ml、250ng/ml、260ng/ml、270ng/ml、280ng/ml、290ng/ml、300ng/ml、310ng/ml、320ng/ml、330ng/ml、340ng/ml、350ng/ml、360ng/ml、370ng/ml、380ng/ml、390ng/ml、400ng/ml、410ng/ml、420ng/ml、430ng/ml、440ng/ml、450ng/ml、460ng/ml、470ng/ml、480ng/ml、490ng/ml、500ng/ml、510ng/ml、520ng/ml、530ng/ml、540ng/ml、550ng/ml、560ng/ml、570ng/ml、580ng/ml、590ng/ml、600ng/ml、610ng/ml、620ng/ml、630ng/ml、640ng/ml、650ng/ml、660ng/ml、670ng/ml、680ng/ml、690ng/ml、700ng/ml、710ng/ml、720ng/ml、730ng/ml、740ng/ml、750ng/ml、760ng/ml、770ng/ml、780ng/ml、790ng/ml、800ng/ml、810ng/ml、820ng/ml、830ng/ml、840ng/ml、850ng/ml、860ng/ml、870ng/ml、880ng/ml、890ng/ml、900ng/ml、910ng/ml、920ng/ml、930ng/ml、940ng/ml、950ng/ml、960ng/ml、970ng/ml、980ng/ml、990ng/ml、1000ng/mlでありうる。これらのサイトカインを濃縮し、場合によっては栄養培地に添加する前に凍結乾燥して、上記の最終濃度の例を得ることができることを当業者は認識している。培養に添加する質量は、サイトカイン調製物の具体的な生物活性に依存することも当業者は認識している。サイトカインの生物学的効果を判断するための生物検定は、当該技術分野でよく知られている。したがって、生物活性を質量に関連付ける場合は、検定によって規定されるような生物「単位」を用いる。
本発明の方法は、サイトカインカクテルを含む栄養培地中で幹細胞源からの幹細胞を培養または増殖させることを含む。細胞の培養方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、非特許文献19を参照されたい。「細胞培養」とは、人工的な生体内環境に細胞を維持することを意味する。「細胞培養」という用語は、総称であり、個々の細胞ばかりでなく、組織、器官系または生体全体の培養を包括するのに用いることができることが理解されるべきである。ある実施形態では、幹細胞源由来の細胞は栄養培地を含む培養容器内に置かれる。該培地は、サイトカイン混合物を含んでいてもよく、またはサイトカインを後で添加することができる。次いで、細胞をサイトカイン混合物とともに、細胞成長に好適な温度(いくつかの実施形態では約37℃)にて少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、少なくとも96時間、またはそれより長い時間にわたってインキュベートする。当該技術分野で知られている任意の方法で細胞を収穫することができ、該収穫方法としては、非接着細胞を回収するための遠心分離、接着細胞のトリプシン処理、または表面から細胞を擦り取ることを含むが、それらに限定されない。
間質細胞は、骨髄における造血細胞の増殖および分化のための重要な役割を果たす。例えば、非特許文献20、非特許文献21、非特許文献22および非特許文献23を参照されたい。したがって、骨髄由来造血細胞調製物、またはAFT024の如きマウス培養細胞の培養物中に形成された間質供給層を利用して、造血幹細胞または前駆細胞を生体外で維持することができる場合もある。例えば、非特許文献6を参照されたい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の細胞の増殖化は、誘導された細胞を間質支持細胞と接触させることを含むことができる。他の実施形態において、幹細胞源由来の非分割(unfractionated)白血球(総有核細胞、TNC)を本明細書に開示されたサイトカインカクテルで培養するときに、間質細胞を臍帯血から誘導する。当該技術分野で知られている方法を用いて、骨髄からの間質細胞の単離および培養を成し遂げることができるが、臍帯血源から間質細胞を導く方法を記載した報告書はわずかしか存在しない(例えば非特許文献24および非特許文献25参照)。本発明の方法に従って、接着間質細胞の増殖は、本明細書に開示されているサイトカインカクテル、特に上記のG2培地で臍帯血由来総有核細胞を培養することによってなされる。本明細書に記載されている方法のいずれかのために、サイトカインカクテルでの培養から導かれた間質細胞を、増殖されたCD34br細胞集団と組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、増殖された間質細胞は、間葉起源の少なくとも1つまたは複数の細胞型を生成することが可能な間葉幹細胞を含む。
代替的な造血幹細胞及び前駆細胞源、例えば臍帯血、動員末梢血またが胎盤は、間質支持層を自動的には供給しない。加えて、治療用途のための細胞は、細胞受容体に対する免疫原性または感染発生のリスクのない十分に特定された培養物中に維持されなければならない。治療用途では、治療細胞と未特定の支持層とを直接に接触させることは望ましくない。代替的な培養系が、研究され、当該技術分野で知られている。例えば非特許文献26を参照されたい。
したがって、未特定の間質支持層は、特に患者の疾病により自己移植が可能でない場合は、一般的に望ましくない。したがって、本発明は、無間質培養を含めて、幹細胞及び前駆細胞の増殖のための十分に制御され、かつ十分に特定された培養条件を提供する。本発明は、細胞の量が投入レベル未満に低下しないように、SPC成長を長期にわたって持続させるサイトカイン補充をさらに提供する。
培養に使用される細胞は、臍帯血、末梢血、胎児肝臓、胎盤、胚幹細胞または骨髄の如き任意の幹細胞源から導かれた細胞を含むことができる。これらの試料は、新鮮な試料、凍結試料または冷蔵試料であってもよい。細胞を凍結させる方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば非特許文献27を参照されたい。
培養前の幹細胞の細胞凍結、または本明細書に開示されている増殖細胞の細胞凍結を知られている方法に従って実施することができる。例えば、細胞を「凍結培地」に懸濁させることができ、該凍結培地として例えば5〜10%のグリセロールを有する、または有さない10%のジメチルスルホキシド(DMSO)をさらに含む培地を挙げることができ、その密度は例えば約0.5〜4×106個/mlの密度である。細胞をガラスまたはプラスチックバイアルに分配し、次いでそれらを密封し、プログラム式フリーザーまたはパッシブ(passive)フリーザーである冷凍室に移す。最適な凍結速度を実験的に決定することができる。例えば、融解熱による−1℃/分の温度変化を与える凍結プログラムを用いることができる。細胞を含むバイアルが−80℃に達すると、それらを液体窒素保存部に移す。低温保存細胞を数年間にわたって保存することができる。
いくつかの実施形態において、任意の幹細胞源から新たに単離された細胞を低温保存して、細胞バンク(cell bank)を構成することができ、そのいくつかの部分を解凍により取り出し、次いで必要に応じて本発明の増殖細胞を生成するのに使用することができる。解凍は、一般には迅速に実施される必要があり、例えばバイアルを液体窒素から37℃の水槽に移すことによって行われる。バイアルの解凍内容物を、栄養培地の如き適切な培地を含む培養容器に、無菌条件下で即座に移す必要がある。培養を始めたら、細胞を、例えば倒立顕微鏡で毎日検査して、細胞増殖を検出し、適切な密度に達するとすぐに継代培養することができる。
細胞を必要に応じて細胞バンクから取り出し、体外(in vitro、例えば以下に記載される三次元骨格培養物として)で、または生体内で(in vivo、例えば組織復元または修復が必要とされる部位に対する細胞の投与により)新たな幹細胞または組織の生成に使用することができる。本明細書に記載されているように、本発明の増殖細胞を使用して被検体における組織を復元または修復することができ、該増殖細胞は被検体自身の血液またはその他の組織から単離された(すなわち自己由来細胞)ものに由来する。あるいは、本明細書に開示されている増殖細胞を、任意の被検体における組織を復元または修復するための遍在的な供与体細胞として使用できる(すなわち異種由来細胞)。
培養に先だって、分化細胞の消極的選択により、終末分化細胞の大部分を幹細胞源から除去することができる。例えば、多数の系統拘束細胞を選択的な磁性ビーズの分別により除去することができる。いくつかの実施形態において、少なくとも約80%、通常は少なくとも約70%の分化細胞が、培養に先立って除去されることになる。
当該技術分野で知られている任意の方法を用いて培養SPCをさらに特徴付けることができる。一般には、細胞は、細胞表面から導かれたモノクローナル抗体と接触し、積極的または消極的に選択される。選択のための当該技術は、当該技術分野でよく知られており、免疫磁性ビーズ、補体媒介溶菌、固体基質に結合した抗体を用いた「パンニング法」、凝集反応法、磁性活性細胞分類(MACS)またはFACS、による分類を含む。
本発明の増殖細胞は、疾病および傷害の治療および緩和における広範な用途を有する。本発明の増殖細胞は、遺伝子送達はもちろんのこと、組織の修復、復元および再生を含む多くの治療用途に有用である。本発明の細胞は、系統拘束、また非拘束細胞の双方を含むことができるため、双方の細胞型を併用して、複数の治療目標を、いくつかの実施形態ではさらに同時に達成することができる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の増殖細胞を免疫不全症の治療に使用することができ、または幹細胞移植体として使用することができ、または懸濁物中もしくは支持骨格上の幹細胞移植片において使用することができる。
本発明の増殖細胞を投与前に担体培地に仕込むことができる。注入については、本発明の増殖細胞を生理的に許容可能な媒体で、通常は血管内投与(静脈内投与を含む)により投与することができるが、骨髄(細胞にとって再生および分化のための好適な部位でありうる)の如き他の都合のよい部位に導入してもよい。通常は、少なくとも1×105細胞/kg、少なくとも5×105細胞/kg、少なくとも1×106細胞/kg、少なくとも2×106細胞/kg、少なくとも3×106細胞/kg、少なくとも4×106細胞/kg、少なくとも5×106細胞/kg、少なくとも6×106細胞/kg、少なくとも7×106細胞/kg、少なくとも8×106細胞/kg、少なくとも9×106細胞/kg、少なくとも10×106細胞/kg、またはそれよりも多くの細胞が投与されることになる。例えば非特許文献28を参照されたい。注射およびカテーテル法等を含む任意の方法によって細胞を導入することができる。所望により、さらなる薬物または成長因子を共投与することができる。対象となる薬物としては、5−フルオロウラシル、およびサイトカインを含む成長因子(IL−2、IL−3、G−CSF、M−CSF、M−CSF、GM−CSF、IFNガンマおよびEPO等)が挙げられる。
投与細胞は、本発明の細胞の混合物、および対象となるさらなる細胞を含むこともできる。対象となる細胞としては、分化肝細胞、分化心筋、分化脾臓細胞、またはこれらの分化細胞の前駆対等が挙げられる。これらの組合せは、本発明の増殖細胞が本明細書に開示されている三次元骨格に接種される場合は特に有用である。
いくつかの実施形態において、集団の増殖細胞を使用して、免疫応答を調節することができる。例えば、前駆および幹細胞はリンパ球に成長するため、抗原をこれらの細胞に充填することができる。それらの細胞は、成長するに従って、治療用途および抗原に応じて特定の抗原に対する耐性または免疫を誘発することができる。
いくつかの実施形態において、本発明の増殖細胞は骨髄機能を復元する際に有用であり、例えば骨髄が癌放射線療法または癌化学療法等において切除された場合に有用である。骨髄機能が損なわれる疾病の例としては、白血病類、貧血症類(鎌形細胞、地中海貧血、フォンウィルブランド病等)、リンパ腫類(ホジキン病および多発性骨髄腫等)、ならびに固形器官癌類(肺癌、乳癌、精巣癌、卵巣癌および結腸癌等)が挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの実施形態において、患者からの幹細胞を除去し、増殖させ、かつ再導入することができる。このような場合は、増殖のための幹細胞源は、動員末梢血および骨髄を含む。増殖後、これらの細胞を分類し、再導入して、癌細胞が受容体に戻る機会を低下させることによって、自己由来幹細胞移植体に対する成果を向上させることが得きる。
治療は、造血幹細胞のより従来的な使用に限定されない。本明細書に記載されているように、本発明の増殖された幹細胞及び前駆細胞は、造血系統および間葉系統の双方に分化することができる。例えば非特許文献29を参照されたい。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の増殖された細胞集団を使用して、損傷間葉組織または疾患間葉組織(心臓、膵臓、肝臓、骨、軟骨、内皮、神経、星状膠細胞および真皮等)の修復および復元を行うことができる。増殖された細胞は、帰巣するか、あるいは損傷部位に仕込まれると、分化して、新たな組織を形成し補足器官機能を果たすことができる。いくつかの実施形態において、それらの細胞を使用して、血管新生を促進することができるため、酸素添加反応、および組織からの廃棄物除去を向上させることができる。これらの実施形態において、本発明の増殖された細胞を使用して、分化組織および器官(心不全等における虚血心臓または卒中等における虚血神経等)の機能を高めることができる。したがって、本発明の幹細胞は、細胞機能または器官機能が低下したあらゆる疾病に有用である。
移植の前に、細胞を組織工学構造体(tissue−engineered construct)と接触させることにより、本発明の増殖された細胞を移植に使用することができる。次いで、これらの細胞を含む該構造体を、当該移植体を必要とする宿主に移植する。本発明の細胞は、移植体での血管形成および脈管形成を促進させることによって、酸素添加反応および廃棄物除去を容易にし、移植体における虚血性壊死および炎症のリスクを低減するのに特に有用である。いくつかの実施形態において、本発明の組織工学構造体は、少なくとも血管系促進幹細胞、すなわち三次元生体適合骨格上の分化細胞を含み、それによって修復または交換されるべき器官の少なくとも1つの生理的機能を果たす。本発明の増殖細胞は、血管系促進幹細胞として特に有用である。「血管新生促進」または「血管系促進」とは、新たな血管の成長(血管形成)を促進すること、または既存の血管からの成長(脈管形成)を誘発すること、またはそれらの任意の組合せを意味するものである。
「分化細胞」とは、限定された組織発生へと拘束された細胞を意味するものである。いくつかの実施形態において、本発明の増殖細胞は、系統拘束細胞、非拘束細胞の双方を含むことができる。したがって、いくつかの構造体において、幹細胞は、分化組織を生成するとともに、血管系促進細胞源として作用することができる。他の実施形態において、分化組織源は、目的とする移植体受容体または他の供与体からの細胞または組織を含むことができる。細胞または組織源を移植前に分化させることができる。例えば、非特許文献30および非特許文献31に詳述されている胚様体形成について記載されている条件を用いて、脾臓ベータ細胞を分化させることができる。
分化細胞と組み合わされる血管系促進細胞は、例えば、臍帯血を含む任意の幹細胞源から導かれるCD34br細胞、新たに単離された、または体外(in vitro)でCD34br細胞から分化された内皮前駆細胞、任意の幹細胞源からの新たに単離された幹細胞、および細胞表面マーカーCD34、CD133と共発現するCD34、およびCD31と共発現するCD34の発現のために選択される任意の細胞源からの細胞を含むことができる。いくつかの実施形態において、血管系促進細胞をVEGFおよびbFGFの如き脈管形成成長因子と接触させる。細胞を骨格に接種する前または後に脈管形成成長因子と接触させてから、構造体を損傷器官に移植することができる。いくつかの実施形態において、サイトカイン含浸ポリマーは、ある期間にわたってVEGFおよびbFGFを放出することができる。他の実施形態において、接種細胞の増殖(expansion)および分裂(proliferation)を誘導するように、該骨格を条件付けすることができる。例えば、特許文献14を参照されたい。他の実施形態において、微小球を血管系促進幹細胞と接触させ、目標部位に仕込むことができる。微小球をベースとした骨格は、当該技術分野でよく知られている。例えば、非特許文献32を参照されたい。
「損傷器官を補足する」とは、最適な能力未満で機能する器官の機能を高め、強化し、かつ向上させることを意味するものである。その用語は、器官が被検体にとって生理的に許容可能な能力で機能するように機能を獲得することを意味するものである。例えば、小児の器官、例えば腎臓または心臓にとって生理的に許容可能な能力は、成人または高齢患者の生理的に許容可能な能力とは異なる。器官全体または器官の一部を補足することができる。補足結果が、本来の器官と同じ生理的応答を有する器官をもたらすことが好ましい。一実施形態において、器官は、その自然の能力の少なくとも約10%で機能しているときに能力が補足される。
三次元生体適合骨格が、本発明の血管系促進増殖細胞と接触した後に(例えば器官内の)目標部位において宿主組織と接触される場合、またはその器官組織を移植前に該骨格上で成長させる場合には、移植体は、目標部位内で成長、増殖し、器官の低下した活性を交換または補足することが可能である。構造物を宿主の単一個所に添加することができる。あるいは、複数の構造体を形成し、宿主の複数の部位に添加することができる。
本明細書に用いられている「目標部位」という用語は、交換または補足を必要とする宿主または器官における領域を意味する。目標部位は、器官または宿主における単一領域、あるいは器官または宿主における複数の領域でありうる。いくつかの実施形態において、補足または交換は、正常器官と同じ生理的応答をもたらす。
骨格の形状および寸法は、交換または補足されている器官、および構造体を形成するのに使用されている骨格材料の種類に基づいて決定される。例えば、ポリマー骨格が腎臓交換または補足に使用される場合は、そのポリマー骨格の寸法は、そのポリマー骨格の幅および長さの点で変化しうる。ポリマー骨格の大きさおよび寸法は、交換または補足されている器官の面積に基づいて決定されることを当業者は認識している。
本明細書に用いられている「脱細胞化される」または「脱細胞化」という用語は、生物構造体(例えば器官、または器官の一部)から細胞および組織内容物を除去して、無傷の無細胞基礎構造を残した該生物構造体を意味する。脱細胞化の方法は、特定組織を除去し、結合組織の複雑な三次元網を残すものである。結合組織基礎構造は、主にコラーゲンからなる。脱細胞化構造体は基質材料を提供し、その上に異なる細胞集団を注入することができる。脱細胞化生物構造体は、硬質、または半硬質で、その形状を変化させることができる。例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれている特許文献15に記載されているように、脱細胞化生物構造体の培養および作製を実施することができる。
本発明の組織工学構造体は、骨格材料を基体として使用して、その上に細胞を堆積させ、その上で細胞を成長させ及び接着させて形成される。
本発明は組織工学構造体を形成する方法を提供し、該方法では、さらなる培養細胞の生体内(in vivo)での成熟、成長および分化を支持する骨格材料を使用して、それらの生体内(in vivo)相当物に類似した生体組織の成分を形成させる。該骨格は、最適な細胞−細胞相互作用を可能にすることによって、細胞表現型および組織微小環境のより自然な形成を可能にする。該骨格は、また、細胞が活発に成長し、増殖し、分化して、組織工学構造体を生成し続けることを可能にし、該組織工学構造体は必要であれば、さらなる培養細胞集団の成長、増殖および分化を支持することも可能である。
骨格材料上で成長する細胞は、本発明によれば、多層で成長して、生体内(in vivo)に見られる生理的条件に類似した細胞構造体を形成することができる。骨格は、異なる型の細胞の増殖、およびいくつかの異なる組織の形成を支持することができる。例としては、胃腸および泌尿管、および循環系はもちろんのこと、腎臓、心臓、皮膚、肝臓、膵臓、副腎および神経組織、ならびに胃腸および泌尿管の組織が挙げられるが、それらに限定されない。
接種された骨格を様々な用途に使用できる。例えば、骨格を被検体に移植することができる。本発明によれば、移植体を使用して既存の組織を交換または補足することができ、例えば、自然の膵臓を交換または補足することにより膵臓疾患の被検体を治療することによってすることができる。膵臓疾患を改善するための移植の後で被検体をモニタリングすることができる。
いくつかの実施形態において、骨格はポリマー材料である。好適なポリマーとしては、アルギネート、ヒアルロネート、コラーゲン、ポリ(アルファエステル)[ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリオルソエステルおよびポリ無水物およびそれらのコポリマー等]、セルロースエーテル、セルロース、セルロースエステル、フッ化ポリエチレン、フェノール類、ポリ−4−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンゾキサゾール、ポリカーボネート、ポリシアノアリールエーテル、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロエチレン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、酸化ポリフェニレン、ポリフェニレン、スルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、フッ化ポリビニリデン、再生セルロース、尿素−ホルムアルデヒド、またはそれらのコポリマーもしくは物理的混合物が挙げられるが、それらに限定されない。
ポリグリコール酸の如きポリマーは、器官増強構造体を生成するための好適な生体適合構造体である。溶液流延、圧縮成型、フィラメント絞り成形(filament drawing)、網目形成(meshing)、浸出、製織(weaving)およびコーティングの如き方法を用いて生体適合ポリマーを成形することができる。
他の骨格材料としては、ポリグリコール酸ポリマー(PGA)、ポリ乳酸ポリマー(PLA)、ポリセバシン酸ポリマー(PSA)、ポリ(乳酸・グリコール酸)コポリマー(PLGA)、ポリ(乳酸・セバシン酸)コポリマー(PLSA)、ポリ(グリコール酸・セバシン酸)コポリマー(PGSA)およびポリヒドロキシアルカノエート(PHA)を含む生物分解性ポリマーが挙げられる。PHAおよびそれらの生成は、例えば、特許文献16、特許文献17および特許文献18に記載されている。生物分解性ポリマー、例えばPGAとPLGAの組合せを使用することもできる。
本発明に有用な他の生物分解性ポリマーとしては、カプロラクトン、カーボネート、アミド、アミノ酸、オルトエステル、アセタール、シアノアクリレートおよび分解性ウレタンのポリマーまたはコポリマーが挙げられ、これらと直鎖状または枝分れした、置換または無置換のアルカニル、ハロアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、アルケニル、または芳香族ヒドロキシもしくは芳香族ジカルボン酸とのコポリマーももちろん挙げられる。加えて、リシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、チロシンおよびシステイン、またはそれらの鏡像異性体の如き反応性側鎖基を有する生物学的に重要なアミノ酸を上記材料のいずれかとともにコポリマーに含めることができる。
本発明は、治療組織を調製するための細胞接種骨格を採用するため、骨格が生体適合性を有し、細胞結合および後の組織成長に貢献することが必要である。したがって、機械強度または熱特性の如き骨格の他の特性を変えることなく、目標とする用途に適合するように表面特性を改良することができる。有用な表面改良としては、例えば、化学基機能、表面帯電、疎水性、親水性および濡れ性の改変を挙げることが可能である。例えば、細胞結合を促進させる生物活性化合物またはペプチドを表面に結合または被覆することによって、細胞接着を容易にすることができる。コーティング剤または生物活性化合物を共有結合または非共有結合的に結合させることができる。当該技能は当該技術分野で知られている。
骨格に細胞を接種する前に滅菌を行う。熱処理はデバイスを変形させうるため、熱滅菌は非実用的であることが多く、特に材料が熱滅菌処理に必要な温度を下回る溶融温度を有する場合はそうである。したがって、いくつかの実施形態では低温のエチレンオキシドガスを滅菌剤として使用することができる。あるいは、ガンマ放射線または電子ビーム滅菌を用いることもできる。
培養における細胞のための好適な成長条件および培地は、当該技術分野でよく知られている。細胞培地は、典型的には、必須栄養分を含むが、場合によっては、特定の細胞型の成長および分化に合わせて個別調整できるさらなる要素(例えば成長因子、塩および鉱物)をも含む。
培地からの栄養分が堆積細胞集団に到達するが、培養細胞が孔を通じて移動することを防ぐことを可能にする調節孔構造を有するように、ポリマー基質を作製することができる。走査電子顕微鏡法、組織検査(histology)、および放射性同位元素による定量評価を用いて、体外(in vitro)細胞結合および細胞生存度を評価することができる。
ポリマー基質を任意の数の所望の形状に成形して、任意の数の全体系、幾何学構造または空間制限を満たすことができる。ポリマー基質を異なるサイズに成形して、異なるサイズの患者の器官に対応させることができる。
組織工学構造体は、平坦、管状、または複雑な形状でありうる。構造体の形状は、その目的とする用途によって決定されることになる。構造体を移植して、器官の疾患または損傷部を修復、補足または交換することができる。
一実施形態において、骨格材料は、典型的には水に不溶または難溶の架橋ポリマー網で構成されたヒドロゲルであるが、過剰の水の存在下で平衡サイズまで膨張することができる。例えば、細胞をヒドロゲルに仕込み、ヒドロゲルを器官内の所望の個所に注入することができる。一実施形態において、細胞をコラーゲンのみで注入することができる。他の実施形態において、細胞をコラーゲンおよび他のヒドロゲルで注入することができる。ヒドロゲル組成物としては、例えば、ポリ(エステル)、ポリ(ヒドロキシ酸)、ポリ(ラクトン)、ポリ(アミド)、ポリ(エステル−アミド)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(オルト−エステル)、ポリ(カーボネート)、ポリ(ホスファジン)、ポリ(チオエステル)、多糖類およびそれらの混合物を挙げることができるが、それらに限定されない。また、該組成物としては、例えば、ポリ(アルファ−ヒドロキシ)酸およびポリ(ベータヒドロキシ)酸を含むポリ(ヒドロキシ)酸を挙げることもできる。当該ポリ(ヒドロキシ)酸としては、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロン酸、ポリ酪酸、ポリ吉草酸、ならびにそれらのコポリマーおよび混合物が挙げられる。ヒドロゲルの独自の特性、ならびに薬物送達のような分野におけるそれらの潜在的な用途により、様々な種類のヒドロゲルが合成され、特徴付けられてきた。本発明の基質材料は、従来の泡およびスポンジ材料と、いわゆる「ヒドロゲルスポンジ」の双方を包括する。例えば特許文献19を参照されたい。
他の実施形態において、自然の脱細胞化器官の部分を使用して、骨格を形成する。器官から全細胞および組織内容物を除去することによって器官の部分を脱細胞化することができる。例えば、特許文献15を参照されたい。
本発明の増殖細胞を、それを必要とする患者における遺伝子治療に使用することができる。いくつかの実施形態において、より成熟した系統拘束細胞は、特に一時的な遺伝子発現が必要とされる場合、または細胞の成熟および分裂によって遺伝子形質導入が促進される場合に特に有用である。例えば、いくつかのレトロウィルスベクターは、細胞が、統合される遺伝子に対して循環することを必要とする。幹細胞及び前駆細胞を形質導入して、新たな治療遺伝子を送達する方法は、当該技術分野で知られている。例えば、非特許文献33を参照されたい。遺伝子治療によって治療できる先天性疾患としては、ベータ地中海貧血、鎌形細胞貧血、リコンビナーゼ不全およびアデノシンデアミナーゼ不全を治療するための遺伝子の如き新たな機能的遺伝子を導入することが挙げられるが、それに限定されない。感染病および癌において、本発明の増殖細胞に、病原または化学治療剤に対する特異的抵抗を与える遺伝子を形質導入することによって、生体内(in vivo)での形質導入細胞の長期間の生存を確保することができる。
他の実施形態において、培養におけるSPCから分化細胞を導くことができる。輸血医療では、感染病伝染のリスクはもちろんのこと、献血量が限られていることによる不足によって影響を受けているように、代替的な血液細胞源が必要とされている。本明細書に開示されている培地での並行分化による造血SPCの増殖を利用して、輸血用血液細胞を体外で(in vitro)成長させることができる。特に、G2培地を使用して、赤血球を成長させることができる。
以下に提示する実施例は、例示を目的とし、制限することを目的とするものではない。
実験
これらの実施例において、表1に記載した濃度で、上記した定義済みのサイトカイン培地G2、F2、D6、F2N、F4、およびG8中、非制限法にてサイトカイン類を用いた。
これらの実施例において、表1に記載した濃度で、上記した定義済みのサイトカイン培地G2、F2、D6、F2N、F4、およびG8中、非制限法にてサイトカイン類を用いた。
培地の同定
臍帯血由来のCD34+細胞の増殖を支持する培地組成を同定した。60の異なる組成で30因子を含む96ウェルプレートを用いて、スクリーニングプレートを調製した。1000の臍帯血由来のCD34+細胞を7日間それぞれのウェル中でインキュベートした。それぞれの実験を3回繰り返し、全体で3つの異なる臍帯血調製が試験されるようにそれぞれのスクリーニングをさらに2回繰り返した。7日間インキュベーションを行った後、4色フローサイトメトリー(FACS、BD Biosciences、ノースカロライナ州)により培養細胞を特性付けた。7AAD(死細胞を選択するため)、CD34(幹細胞及び前駆細胞を選択するため)、CD33(骨髄性細胞を選択するため)およびCD38(成熟造血細胞を選択するため)の組合せを用いて、増殖細胞を染色した。それぞれのスクリーニングからの繰り返しから得られた生細胞とCD34+細胞の平均数を基に、最適の培地組成を選択した。
臍帯血由来のCD34+細胞の増殖を支持する培地組成を同定した。60の異なる組成で30因子を含む96ウェルプレートを用いて、スクリーニングプレートを調製した。1000の臍帯血由来のCD34+細胞を7日間それぞれのウェル中でインキュベートした。それぞれの実験を3回繰り返し、全体で3つの異なる臍帯血調製が試験されるようにそれぞれのスクリーニングをさらに2回繰り返した。7日間インキュベーションを行った後、4色フローサイトメトリー(FACS、BD Biosciences、ノースカロライナ州)により培養細胞を特性付けた。7AAD(死細胞を選択するため)、CD34(幹細胞及び前駆細胞を選択するため)、CD33(骨髄性細胞を選択するため)およびCD38(成熟造血細胞を選択するため)の組合せを用いて、増殖細胞を染色した。それぞれのスクリーニングからの繰り返しから得られた生細胞とCD34+細胞の平均数を基に、最適の培地組成を選択した。
それぞれの因子に対して、文献値または報告されているED50値を基に、因子濃度を選択した。成長因子およびサイトカインを加える際に造血幹および前駆増殖を支持することが知られている、市販されている細胞培養用基本培地(Stemline、Sigma)を選択した。
サイトカインスクリーニングの最適なウェルに「適合(hits)」したのは、それぞれG2、F2、およびD6ウェルであった。
G2ウェルは、サイトカイン類であるフィブロネクチン、SDF−1アルファ、IL−6、SCF、IL−5、BDNF、PD−ECGF、IL−11、IL−3、EPO、Flt−3/Flk−2リガンド、BMP−4、トロンボスポンジン、IGF−1、およびbFGFを含んでいた。
F2ウェルは、サイトカイン類であるアンジオテンシン、IL−6、SCF、BDNF、IL−3、PDGF−AB、BMP−4、TGF−ベータ1、トロンボスポンジン、GM−CSF、VEGF、EGF、bFGF、M−CSF、およびMCP−1を含んでいた。
D6ウェルは、サイトカイン類であるPlGF、SDF−1アルファ、IL−6、SCF、IL−5、BDNF、IL−11、IL−3、EPO、PDGF−AB、Flt−3/Flk−2リガンド、アミノ酸配列VTCGを含む造血性接着ペプチド、TRANCE、GM−CSF、VEGF、およびG−CSFを含んでいた。
ウェルG2、F2、およびD6のサイトカイン組成物は、以後それぞれ「G2」、「F2」および「D6」と称する。増殖細胞の詳細な特徴付け、例えば表現型検査、遺伝子配列研究および生体内動物移植研究などを行った後、以下に記載する通りに、G2の組合せを使用して、致死量以下の照射を受けたNOD/SCIDマウスをうまく移植することができる機能性臍帯血細胞の増殖を支持した。
一例として、G2培地は、高度複合混合物を表現する15の因子を含んでいた。上記した通りにG2で得られた結果を基に、因子の他の組合せも増殖を支持するか否かを確認するために、2次スクリーニングを行った。
21の因子を有するPlackett−Burman計画を用いて2次スクリーニングを計画した結果、60の独特な複合組合せが96ウェルプレートの内部60ウェル中の細胞培養用基本培地(Stemline、Sigma)で作製された。
1000の臍帯血由来のCD34+細胞をそれぞれのウェルでインキュベートした。3回繰り返し、スクリーニングをさらに2回繰り返して、3つの異なる臍帯血調製をカバーした。1次スクリーニングからの最適ウェルに「適合」したG2をコントロールとして使用し、7日間インキュベートした後に生存細胞およびCD34+細胞が、G2と比較してより多くなる条件を「適合」として定義した。
7日間インキュベートした後に、4色フローサイトメトリー(FACS、BD Biosciences、ノースカロライナ州)により培養細胞を特性付けた。7AAD(死細胞を選択するため)、CD34(幹細胞及び前駆細胞を選択するため)、CD33(骨髄性細胞を選択するため)およびCD38(成熟造血細胞を選択するため)の組合せを用いて、増殖細胞を染色した。それぞれのスクリーニングからの繰り返しから得られた生存細胞とCD34+細胞の平均数を基に、最適の培地組成を選択した。
3つの臍帯血調製の間には応答に対してかなりの変動があるけれども、最適なウェルとして「適合」したのは一貫してF2N、F4、およびG8ウェルであった。
F2Nウェルは、サイトカイン類であるBDNF、bFGF、EPO、フィブロネクチン、Flt−3/Flk−2リガンド、IGF−1、IL−11、IL−3、IL−5、SCF、TGF−ベータ1、G−CSF、およびGM−CSFを含んでいた。
F4ウェルは、サイトカイン類であるbFGF、EPO、Flt−3/Flk−2リガンド、IL−11、IL−6、PD−ECGF、トロンボスポンジン、およびTpoを含んでいた。
G8ウェルは、サイトカイン類であるBDNF、bFGF、Flt−3/Flk−2リガンド、IL−3、IL−6、PD−ECGF、SCF、G−CSF、LIF、およびSCGF−アルファを含んでいた。
F4を除くこれらすべての適合したウェルは、1次スクリーニングからの前の「最適ウェル」培地G2よりも、7日間の増殖後に生存細胞がより多かった。驚くべきことに、ウェルF4における増殖は他の条件よりも極めて低かったけれども、ウェルF4における細胞組成物は、およそ50%のCD34br細胞を含んでいた(実施例2参照)。ウェルF2N、F4、およびG8のサイトカイン組成物は、以後それぞれ「F2N」、「F4」、および「G8」と称する。
この実施例は、治療上の価値を有する1次ホ乳類細胞の増殖に導くような、成長因子の複合混合物を同定できたことを説明している。必要とされる成長因子数は、細胞増殖を維持または促進さえしながら、減少することができる。上記因子の任意の3次スクリーニングを、必要とされる成長因子数をさらに減少させるために使用することができ、またはそれぞれの培地成分濃度を最適化するために使用することができる。加えて、以下に示すように、動物モデルにおけるこれらの移植能など、これらの細胞の機能的特徴を維持しながら増殖することが観察された。
臍帯血HSC類の生体外増殖
培地(G2、F2、およびD6)
細胞調製
6%ヘタスターチ(hetastarch)溶液を臍帯血に加え、45〜60分間インキュベートした。このインキュベート段階の間、ヘタスターチは優先的に赤血球に取り込まれる。結果として、赤血球はコニカルチューブの底に沈殿し、血液は、チューブ上部の軽い血漿/軟層画分とチューブ底部の赤血球を含む暗赤色画分とに分離する。白血球は、軟層中はもちろんのこと血漿中にも含まれる。5mlのピペットを、軟層上部の中間にある透明層にゆっくり浸けた。次いで透明層をゆっくり攪拌し、該透明層に含まれる軟層および任意の細胞を、赤血球層の外に、かつ血漿中に移動させた。次いで透明層(血漿および軟層混合物)を集め、5分間309gで遠心分離し、上澄み液を除去し、廃棄した。次いでACK溶解緩衝液を細胞ペレットに加え、室温で10分間インキュベートして、残っている赤血球を溶解した。10分間インキュベートした後、2%ウシ胎仔血清(FCS)を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)を細胞懸濁液に加え、懸濁液を再度5分間309gで遠心分離した。細胞ペレット上の上澄み液を除去し、廃棄した。
培地(G2、F2、およびD6)
細胞調製
6%ヘタスターチ(hetastarch)溶液を臍帯血に加え、45〜60分間インキュベートした。このインキュベート段階の間、ヘタスターチは優先的に赤血球に取り込まれる。結果として、赤血球はコニカルチューブの底に沈殿し、血液は、チューブ上部の軽い血漿/軟層画分とチューブ底部の赤血球を含む暗赤色画分とに分離する。白血球は、軟層中はもちろんのこと血漿中にも含まれる。5mlのピペットを、軟層上部の中間にある透明層にゆっくり浸けた。次いで透明層をゆっくり攪拌し、該透明層に含まれる軟層および任意の細胞を、赤血球層の外に、かつ血漿中に移動させた。次いで透明層(血漿および軟層混合物)を集め、5分間309gで遠心分離し、上澄み液を除去し、廃棄した。次いでACK溶解緩衝液を細胞ペレットに加え、室温で10分間インキュベートして、残っている赤血球を溶解した。10分間インキュベートした後、2%ウシ胎仔血清(FCS)を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)を細胞懸濁液に加え、懸濁液を再度5分間309gで遠心分離した。細胞ペレット上の上澄み液を除去し、廃棄した。
白血球ペレットに公知量の培地を加え、少量の得られた細胞懸濁液を除去し、この部分を公知の比にてトリパンブルー(trypan blue)で希釈し、血球計数器でこの懸濁液から細胞を計数する(本アッセイにて死細胞は青色になる)ことにより、生存する有核細胞の全数を得た。元の懸濁液に含まれる生存細胞数は、トリパンブルー含有試料を作製するために使用した希釈液を元に計数した。
CD34 + 細胞濃縮
磁気ビーズ技術[AutoMACS(商標)、Miltenyi Biotec、カリフォルニア州]を用いて、臍帯血の有核細胞画分からCD34+細胞を濃縮した。上記した手順に従って調製した有核細胞を、2%FCSおよび2mMのEDTAを含むPBSに再懸濁させた。直接法および間接法の2つの単離方法を、CD34+細胞を単離するために使用した。間接法において、Fc受容体遮断剤を加え、細胞懸濁液とよく混合した。CD34ハプテン−抗体(Miltenyi Biotec、カリフォルニア州)を加え、よく混合し、6〜12℃で15分間インキュベートした。次いで、2%FCS/2mMのEDTAを含むPBSで細胞を洗浄した。2%FCS/2mMのEDTAを含むPBSに細胞を再懸濁させ、抗−ハプテンマイクロビーズを加えた。細胞/マイクロビーズ懸濁液をよく混合し、6〜12℃で15分間インキュベートした。2%FCS/2mMのEDTAを含むPBSで細胞を洗浄し、70μMフィルターを通して濾過した。直接法において、FcR遮断剤およびCD34マイクロビーズを懸濁液に加え、よく混合し、6〜12℃で30分間インキュベートした。次いで2%FCS/2mMのEDTAを含むPBSで細胞を洗浄し、70μMフィルターを通して濾過した。間接法および直接法の両方において濾過した後、AutoMACS(商標)(Miltenyi Biotec、カリフォルニア州)で細胞懸濁液を分離し、得られたCD34+細胞画分の純度をフローサイトメトリーを用いて決定した。
磁気ビーズ技術[AutoMACS(商標)、Miltenyi Biotec、カリフォルニア州]を用いて、臍帯血の有核細胞画分からCD34+細胞を濃縮した。上記した手順に従って調製した有核細胞を、2%FCSおよび2mMのEDTAを含むPBSに再懸濁させた。直接法および間接法の2つの単離方法を、CD34+細胞を単離するために使用した。間接法において、Fc受容体遮断剤を加え、細胞懸濁液とよく混合した。CD34ハプテン−抗体(Miltenyi Biotec、カリフォルニア州)を加え、よく混合し、6〜12℃で15分間インキュベートした。次いで、2%FCS/2mMのEDTAを含むPBSで細胞を洗浄した。2%FCS/2mMのEDTAを含むPBSに細胞を再懸濁させ、抗−ハプテンマイクロビーズを加えた。細胞/マイクロビーズ懸濁液をよく混合し、6〜12℃で15分間インキュベートした。2%FCS/2mMのEDTAを含むPBSで細胞を洗浄し、70μMフィルターを通して濾過した。直接法において、FcR遮断剤およびCD34マイクロビーズを懸濁液に加え、よく混合し、6〜12℃で30分間インキュベートした。次いで2%FCS/2mMのEDTAを含むPBSで細胞を洗浄し、70μMフィルターを通して濾過した。間接法および直接法の両方において濾過した後、AutoMACS(商標)(Miltenyi Biotec、カリフォルニア州)で細胞懸濁液を分離し、得られたCD34+細胞画分の純度をフローサイトメトリーを用いて決定した。
培地調製
1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび4mMグルタミンで補充したStemline(商標)培地(Sigma、St Louis、ミズーリ州、S−0189)中に細胞を維持した。成長因子を解凍し、適切な濃度で培地中に直接加えた。培地および成分は研究するその日に調製した。
1%ペニシリン/ストレプトマイシンおよび4mMグルタミンで補充したStemline(商標)培地(Sigma、St Louis、ミズーリ州、S−0189)中に細胞を維持した。成長因子を解凍し、適切な濃度で培地中に直接加えた。培地および成分は研究するその日に調製した。
細胞培養
1)96ウェルプレート:1,000のCD34+濃縮細胞を、例えばG2、F2、またはD6培地などの培地100μlに加え、研究期間中、5%CO2中37℃でインキュベートした。
2)48ウェルプレート:2,500のCD34+濃縮細胞を、例えばG2、F2、またはD6培地などの培地1mlに加え、研究期間中、5%CO2中37℃でインキュベートした。
3)T−25フラスコ:500,000の細胞を、例えばG2、F2、またはD6培地などの培地10mlに加え、研究期間中、5%CO2中37℃でインキュベートした。
1)96ウェルプレート:1,000のCD34+濃縮細胞を、例えばG2、F2、またはD6培地などの培地100μlに加え、研究期間中、5%CO2中37℃でインキュベートした。
2)48ウェルプレート:2,500のCD34+濃縮細胞を、例えばG2、F2、またはD6培地などの培地1mlに加え、研究期間中、5%CO2中37℃でインキュベートした。
3)T−25フラスコ:500,000の細胞を、例えばG2、F2、またはD6培地などの培地10mlに加え、研究期間中、5%CO2中37℃でインキュベートした。
フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー研究のための細胞(新鮮濃縮CD34+細胞またはG2、F2、またはD6培地中で増殖した細胞)を、2%FCSを含むPBSに懸濁させた。マウスFcブロック(商標)を加え、4℃で5分間インキュベートした。1/10に希釈した蛍光標識抗体混合物を加え、細胞懸濁液とともに4℃で15分間インキュベートした。新鮮濃縮CD34+細胞の純度またはG2、F2、またはD6培地中で増殖した後の細胞免疫表現型を決定するために、CD34−PE、CD33−FITC、およびCD38−APC抗体の混合物を加えた(BD Pharmingen、カリフォルニア州)。増殖後完全に免疫表現型検査するために、単一の蛍光標識抗体を細胞懸濁液に加えた。
フローサイトメトリー研究のための細胞(新鮮濃縮CD34+細胞またはG2、F2、またはD6培地中で増殖した細胞)を、2%FCSを含むPBSに懸濁させた。マウスFcブロック(商標)を加え、4℃で5分間インキュベートした。1/10に希釈した蛍光標識抗体混合物を加え、細胞懸濁液とともに4℃で15分間インキュベートした。新鮮濃縮CD34+細胞の純度またはG2、F2、またはD6培地中で増殖した後の細胞免疫表現型を決定するために、CD34−PE、CD33−FITC、およびCD38−APC抗体の混合物を加えた(BD Pharmingen、カリフォルニア州)。増殖後完全に免疫表現型検査するために、単一の蛍光標識抗体を細胞懸濁液に加えた。
抗体でインキュベートした後、2%FCSを含むPBSで細胞を洗浄した。次いで2%FCSおよび7−アミノアクチノマイシンDを含むPBS中に細胞を再懸濁させ、死細胞を検出するために最終濃度を0.25μg/mlにした(7−AAD;ViaProbe;BD Biosciences、ノースカロライナ州)。細胞を分析するためにFACS(Biosciences、ノースカロライナ州)を使用した。細胞試料毎に少なくとも10,000の事象を採集した。CellQuestソフトを用いてフローサイトメトリーデータを解析した。
コロニー形成単位アッセイ
新鮮単離細胞および14日目までにG2、F2、またはD6培地中で増殖した細胞のクローン原性能を評価するために、成長因子含有半固形培地[MethCult GF H4434(商標)、StemCell Technologies、Vancouver、カリフォルニア州]中の培養液を使用した。この特殊な半固形培地は、SCF、IL−3、GM−CSF、およびEPOを含んでいた。Stemline(商標)培地(Sigma)に細胞を懸濁させ、次いでMethCult GF H4434(商標)に加えた。半固形培地中の細胞を35mm培養皿で培養し、半固体培養液からの蒸発を最小化するために、開放された滅菌水含有35mmペトリ皿を含む150mmペトリ皿にそれぞれを設置した。35mm皿を含む150mmペトリ皿を、5%CO2雰囲気下、少なくとも95%湿度で37℃のインキュベーター中に保持した。製造業者の推薦に従い、14〜16日インキュベートした後にコロニーを調べた。
新鮮単離細胞および14日目までにG2、F2、またはD6培地中で増殖した細胞のクローン原性能を評価するために、成長因子含有半固形培地[MethCult GF H4434(商標)、StemCell Technologies、Vancouver、カリフォルニア州]中の培養液を使用した。この特殊な半固形培地は、SCF、IL−3、GM−CSF、およびEPOを含んでいた。Stemline(商標)培地(Sigma)に細胞を懸濁させ、次いでMethCult GF H4434(商標)に加えた。半固形培地中の細胞を35mm培養皿で培養し、半固体培養液からの蒸発を最小化するために、開放された滅菌水含有35mmペトリ皿を含む150mmペトリ皿にそれぞれを設置した。35mm皿を含む150mmペトリ皿を、5%CO2雰囲気下、少なくとも95%湿度で37℃のインキュベーター中に保持した。製造業者の推薦に従い、14〜16日インキュベートした後にコロニーを調べた。
結果
増殖収量
G2、F2、およびD6培地中で培養する間、細胞数は時間の関数で増加した。例えば、48ウェルプレートで培養する際、培養19日後に、全生存細胞数が最も増加していたのは、D6培地にて408倍であり、2番目はG2培地にて208倍であり、続いてF2培地により188倍の増加であった。
増殖収量
G2、F2、およびD6培地中で培養する間、細胞数は時間の関数で増加した。例えば、48ウェルプレートで培養する際、培養19日後に、全生存細胞数が最も増加していたのは、D6培地にて408倍であり、2番目はG2培地にて208倍であり、続いてF2培地により188倍の増加であった。
細胞数の増加倍率は、培地中の細胞濃度に強く依存してことが見出された。培地1ml当たりの細胞数が少ないと、細胞数の増加倍率が高い結果になることが見出された。表面積の増加も増殖収量に明確に影響する。細胞成長に対するこれらの培養条件の効果を表2に示す。
増殖細胞の表現型
増殖臍帯血細胞集団に含まれる細胞表現型を特徴付けるために、フローサイトメーター(FACS;BD Biosciences、ノースカロライナ州)を使用した。これに関し、上記した通りにCD34+細胞を単離し、G2、F2、またはD6培地を用いて培養液に置き、上記した通りに7日間培養した。増殖細胞集団を、それぞれ異なる抗体を含む異なるチューブに分配し、上記の通りに当該抗体で標識した。本研究においてCD34+濃縮細胞の免疫表現型検査に使用した抗体を以下の表3に記載し、細胞を免疫表現型検査するためのフローサイトメトリー分析の結果を表4に記載する。
増殖臍帯血細胞集団に含まれる細胞表現型を特徴付けるために、フローサイトメーター(FACS;BD Biosciences、ノースカロライナ州)を使用した。これに関し、上記した通りにCD34+細胞を単離し、G2、F2、またはD6培地を用いて培養液に置き、上記した通りに7日間培養した。増殖細胞集団を、それぞれ異なる抗体を含む異なるチューブに分配し、上記の通りに当該抗体で標識した。本研究においてCD34+濃縮細胞の免疫表現型検査に使用した抗体を以下の表3に記載し、細胞を免疫表現型検査するためのフローサイトメトリー分析の結果を表4に記載する。
T細胞(CD3)、B細胞(CD19)もしくは好中球(mature glanulocytes)、NKリンパ球、またはマクロファージ(CD16)は、F2、G2、またはD6培地の何れにも増殖後にほとんど見られなかった。少数の単球(CD14)および血小板または巨核球(CD42a)が、増殖細胞集団に見られた。多数の細胞が、内皮細胞、血小板、白血球もしくはこれらの前駆体(CD31)の、骨髄性前駆細胞(CD33)の、造血幹細胞及び前駆細胞(CD34)の、増殖性細胞および赤血球前駆体(CD71)の、ならびに造血性およびCD34+幹と前駆細胞または神経幹細胞(CD133)の、表面マーカー特性を発現することが見出された。驚くべきことに、造血細胞を分化する際に通常発現されるマーカーであるCD38の発現が、すべての3つの培地中、7日間培養した後ほとんど消失した。
他の驚くべき発見は、G2、F2、およびD6培地中での増殖後の増殖CD34発現パターンであった。明瞭なCD34br集団が、G2培地で7日間増殖した後に存在し、投入CD34+細胞集団に比較してより高いレベルでCD34を発現する細胞を極めてより多く含んでいた。これはF2およびD6培地でも程度はこれより低いものの、観測された。
上記した通りに細胞培養およびフローサイトメトリー方法を用いて、G2培地中で細胞を増殖した後、さらなる免疫表現型検査研究を行った。7日間培養後の総有核細胞(TNC)に関する増殖倍率およびCD34発現結果を表5に要約する。CD34br細胞における多くの細胞受容体/マーカーを発現するこれらの増殖細胞の百分率を表6に示す(3つの実験を反復したものとして)。CD34dim細胞における多くの細胞受容体マーカーを発現するこれらの増殖細胞の百分率を表7に示す(3つの実験を反復したものとして)。
CD34 + およびCD34 br 細胞の増殖
G2、F2、およびD6培地中でのCD34+およびCD34br細胞の増殖を決定するために、成長曲線研究を行った。CD34+濃縮細胞を上記の通りに調製した。上記の通りに48ウェルプレート中、G2、F2、またはD6培地中で細胞を培養した。0、4、7、11、14、および19日目に上記の通りにフローサイトメトリーによりCD34発現を決定した。表8は、G2、F2、およびD6培地中でそれぞれCD34+およびCD34br細胞の増殖を示す。G2培地において、7日目でCD34+細胞が28倍まで増加し、14日目でCD34br細胞が269倍まで増加したことが認められた。
G2、F2、およびD6培地中でのCD34+およびCD34br細胞の増殖を決定するために、成長曲線研究を行った。CD34+濃縮細胞を上記の通りに調製した。上記の通りに48ウェルプレート中、G2、F2、またはD6培地中で細胞を培養した。0、4、7、11、14、および19日目に上記の通りにフローサイトメトリーによりCD34発現を決定した。表8は、G2、F2、およびD6培地中でそれぞれCD34+およびCD34br細胞の増殖を示す。G2培地において、7日目でCD34+細胞が28倍まで増加し、14日目でCD34br細胞が269倍まで増加したことが認められた。
D6培地において、大きな増殖が観察され、19日目までに培養液がピンク色に変色し始め、これはヘモグロビンの存在を示し、いくらかの細胞が赤血球に分化したことを示している。
増殖細胞の機能−生体外コロニー形成単位
コロニー形成アッセイにおけるコロニー形成能により、増殖細胞の機能を調査した。上記の通りにアッセイを行った。コロニー形成単位は36倍までに増加した(D6培地、11日目)。11日目までに培養したこれら3つのサイトカインカクテル培地に維持された細胞は、クローン原性の可能性を未だに有しており、未成熟な前駆細胞がこれらの培養液に維持されていることが示されている。
コロニー形成アッセイにおけるコロニー形成能により、増殖細胞の機能を調査した。上記の通りにアッセイを行った。コロニー形成単位は36倍までに増加した(D6培地、11日目)。11日目までに培養したこれら3つのサイトカインカクテル培地に維持された細胞は、クローン原性の可能性を未だに有しており、未成熟な前駆細胞がこれらの培養液に維持されていることが示されている。
増殖細胞集団中のコロニー形成細胞の表現型を決定するために、このアッセイにて形成されるコロニーの顕微鏡分析を行った。D6培地中で増殖された細胞は主にBFU−E/CFU−E[バースト形成単位−赤血球/コロニー形成単位赤血球(例えば赤血球前駆細胞に特徴のあるコロニーなど);データは示していない]を形成した。G2およびF2中で増殖された細胞は主にBFU−E/CFU−EとCFU−GM[コロニー形成単位−顆粒球/マクロファージ(例えば好中球/単球前駆体など)]との混合物を、およびいくらかのCFU−GEMM[コロニー形成単位−顆粒球、−赤血球、−マクロファージ、および−巨核球(例えばより未成熟な骨髄性幹細胞に特徴のあるなど)](データは示していない)を形成した。
G2、F2、およびD6培地中で増殖されたCD34+濃縮臍帯血細胞のためのコロニー形成単位アッセイからのデータを表9に示す。
G2培地中で7日間増殖後のCD34 + およびCD34 br 細胞の機能
7日間G2培地中で増殖された細胞についての新鮮単離・濃縮したCD34+細胞(82.4%純度)の、ならびに7日間G2培地中で増殖された細胞集団からフローサイトメトリーでの分別により単離したCD34br細胞のプレーティング効率を、上記したコロニー形成アッセイを用いて実験的に決定した。本実験におけるプレーティング効率は、下記表10に示すように、それぞれ16.5%、7%、および21.3%であった。
7日間G2培地中で増殖された細胞についての新鮮単離・濃縮したCD34+細胞(82.4%純度)の、ならびに7日間G2培地中で増殖された細胞集団からフローサイトメトリーでの分別により単離したCD34br細胞のプレーティング効率を、上記したコロニー形成アッセイを用いて実験的に決定した。本実験におけるプレーティング効率は、下記表10に示すように、それぞれ16.5%、7%、および21.3%であった。
増殖前後で100%純粋なCD34+細胞のプレーティング効率を決定しておらず、また新鮮単離された100%純粋なCD34br細胞のプレーティング効率を決定することは、これらの細胞は大変稀少で多量の臍帯血が必要なために実際的ではないけれども、これらの数の見積りを得ることはまだ可能である(表10参照)。これらの例において、投入CD34+細胞(80〜90%純度の投入CD34+)および7日目のTNC(30〜40%純度の投入CD34+)のCFUプレーティング効率は、試料UCB−29からであり、7日目のCD34br(およそ90%純度の投入CD34+)のCFUプレーティング効率は、試料UCB−31からである。新鮮単離・濃縮したCD34+細胞集団は82.4%純度であり、言い方を変えると、100の細胞のうちの82.4がCD34+であった。この集団のプレーティング効率は16.5%と決定され、それゆえ82.4%純度のCD34+集団からの100の細胞のうち、16.5の細胞がコロニーを形成する。100の細胞の82.4がCD34+であったので、この細胞集団からの約20のCD34+細胞がコロニーを形成し、例えば、増殖前の100%純粋なCD34+細胞のプレーティング効率はおよそ20%である。表11は、投入CD34+細胞および7日間G2培地中で培養された細胞におけるCFUプレーティング効率を示す。表中の範囲の記載は、およその値を示す。
CD34br細胞は、これらのCD34+細胞の小部分であり、それゆえ、これらの細胞のプレーティング効率が、増殖前の100%純粋なCD34+細胞のプレーティング効率に近いと仮定することは妥当である。しかしながら、CD34の高発現のため、極めて幹様の細胞がこの集団に含まれており、それゆえに、この集団は最も高いコロニー形成能を有していると仮定することも妥当である。それゆえ、増殖前の100%純粋なCD34br細胞のプレーティング効率の上限が仮定される。しかしながら、CD34の高発現のため、極めて幹様の細胞がこの集団に含まれており、それゆえに、この集団は最も高いコロニー形成能を有していると仮定することも妥当である。
増殖後、細胞集団を含む41.5%CD34+のプレーティング効率は6.7%と決定された。これは、増殖細胞集団から単離された100%純粋なCD34+細胞のプレーティング効率の下限とも見積もられる。増殖細胞集団から単離された100%純粋なCD34+細胞のプレーティング効率の上限として、投入細胞集団に関して、上記した計算と同様の計算を行った。増殖細胞集団からの100の細胞のうち、6.7細胞はコロニーを形成し、これら100の細胞の41.5はCD34+細胞である。観察されたすべてのコロニーがCD34+細胞のみが起源であると仮定すると、増殖細胞集団から単離された100%純粋なCD34+細胞のプレーティング効率は16.1%であると算出された。
下記表12に示した、これらCFUプレーティング効率の見積りおよび細胞数を元に、CFU数および7日間G2培地中で培養した後のCFUの増加倍率を算出した。表中の範囲の記載は、およその値を示す。表12は、投入CD34+細胞数、G2培地中で7日後のCD34+細胞数、および増加倍率を示す。表13は、同じカテゴリーでのCFU数を示す。
図1は、G2培地中で7日間、UCBからCD34+濃縮細胞を増殖した結果を要約する。この図は、全生存細胞数が57倍増加し、CD34+細胞は29倍増加していることおよびCD34br細胞は183倍増加していることを示しており、全CFUは23倍増加し、CFU起源のCD34+は10から23倍増加していること、およびCFUは39から197倍増加していることを示している。
培地(F2N、G8、およびF4)
培地製剤F2N、G8、およびF4でも、上記のように、細胞調製、細胞濃縮、培地調製、細胞培養、およびフローサイトメーター分析を用いて、CD34細胞の生体外増殖を支持する能力を試験した。
培地製剤F2N、G8、およびF4でも、上記のように、細胞調製、細胞濃縮、培地調製、細胞培養、およびフローサイトメーター分析を用いて、CD34細胞の生体外増殖を支持する能力を試験した。
細胞数は、およそ3週間(22日)かけたG2、G8、F2N、およびF4培地中での培養の間、時間の関数として増加した。例えば、培養22日後、F2培地に関して45.70倍の増加が見られ、G2培地では37.77倍の増加、G8培地では24.86倍の増加、およびF4培地では2.21倍の増加が見られた。F4培地の結果は、他の培地よりも極めて低い増殖となったけれども、本明細書の他の箇所に記載したように、好ましい幹細胞または前駆細胞表現型を実際に維持していた。
CD34+濃縮細胞を7日間G2、F2N、G8、およびF4培地中で培養し、その後、上記の通りにCFUアッセイを行った。表14に示すように、F2NおよびF4培地中で増殖されたCD34br細胞は、投入細胞と比較して同様のプレーティング効率を有している。加えて、F2N培地中で増殖されたCD34br細胞は、F4培地中で増殖されたCD34br細胞と比較して、より高いBFU−E百分率およびより低いCFU−GM百分率を有していた。F4培地中の増殖TNCは、他の3つの培地と比較して最も高いプレーティング効率を与えることを、表15は示している。
異なる酸素分圧条件下での増殖収量
G2培地を用いて実施例2に記載した通りに、CD34+濃縮細胞を調製し、培養した。T−25フラスコ(横倒しかまたは逆さまのいずれか)または48ウェルプレート中で、細胞培養を行った。フローサイトメトリー分析およびコロニー形成単位アッセイを、実施例2に記載した通りに行った。
G2培地を用いて実施例2に記載した通りに、CD34+濃縮細胞を調製し、培養した。T−25フラスコ(横倒しかまたは逆さまのいずれか)または48ウェルプレート中で、細胞培養を行った。フローサイトメトリー分析およびコロニー形成単位アッセイを、実施例2に記載した通りに行った。
細胞培養液
1)T−25フラスコ(横倒し)
a)G2培地10mlに2,500の細胞を加え、研究期間中、5%または20%のO2中37℃でインキュベートした。
1)T−25フラスコ(横倒し)
a)G2培地10mlに2,500の細胞を加え、研究期間中、5%または20%のO2中37℃でインキュベートした。
b)G2培地10mlに8,300の細胞を加え、研究期間中、5%のO2中37℃でインキュベートした。
2)T−25フラスコ(逆さま)
a)G2培地50mlに2,500の細胞を加え、研究期間中、5%または20%のO2中37℃でインキュベートした。
a)G2培地50mlに2,500の細胞を加え、研究期間中、5%または20%のO2中37℃でインキュベートした。
b)G2培地10mlに2,700の細胞を加え、研究期間中、5%または20%のO2中37℃でインキュベートした。
3)48ウェルプレート
a)G2培地1mlに2,500の細胞を加え、研究期間中、5%または20%のO2中37℃でインキュベートした。
a)G2培地1mlに2,500の細胞を加え、研究期間中、5%または20%のO2中37℃でインキュベートした。
b)G2培地1mlに5,000の細胞を加え、研究期間中、5%または20%のO2中37℃でインキュベートした。
結果
増加倍率は、培養条件の酸素分圧に強く依存することが見られた。それぞれの場合、5%のO2条件では、20%のO2条件と比較してより大きな増加倍率が得られた。表16は、細胞成長に対するこれらの培養条件の効果を示す。
増加倍率は、培養条件の酸素分圧に強く依存することが見られた。それぞれの場合、5%のO2条件では、20%のO2条件と比較してより大きな増加倍率が得られた。表16は、細胞成長に対するこれらの培養条件の効果を示す。
Lin−およびCD133+細胞出発集団を用いる増殖収量
Lin − 細胞濃縮
G2およびD6培地を用いてLin−細胞濃縮を行った。実施例2に記載した通りに臍帯血から細胞を単離し、2%FCSを含むPBS中、2×107細胞/mlと8×107細胞/mlとの間の密度(好ましくは、5×107細胞/ml)で再懸濁させた。StemStep Primitive Progenitor Enrichment Cocktail(StemCell Technologies、バンクーバー、カナダ)を、100μ/ml濃度の細胞溶液に加え、よく混合した。細胞を、氷上で30分間または室温で15分間インキュベートした。
Lin − 細胞濃縮
G2およびD6培地を用いてLin−細胞濃縮を行った。実施例2に記載した通りに臍帯血から細胞を単離し、2%FCSを含むPBS中、2×107細胞/mlと8×107細胞/mlとの間の密度(好ましくは、5×107細胞/ml)で再懸濁させた。StemStep Primitive Progenitor Enrichment Cocktail(StemCell Technologies、バンクーバー、カナダ)を、100μ/ml濃度の細胞溶液に加え、よく混合した。細胞を、氷上で30分間または室温で15分間インキュベートした。
製造業者(StemCell Technologies、Vancouver、カリフォルニア州)により記載されている通りに磁気ビーズ技術を用いて、Lin−細胞を濃縮した。磁石中にカラムを設置し、組み立て、製造業者の使用説明書に従い、PBSで抗原刺激(primed)した。2%FCSを含むPBS(25ml)でカラムを洗浄した。60μl/mlの濃度の細胞溶液に磁気コロイドを加え、よく混合し、氷上で30分間または室温で15分間インキュベートした。試料を充填し、続いて2%FCSを含むPBS(25ml)で洗浄した。試料を採集し、FACS分析により純度を調べた。トリパンブルー色素排除法により細胞生存度を調べた。
実施例2記載した通りに、G2およびD6培地中で細胞を維持した。実施例2記載した通りに、細胞培養法、フローサイトメーター分析、およびコロニー形成単位アッセイを行った。
結果
G2およびD6培地の両方がLin−細胞の増殖を支持し、得られた細胞集団はCD34+幹細胞及び前駆細胞を含んでいた。表17は、G2培地中でLin−細胞を増殖すると、これらのCD34+細胞を9.5%有して細胞が平均45.7倍増加する結果となり、D6培地中で増殖すると、これらのCD34+細胞を7.3%有して細胞が平均73.6倍増加する結果となったことを示している。
G2およびD6培地の両方がLin−細胞の増殖を支持し、得られた細胞集団はCD34+幹細胞及び前駆細胞を含んでいた。表17は、G2培地中でLin−細胞を増殖すると、これらのCD34+細胞を9.5%有して細胞が平均45.7倍増加する結果となり、D6培地中で増殖すると、これらのCD34+細胞を7.3%有して細胞が平均73.6倍増加する結果となったことを示している。
CD133 + 細胞濃縮
磁気ビーズ技術[AutoMACS(商標)、Miltenyi Biotec、カリフォルニア州]を用いて、臍帯血の有核細胞画分からCD133+細胞を濃縮した。実施例2に上記した手順に従って調製した有核細胞を、2%FCSおよび2mMのEDTAを含むPBSに再懸濁させた。FcR遮断剤およびCD133マイクロビーズを懸濁液に加え、よく混合し、6〜12℃で30分間インキュベートした。次いで2%FCS/2mMEDTAを含むPBSで細胞を洗浄し、70μMフィルターを通して濾過した。間接法および直接法の両方において濾過した後、AutoMACS(商標)(Miltenyi Biotec、カリフォルニア州)で細胞懸濁液を分離し、得られたCD133+細胞画分の純度をフローサイトメトリーを用いて決定した。濃縮したCD133+の純度は84%であり、CD133+細胞の約94%がCD34抗原を発現した。
磁気ビーズ技術[AutoMACS(商標)、Miltenyi Biotec、カリフォルニア州]を用いて、臍帯血の有核細胞画分からCD133+細胞を濃縮した。実施例2に上記した手順に従って調製した有核細胞を、2%FCSおよび2mMのEDTAを含むPBSに再懸濁させた。FcR遮断剤およびCD133マイクロビーズを懸濁液に加え、よく混合し、6〜12℃で30分間インキュベートした。次いで2%FCS/2mMEDTAを含むPBSで細胞を洗浄し、70μMフィルターを通して濾過した。間接法および直接法の両方において濾過した後、AutoMACS(商標)(Miltenyi Biotec、カリフォルニア州)で細胞懸濁液を分離し、得られたCD133+細胞画分の純度をフローサイトメトリーを用いて決定した。濃縮したCD133+の純度は84%であり、CD133+細胞の約94%がCD34抗原を発現した。
細胞培養
48ウェルプレート:2,500のCD34+濃縮細胞を、例えばG2、F2、またはD6培地などの培地1mlに加え、研究期間中、5%CO2中37℃でインキュベートした。
48ウェルプレート:2,500のCD34+濃縮細胞を、例えばG2、F2、またはD6培地などの培地1mlに加え、研究期間中、5%CO2中37℃でインキュベートした。
フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリー研究のための細胞(新鮮濃縮CD34+細胞またはG2、F2、またはD6培地中で増殖した細胞)を、2%FCSを含むPBSに懸濁させた。マウスFcブロック(商標)を加え、4℃で5分間インキュベートした。1:10に希釈した蛍光標識抗体混合物を加え、細胞懸濁液とともに4℃で15分間インキュベートした。新鮮濃縮CD34+細胞の純度またはG2、F2、またはD6培地中で増殖した後の細胞免疫表現型検査を決定するために、CD34−PE、CD33−FITC、およびCD38−APC抗体の混合物を加えた(BD Pharmingen、カリフォルニア州)。以下の組合せも本研究に使用した:CD34FITC/CD133PE、CD34FITC/CD90PE/CD117APC(BD Pharmingen、カリフォルニア州)。
フローサイトメトリー研究のための細胞(新鮮濃縮CD34+細胞またはG2、F2、またはD6培地中で増殖した細胞)を、2%FCSを含むPBSに懸濁させた。マウスFcブロック(商標)を加え、4℃で5分間インキュベートした。1:10に希釈した蛍光標識抗体混合物を加え、細胞懸濁液とともに4℃で15分間インキュベートした。新鮮濃縮CD34+細胞の純度またはG2、F2、またはD6培地中で増殖した後の細胞免疫表現型検査を決定するために、CD34−PE、CD33−FITC、およびCD38−APC抗体の混合物を加えた(BD Pharmingen、カリフォルニア州)。以下の組合せも本研究に使用した:CD34FITC/CD133PE、CD34FITC/CD90PE/CD117APC(BD Pharmingen、カリフォルニア州)。
抗体でインキュベートした後、2%FCSを含むPBSで細胞を洗浄した。次いで2%FCSおよび7−アミノアクチノマイシンDを含むPBSに細胞を再懸濁させ、死細胞を検出するために最終濃度を0.25μg/mlにした(7−AAD;ViaProbe;BD Bioscience、ノースカロライナ州)。細胞を分析するためにFACS(Bioscience、ノースカロライナ州)を使用した。細胞試料毎に少なくとも10,000の事象を採集した。CellQuestソフトを用いてフローサイトメトリーデータを解析した。
結果
表18に示すように、CD133+細胞は、出発集団としてのCD34+細胞と比較して、G2、F2、およびD6培地中で7日間増殖した後の総有核細胞がより多くなっている(表18参照)。
表18に示すように、CD133+細胞は、出発集団としてのCD34+細胞と比較して、G2、F2、およびD6培地中で7日間増殖した後の総有核細胞がより多くなっている(表18参照)。
連続的増殖方法を用いる増殖収量
CD34+細胞を単離し、G2培地を用いて実施例2に記載した通りに7日間培養した。増殖細胞をCD34−PEで染色し、実施例2に記載した通りにCD34brおよびCD34dim細胞にFACS(BD Biosciences、ノースカロライナ州)により分別した。次いで分別したCD34brおよびCD34dim細胞を、さらに7日間48ウェルプレート中、G2培地中2500細胞/mlの密度で再度培養した。実施例2に記載した通りに、細胞培養方法、ならびにフローサイトメトリー分析およびコロニー形成単位アッセイを含む細胞分析を行った。
CD34+細胞を単離し、G2培地を用いて実施例2に記載した通りに7日間培養した。増殖細胞をCD34−PEで染色し、実施例2に記載した通りにCD34brおよびCD34dim細胞にFACS(BD Biosciences、ノースカロライナ州)により分別した。次いで分別したCD34brおよびCD34dim細胞を、さらに7日間48ウェルプレート中、G2培地中2500細胞/mlの密度で再度培養した。実施例2に記載した通りに、細胞培養方法、ならびにフローサイトメトリー分析およびコロニー形成単位アッセイを含む細胞分析を行った。
結果
G2培地中の増殖の連続的ステージは、増殖の単一ステージと比較して、CD34br、CD34dim、およびCD34−細胞のさらなる増殖を支持した。表19に示すように、CD34br細胞は、CD34dim細胞(平均27.7倍の増加)およびCD34−細胞(平均8.2倍の増加)と比較して、より大きな増殖能(平均53.6倍の増加)を示した。
G2培地中の増殖の連続的ステージは、増殖の単一ステージと比較して、CD34br、CD34dim、およびCD34−細胞のさらなる増殖を支持した。表19に示すように、CD34br細胞は、CD34dim細胞(平均27.7倍の増加)およびCD34−細胞(平均8.2倍の増加)と比較して、より大きな増殖能(平均53.6倍の増加)を示した。
SCID/NODマウスモデルにおけるCD34br細胞の生体内機能
ヒト臍帯血CD34 + 細胞の精製
非特許文献34に刊行されている手順に従い、3つの臍帯血(UCB)単位を処理した。簡潔には、6(重量/容量)%のヒドロキシエチルデンプン(Sigma)を加えることによりUCBから赤血球を除去して最終濃度を1.2%とし、続いて室温で1時間インキュベートして、白血球−濃縮血漿画分を得た。血漿画分を1200rpmで5分間遠心分離し、血漿上澄み液を除去し、細胞ペレットを塩化アンモニウム溶解緩衝液20mlを用いて室温で8分間処理した。2%FCSを含むPBSで細胞を洗浄し、計数した。この特殊のケースでは、1×109の総有核細胞が得られた。この白血球集団は、1.45%のCD34+および0.55%のThy−1+細胞を含んでいた(フローサイトメトリーにより決定、FACS;BD Biosciences、ノースカロライナ州)。次いで白血球−濃縮ペレットを、製造業者の使用説明書に従い、磁気的活性化細胞分離装置(AutoMACS(商標)、Miltenyi Biotec、カリフォルニア州)を用いてCD34+細胞濃縮のために使用した。濃縮後の総有核細胞数は2.44×106細胞であり、細胞集団は91.13%のCD34+細胞から構成されていた(フローサイトメトリーにより決定、FACS;BD Biosciences、ノースカロライナ州)。
ヒト臍帯血CD34 + 細胞の精製
非特許文献34に刊行されている手順に従い、3つの臍帯血(UCB)単位を処理した。簡潔には、6(重量/容量)%のヒドロキシエチルデンプン(Sigma)を加えることによりUCBから赤血球を除去して最終濃度を1.2%とし、続いて室温で1時間インキュベートして、白血球−濃縮血漿画分を得た。血漿画分を1200rpmで5分間遠心分離し、血漿上澄み液を除去し、細胞ペレットを塩化アンモニウム溶解緩衝液20mlを用いて室温で8分間処理した。2%FCSを含むPBSで細胞を洗浄し、計数した。この特殊のケースでは、1×109の総有核細胞が得られた。この白血球集団は、1.45%のCD34+および0.55%のThy−1+細胞を含んでいた(フローサイトメトリーにより決定、FACS;BD Biosciences、ノースカロライナ州)。次いで白血球−濃縮ペレットを、製造業者の使用説明書に従い、磁気的活性化細胞分離装置(AutoMACS(商標)、Miltenyi Biotec、カリフォルニア州)を用いてCD34+細胞濃縮のために使用した。濃縮後の総有核細胞数は2.44×106細胞であり、細胞集団は91.13%のCD34+細胞から構成されていた(フローサイトメトリーにより決定、FACS;BD Biosciences、ノースカロライナ州)。
ヒト臍帯血CD34 + 細胞の増殖
濃縮CD34+UCB細胞をG2サイトカイン混合物とともにStemline(商標)培地(Sigma)中に懸濁させ、6ウェルプレートに30,000細胞/ウェル(6ml/ウェル)で蒔いた。5%CO2、99%湿度で7日間何ら中間体を加えることなく、細胞を培養した。トリパンブルー色素排除法によって、培養後の細胞生存度を決定し、95%より大きいことを確認した。培養後、抗−ヒト−CD34PE(BD Technologies)で細胞を染色し、FACS(BD Biosciences、ノースカロライナ州)を用いてCD34brおよびCD34dim集団に分別した[これら2つの細胞集団間を区別するために使用したゲーティング戦略(gating starategy)に関して図2を参照のこと]。両方の細胞集団の見積り純度は、フローサイトメーター分別後に約95%であった。
濃縮CD34+UCB細胞をG2サイトカイン混合物とともにStemline(商標)培地(Sigma)中に懸濁させ、6ウェルプレートに30,000細胞/ウェル(6ml/ウェル)で蒔いた。5%CO2、99%湿度で7日間何ら中間体を加えることなく、細胞を培養した。トリパンブルー色素排除法によって、培養後の細胞生存度を決定し、95%より大きいことを確認した。培養後、抗−ヒト−CD34PE(BD Technologies)で細胞を染色し、FACS(BD Biosciences、ノースカロライナ州)を用いてCD34brおよびCD34dim集団に分別した[これら2つの細胞集団間を区別するために使用したゲーティング戦略(gating starategy)に関して図2を参照のこと]。両方の細胞集団の見積り純度は、フローサイトメーター分別後に約95%であった。
増殖ヒト臍帯血CD34 + 細胞のコロニー形成アッセイ
FACS(BD Biosciences、ノースカロライナ州)によって分別した後、増殖CD34br集団からの約600の細胞および増殖CD34dim集団からの約2500の細胞を、SCF、IL−3、EPO、およびGM−CSFを含むメチルセルロース培地に蒔いた。コントロールとして、培養前の新鮮単離・濃縮したCD34+細胞集団からの約600の細胞を、同じ条件に置いた。
FACS(BD Biosciences、ノースカロライナ州)によって分別した後、増殖CD34br集団からの約600の細胞および増殖CD34dim集団からの約2500の細胞を、SCF、IL−3、EPO、およびGM−CSFを含むメチルセルロース培地に蒔いた。コントロールとして、培養前の新鮮単離・濃縮したCD34+細胞集団からの約600の細胞を、同じ条件に置いた。
プレーティング効率は、
・ 新鮮単離CD34+細胞(91.1%純度)で17.9%(16.45%〜31.5%)
・ CD34br(約95%純度)で9.1%(9.1%〜21.3%)
・ CD34dim(約95%純度)で6.1%
であることが見出された。
・ 新鮮単離CD34+細胞(91.1%純度)で17.9%(16.45%〜31.5%)
・ CD34br(約95%純度)で9.1%(9.1%〜21.3%)
・ CD34dim(約95%純度)で6.1%
であることが見出された。
NOD/SCIDマウス移植
7週齢の雄のNOD/CB17−Prkdc−SCID/Jマウスを得(Jackson Laboratories、メイン州)、マイクロ分離ケージラックに収容し、高圧滅菌した詞料および水を与えた。Becton−Dickinson Technologies(BDT)およびDuke University Medical Centerの動物管理使用委員会がすべての実験を承認した。
7週齢の雄のNOD/CB17−Prkdc−SCID/Jマウスを得(Jackson Laboratories、メイン州)、マイクロ分離ケージラックに収容し、高圧滅菌した詞料および水を与えた。Becton−Dickinson Technologies(BDT)およびDuke University Medical Centerの動物管理使用委員会がすべての実験を承認した。
NOD/SCIDマウス(6〜8週齢)は、セシウムCs137源から300cGyの全照射量を受けた。照射後24時間内で、7日間事前に増殖させたヒトUCB CD34brおよびCD34dim細胞を、マウスの骨髄内(iBM)に移植した。非特許文献35によりすでに記載されている通りに、これをわずかに修正して、iBM移植を行った。簡潔には、29−ゲージ針を麻酔下にあるマウスの右大腿部の関接表面に挿入した。40μlのPBSに懸濁させた増殖UCB CD34+細胞を、BM腔に移植した。送達された細胞投与量を表20に概略する。
移植結果分析
マウスBM、脾臓、および末梢血(PB)を移植後7週で収集した。文献に記載されている方法を用いて、ヒト用再形成(human reconstitution)のための分析を行った。簡潔には、BM、脾臓、およびPBからの細胞を、2色フローサイトメトリー分析により分析した。末梢血(PB)からの赤血球(RBC)(または必要であれば脾臓およびBM)を、3〜4mlのACK溶解緩衝液を用いて溶解した(室温で10分間インキュベート)。細胞を洗浄し、2%FCSを含むPBSに再懸濁させて、最終容量を50μl/チューブにした。全部で10のチューブをBM分析のためにマウス毎に使用し、それぞれさらに2つのチューブを脾臓およびPB試料分析のために使用した。RBC溶解後の細胞を、4℃で5分間、FcgII/IIIR−媒介非特異的結合をブロックするために、8μlのマウスFcブロックでインキュベートし、引き続き適切なモノクローナル抗体でインキュベートし(それぞれ約5μlを用いて4℃で30分間インキュベート)、洗浄し、PBS中1%パラホルムアルデヒドに再懸濁させ、FACS(BD Biosciences、ノースカロライナ州)フローサイトメーターで分析した。アイソタイプ・コントロール(IgG1FITC/IgG1PE)に加えて、非移植マウスからの細胞を、同じ抗体の組合せで染色した。非交差反応性PE−抗−ヒトCD45とFITC−抗−マウスCD45との組合せを使用して、マウス白血球に対するヒト白血球の比を決定した。ヒト部分母集団のさらなる明確化のために、多くの二重抗体パネルを使用した。すなわち、リンパ様細胞系統検出のためのCD45FITC/CD3PEおよびCD45FITC/CD19PE;骨髄性細胞系統検出のためのCD45FITC/CD14PEおよびCD45FITC/CD33PE;NK細胞検出のためのCD45FITC/CD16PE;前駆細胞検出のためのCD45FITC/CD34PE;巨核球(MK)細胞系統検出のためのCD45FITC/CD42aPE;および赤血球細胞系統検出のためのCD45FITC/グリコホリンAPEである。最小でもBM、脾臓からの100,000の細胞、およびPBからの100,000の細胞を、それぞれのマウスについてFACS(BD Biosciences、ノースカロライナ州)を用いて分析した。少なくとも0.1%のヒト用再形成(マウスCD45発現に対するヒトCD45発現)(最小でも100,000BM細胞当たりそれぞれ10の陽性事象)を示した場合、SCID再構築細胞(SRC)再形成により定義されるヒトの細胞移植(骨髄およびリンパ球移植を含む)について陽性としてマウスを分類した。CellQuest(商標)ソフトを用いて、FACS分析を行った。
マウスBM、脾臓、および末梢血(PB)を移植後7週で収集した。文献に記載されている方法を用いて、ヒト用再形成(human reconstitution)のための分析を行った。簡潔には、BM、脾臓、およびPBからの細胞を、2色フローサイトメトリー分析により分析した。末梢血(PB)からの赤血球(RBC)(または必要であれば脾臓およびBM)を、3〜4mlのACK溶解緩衝液を用いて溶解した(室温で10分間インキュベート)。細胞を洗浄し、2%FCSを含むPBSに再懸濁させて、最終容量を50μl/チューブにした。全部で10のチューブをBM分析のためにマウス毎に使用し、それぞれさらに2つのチューブを脾臓およびPB試料分析のために使用した。RBC溶解後の細胞を、4℃で5分間、FcgII/IIIR−媒介非特異的結合をブロックするために、8μlのマウスFcブロックでインキュベートし、引き続き適切なモノクローナル抗体でインキュベートし(それぞれ約5μlを用いて4℃で30分間インキュベート)、洗浄し、PBS中1%パラホルムアルデヒドに再懸濁させ、FACS(BD Biosciences、ノースカロライナ州)フローサイトメーターで分析した。アイソタイプ・コントロール(IgG1FITC/IgG1PE)に加えて、非移植マウスからの細胞を、同じ抗体の組合せで染色した。非交差反応性PE−抗−ヒトCD45とFITC−抗−マウスCD45との組合せを使用して、マウス白血球に対するヒト白血球の比を決定した。ヒト部分母集団のさらなる明確化のために、多くの二重抗体パネルを使用した。すなわち、リンパ様細胞系統検出のためのCD45FITC/CD3PEおよびCD45FITC/CD19PE;骨髄性細胞系統検出のためのCD45FITC/CD14PEおよびCD45FITC/CD33PE;NK細胞検出のためのCD45FITC/CD16PE;前駆細胞検出のためのCD45FITC/CD34PE;巨核球(MK)細胞系統検出のためのCD45FITC/CD42aPE;および赤血球細胞系統検出のためのCD45FITC/グリコホリンAPEである。最小でもBM、脾臓からの100,000の細胞、およびPBからの100,000の細胞を、それぞれのマウスについてFACS(BD Biosciences、ノースカロライナ州)を用いて分析した。少なくとも0.1%のヒト用再形成(マウスCD45発現に対するヒトCD45発現)(最小でも100,000BM細胞当たりそれぞれ10の陽性事象)を示した場合、SCID再構築細胞(SRC)再形成により定義されるヒトの細胞移植(骨髄およびリンパ球移植を含む)について陽性としてマウスを分類した。CellQuest(商標)ソフトを用いて、FACS分析を行った。
結果
G2培地中で増殖された臍帯血細胞を、照射を受けたNOD/SCIDマウスの骨髄、脾臓、およびPBに移植した。図3に示すように、骨髄への確実な移植を成し遂げるために、細胞投与量は100,000のCD34br細胞で十分であった。骨髄、脾臓、およびPBに500,000のCD34br細胞を用いると20%を超える移植が観測され、対照的に、このモデルへの移植を成し遂げるために、1,000,000のCD34dim細胞は十分でなかった。増殖CD34br細胞は、B細胞(CD19)、骨髄性前駆細胞(CD33)、造血幹細胞及び前駆細胞(CD34)を、極小範囲のNK細胞(CD16)、単球(CD14)、および血小板前駆体(CD42a)(データは示していない)に再形成できた。
G2培地中で増殖された臍帯血細胞を、照射を受けたNOD/SCIDマウスの骨髄、脾臓、およびPBに移植した。図3に示すように、骨髄への確実な移植を成し遂げるために、細胞投与量は100,000のCD34br細胞で十分であった。骨髄、脾臓、およびPBに500,000のCD34br細胞を用いると20%を超える移植が観測され、対照的に、このモデルへの移植を成し遂げるために、1,000,000のCD34dim細胞は十分でなかった。増殖CD34br細胞は、B細胞(CD19)、骨髄性前駆細胞(CD33)、造血幹細胞及び前駆細胞(CD34)を、極小範囲のNK細胞(CD16)、単球(CD14)、および血小板前駆体(CD42a)(データは示していない)に再形成できた。
増殖細胞集団の直接骨髄移植によるNOD/SCIDマウスへの巨核球増殖
G2培地中で増殖したUCB細胞をマウスの骨髄に移植し、照射を受けたNOD/SCIDマウスの骨髄に直接移植した場合にかなりの巨核球増殖に導くことを、本実施例は例示している。
G2培地中で増殖したUCB細胞をマウスの骨髄に移植し、照射を受けたNOD/SCIDマウスの骨髄に直接移植した場合にかなりの巨核球増殖に導くことを、本実施例は例示している。
全臍帯血をNDRIから受け、実施例6に記載した通りに処理した。CD34+細胞をG2培地中で7日間培養し、次いでCD34dimおよびCD34br細胞に分別し、次いで実施例6に記載した通りに、亜致死量(sub−lethally)で照射を受けたマウスへ骨髄に直接注入することにより移植した。新鮮単離CD34+細胞をコントロールとして使用した。使用した細胞投与量、移植動物の数、移植マウスの数および移植のレベルを、移植後7週でマウスの骨髄に見られるヒトCD45+細胞の百分率として定義される通りに、表21に示す。
表21におけるデータに従い、100,000のCD34+、500,000のCD34br、または1,900,000のCD34dim細胞を投与すると、マウス骨髄中におよそ15%のヒトCD45+細胞というほぼ同じ移植レベルになる。
驚くべきことに、CD34br細胞集団を投与すると、ヒトCD42a+細胞によって定義されるように、マウス骨髄に含まれるヒト巨核球が最も多数になった(表22参照)。
新鮮単離CD34+細胞、G2培地中で増殖したCD34br細胞、またはG2培地中で増殖したCD34dim細胞を骨髄内に注入した後の、マウスBM、脾臓、およびPB中に存在するヒトCD45+細胞の百分率を、それぞれ表23、24、および25に示す。
尾静脈注入によるNOD/SCIDマウスへの増殖細胞集団の移植後の帰巣および巨核球移植
本発明の種々の培地中で増殖されたUCB細胞を、照射を受けたNOD/SCIDマウスの末梢血循環に尾静脈を通して注入して、マウス骨髄に帰巣及び移植して(home and engraft)、優先的に巨核球移植に導くことを、本実施例は例証している。
本発明の種々の培地中で増殖されたUCB細胞を、照射を受けたNOD/SCIDマウスの末梢血循環に尾静脈を通して注入して、マウス骨髄に帰巣及び移植して(home and engraft)、優先的に巨核球移植に導くことを、本実施例は例証している。
G2培地
全臍帯血をNDRIから受け取り、実施例6に記載した通りに処理した。CD34+細胞をG2培地中で7日間培養し、次いでCD34dimおよびCD34br細胞に分別し、次いで実施例6に記載した通りに、亜致死量で照射を受けたマウスに尾静脈注入することにより移植した。新鮮単離CD34+細胞をコントロールとして使用した。使用した細胞投与量、移植動物の数、移植マウスの数および移植のレベルを、移植後7週でマウス骨髄に見られるヒトCD45+細胞の百分率として定義したものを、表25に示す。G2培地中で増殖されたUCB細胞は、尾静脈注入により末梢血循環へと注入する際に、受容マウスの骨髄に帰巣することができることを、表26のデータは確認した。
全臍帯血をNDRIから受け取り、実施例6に記載した通りに処理した。CD34+細胞をG2培地中で7日間培養し、次いでCD34dimおよびCD34br細胞に分別し、次いで実施例6に記載した通りに、亜致死量で照射を受けたマウスに尾静脈注入することにより移植した。新鮮単離CD34+細胞をコントロールとして使用した。使用した細胞投与量、移植動物の数、移植マウスの数および移植のレベルを、移植後7週でマウス骨髄に見られるヒトCD45+細胞の百分率として定義したものを、表25に示す。G2培地中で増殖されたUCB細胞は、尾静脈注入により末梢血循環へと注入する際に、受容マウスの骨髄に帰巣することができることを、表26のデータは確認した。
驚くべきことに、マウス骨髄細胞からの移植されたヒトCD45+をさらに特徴付ける際、新鮮単離CD34+細胞と比較してヒトCD34br細胞を同等数投与すると、マウス骨髄に含まれるヒトCD42a+細胞によって明らかなように、ヒト巨核球が最も多数になった(表27参照)。
新鮮単離CD34+細胞、G2培地中で増殖したCD34br細胞、およびG2培地中で増殖したCD34dim細胞を尾静脈注入後に、マウスBM、脾臓、およびPB中に存在するヒトCD45+細胞の百分率を、それぞれ表28、29、および30に示す。
G2培地中で7または9日間増殖した後、TNCを尾静脈注入した後の、マウスBM中に存在するヒトCD45+細胞の百分率を、それぞれ表31および32に示す。G2培地中で7日間増殖した後、2,000,000のTNCを尾静脈注入した後の、マウス脾臓中に存在するヒトCD45+細胞の百分率は、4.3%から35.5%の範囲であった。G2培地中で7日間増殖した後、2,000,000のTNCを尾静脈注入した後の、マウスPB中に存在するヒトCD45+細胞の百分率は、1.1%から11.3%の範囲であった。
G8培地
G8培地中で7日間増殖した後、TNCを尾静脈注入した後の、マウスBM中に存在するヒトCD45+細胞の百分率を、表33に示す。G8培地中で7日間増殖した後、2,000,000のTNCを尾静脈注入した後の、マウス脾臓中に存在するヒトCD45+細胞の百分率は、23.2%から23.7%の範囲であった。G8培地中で7日間増殖した後、2,000,000のTNCを尾静脈注入した後の、マウスPB中に存在するヒトCD45+細胞の百分率は、2.2%から10.2%の範囲であった。
G8培地中で7日間増殖した後、TNCを尾静脈注入した後の、マウスBM中に存在するヒトCD45+細胞の百分率を、表33に示す。G8培地中で7日間増殖した後、2,000,000のTNCを尾静脈注入した後の、マウス脾臓中に存在するヒトCD45+細胞の百分率は、23.2%から23.7%の範囲であった。G8培地中で7日間増殖した後、2,000,000のTNCを尾静脈注入した後の、マウスPB中に存在するヒトCD45+細胞の百分率は、2.2%から10.2%の範囲であった。
F4培地
F4培地中で7または9日間増殖した後、TNCを尾静脈注入した後の、マウスBM、脾臓、およびPB中に存在するヒトCD45+細胞の百分率を、それぞれ表34および35に示す。
F4培地中で7または9日間増殖した後、TNCを尾静脈注入した後の、マウスBM、脾臓、およびPB中に存在するヒトCD45+細胞の百分率を、それぞれ表34および35に示す。
二次マウス移植研究
これらの研究に関し、一次マウス移植について、実施例6に上記した通りの方法を行った。増殖CD34brまたはCD34dim細胞で移植したマウスは、移植後7週で屠殺した。大腿骨および脛骨の両方からのマウスBMを、25ゲージの針を用いて流し出した。BM細胞を洗浄し、2%FCSを含むPBSで再懸濁させた。細胞をトリパンブルーを用いて計数し、亜致死量で照射を受けたNOD/SCIDマウスの第2群に尾静脈を通して注入した。マウスの第2群を、移植後7週で屠殺した。実施例6に上記した通りにマウス骨髄を分析した。
これらの研究に関し、一次マウス移植について、実施例6に上記した通りの方法を行った。増殖CD34brまたはCD34dim細胞で移植したマウスは、移植後7週で屠殺した。大腿骨および脛骨の両方からのマウスBMを、25ゲージの針を用いて流し出した。BM細胞を洗浄し、2%FCSを含むPBSで再懸濁させた。細胞をトリパンブルーを用いて計数し、亜致死量で照射を受けたNOD/SCIDマウスの第2群に尾静脈を通して注入した。マウスの第2群を、移植後7週で屠殺した。実施例6に上記した通りにマウス骨髄を分析した。
結果
G2培地中で増殖したCD34brおよびCD34dim細胞の両方は、ヒト造血細胞の長期間移植を誘発でき、第2照射を受けたNOD/SCIDマウスの骨髄を再形成できた。表36は、G2培地中で増殖したCD34brまたはCD34dim細胞の一次および2次移植後の、マウスBM中のヒトCD45+細胞百分率を示す。
G2培地中で増殖したCD34brおよびCD34dim細胞の両方は、ヒト造血細胞の長期間移植を誘発でき、第2照射を受けたNOD/SCIDマウスの骨髄を再形成できた。表36は、G2培地中で増殖したCD34brまたはCD34dim細胞の一次および2次移植後の、マウスBM中のヒトCD45+細胞百分率を示す。
UCBから由来する接着、ストローマ様細胞の培養および増殖
本実施例は、G2培地を用いると、UCBからの柔軟な組織培養表面に接着することにより、ストローマ様細胞を濃縮できることを例証している。
本実施例は、G2培地を用いると、UCBからの柔軟な組織培養表面に接着することにより、ストローマ様細胞を濃縮できることを例証している。
全血をNDRIから受け取り、最初にヘタスターチを使用することにより赤血球を除去し、続いて実施例2に記載した通りに溶解緩衝液処理することにより、白血球画分を単離した。全有核白血球画分を、6ウェルプレート中G2培地の1,000,000TNC/ウェル/6mlの播種密度で、またはG2培地の5,000,000TNC/T−25フラスコ/15mlの播種密度で播種し、16日間インキュベートした。接着細胞層が培養開始約24時間内で形成した。接着細胞の形態は、ストローマ様上皮細胞を示している。
増殖CD34br細胞の遺伝子発現プロファイル
RNA精製
第0日目に、および細胞培養後第1日目と第7日目に、2日間冷凍したUCBから分離したCD34+細胞から、RNA精製を精製した。Qiagen RNeasy法(Qiagenカタログ番号74104)を用いてRNA精製を行った。室温で10分間400xgで遠心分離することにより、およそ2×106のCD34+細胞を採集し、培地を除去した。
RNA精製
第0日目に、および細胞培養後第1日目と第7日目に、2日間冷凍したUCBから分離したCD34+細胞から、RNA精製を精製した。Qiagen RNeasy法(Qiagenカタログ番号74104)を用いてRNA精製を行った。室温で10分間400xgで遠心分離することにより、およそ2×106のCD34+細胞を採集し、培地を除去した。
使用する直前に、RLT溶解緩衝液にメルカプトエタノールを10μl/ml(容量/容量)で加えた。RLTカオトロープ−溶解緩衝液350μlを加え、数回ピペットで混合し、次いで渦巻き状に混合(vortex mixed)することにより、細胞を溶解させた。溶解物を2mlのコレクションチューブ中、QIAshredderスピンカラムに移液し、最大速度(約16,000xg)で2分間遠心分離して均一化した。1容量の70%エタノールを溶解物に加え、ピペット混合した。溶解物を2mlのコレクションチューブ中、RNeasyスピンカラムに移液し、10,000xgで15秒間遠心分離して、カラムマトリックスにRNAを結合させた。フロースルー(flow−thru)を廃棄し、RW1洗浄緩衝液350μlを加えてカラムマトリックスを洗浄し、上記のように遠心分離した。
以下に簡潔に記載するように、Qiagen Rnase−free DNaseセット(cat#79254)を用いて、カラム上でのDNase処理を行った。再構成され/希釈されたDNAse(10μlの再構成されたDNAse+70μlのRDD緩衝液)80μlを、スピンカラム膜の中心に加え、室温で15分間インキュベートした。次いでRW1(350μl)を加えることによりスピンカラムを2回洗浄し、次いで10,000rpmで1分間遠心分離した。
次いでスピンカラムを新しいコレクションチューブに設置し、RPE緩衝液(500μl)を加えることにより洗浄し、10,000rpmで1分間遠心分離した。フロースルーを廃棄し、さらに500μlのRPE緩衝液をスピンカラムに適用し、続いて13,200rpmで3分間遠心分離した。スピンカラムを新しい1.7mlの蓋付マイクロチューブに移した。スピンカラム上にエタノールが残っていないことを確かめるために、試料を再度最大速度で1分間遠心分離した。カラムを清浄なマイクロチューブに移し、膜中心にRNAse不含の水30μlを2度加えることによりRNAを溶離し、10,000xgで1分間遠心分離した。
マイクロアレイ
AgilentヒトオリゴIA22Kアレイを用いて、RNA試料を遺伝子発現(転写)プロファイルの差異について比較した。マイクロアレイハイブリッド形成/スキャンはParadigm Geneticsと契約した。彼らは、AgilentスキャナーおよびRosettaレゾルバを用いて、データの抽出および正規化を行った。また、BDTバイオインフォマティクスにより、BDTで開発したアルゴリズムを用いて抽出したデータを正規化した。
AgilentヒトオリゴIA22Kアレイを用いて、RNA試料を遺伝子発現(転写)プロファイルの差異について比較した。マイクロアレイハイブリッド形成/スキャンはParadigm Geneticsと契約した。彼らは、AgilentスキャナーおよびRosettaレゾルバを用いて、データの抽出および正規化を行った。また、BDTバイオインフォマティクスにより、BDTで開発したアルゴリズムを用いて抽出したデータを正規化した。
次いで、7日目のCD34br対CD34dim細胞集団において、および0日目対1日目に培養されたCD34+細胞において、転写変動調整(up nad down regulated transcripts)されているかどうかについて、両者の正規化データを評価した。作動的に発現した遺伝子の分類を、文献から認められた遺伝子機能に関連するパターンに対して研究した。関連する遺伝子機能を基に、興味あるサブグループを確認し、これらの関係は、さらに試験可能または試験済みのある特異的な生物学的解釈を示唆した。例えば、Rosettaアレイ規準化からの16,000を越える観測できる転写から、7日目のCD34br細胞集団が有する転写のうち、CD34dim集団に比較して2.5倍以上増加したのは19の転写のみであった。これらの転写のいくつかは、すなわちDLK1、CSRP2、およびPROML1(CD133)は、増殖および非分化により特徴付けられる多分化能幹細胞及び前駆細胞と関連する、文献記載の機能または関連性を有する。BDT規準化を基に、15の転写のみが2倍以上増加し、これは統計的に重要な変化と決定された。これらは再度DLK1およびCSRP2の両方を含んでいた。加えて、この分類に属する転写STMN3も含んでいた。幹細胞転写PROML1(CD133)は2.0倍増加したが、BDT規準化にとって、これらの試料を用いる測定での変動を基にすると、統計的に重要な変化とは決定されなかった。
dim集団と比較して、CD34br集団においては、多数の転写(BDT正規化データとして81)が下方調整された。bright集団において発現されにくかったこれらの転写の多くは、さらに造血細胞分化と関連または関係する機能を有する。これらの結果は、より分化されたdim細胞集団と比較して、CD34br細胞集団が初期段階として、より多能性幹細胞であると特徴付けられる。しかしながら、CD34、CD90(Thy1)、SZF1、C17、IK、PODLX3、FLT1、FLT3、FLT4、CD33、KITLGなどの他のいくつかの知られている幹細胞関連転写は、brightおよびdim集団におけるレベルと同様のレベルであった。
Paradigm Genetics Rosettaアレイでは、16,388の全転写を測定した。CD34br細胞において、19の遺伝子が2.5倍以上向上しP<0.01であったが、他方、95の遺伝子は1/2.5以下への低下でP<0.01であった。BD Technologiesアレイにおいては、15の遺伝子が2倍の向上であった。例えば、血液新生を調整し、分化を抑制するDLK1は、3.0倍の向上であった。細胞増殖の役割を有するSTMN3は、2.0倍の向上であった。増殖および分化を促進する転写要因であるCSRP2は、2.6倍の向上であった。BD Technologiesアレイにおいては、81の遺伝子は1/2以下への低下であった。分化および炎症に関連する遺伝子は、培養後下方調整された。時間の経過につれて、細胞帰巣(cell homing)に関係する転写発現は異なった。示されたCD34br細胞は、デルタ様タンパク質−1、システインおよびグリシン−リッチプロテイン2(glycine−rich protein 2)、FADD、S100A9、ならびにITB2mRNA転写のレベルを減少させた。
CD34br細胞を含む3−D骨格の新血管形成
結果
アルギネート骨格を濃縮CD34+臍帯血細胞(80〜90%純度)で播種し、G2培地(VEGF添加及び非添加)と混合したStemline(商標)栄養培地中で7日間培養し、次いでSCID/NODマウスに皮下移植すると、CD34−細胞を含む骨格と比較して新血管形成が観測された。VEGFが存在すると、CD34+細胞を含む骨格内での新血管形成が大きく高められた。
結果
アルギネート骨格を濃縮CD34+臍帯血細胞(80〜90%純度)で播種し、G2培地(VEGF添加及び非添加)と混合したStemline(商標)栄養培地中で7日間培養し、次いでSCID/NODマウスに皮下移植すると、CD34−細胞を含む骨格と比較して新血管形成が観測された。VEGFが存在すると、CD34+細胞を含む骨格内での新血管形成が大きく高められた。
膵臓修復モデルにおけるCD34br細胞による新血管形成
全臍帯血をNDRIから受け取り、実施例6に記載した通りに処理した。CD34+細胞をG2培地中で7日間培養し、次いでCD34dimおよびCD34br細胞に分別し、次いでマウス再生膵臓モデルに移植した。
全臍帯血をNDRIから受け取り、実施例6に記載した通りに処理した。CD34+細胞をG2培地中で7日間培養し、次いでCD34dimおよびCD34br細胞に分別し、次いでマウス再生膵臓モデルに移植した。
結果
マウス再生膵臓モデルに移植後4週で、CD34br細胞は、、長いチューブ様構造(潜在的に脈管構造)を形成する再生膵臓組織に組み込まれた。ところがCD34dim細胞は、活発に再構築する膵臓組織の境界で、高密度かつ組み込まれない状態の小瘤のみを形成した。
マウス再生膵臓モデルに移植後4週で、CD34br細胞は、、長いチューブ様構造(潜在的に脈管構造)を形成する再生膵臓組織に組み込まれた。ところがCD34dim細胞は、活発に再構築する膵臓組織の境界で、高密度かつ組み込まれない状態の小瘤のみを形成した。
QuantiBRITE(商標)PEビーズを用いるCD34発現の定量化
本実施例は、本明細書の他の箇所に記載したように、QuantiBRITE(商標)PEビーズ(Becton−Dickinson、米国)を用いて、G2培地からの増殖CD34br細胞へのCD34発現を定量化する。
本実施例は、本明細書の他の箇所に記載したように、QuantiBRITE(商標)PEビーズ(Becton−Dickinson、米国)を用いて、G2培地からの増殖CD34br細胞へのCD34発現を定量化する。
CD34+細胞を単離し、G2培地を用いて実施例1に記載した通りに7日間培養した。増殖細胞を、TruCOUNT(商標)(Becton−Dickinson)チューブ中、1%BSA(ウシ血清アルブミン)を含むPBSに、1×106細胞/100μlで懸濁させ、暗闇で室温下15分間、20μlのCD34−PE 1:1(Becton Dickinson Immunocytochemistry Systems、San Jose、カリフォルニア州)で細胞を染色した。インキュベートした後、調製したての1×PharMLyse(商標)(BD Pharmingen)(1ml)およびViaProbe(BD Pharmingen)(20μl)を細胞懸濁液に加え、続いて暗闇で室温下10分間インキュベートした。
インキュベートする間、QuantiQuestソフトによりQuantiBRITE(商標)PEビーズを解析して、細胞当たりの結合抗体(ABC)値に関する検量線を構築した。
FACS(BD Biosciences、ノースカロライナ州)によりインキュベートした後、30分以内に試料を採集し、ISHAGE方法によりデータを解析して、(ヒストグラム中央値/ピークチャネル)値(hystogram median/peak channel)を求めた。CD34−PEのための(中央値/ピークチャネル)値を検量線と比較して、CD34発現のためのABC値を得た。
結果
CD34抗原発現量を、増殖CD34+細胞について定量的に測定した。表37は、QuantiBRITE(商標)PEビーズを用いて測定したときの、CD34brおよび全CD34+細胞からのABC値の比を示す。10の実験を行い、1.55から3.03の範囲でABC比の値を得た。
CD34抗原発現量を、増殖CD34+細胞について定量的に測定した。表37は、QuantiBRITE(商標)PEビーズを用いて測定したときの、CD34brおよび全CD34+細胞からのABC値の比を示す。10の実験を行い、1.55から3.03の範囲でABC比の値を得た。
QuantiBrite(商標)PEビーズを用いる増殖CD34br細胞についてのCD34発現量の定量
本明細書に述べたすべての刊行物および出願特許は、本発明に関係する当業者のレベルを示すものである。すべての刊行物および出願特許は、それぞれ個々の刊行物および出願特許が参照により組み込まれるべきであると特におよび個々に示したのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
前述の発明を、理解を明確にする目的のために説明や実施例の方法でいくらか詳しく記載してきたけれども、添付した特許請求の範囲内で変更や修飾を行うことができることは明白であろう。
Claims (32)
- サイトカインカクテルで増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団であって、
該集団がCD34+細胞集団およびCD34br細胞集団を含み、前記CD34br細胞集団が、前記CD34+細胞集団についての細胞当たりの結合抗体値の少なくとも1.5倍の細胞当たりの結合抗体値を有することを特徴とする、
前記幹細胞及び前駆細胞の集団。 - 請求項1に記載の集団であって、
前記カクテルが、フィブロネクチン、SDF−1アルファ、IL−6、SCF、IL−5、BDNF、PD−ECGF、IL−11、IL−3、EPO、Flt−3/Flk−2リガンド、BMP−4、トロンボスポンジン、IGF−1、bFGF、アンギオテンシン、PDGF−AB、TGF−ベータ1、GM−CSF、VEGF、EGF、M−CSF、MCP−1、PlGF、アミノ酸配列VTCGを含む造血接着ペプチド、TRANCE、G−CSF、Tpo、LIF、SCGF−アルファ、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも8のサイトカインを含むことを特徴とする集団。 - 請求項2に記載の集団であって、
前記カクテルは、G2、F2、D6、F2N、F4またはG8であることを特徴とする集団。 - 請求項3に記載の集団であって、
前記細胞の実質的な部分は造血前駆細胞であることを特徴とする集団。 - 請求項3に記載の集団であって、
前記細胞の実質的な部分は内皮前駆細胞であることを特徴とする集団。 - 請求項3に記載の集団であって、
前記細胞の実質的な部分は血管芽細胞であることを特徴とする集団。 - 請求項3に記載の集団であって、
前記細胞の実質的な部分は、BFU−E/CFU−E、CFU−GM、CFU−G、CFU−GEMM、およびそれらの組合せからなる群から選択される幹細胞および前駆細胞を含むことを特徴とする集団。 - 請求項3に記載の集団であって、
前記細胞の実質的な部分は、CD31、CD33またはCD71、またはそれらの組合せを発現することを特徴とする集団。 - 請求項3に記載の集団であって、
5%を上回る前記細胞はCD34br細胞であることを特徴とする集団。 - 請求項3に記載の集団であって、
細胞表面マーカーを発現する増殖細胞の百分率が、10%未満の細胞がCD14を発現すること、1%未満の細胞がCD16を発現すること、1%未満の細胞がCD3を発現すること、50%を上回る細胞がCD31を発現すること、50%を上回る細胞がCD33を発現すること、10%を上回る細胞がCD34を発現すること、10%未満の細胞がCD38を発現すること、40%を上回る細胞がCD71を発現すること、5%を上回る細胞がCD133を発現すること、およびそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする集団。 - 幹細胞または前駆細胞の集団を増殖させるための細胞培地であって、
フィブロネクチン、SDF−1アルファ、IL−6、SCF、IL−5、BDNF、PD−ECGF、IL−11、IL−3、EPO、Flt−3/Flk−2リガンド、BMP−4、トロンボスポンジン、IGF−1、bFGF、アンギオテンシン、PDGF−AB、TGF−ベータ1、GM−CSF、VEGF、EGF、M−CSF、MCP−1、PlGF、アミノ酸配列VTCGを含む造血接着ペプチド、TRANCE、G−CSF、Tpo、LIF、SCGF−アルファ、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも8のサイトカインを含むことを特徴とする細胞培地。 - 請求項11に記載の細胞培地であって、
前記サイトカインは、フィブロネクチン、SDF−1アルファ、IL−6、SCF、IL−5、BDNF、PD−ECGF、IL−11、IL−3、EPO、Flt−3/Flk−2リガンド、BMP−4、トロンボスポンジン、IGF−1およびbFGFを含むことを特徴とする細胞培地。 - 増殖された間質細胞の集団を生成する方法であって、請求項12に記載の前記細胞培地で臍帯血由来総有核細胞(TNC)を培養することを含むことを特徴とする方法。
- 請求項11に記載の培地であって、
前記サイトカインは、アンギオテンシン、IL−6、SCF、BDNF、IL−3、PDGF−AB、BMP−4、TGF−ベータ1、トロンボスポンジン、GM−CSF、VEGF、EGF、bFGF、M−CSFおよびMCP−1を含むことを特徴とする培地。 - 請求項11に記載の細胞培地であって、
前記サイトカインは、PlGF、SDF−1アルファ、IL−6、SCF、IL−5、BDNF、IL−11、IL−3、EPO、PDGF−AB、Flt−3/Flk−2リガンド、アミノ酸配列VTCGを含む造血接着ペプチド、TRANCE、GM−CSF、VEGFおよびG−CSFを含むことを特徴とする培地。 - 幹細胞及び前駆細胞の集団を増殖、分化させる方法であって、請求項15に記載の前記培地で前記集団を培養することを含むことを特徴とする方法。
- 請求項16に記載の方法であって、
前記培地は、前記集団の少なくとも一部を赤血球に分化させることを特徴とする方法。 - 請求項11に記載の細胞培地であって、
前記サイトカインは、BDNF、bFGF、EPO、フィブロネクチン、Flt−3/Flk−2リガンド、IGF−1、IL−11、IL−3、IL−5、SCF、TGF−ベータ1、G−CSFおよびGM−CSFを含むことを特徴とする培地。 - 請求項11に記載の細胞培地であって、
前記サイトカインは、bFGF、EPO、Flt−3/Flk−2リガンド、IL−11、IL−6、PD−ECGF、トロンボスポンジンおよびTpoを含むことを特徴とする培地。 - 請求項11に記載の細胞培地であって、
前記サイトカインは、BDNF、bFGF、Flt−3/Flk−2リガンド、IL−3、IL−6、PD−ECGF、SCF、G−CSF、LIFおよびSCGF−アルファを含むことを特徴とする培地。 - 増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団を生成する方法であって、
フィブロネクチン、SDF−1アルファ、IL−6、SCF、IL−5、BDNF、PD−ECGF、IL−11、IL−3、EPO、Flt−3/Flk−2リガンド、BMP−4、トロンボスポンジン、IGF−1、bFGF、アンギオテンシン、PDGF−AB、TGF−ベータ1、GM−CSF、VEGF、EGF、M−CSF、MCP−1、PlGF、アミノ酸配列VTCGを含む造血接着ペプチド、TRANCE、G−CSF、Tpo、LIF、SCGF−アルファ、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも8のサイトカインを含む細胞培地で、幹細胞及び前駆細胞の集団を培養することを含むことを特徴とする方法。 - 請求項21に記載の方法であって、
前記集団はCD34+細胞集団およびCD34br細胞集団を含み、前記CD34br細胞集団は、前記CD34+細胞集団に対する細胞当りの結合抗体値の少なくとも1.5倍の細胞当たりの結合抗体値を有することを特徴とする方法。 - 増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団を、それを必要とする患者に対して投与することを含む、幹細胞及び前駆細胞を移植する方法であって、前記増殖された集団はCD34+細胞集団およびCD34br細胞集団を含み、前記CD34br細胞集団は、前記CD34+細胞集団に対する細胞当りの結合抗体値の少なくとも1.5倍の細胞当りの結合抗体値を有することを特徴とする方法。
- 請求項23に記載の方法であって、
前記増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団を、リンパまたは骨髄細胞の生成を回復させるのに有効な量、投与されることを特徴とする方法。 - 請求項23に記載の方法であって、
前記増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団を、前記患者のある部位における血管新生を促進させるのに有効な量、投与されることを特徴とする方法。 - 請求項25に記載の方法であって、
前記部位は損傷組織であることを特徴とする方法。 - 請求項26に記載の方法であって、
前記組織は心臓組織であることを特徴とする方法。 - 前記増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団は、移植に先立って生体適合骨格に含浸されることを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 請求項23に記載の方法であって、
前記増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団が、損傷組織を修復するのに有効な量、投与されることを特徴とする方法。 - 請求項29に記載の方法であって、
前記組織は心臓組織であることを特徴とする方法。 - 請求項29に記載の方法であって、
前記増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団が、移植に先立って生体適合骨格に含浸されることを特徴とする方法。 - 請求項23に記載の方法であって、
巨大核細胞の移植を必要とする患者に、巨大核細胞の移植を提供するのに有効な量の前記増殖された幹細胞及び前駆細胞の集団を移植することを特徴とする方法。
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