JPWO2018021357A1 - 幹細胞の分化を抑制する方法、幹細胞を調製する方法、及び幹細胞を分化誘導する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、幹細胞の分化を抑制する方法であって、（１）前記幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び（２）前記幹細胞を培養し、増殖させる工程を含み、ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法に関する。

Description

本発明は、幹細胞の分化を抑制する方法、幹細胞を調製する方法、及び幹細胞を分化誘導する方法に関する。

幹細胞の分化抑制について
再生医療の重要度が加速的に増す中、幹細胞の果たす役割は益々重要となっている。例えば、自家細胞移植を実施する場合に大量の幹細胞が必要となる。しかし、増殖させる過程で幹細胞は自発的に分化しやすく、未分化性を維持しながら培養することは困難であることが知られている。

表面に、カドヘリンファミリーに属するタンパク質またはカドヘリンファミリーに属するタンパク質全部または一部の領域を含む融合タンパク質、および、糖側鎖を有するポリマーを、固定またはコーティングを、固定またはコーティングした細胞培養基材を用いて、分化を抑制しながら幹細胞を培養する方法が報告されている（特許文献１）。

また、中空糸を用いて、分化を抑制しながら幹細胞を培養する方法が報告されている（特許文献２及び３）。

ポリイミド多孔質膜
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献４〜６は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。

細胞をポリイミド多孔質膜に適用して培養することを含む、細胞の培養方法が報告されている（特許文献７）。

特開２０１３−１２６４０５号公報 特開２０１４−６０９９１号公報 特開２０１６−７２０７号公報 ＷＯ２０１０／０３８８７３ 特開２０１１−２１９５８５号公報 特開２０１１−２１９５８６号公報 ＷＯ２０１５／０１２４１５

本発明は、従来とは全く異なる手段を用いて幹細胞の分化を抑制し、当該幹細胞を大量に供給可能な方法を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、複数の孔を有する２つの表面層と、当該２つの表面層との間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜上で幹細胞を培養することで、驚くべきことに、幹細胞の分化を抑制できることを見出し、本発明に至った。

すなわち本発明は、以下の態様を有する。
［１］
幹細胞の分化を抑制する方法であって、
（１）前記幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）前記幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法。
［２］
前記細胞がＥＳ細胞、ＥＣ細胞、ＥＧ細胞、核移植ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、骨髄幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、精原細胞、ＩＩ型肺胞上皮細胞、脂肪幹細胞、歯髄幹細胞、脱分化脂肪細胞又はMUSE細胞である、［１］に記載の方法。
［３］
前記工程（２）が少なくとも３０日間実施される、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
前記工程（２）において、細胞を、ポリマー多孔質膜１平方センチメートル当たりに１．０ｘ１０⁵個以上となるまで増殖させる、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］
２以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の方法。
［６］
前記ポリイミド多孔質膜を
ｉ）折り畳んで、
ｉｉ)ロール状に巻き込んで、
ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
ｉｖ）縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の方法。
［７］
工程（２）において、ポリイミド多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の方法。
［８］
工程（２）において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の方法。
［９］
前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、［１］〜［８］のいずれか１つに記載の方法。
［１０］
前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、［１］〜［９］のいずれか１つに記載の方法。
［１１］
前記ポリマー多孔質膜の膜厚が、５〜５００μｍである、［１］〜［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］
前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、［１］〜［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１３］
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、［１２］に記載の方法。
［１４］
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、［１２］又は［１３］に記載の方法。
［１５］
前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、［１］〜［１１］のいずれか１つに記載の方法。
［１６］
幹細胞を調製する方法であって、
（１）前記幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）前記幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において前記幹細胞の分化は抑制される、前記方法。
［１７］
幹細胞を分化誘導する方法であって、
（１）前記幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
（２）前記幹細胞を培養し、増殖させる工程、及び
（３）培養した前記幹細胞を分化誘導条件下で培養する工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において前記幹細胞の分化は抑制される、前記方法。

本発明によれば、幹細胞の分化を抑制し、当該細胞を大量に供給することができる。

図１は、ポリイミド多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を示す。 図２は、細胞培養装置の一例を示す。 図３は、ヒト間葉系幹細胞をポリイミド多孔質膜で培養した後の遺伝子解析結果を示す。図中、実線は３日間、７０日間及び１８２日間、部材培養した細胞サンプルの結果である。破線は、３日間、７０日間及び１１８日間、通常培養した細胞サンプルの結果である。 図４は、ヒト間葉系幹細胞をポリイミド多孔質膜で６日培養後、１３日間脂肪細胞へと分化誘導し、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏで染色した際の蛍光顕微鏡写真を示す。 図５は、ヒト間葉系幹細胞をポリイミド多孔質膜で１８２日間培養後、１５日間脂肪細胞へと分化誘導し、ＢＯＤＩＰＹで染色した際の蛍光顕微鏡写真を示す。 図６は、ポリイミド多孔質膜を用いて、又は用いずにヒト間葉系幹細胞を培養した際の細胞数の経時変化を示す。 図７は、ヒト間葉系幹細胞をポリイミド多孔質膜で培養した際の細胞数の経時変化を示す。 図８は、ヒト間葉系幹細胞をポリイミド多孔質膜で１２５日培養後、１０日間分化誘導し、ＢＯＤＩＰＹで染色した際の蛍光顕微鏡写真を示す。 図９は、ヒト間葉系幹細胞をポリイミド多孔質膜で培養した際の細胞数の経時変化を示す。 図１０は、ポリイミド多孔質膜上での培養開始後１５日目、３０日目及び１５０日目のヒト間葉系幹細胞の蛍光顕微鏡写真を示す。 図１１は、ヒト間葉系幹細胞が生着したポリイミド多孔質膜をホルマリン固定した試料の電子顕微鏡画像を示す。 図１２は、ヒト間葉系幹細胞が生着したポリイミド多孔質膜をホルマリン固定した試料の蛍光顕微鏡画像を示す。 図１３は、ヒト間葉系幹細胞をポリイミド多孔質膜で長期間培養した際の細胞数の経時変化を示す。 図１４は、ヒト間葉系幹細胞をポリイミド多孔質膜で４６３日培養後、脂肪細胞へと２６日間分化誘導し、ＢＯＤＩＰＹで染色した際の蛍光顕微鏡写真を示す。 図１５は、ヒト間葉系幹細胞をポリイミド多孔質膜で４９０日培養後、骨芽細胞へと２６日間分化誘導し、その後石灰化誘導した試料の光学顕微鏡画像を示す。 図１６Ａは、ヒト間葉系幹細胞をポリイミド多孔質膜で長期培養した後の遺伝子解析結果を示す。 図１６Ｂは、ヒト間葉系幹細胞をポリイミド多孔質膜で長期培養した後の遺伝子解析結果を示す。 図１７は、ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞をポリイミド多孔質膜で培養した際の細胞数の経時変化を示す。 図１８は、ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞をポリイミド多孔質膜で培養した後の遺伝子解析結果を示す。 図１９は、培養２２日目のヒトＩＩ型肺胞上皮細胞を免疫染色した写真である。ＤＡＰＩ：青、Ｐｒｏ ＳＰ−Ｃ：緑、ポドプラニン：赤。 図２０は、ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞をポリイミド多孔質膜で長期間培養した際の細胞数の経時変化を示す。 図２１は、異なる細胞播種法でポリイミド多孔質膜に播種されたヒトＩＩ型肺胞上皮細胞を培養した際の細胞数の経時変化を示す。 図２２は、ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞をポリイミド多孔質膜で長期培養した後の遺伝子解析結果を示す。

本発明の一態様は、幹細胞の分化を抑制する方法であって、
（１）前記幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）前記幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法に関する。以下で「本発明の分化抑制方法」とも呼ぶ。

また、本発明の別の態様は、幹細胞を調製する方法であって、
（１）前記幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
（２）前記幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において前記幹細胞の分化は抑制される、前記方法に関する。以下で「本発明の幹細胞調製方法」とも呼ぶ。

また、本発明の別の態様は、幹細胞を分化誘導する方法であって、
（１）前記幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
（２）前記幹細胞を培養し、増殖させる工程、及び
（３）培養した前記幹細胞を分化誘導条件下で培養する工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程（２）において前記幹細胞の分化は抑制される、前記方法に関する。以下で「本発明の分化誘導方法」とも呼ぶ。

「本発明の分化抑制方法」、「本発明の幹細胞調製方法」及び「本発明の分化誘導方法」を、以下で「本発明の方法」とも呼ぶ。

１．本発明の方法で使用される幹細胞について
本明細書において「幹細胞」とは、分裂して自分と同じ細胞を作る(self-renewal)能力（自己複製能）と、別の種類の細胞に分化する能力を持つ細胞のことである。近年、ダイレクト・リプログラミングなどの手法で最終分化細胞を別の最終分化細胞へと直接的に誘導することが可能であるが、本明細書における「幹細胞」は、最終分化細胞を含まない。幹細胞は、以下の分化能力の違いで分類することができる。
（１）多能性
本明細書において、「多能性」(pluripotency)とは、三胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に属する細胞系列の全てに分化し得る能力のことである。例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、核移植ＥＳ細胞、体細胞由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、ＭＵＳＥ細胞（Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell）が挙げられるが、これらに限定されない。
（２）多分化能性
本明細書において、「多分化能性」(multipotency)とは、分化可能な細胞系列が限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力のことである。一般的に胚葉を超えた分化は行えないが、例外もある。多分化能性は、組織幹細胞（生物の体内に見られる最終分化していない細胞）などが持つ分化能力である。例えば、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、歯髄幹細胞、脂肪幹細胞、脱分化脂肪細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
（３）寡能性
本明細書において、「寡能性」(oligopotentcy)とは、数種の細胞種にのみ分化可能な能力のことである。寡能性を有する細胞は、前駆細胞と呼ばれることもあり、本明細書において幹細胞に含まれる。例えば、骨髄幹細胞が挙げられるが、これに限定されない。
（４）単分化能性
本明細書において、「単分化能性」（unipotency）とは、分化可能な細胞種が一種類に限定されている分化能力のことである。単分化能性を有する細胞は、前駆細胞と呼ばれることもあり、本明細書において幹細胞に含まれる。幹細胞として分裂増殖するか、分化して別の（幹細胞以外の）細胞種に変化することができる。例えば、筋幹細胞、生殖幹細胞、精原細胞、ＩＩ型肺胞上皮細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の方法で使用される幹細胞としては、好ましくは、ＥＳ細胞、ＥＣ細胞、ＥＧ細胞、核移植ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、骨髄幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、精原細胞又はＩＩ型肺胞上皮細胞であり、より好ましくは、間葉系幹細胞又はＩＩ型肺胞上皮細胞である。

本発明に利用し得る幹細胞の種類は、特に限定されないが、好ましくは哺乳動物の幹細胞であり、より好ましくは霊長類（ヒト、サルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモットなど）、ネコ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ又はフェレットの幹細胞であり、特に好ましくはヒトの幹細胞である。

２．本発明で使用される幹細胞をポリマー多孔質膜へする適用する工程について
本発明で使用される幹細胞のポリマー多孔質膜への適用の具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程、あるいは、幹細胞を膜状の担体に適用するのに適した任意の手法を採用することが可能である。限定されるわけではないが、本発明の方法において、幹細胞のポリマー多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。

（Ａ）幹細胞を前記ポリマー多孔質膜の表面に播種する工程を含む、態様；
（Ｂ）前記ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に幹細胞懸濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、幹細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
幹細胞懸濁液中の幹細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様；並びに、
（Ｃ）前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリマー多孔質膜に幹細胞懸濁液を装填し、そして、
幹細胞懸濁液中の幹細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。

（Ａ）の態様は、ポリマー多孔質膜の表面に細胞、細胞塊を直接播種することを含む。あるいは、ポリマー多孔質膜を幹細胞懸濁液中に入れて、膜の表面から細胞培養液を浸潤させる態様も含む。

ポリマー多孔質膜の表面に播種された幹細胞は、ポリマー多孔質膜に接着し、多孔の内部に入り込んでいく。好ましくは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、幹細胞はポリマー多孔質膜に自発的に接着する。ポリマー多孔質膜の表面に播種された幹細胞は、膜の表面及び／又は内部において安定して生育・増殖することが可能である。幹細胞は生育・増殖する膜の位置に応じて、種々の異なる形態をとりうる。

（Ｂ）の態様において、ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に幹細胞懸濁液を載せる。ポリマー多孔質膜を放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、幹細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませることにより、幹細胞懸濁液が膜中に浸透する。理論に縛られるわけではないが、これはポリマー多孔質膜の各表面形状等に由来する性質によるものであると考えられる。本態様により、膜の幹細胞懸濁液が装填された箇所に幹細胞が吸い込まれて播種される。

あるいは、（Ｃ）の態様のように、前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面の部分又は全体を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤してから、湿潤したポリマー多孔質膜に幹細胞懸濁液を装填してもよい。この場合、幹細胞懸濁液の通過速度は大きく向上する。

例えば、膜の飛散防止を主目的として膜極一部を湿潤させる方法（以後、これを「一点ウェット法」と記載する）を用いることができる。一点ウェット法は、実質上は膜を湿潤させないドライ法（（Ｂ）の態様）にほぼ近いものである。ただし、湿潤させた小部分については、細胞液の膜透過が迅速になると考えられる。また、ポリマー多孔質膜の片面又は両面の全体を十分に湿潤させたもの（以後、これを「ウェット膜」と記載する）に幹細胞懸濁液を装填する方法も用いることができる（以後、これを「ウェット膜法」と記載する）。この場合、ポリマー多孔質膜の全体において、幹細胞懸濁液の通過速度が大きく向上する。

（Ｂ）及び（Ｃ）の態様において、幹細胞懸濁液中の幹細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる。これにより幹細胞懸濁液中の幹細胞の濃度を濃縮する、幹細胞以外の不要な成分を水分とともに流出させる、などの処理も可能になる。

（Ａ）の態様を「自然播種」（Ｂ）及び（Ｃ）の態様を「吸込み播種」と呼称する場合がある。

限定されるわけではないが、好ましくは、ポリマー多孔質膜には生細胞が選択的に留まる。よって、本発明の方法の好ましい実施形態において、生細胞が前記ポリマー多孔質膜内に留まり、死細胞は優先的に水分とともに流出する。

態様（Ｃ）において用いる滅菌された液体は特に限定されないが、滅菌された緩衝液若しくは滅菌水である。緩衝液は、例えば、(+)及び(-)Dulbecco’s PBS 、(+)及び(-)Hank's Balanced Salt Solution等である。緩衝液の例を以下の表１に示す。

さらに、本発明の方法において、幹細胞のポリマー多孔質膜への適用は、浮遊状態にある幹細胞をポリマー多孔質膜と懸濁的に共存させることにより幹細胞を膜に付着させる態様（絡め取り）も含む。例えば、本発明の方法において、幹細胞をポリマー多孔質膜に適用するために、細胞培養容器中に、細胞培養培地、幹細胞及び１又はそれ以上の前記ポリマー多孔質膜を入れてもよい。細胞培養培地が液体の場合、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態である。ポリマー多孔質膜の性質から、幹細胞はポリマー多孔質膜に接着しうる。よって、生来浮遊培養に適さない幹細胞であっても、ポリマー多孔質膜は細胞培養培地中に浮遊した状態で培養することが可能である。好ましくは、幹細胞は、ポリマー多孔質膜に自発的に接着する。「自発的に接着する」とは、特に外部から物理的又は化学的な力を加えなくても、幹細胞がポリマー多孔質膜の表面又は内部に留まることを意味する。

上述した幹細胞のポリマー多孔質膜への適用は、２種類又はそれより多くの方法を組み合わせて用いてもよい。例えば、態様（Ａ）〜（Ｃ）のうち、２つ以上の方法を組み合わせてポリマー多孔質膜に幹細胞を適用してもよい。

３．本発明で使用される幹細胞を培養し、増殖させる工程について
細胞培養は、細胞培養における存在形態により培養細胞は接着培養系細胞と浮遊培養系細胞に分類することができる。接着培養系細胞は培養容器に付着し増殖する培養細胞であり、継代には培地交換を行う。浮遊培養系細胞は培地中において浮遊状態で増殖する培養細胞であり、一般的には継代の際には培地交換は行わず、希釈培養を行う。浮遊培養は、浮遊状態、即ち液体中での培養が可能なため、大量培養が可能であり、培養容器表面にのみ生育する付着細胞と比較すると、立体的な培養である為に、単位空間当りの培養可能細胞数は多いという利点がある。

本発明の方法において、ポリマー多孔質膜を細胞培養培地中に浮遊した状態で用いる場合、２以上の前記ポリマー多孔質膜の小片を用いてもよい。ポリマー多孔質膜は立体的でフレキシブルな薄膜であるため、例えばその小片を培養液中に浮遊させて用いることにより、一定容量の細胞培養培地中に多くの培養可能な表面積を有するポリマー多孔質膜を持ち込むことが可能となる。通常培養の場合、容器底面積が細胞培養可能な面積の上限となるが、本発明のポリマー多孔質膜を用いた細胞培養では、先の持ち込まれたポリマー多孔質膜の大表面積の全てが細胞培養可能な面積となる。ポリマー多孔質膜は細胞培養液を通過させるので、例えば折りたたまれた膜内にも栄養や酸素等の供給が可能となる。また、ポリマー多孔質膜は従来の平面培養とは全く異なり、立体的かつフレキシブルな構造を有する細胞培養基材であるため、接着性を有する細胞を培養容器の形状を選ばず、様々な形状、材質、大きさの培養容器内でも培養可能である（例えば、シャーレ、フラスコ、タンク、バッグ等）。

ポリマー多孔質膜の小片の大きさ、形状は、特に限定されない。形状は、円、楕円形、四角、三角、多角形、ひも状など任意の形をとりうる。

本発明のポリマー多孔質膜は柔軟性があるため形状を変化させて用いることができる。ポリマー多孔質膜を平面状ではなく、立体状に形状を加工して用いてもよい。例えば、ポリマー多孔質膜を、ｉ）折り畳んで、ｉｉ)ロール状に巻き込んで、ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、ｉｖ）縄状に結んで、細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させてもよい。ｉ）〜ｉｖ）のように形状を加工することにより、小片を用いる場合と同様に、一定容量の細胞培養培地中に多くのポリマー多孔質膜を入れることができる。さらに、各小片を集合体として取り扱うことができるため、細胞体を集合化して移動させることが可能となり、総合的な応用性が高い。

小片集合体と同様の考え方として、２以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いてもよい。積層とは、ポリマー多孔質膜が一部重なる態様も含む。積層培養により、狭いスペースで高密度に幹細胞を培養することが可能になる。既に幹細胞が育成している膜上にさらに膜を積層させて設置して別種細胞との多層系を形成することも可能である。積層するポリマー多孔質膜の数は特に限定されない。

本発明の方法において、好ましくは、幹細胞はポリマー多孔質膜の表面及び内部に生育し増殖する。

本発明の方法において、従来のようにトリプシン処理等を行う継代操作を行う事なく、少なくとも３０日間、少なくとも６０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも２００日間、または少なくとも３００日間の長期にわたって、分化を抑制しながら幹細胞を培養することができる。また、本発明の方法により、従来の平面培養で培養することができる期間以上、例えば、平面培養期間の１．５倍以上、２倍以上、２．５倍以上、３倍以上、３．５倍以上、４倍以上、４．５倍以上の期間、分化を抑制しながら幹細胞を培養することができる。本発明によれば、シャーレ等の平面培養での長期間の細胞培養で発生する細胞の剥離や死滅等を生じる事なく、休止状態ではなく動的な生命を長期間維持する事ができる。また、本発明によれば、長期培養した幹細胞であってもセルバイアビリティ又は幹細胞の性質（例えば、細胞表面マーカーの発現量等）が、長期培養前の幹細胞と比較してほとんど変化しない。また、本発明によれば、幹細胞がポリマー多孔質膜内において三次元的に増殖するため、従来の平面培養で見られるような培養領域の制限及び平面環境によりおこるコンタクトインヒビションが起こりにくいため、長期間、生育させる培養が可能となる。また、本発明によれば、幹細胞が接着したポリマー多孔質膜に別のポリマー多孔質膜を接触させることによって、細胞培養可能な空間を任意に増加することが可能であり、従来のようなトリプシン処理を伴った継代操作を行うことなく、コンタクトインヒビションが引き起こされるコンフルエント状態を回避しながら長期間、増殖させる培養が可能となる。また、本発明によれば、幹細胞を凍結等行うことなく、生きたまま長期間保存するという新たな保存方法までも提供するものである。

４．本発明で使用されるポリマー多孔質膜について
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ａ（以下で、「Ａ面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、０．０１μｍ以上２００μｍ未満、０．０１〜１５０μｍ、０．０１〜１００μｍ、０．０１〜５０μｍ、０．０１μｍ〜４０μｍ、０．０１μｍ〜３０μｍ、０．０１μｍ〜２０μｍ、又は０．０１μｍ〜１５μｍであり、好ましくは、０．０１μｍ〜１５μｍである。

本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層Ｂ（以下で、「Ｂ面」又は「大穴面」とも呼ぶ）に存在する孔の平均孔径は、表面層Ａに存在する孔の平均孔径よりも大きい限り特に限定されないが、例えば、５μｍ超２００μｍ以下、２０μｍ〜１００μｍ、３０μｍ〜１００μｍ、４０μｍ〜１００μｍ、５０μｍ〜１００μｍ、又は６０μｍ〜１００μｍであり、好ましくは、２０μｍ〜１００μｍである。

ポリマー多孔質膜表面の平均孔径は、多孔質膜表面の走査型電子顕微鏡写真より、２００点以上の開孔部について孔面積を測定し、該孔面積の平均値から下式（１）に従って孔の形状が真円であるとした際の平均直径を計算より求めることができる。
（式中、Ｓａは孔面積の平均値を意味する。）

表面層Ａ及びＢの厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは０．０１〜２０μｍである。

ポリマー多孔質膜におけるマクロボイド層中のマクロボイドの膜平面方向の平均孔径は、特に限定されないが、例えば１０〜５００μｍであり、好ましくは１０〜１００μｍであり、より好ましくは１０〜８０μｍである。また、当該マクロボイド層中の隔壁の厚さは、特に限定されないが、例えば０．０１〜５０μｍであり、好ましくは、０．０１〜２０μｍである。一の実施形態において、当該マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。別の実施形態において、当該マクロボイド層中の隔壁は孔を有さない。

本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚は、特に限定されないが、５μｍ以上、１０μｍ以上、２０μｍ以上又は２５μｍ以上であってもよく、５００μｍ以下、３００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下又は５０μｍ以下であってもよい。好ましくは、５〜５００μｍであり、より好ましくは２５〜７５μｍである。

本発明で使用されるポリマー多孔質膜の膜厚の測定は、接触式の厚み計で行うことができる。

本発明で使用されるポリマー多孔質膜の空孔率は特に限定されないが、例えば、４０％以上９５％未満である。

本発明において用いられるポリマー多孔質膜の空孔率は、所定の大きさに切り取った多孔質フィルムの膜厚及び質量を測定し、目付質量から下式（２）に従って求めることができる。
（式中、Ｓは多孔質フィルムの面積、ｄは膜厚、ｗは測定した質量、Ｄはポリマーの密度をそれぞれ意味する。ポリマーがポリイミドである場合は、密度は１．３４ｇ／ｃｍ³とする。）

本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリマー多孔質膜である。一の実施形態において、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又複数の孔を有する。別の実施形態において、隔壁は、そのような孔を有さない。

本発明において用いられるポリマー多孔質膜は、滅菌されていることが好ましい。滅菌処理としては、特に限定されないが、乾熱滅菌、蒸気滅菌、エタノール等消毒剤による滅菌、紫外線やガンマ線等の電磁波滅菌等任意の滅菌処理などが挙げられる。

本発明で使用されるポリマー多孔質膜は、上記した構造的特徴を備える限り、特に限定されないが、好ましくはポリイミド、又はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）の多孔質膜である。

ポリイミドとは、繰り返し単位にイミド結合を含む高分子の総称であり、通常は、芳香族化合物が直接イミド結合で連結された芳香族ポリイミドを意味する。芳香族ポリイミドは芳香族と芳香族とがイミド結合を介して共役構造を持つため、剛直で強固な分子構造を持ち、かつ、イミド結合が強い分子間力を持つために非常に高いレベルの熱的、機械的、化学的性質を有する。

本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、好ましくは、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを（主たる成分として）含むポリイミド多孔質膜であり、より好ましくはテトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドからなるポリイミド多孔質膜である。「主たる成分として含む」とは、ポリイミド多孔質膜の構成成分として、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミド以外の成分は、本質的に含まない、あるいは含まれていてもよいが、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドの性質に影響を与えない付加的な成分であることを意味する。

一実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜も含まれる。

ポリアミック酸は、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とを重合して得られる。ポリアミック酸は、熱イミド化又は化学イミド化することにより閉環してポリイミドとすることができるポリイミド前駆体である。

ポリアミック酸は、アミック酸の一部がイミド化していても、本発明に影響を及ぼさない範囲であればそれを用いることができる。すなわち、ポリアミック酸は、部分的に熱イミド化又は化学イミド化されていてもよい。

ポリアミック酸を熱イミド化する場合は、必要に応じて、イミド化触媒、有機リン含有化合物、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。また、ポリアミック酸を化学イミド化する場合は、必要に応じて、化学イミド化剤、脱水剤、無機微粒子、有機微粒子等の微粒子等をポリアミック酸溶液に添加することができる。ポリアミック酸溶液に前記成分を配合しても、着色前駆体が析出しない条件で行うことが好ましい。

本明細書において、「着色前駆体」とは、２５０℃以上の熱処理により一部または全部が炭化して着色化物を生成する前駆体を意味する。

上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得る着色前駆体としては、ポリアミック酸溶液又はポリイミド溶液に均一に溶解または分散し、２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理、好ましくは空気等の酸素存在下での２５０℃以上、好ましくは２６０℃以上、更に好ましくは２８０℃以上、より好ましくは３００℃以上の熱処理により熱分解し、炭化して着色化物を生成するものが好ましく、黒色系の着色化物を生成するものがより好ましく、炭素系着色前駆体がより好ましい。

着色前駆体は、加熱していくと一見炭素化物に見えるものになるが、組織的には炭素以外の異元素を含み、層構造、芳香族架橋構造、四面体炭素を含む無秩序構造のものを含む。

炭素系着色前駆体は特に制限されず、例えば、石油タール、石油ピッチ、石炭タール、石炭ピッチ等のタール又はピッチ、コークス、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体、フェロセン化合物（フェロセン及びフェロセン誘導体）等が挙げられる。これらの中では、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体及び／又はフェロセン化合物が好ましく、アクリロニトリルを含むモノマーから得られる重合体としてはポリアクリルニトリルが好ましい。

また、別の実施形態において、本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、上記の着色前駆体を使用せずに、テトラカルボン酸成分とジアミン成分とから得られるポリアミック酸溶液を成形した後、熱処理することにより得られる、ポリイミド多孔質膜も含まれる。

着色前駆体を使用せずに製造されるポリイミド多孔質膜は、例えば、極限粘度数が１．０〜３．０であるポリアミック酸３〜６０質量％と有機極性溶媒４０〜９７質量％とからなるポリアミック酸溶液をフィルム状に流延し、水を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、ポリアミック酸の多孔質膜を作製し、その後当該ポリアミック酸の多孔質膜を熱処理してイミド化することにより製造されてもよい。この方法において、水を必須成分とする凝固溶媒が、水であるか、又は５質量％以上１００質量％未満の水と０質量％を超え９５質量％以下の有機極性溶媒との混合液であってもよい。また、上記イミド化の後、得られた多孔質ポリイミド膜の少なくとも片面にプラズマ処理を施してもよい。

上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るテトラカルボン酸二無水物は、任意のテトラカルボン酸二無水物を用いることができ、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。テトラカルボン酸二無水物の具体例として、ピロメリット酸二無水物、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）、２，３，３’，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ａ−ＢＰＤＡ）などのビフェニルテトラカルボン酸二無水物、オキシジフタル酸二無水物、ジフェニルスルホン−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）スルフィド二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン二無水物、２，３，３’，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、３，３’，４，４’−ベンゾフェノンテトラカルボン酸二無水物、ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）メタン二無水物、２，２−ビス（３，４−ジカルボキシフェニル）プロパン二無水物、ｐ−フェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｐ−ビフェニレンビス（トリメリット酸モノエステル酸無水物）、ｍ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、ｐ−ターフェニル−３，４，３’，４’−テトラカルボン酸二無水物、１，３−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ベンゼン二無水物、１，４−ビス（３，４−ジカルボキシフェノキシ）ビフェニル二無水物、２，２−ビス〔（３，４−ジカルボキシフェノキシ）フェニル〕プロパン二無水物、２，３，６，７−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、１，４，５，８−ナフタレンテトラカルボン酸二無水物、４，４’−（２，２−ヘキサフルオロイソプロピリデン）ジフタル酸二無水物等を挙げることができる。また、２，３，３’，４’−ジフェニルスルホンテトラカルボン酸等の芳香族テトラカルボン酸を用いることも好ましい。これらは単独でも、２種以上を組み合わせて用いることもできる。

これらの中でも、特に、ビフェニルテトラカルボン酸二無水物及びピロメリット酸二無水物からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族テトラカルボン酸二無水物が好ましい。ビフェニルテトラカルボン酸二無水物としては、３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物を好適に用いることができる。

上記ポリイミド多孔質膜の製造において使用され得るジアミンは、任意のジアミンを用いることができる。ジアミンの具体例として、以下のものを挙げることができる。
１）１，４−ジアミノベンゼン（パラフェニレンジアミン）、１，３−ジアミノベンゼン、２，４−ジアミノトルエン、２，６−ジアミノトルエンなどのベンゼン核１つのべンゼンジアミン；
２）４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ジメチル−４，４’−ジアミノビフェニル、２，２’−ビス（トリフルオロメチル）−４，４’−ジアミノビフェニル、３，３’−ジメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’−ジカルボキシ−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、３，３’，５，５’−テトラメチル−４，４’−ジアミノジフェニルメタン、ビス（４−アミノフェニル）スルフィド、４，４’−ジアミノベンズアニリド、３，３’−ジクロロベンジジン、３，３’−ジメチルベンジジン、２，２’−ジメチルベンジジン、３，３’−ジメトキシベンジジン、２，２’−ジメトキシベンジジン、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル、３，３’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、４，４’−ジアミノジフェニルスルフィド、３，３’−ジアミノジフェニルスルホン、３，４’−ジアミノジフェニルスルホン、４，４’−ジアミノジフェニルスルホン、３，３’−ジアミノベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジクロロベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジメトキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノジフェニルメタン、３，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）プロパン、２，２−ビス（３−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス（４−アミノフェニル）−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、３，３’−ジアミノジフェニルスルホキシド、３，４’−ジアミノジフェニルスルホキシド、４，４’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核２つのジアミン；
３）１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェノキシ）−４−トリフルオロメチルベンゼン、３，３’−ジアミノ−４−（４−フェニル）フェノキシベンゾフェノン、３，３’−ジアミノ−４，４’−ジ（４−フェニルフェノキシ）ベンゾフェノン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルフィド）ベンゼン、１，３−ビス（３−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニルスルホン）ベンゼン、１，３−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（３−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼン、１，４−ビス〔２−（４−アミノフェニル）イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核３つのジアミン；
４）３，３’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、３，３’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（３−アミノフェノキシ）ビフェニル、４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕エーテル、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕ケトン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルフィド、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕スルホン、ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕メタン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕プロパン、２，２−ビス〔３−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔３−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（３−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパン、２，２−ビス〔４−（４−アミノフェノキシ）フェニル〕−１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核４つのジアミン。

これらは単独でも、２種以上を混合して用いることもできる。用いるジアミンは、所望の特性などに応じて適宜選択することができる。

これらの中でも、芳香族ジアミン化合物が好ましく、３，３’−ジアミノジフェニルエーテル、３，４’−ジアミノジフェニルエーテル、４，４’−ジアミノジフェニルエーテル及びパラフェニレンジアミン、１，３−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェニル）ベンゼン、１，４−ビス（４−アミノフェニル）ベンゼン、１，３−ビス（４−アミノフェノキシ）ベンゼン、１，４−ビス（３−アミノフェノキシ）ベンゼンを好適に用いることができる。特に、ベンゼンジアミン、ジアミノジフェニルエーテル及びビス（アミノフェノキシ）フェニルからなる群から選ばれる少なくとも一種のジアミンが好ましい。

本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が２４０℃以上であるか、又は３００℃以上で明確な転移点がないテトラカルボン酸二無水物とジアミンとを組み合わせて得られるポリイミドから形成されていることが好ましい。

本発明で使用され得るポリイミド多孔質膜は、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、以下の芳香族ポリイミドからなるポリイミド多孔質膜であることが好ましい。
（ｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
（ｉｉ）テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び／又は、
（ｉｉｉ）ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス（アミノフェノキシ）フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。

本発明において用いられるポリイミド多孔質膜は、好ましくは、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であって、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は０．０１μｍ〜１５μｍであり、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は２０μｍ〜１００μｍであり、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記マクロボイド層の隔壁、並びに前記表面層Ａ及びＢの厚さは０．０１〜２０μｍであり、前記表面層Ａ及びＢにおける孔がマクロボイドに連通しており、総膜厚が５〜５００μｍであり、空孔率が４０％以上９５％未満である、ポリイミド多孔質膜である。ここで、マクロボイド層中の少なくとも１つの隔壁は、隣接するマクロボイド同士を連通する、平均孔径０．０１〜１００μｍの、好ましくは０．０１〜５０μｍの、１つ又は複数の孔を有する。

例えば、国際公開ＷＯ２０１０／０３８８７３、特開２０１１−２１９５８５、又は特開２０１１−２１９５８６に記載されているポリイミド多孔質膜も、本発明に使用可能である。

本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、ポリエーテルスルホンを含み、典型的には実質的にポリエーテルスルホンからなる。ポリエーテルスルホンは当業者に公知の方法で合成されたものであってよく、例えば、二価フェノール、アルカリ金属化合物及びジハロゲノジフェニル化合物を有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法、二価フェノールのアルカリ金属二塩を予め合成しジハロゲノジフェニル化合物と有機極性溶媒中で重縮合反応させる方法等によって製造できる。

アルカリ金属化合物としては、アルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属水酸化物、アルカリ金属水素化物、アルカリ金属アルコキシド等が挙げられる。特に、炭酸ナトリウム及び炭酸カリウムが好ましい。

二価フェノール化合物としては、ハイドロキノン、カテコール、レゾルシン、４，４’−ビフェノール、ビス（ヒドロキシフェニル）アルカン類（例えば２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）プロパン、及び２，２−ビス（ヒドロキシフェニル）メタン）、ジヒドロキシジフェニルスルホン類、ジヒドロキシジフェニルエーテル類、又はそれらのベンゼン環の水素の少なくとも１つが、メチル基、エチル基、プロピル基等の低級アルキル基、又はメトキシ基、エトキシ基等の低級アルコキシ基で置換されたものが挙げられる。二価フェノール化合物としては、上記の化合物を二種類以上混合して用いることができる。

ポリエーテルスルホンは市販品であってもよい。市販品の例としては、スミカエクセル７６００Ｐ、スミカエクセル５９００Ｐ（以上、住友化学(株)製）等が挙げられる。

ポリエーテルスルホンの対数粘度は、ＰＥＳ多孔質膜のマクロボイドを良好に形成する観点で、好ましくは０．５以上、より好ましくは０．５５以上であり、多孔質ポリエーテルスルホン膜の製造容易性の観点から、好ましくは１．０以下、より好ましくは０．９以下、更に好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．７５以下である。

また、ＰＥＳ多孔質膜、又はその原料としてのポリエーテルスルホンは、耐熱性、高温下での寸法安定性の観点から、ガラス転移温度が、２００℃以上であるか、又は明確なガラス転移温度が観察されないことが好ましい。

本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜の製造方法は特に限定されないが、例えば、
対数粘度０．５〜１．０のポリエーテルスルホンの０．３質量％〜６０質量％と有機極性溶媒４０質量％〜９９．７質量％とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、ＰＥＳ多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、若しくは２４０℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。

本発明で使用され得るＰＥＳ多孔質膜は、好ましくは、表面層Ａ、表面層Ｂ、及び前記表面層Ａと前記表面層Ｂとの間に挟まれたマクロボイド層、を有するＰＥＳ多孔質膜であって、
前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が１０μｍ〜５００μｍである複数のマクロボイドとを有し、
前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢはそれぞれ、厚さが０．１μｍ〜５０μｍであり、
前記表面層Ａ及びＢのうち、一方が平均孔径５μｍ超２００μｍ以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径０．０１μｍ以上２００μｍ未満の複数の細孔を有し、
表面層Ａ及び表面層Ｂの、一方の表面開口率が１５％以上であり、他方の表面層の表面開口率が１０％以上であり、
前記表面層Ａ及び前記表面層Ｂの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記ＰＥＳ多孔質膜は、総膜厚が５μｍ〜５００μｍであり、かつ空孔率が５０％〜９５％である、
ＰＥＳ多孔質膜である。

５．細胞培養と培養体積
ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を図１に示す。図１は理解を助けるための図であり、各要素は実寸ではない。本発明の方法では、ポリマー多孔質膜に幹細胞を適用し、培養することにより、ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の幹細胞が生育するため、大量の幹細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の幹細胞を培養することが可能となる。たとえば、ポリマー多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない状態であっても、大量の幹細胞を長期にわたって培養することができる。また、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を著しく減らすことも可能となる。

本明細書において、細胞を含まないポリマー多孔質膜がその内部間隙の体積も含めて空間中に占める体積を「見かけ上ポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図１参照）。そして、ポリマー多孔質膜に幹細胞を適用し、ポリマー多孔質膜の表面及び内部に幹細胞が担持された状態において、ポリマー多孔質膜、幹細胞、及びポリマー多孔質膜内部に浸潤した培地が全体として空間中に占める体積を「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積」と呼称する（図１参照）。膜厚２５μｍのポリマー多孔質膜の場合、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積は、見かけ上ポリマー多孔質膜体積より、最大で５０％程度大きな値となる。本発明の方法では、１つの細胞培養容器中に複数のポリマー多孔質膜を収容して培養することができるが、その場合、幹細胞を担持した複数のポリマー多孔質膜のそれぞれについての細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和を、単に「細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和」と記載することがある。

本発明の方法を用いることにより、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない条件でも、幹細胞を長期にわたって良好に培養することが可能となる。また、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０００倍又はそれより少ない条件でも、幹細胞を長期にわたって良好に培養することができる。さらに、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１００倍又はそれより少ない条件でも、幹細胞を長期にわたって良好に培養することができる。そして、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の１０倍又はそれより少ない条件でも、幹細胞を長期にわたって良好に培養することができる。

つまり、本発明によれば、細胞培養する空間（容器）を従来の二次元培養を行う細胞培養装置に比べて極限まで小型化可能となる。また、培養する幹細胞の数を増やしたい場合は、積層するポリマー多孔質膜の枚数を増やす等の簡便な操作により、柔軟に細胞培養する体積を増やすことが可能となる。本発明に用いられるポリマー多孔質膜を備えた細胞培養装置であれば、幹細胞を培養する空間（容器）と細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）とを分離することが可能となり、培養する細胞数に応じて、必要となる量の細胞培養培地を準備することが可能となる。細胞培養培地を貯蔵する空間（容器）は、目的に応じて大型化又は小型化してもよく、あるいは取り替え可能な容器であってもよく、特に限定されない。

本発明の方法において、たとえば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる幹細胞の数が、幹細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして、培地１ミリリットルあたり１．０×１０⁵個以上、１．０×１０⁶個以上、２．０×１０⁶個以上、５．０×１０⁶個以上、１．０×１０⁷個以上、２．０×１０⁷個以上、５．０×１０⁷個以上、１．０×１０⁸個以上、２．０×１０⁸個以上、５．０×１０⁸個以上、１．０×１０⁹個以上、２．０×１０⁹個以上、または５．０×１０⁹個以上となるまで培養することをいう。

なお、培養中または培養後の細胞数を計測する方法としては、種々の公知の方法を用いることができる。たとえば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後に細胞培養容器中に含まれる幹細胞の数を、幹細胞がすべて細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地に均一に分散しているものとして計測する方法としては、公知の方法を適宜用いることができる。たとえば、ＣＣＫ８を用いた細胞数計測法を好適に用いることができる。具体的には、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｉｇ Ｋｉｔ８；同仁化学研究所製溶液試薬（以下、「ＣＣＫ８」と記載する。）を用いて、ポリマー多孔質膜を用いない通常の培養における細胞数を計測し、吸光度と実際の細胞数との相関係数を求める。その後、幹細胞を適用し、培養したポリマー多孔質膜を、ＣＣＫ８を含む培地に移し、１〜３時間インキュベータ内で保存し、上清を抜き出して４８０ｎｍの波長にて吸光度を測定して、先に求めた相関係数から細胞数を計算する。

また、別の観点からは、細胞の大量培養とは、たとえば、ポリマー多孔質膜を用いた培養後にポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数が１．０×１０⁵個以上、２．０×１０⁵個以上、１．０×１０⁶個以上、２．０×１０⁶個以上、５．０×１０⁶個以上、１．０×１０⁷個以上、２．０×１０⁷個以上、５．０×１０⁷個以上、１．０×１０⁸個以上、２．０×１０⁸個以上、または５．０×１０⁸個以上となるまで培養することをいう。ポリマー多孔質膜１平方センチメートルあたりに含まれる細胞数は、セルカウンター等の公知の方法を用いて適宜計測することが可能である。

６．幹細胞の培養システム及び培養条件
本発明の方法において、幹細胞の培養システム及び培養条件は、幹細胞の種類等に応じて適宜決定することができる。種々の幹細胞に適した培養方法が公知であり、当業者は任意の公知の方法を用いてポリマー多孔質膜に適用した幹細胞を培養することができる。細胞培養培地も幹細胞の種類に応じて適宜調製することができる。

細胞培養培地は、例えば、ロンザ社の細胞培養培地カタログに記載されている。本発明の方法に用いることの細胞培養培地は、液体培地、半固形培地、固形培地等のいずれの形態であってもよい。また、液滴状とした液体培地を細胞培養容器中に噴霧することにより、細胞を担持したポリマー多孔質膜に培地が接触するようにしてもよい。

ポリマー多孔質膜を用いる細胞の培養に関して、マイクロキャリアやセルローススポンジ等、他の浮遊型培養担体と共存させることもできる。

本発明の方法において、培養に用いるシステムの形状、規模などは特に限定されず、細胞培養用のシャーレ、フラスコ、プラスチックバッグ、試験管から大型のタンクまで適宜利用可能である。例えば、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ社製のセルカルチャーディッシュやサーモサイエンティフィック社製のＮｕｎｃ セルファクトリー等が含まれる。なお、本発明においてポリマー多孔質膜を用いることにより、生来浮遊培養が可能でなかった細胞についても浮遊培養向け装置にて、浮遊培養類似状態での培養を行うことが可能になった。浮遊培養用の装置としては、例えば、コーニング社製のスピナーフラスコや回転培養等が使用可能である。また、同様の機能を実現出来る環境として、ＶＥＲＩＴＡＳ社のＦｉｂｅｒＣｅｌｌ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍの様な中空糸培養システムも使用することが可能である。

本発明の方法における培養は、ポリマー多孔質膜上に連続的に培地を添加し回収するような連続循環もしくは開放型の装置を用いて、空気中にポリマー多孔質膜シートを露出させるような型式で実行することも可能である。

本発明において、細胞の培養は、細胞培養容器外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系で行ってもよい。その際、細胞培養培地が細胞培養培地供給手段と細胞培養容器との間を循環する系であることができる。

細胞の培養を、細胞培養容器外に設置された細胞培養培地供給手段から連続的又は間歇的に細胞培養培地が細胞培養容器中に供給される系で行う場合、その系は、細胞培養容器である培養ユニットと細胞培養培地供給手段である培地供給ユニットとを含む細胞培養装置であってよく、ここで
培養ユニットは細胞を担持するための１又は複数のポリマー多孔質膜を収容する培養ユニットであって、培地供給口および培地排出口を備えた培養ユニットであり、
培地供給ユニットは培地収納容器と、培地供給ラインと、培地供給ラインを介して連続的又は間歇的に培地を送液する送液ポンプとを備え、ここで培地供給ラインの第一の端部は培地収納容器内の培地に接触し、培地供給ラインの第二の端部は培養ユニットの培地供給口を介して培養ユニット内に連通している、培地供給ユニットである
細胞培養装置であってよい。

また、上記細胞培養装置において、培養ユニットは空気供給口、空気排出口、及び酸素交換膜を備えない培養ユニットであってよく、また、空気供給口及び空気排出口、又は酸素交換膜を備えた培養ユニットであってよい。培養ユニットは空気供給口及び空気排出口、並びに酸素交換膜を備えないものであっても、細胞の培養に必要な酸素等が培地を通じて十分に細胞に供給される。さらに、上記細胞培養装置において、培養ユニットが培地排出ラインをさらに備え、ここで培地排出ラインの第一の端部は培地収納容器に接続し、培地排出ラインの第二の端部は培養ユニットの培地排出口を介して培養ユニット内に連通し、培地が培地供給ユニットと培養ユニットとを循環可能であってよい。

上記細胞の培養システムの一例である細胞培養装置の例を図２に示すが、本発明の目的のために用いることができる細胞の培養システムはこれに限定されるものではない。

７．本発明の分化誘導方法について
本発明の分化誘導方法において、ポリマー多孔質膜上で増殖した幹細胞は、分化誘導条件下で培養することで分化誘導がなされる。幹細胞の分化誘導に関する具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程を含め、膜状の担体に生育する幹細胞を分化誘導培地等の分化誘導環境に接触させるのに適した任意の手法を採用することが可能である。

限定されるわけではないが、多能性幹細胞から、組織幹細胞への分化は、例えば、神経成長因子（ＮＧＦ）やレチノイン酸等の因子を用いることが可能である。培地は、１０％ＦＢＳ共存αＭＥＭ培地等を用いることが可能である。

限定されるわけではないが、組織幹細胞から、各組織の細胞への分化は、塩基性線維芽細胞増殖因子やフォルスコリンあるいはニューレグリン等の因子を用いることが可能である。限定されるわけではないが、培地は、一般的なＭＥＭ培地等を用いることが可能である。

以下、本発明を実施例に基づいて、より具体的に説明する。なお本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

以下の実施例で使用されたポリイミド多孔質膜は、テトラカルボン酸成分である３，３’，４，４’−ビフェニルテトラカルボン酸二無水物（ｓ−ＢＰＤＡ）とジアミン成分である４，４’−ジアミノジフェニルエーテル（ＯＤＡ）とから得られるポリアミック酸溶液と、着色前駆体であるポリアクリルアミドとを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより、調製された。得られたポリイミド多孔質膜は、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、当該表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリイミド多孔質膜であり、表面層Ａに存在する孔の平均孔径は６μｍであり、表面層Ｂに存在する孔の平均孔径は４６μｍであり、膜厚が２５μｍであり、空孔率が７３％であった。

実施例１
ポリイミド多孔質膜上で培養されたヒト間葉系幹細胞の遺伝子解析
１．サンプルの調製
２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社、cat. 103)に幹細胞培養培地（LONZA社製、PT-3001）０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして浸漬させた。１枚のポリイミド多孔質膜あたり４×１０⁴個のヒト間葉系幹細胞を播種し、週２回培地を交換しながらＣＯ₂インキュベータ内で培養を継続的に行った。当該シャーレ中で３日間培養した細胞、７０日間培養した細胞及び１８２日間培養した細胞をそれぞれ遺伝子解析用サンプルとして使用した。ポリイミド多孔質膜を使用した上記培養を以下で「部材培養」と呼び、得られた細胞サンプルを「部材培養細胞サンプル」と呼ぶ。

また、ポリイミド多孔質膜を使用しないこと以外は同様の条件で、ＰＬＬコートシャーレ（住友ベークライト製、口内径１０ｃｍ）にて間葉系幹細胞を培養した。３日間培養した細胞、７０日間培養した細胞、１１８日間培養した細胞をそれぞれ遺伝子解析用サンプルとして使用した。ポリイミド多孔質膜を使用しなかった上記培養を以下で「通常培養」と呼び、得られた細胞サンプルを「通常培養細胞サンプル」と呼ぶ。

２．遺伝子解析
得られたサンプルに関し、以下の手順で遺伝子解析を行なった。
（１） RNA抽出
RNeasy Plus micro Kit（Qiagen）を用いて付属のプロトコール通りにRNAの抽出を行った。RNAは30μLのNuclease Free Waterで抽出し、その後、TURBO DNA free Kit（Life Technologies）を用いてDNaseによるゲノムDNAの分解処理を行った。分解処理後、RNA 溶液の濃度をNano Drop 2000（Thermo Fishier Scientific）で測定した。

（２） cDNA合成
濃度測定後のRNA 溶液を12.5ng/μLに調製し、100ngをテンプレートとしてcDNA合成を行った。合成にはSuperScript（商標） III First-Strand Synthesis System for RT-PCR（Life Technologies）を使用した。cDNA 溶液の濃度をNano Drop 2000で測定した。

（３）q-PCR 反応
cDNA 溶液を200ng/μLに調製し、200ngをテンプレートとしてとしてリアルタイムPCRによる測定を行った。PCRはCFX connect(Bio-Rad)で行い、試薬はSsoAdvanced（商標） Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad）を使用した。間葉系幹細胞陽性マーカー（CD166、CD44、CD105、CD146、CD90、CD106、CD29、CD71）、間葉系幹細胞陰性マーカー（CD19、CD45、CD31、CD18、CD56、CD34、CD14、CD80、CD40、CD86）について、発現量を測定し、内部標準遺伝子としてはbeta-Actinを使用した。

（４）測定データ解析
測定で求められた各遺伝子のCt値を、内部標準遺伝子として測定したbeta-ActinのCt値で引いた値から、相対発現量を算出して比較した。また、通常培養細胞サンプルと部材培養細胞サンプルで遺伝子発現の経時変化を比較するために、３日間培養した細胞サンプルの発現量を１とした場合の変化をそれぞれ算出して比較した。結果を図３に示す。

（５）結果
間葉系幹細胞の陽性マーカー遺伝子については部材培養の方が通常培養よりも発現量が高い傾向を示した。測定した８つの陽性マーカー中５つのマーカーに関して、通常培養では、発現量が経時的に消失した。これは、培養日数の経過と共に間葉系幹細胞の性質が失われたことを示している。一方、ポリイミド多孔質膜を用いる部材培養では、全てのマーカーが１８２日間の長期培養において維持されたことから、間葉系幹細胞の性質は保持された。逆に間葉系幹細胞の陰性マーカー遺伝子は通常培養の方が部材培養よりも発現量が高い傾向を示した。これらのことから、部材培養により、間葉系幹細胞の分化が抑制されることが示された。

実施例２
ポリイミド多孔質膜上で培養したヒト間葉系幹細胞の分化誘導
２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社, cat. 103）に幹細胞培養培地（LONZA社製、PT-3001）０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして浸漬させた。１枚のポリイミド多孔質膜あたり４×１０⁴個のヒト間葉系幹細胞を播種し、週２回培地を交換しながらＣＯ₂インキュベータ内で培養を継続的に行った。培養開始後、６日、７０日、１１８日、１８２日目に分化誘導培地（PromoCell社製）に培地を切り替えた。

分化誘導培地に切り替えた時点では全く見出されなかった脂肪球が、分化誘導開始後１０日目頃から見え始め、１４日時点では多くの脂肪球が観察された。観察された脂肪球は、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色及びＢＯＤＩＰＹにて染色し、脂肪細胞への分化誘導を確認した。図４に、６日培養後１３日間分化誘導し、Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色した細胞の顕微鏡写真を示す。図５に、１８２日間培養後１５日間分化誘導し、ＢＯＤＩＰＹ染色した細胞の顕微鏡写真を示す。

実施例３
ポリイミド多孔質膜上でのヒト間葉系幹細胞の培養
２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific 社 cat. 103）に細胞培養培地０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして浸漬させた。１枚のポリイミド多孔質膜あたり４×１０⁴個の間葉系幹細胞を播種し、週２回培地（GIBCO製；DMEM+FBS10%）を交換しながらＣＯ₂インキュベータ内で培養を継続的に行った。当該培養を以下で「部材培養」と呼び、得られたサンプルを「部材培養細胞サンプル」と呼ぶ。部材培養開始後７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目及び４２日目にＣＣＫ８を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。

比較対象として、コラーゲンタイプＩコートディッシュ（口内径１０ｃｍ^２）中で、部材培養で用いたものと同一ロットの間葉系幹細胞の培養を行い、ＣＣＫ８を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。ポリイミド多孔質膜を使用しなかった上記培養を以下で「通常培養」と呼び、得られた細胞サンプルを「通常培養細胞サンプル」と呼ぶ。部材培養及び通常培養に使用された培地及び初期細胞播種数を以下の表に示す。また、部材培養及び通常培養した際のヒト間葉系幹細胞数の経時変化を図６に示す。部材培養した場合、安定したヒト間葉系幹細胞の増殖及び生育が観察された。

実施例４
ポリイミド多孔質膜上でのヒト間葉系幹細胞の培養
２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社、cat. 103）に細胞培養培地（GIBCO製；DMEM+FBS10%）０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして浸漬させた。１枚のポリイミド多孔質膜あたり４×１０⁴個の間葉系幹細胞を播種し、週２回培地を交換しながらＣＯ₂インキュベータ内で培養を継続的に行った。培養開始後、７日目、１４日目、２１日目、３５日目、４９日目、６３日目、７７日目、９２日目、１２１日目、１４３日目にＣＣＫ８を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図７に示す。部材培養した場合、長期間に亘る、安定したヒト間葉系幹細胞の増殖及び生育が観察された。

培養開始後１２５日目に、細胞が生着したポリイミド多孔質膜を間葉系幹細胞脂肪細胞分化培地２（PromoCell社製、C-28016）を加えた容器に移し、更に培養を１０日間継続した。その間、週２回誘導培地を交換した。その後、ポリイミド多孔質膜をホルマリン固定し、脂肪細胞に誘導されて生じた細胞内油滴をＢＯＤＩＰＹで染色した。誘導期間が短かったにも関わらず効率的に脂肪細胞への誘導が起こり、蛍光緑色に染まった油滴がポリイミド多孔質膜全体に散見された。顕微鏡画像を図８に示す。長期間培養された後であっても間葉系幹細胞の分化誘導能が維持されたことから、本発明の方法によって幹細胞の分化を抑制できることが実証された。なお、誘導培地での培養を実施しなかった部材培養細胞サンプルでは、ＢＯＤＩＰＹで染色される油滴は観察されなかった。

実施例５
ポリイミド多孔質膜上でのヒト間葉系幹細胞の培養及び顕微鏡観察
２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社、cat. 103）に細胞培養培地（GIBCO製；DMEM+FBS10%）０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして浸漬させた。１枚のポリイミド多孔質膜あたり４×１０^４個の間葉系幹細胞を播種し、週２回培地を交換しながらＣＯ_２インキュベータ内で培養を継続的に行った。培養開始後、７日目、１４日目、２８日目，４２日目、５６日目、７０日目、８５日目、１１４日目、１３６日目、１４３日目にＣＣＫ８を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図９に示す。部材培養した場合、長期間に亘る、安定したヒト間葉系幹細胞の増殖及び生育が観察された。

培養開始後１５日目、３０日目及び１５０日目に、細胞が生着したポリイミド多孔質膜を固定し、Click-iT (商標) EdU Alexa Fluor(商標) 488イメージング試薬（サーモフィッシャー社製）、CellMask Orange Plasma Membrane Stain及びDAPIを用いて染色し、蛍光顕微鏡画像を取得して、細胞のＤＮＡ合成能力について評価した。蛍光顕微鏡画像を図１０に示す。長期培養した後であっても、ＤＮＡ合成を行うＥｄｕ陽性の細胞が一定の割合で存在することが明らかとなった。

培養開始後１４６日目に細胞が生着したポリイミド多孔質膜をホルマリン固定し、電子顕微鏡観察を行った。具体的には、２.５％グルタールアルデヒド、２％ホルムアルデヒド混合固定液でポリイミド多孔質膜を固定後、四酸化オスミウム後固定を行い、逐次的エタノール置換法で脱水後に、液体窒素温度にて凍結割断を行った。ｔ−ブチルアルコールを用いた凍結真空乾燥後、オスミウムプラズマ蒸着により帯電防止処理を行い、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察を実施した。観察には電界放出型ＳＥＭを用い、加速電圧５ｋＶ、高真空下で二次電子像とし、観察を行った。結果を図１１に示す。細胞の整列、細胞の積層構造の形成など、多くの興味深い部材培養挙動が観察された。

培養開始後１５０日目に細胞が生着したポリイミド多孔質膜をホルマリン固定し、蛍光顕微鏡観察を行った。具体的には、ポリイミド多孔質膜をホルマリン固定後、Alexa Fluor（登録商標）488ファロイジン、CellMask Orange Plasma Membrane Stain、及びDAPIで染色し、共焦点レーザー顕微鏡により蛍光顕微鏡画像を取得した。結果を図１２に示す。Ａ面表層とＡ面近傍（内部）層の２つの異なる領域を独立して測定し、細胞の集合状況を検証した。Ａ面表層では、ＳＥＭ観察の結果と同様に、一方向への細胞の強い配向性が見られる一方で、Ａ面近傍（内部）層においては、配向性が消失し、膜のメッシュ面に強く接着する細胞の形態が観察された。

実施例６
ポリイミド多孔質膜上でのヒト間葉系幹細胞の長期培養、及び培養細胞の分化誘導
２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社、cat. 103）に細胞培養培地（LONZA製；間葉系幹細胞用培地MSCBM）０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして浸漬させた。１枚のポリイミド多孔質膜あたり４×１０^４個の間葉系幹細胞を播種し、週２回培地を交換しながらＣＯ_２インキュベータ内で培養を１４日間行った。その後、ＭＳＣＢＭ培地４ｍｌを加えた２０ｃｍ^２ディッシュ中に、細胞の生着した当該ポリイミド多孔質膜を１０枚移送し、培養を行った。３１０日間の培養後、細胞培養培地を含む２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器にポリイミド多孔質膜を移送し、培養を継続した。ＣＣＫ８を用いて細胞数を計測し、細胞生育挙動を観察した。結果を図１３に示す。正方形容器に移送後、安定したヒト間葉系幹細胞の増殖及び生育が観察された。

培養開始後４６３日目に細胞が生着したポリイミド多孔質膜を、間葉系幹細胞脂肪細胞分化培地２（PromoCell社製、C-28016）を加えた容器に移し、更に培養を２６日間継続した。その間、週２回誘導培地を交換した。その後、ポリイミド多孔質膜をホルマリン固定し、脂肪細胞に誘導されて生じた細胞内油滴をＢＯＤＩＰＹで染色した。レーザー共焦点顕微鏡による顕微鏡画像を図１４に示す。効率的に脂肪細胞への誘導が起こり、蛍光緑色に染まった油滴がポリイミド多孔質膜全体に散見された。

また、培養開始後４９０日目に細胞が生着したポリイミド多孔質膜を、骨芽細胞分化誘導培地（PromoCell社製、C-28013）を加えた容器に移し、更に培養を２６日間継続した。その後、骨芽細胞石灰化培地（PromoCell社製、C-28020）を加えた容器にポリイミド多孔質膜を移し、１４日間石灰化誘導を実施した。その後、コスモバイオ製石灰化染色キットにて染色し、石灰化部分の顕著な赤変を顕微鏡にて観察した。光学顕微鏡画像を図１５に示す。

間葉系幹細胞から脂肪細胞又は骨芽細胞への誘導の結果から、長期間培養した後であっても、間葉系幹細胞が分化誘導能を維持していることが確認された。

実施例７
ポリイミド多孔質膜上で長期間培養された間葉系幹細胞の遺伝子解析
２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific社、cat. 103）に細胞培養培地（LONZA製；間葉系幹細胞用培地MSCBM）０．５ｍｌを加え、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして浸漬させた。１枚のポリイミド多孔質膜あたり４×１０^４個の間葉系幹細胞を播種し、週２回培地を交換しながらＣＯ_２インキュベータ内で培養を１４日間行った。その後、ＭＳＣＢＭ培地４ｍｌを加えた２０ｃｍ^２ディッシュ中に、細胞の生着した当該ポリイミド多孔質膜を１０枚移送し、培養を行った。培養開始後２４９日目の部材培養細胞サンプルを、実施例１と同様の方法で遺伝子解析した。また、実施例４における培養開始後３２日目の部材培養細胞サンプル、実施例５における培養開始後１４６日目の部材培養細胞サンプル、実施例６における培養開始後４９６日目の部材培養細胞サンプルを、実施例１と同様の方法で遺伝子解析した。陽性マーカーに関する結果を図１６Ａ及びＢに示す。比較のため、ポリイミド多孔質膜を用いずに７日間通常培養した細胞サンプルにおける各遺伝子の発現量を１とした。なお、陰性マーカーの発現量は全て低値であることを確認した。長期培養後においても、本発明の方法を用いることで、間葉系幹細胞の特性が維持されることが確認された。

実施例８
ポリイミド多孔質膜上で培養されたヒトＩＩ型肺胞上皮細胞の遺伝子解析
１．サンプルの調製
２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific 社、cat. 103）に、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして静置させた。２０週胎児由来ＩＩ型肺胞上皮細胞を、凍結液から溶解し、肺胞上皮細胞用培地（ScienCell Research Laboratories社製、製品コード３２０１）に懸濁して、１枚のポリイミド多孔質膜あたり１×１０⁵個の細胞を、乾いたポリイミド多孔質膜の上に懸濁細胞の液滴として載せ、液部の通過を待った（吸込み播種法）。液部通過後培地１ｍｌを注加した後、ＣＯ₂インキュベータ内で培養を継続的に行った。週２回培地（１ｍｌ）交換を行った。培養開始後、ＣＣＫ８を用いた細胞数評価を定期的に行い、細胞の生育状況を確認した。細胞数の変化を図１７に示す。４日間培養した細胞及び３２日間培養した細胞をそれぞれ遺伝子解析用サンプルとして使用した。ポリイミド多孔質膜を使用した上記培養を以下で「部材培養」と呼び、得られた細胞サンプルを「部材培養細胞サンプル」と呼ぶ。

また、ポリイミド多孔質膜を使用しないこと以外は同様の条件で、ＩＩ型肺胞上皮細胞を培養した。４日間培養した細胞を遺伝子解析用サンプルとして使用した。ポリイミド多孔質膜を使用しなかった上記培養を以下で「通常培養」と呼び、得られたサンプルを「通常培養細胞サンプル」と呼ぶ。

２．遺伝子解析
得られたサンプルに関し、実施例１と同様の手順で遺伝子解析を行った。ＩＩ型肺胞上皮細胞陽性マーカー（Ｐｒｏ ＳＰ−Ｃ、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｄ、ＫＬ−６）、Ｉ型肺胞上皮細胞陽性マーカー（ポドプラニン（Podoplanin）、アクアポリン（Aquaporin）−５）について、発現量を測定した。結果を図１８に示す。

３．結果
ＩＩ型肺胞上皮細胞の陽性マーカー遺伝子については、部材培養の方が通常培養よりも発現量が高い傾向を示した。これは、ＩＩ型肺胞上皮細胞のＩ型肺胞上皮細胞への分化が部材培養によって抑制されたことを示唆している。また、培養の細胞数上昇と共に肺胞上皮II型細胞が増加し、それが維持されることが示唆された。これらを検証するため、Ｐｒｏ ＳＰ−Ｃとポドプラニンを免疫染色にて評価した（Ｄａｙ２２）ところ、同様の結果を確認した（図１９）。

実施例９
ポリイミド多孔質膜上でのヒトＩＩ型肺胞上皮細胞の長期培養
実施例８の細胞培養を約１年間継続した。結果を図２０に示す。長期間に亘る、安定したＩＩ型肺胞上皮細胞の増殖及び生育が観察された。

実施例１０
ポリイミド多孔質膜上で長期培養されたヒトＩＩ型肺胞上皮細胞の遺伝子解析
１．サンプルの調製
２ｃｍ×２ｃｍの滅菌された正方形容器（Thermo Fisher Scientific 社 cat. 103）に、滅菌した１．４ｃｍ角の正方形のポリイミド多孔質膜をメッシュ構造のＡ面を上にして静置させた。２０週胎児由来ヒトＩＩ型肺胞上皮細胞を凍結液から溶解し、培地懸濁液を調製した。以下の３種類の方法で細胞をポリイミド多孔質膜に播種した。

播種法１：１枚のポリイミド多孔質膜あたり２×１０^４個の細胞を、予め培地で湿潤させたポリイミド多孔質膜の上に懸濁液として加えた（自然播種法）。
播種法２：１：１枚のポリイミド多孔質膜あたり４×１０^４個の細胞を、予め培地で湿潤させたポリイミド多孔質膜の上に懸濁液として加えた（自然播種法）。
播種法３：１枚のポリイミド多孔質膜あたり１×１０⁵個の細胞を、乾いたポリイミド多孔質膜の上に懸濁細胞の液滴として載せ、液部の通過を待った（吸込み播種法）。

上記の方法で細胞播種した後、週２回培地交換をしながらＣＯ₂インキュベータ内で培養を継続的に行った。ＣＣＫ８を用いた細胞数評価を定期的に行い、細胞の生育状況を確認した。細胞数の変化を図２１に示す。

２．遺伝子解析
上記播種法３で細胞播種を行い、２１５日間培養した部材培養細胞サンプルを遺伝子解析した。なおコントロールサンプルとして、実施例９の通常培養細胞サンプルを使用した。結果を図２２に示す。ＩＩ型肺胞上皮細胞の陽性マーカー遺伝子については、部材培養の方が通常培養よりも発現量が高い傾向を示した。これは、ＩＩ型肺胞上皮細胞のＩ型肺胞上皮細胞への分化が部材培養によって抑制されたことを示唆している。

本発明の方法は、幹細胞の分化を抑制し、当該細胞を大量に供給するために利用することができる。

Claims (17)

1. 幹細胞の分化を抑制する方法であって、
   （１）前記幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
   （２）前記幹細胞を培養し、増殖させる工程
   を含み、
   ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法。
2. 前記細胞がＥＳ細胞、ＥＣ細胞、ＥＧ細胞、核移植ＥＳ細胞、ｎｔＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、骨髄幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、精原細胞、ＩＩ型肺胞上皮細胞、脂肪幹細胞、歯髄幹細胞、脱分化脂肪細胞又はMUSE細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 前記工程（２）が少なくとも３０日間実施される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記工程（２）において、細胞を、ポリマー多孔質膜１平方センチメートル当たりに１．０ｘ１０⁵個以上となるまで増殖させる、請求項１〜３のいずれか1項に記載の方法。
5. ２以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記ポリイミド多孔質膜を
   ｉ）折り畳んで、
   ｉｉ)ロール状に巻き込んで、
   ｉｉｉ)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
   ｉｖ）縄状に結んで
   細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 工程（２）において、ポリイミド多孔質膜の一部分又は全体が、細胞培養培地の液相と接触していない、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 工程（２）において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリイミド多孔質膜体積の総和の１００００倍又はそれより少ない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記表面層Ａの平均孔径が、０．０１〜５０μｍである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記表面層Ｂの平均孔径が、２０〜１００μｍである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記ポリマー多孔質膜の膜厚が、５〜５００μｍである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項１２に記載の方法。
14. ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、２５０℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項１２又は１３に記載の方法。
15. 前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
16. 幹細胞を調製する方法であって、
    （１）前記幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
    （２）前記幹細胞を培養し、増殖させる工程
    を含み、
    ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
    前記工程（２）において前記幹細胞の分化は抑制される、前記方法。
17. 幹細胞を分化誘導する方法であって、
    （１）前記幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
    （２）前記幹細胞を培養し、増殖させる工程、及び
    （３）培養した前記幹細胞を分化誘導条件下で培養する工程
    を含み、
    ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層Ａ及び表面層Ｂと、前記表面層Ａ及び表面層Ｂの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Ａに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Ｂに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層Ａ及びＢに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層Ａ及びＢに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層Ａ及びＢにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
    前記工程（２）において前記幹細胞の分化は抑制される、前記方法。