JP6884350B2 - 神経幹細胞の分化を抑制する方法、神経幹細胞を調製する方法、及び神経幹細胞を分化誘導する方法 - Google Patents
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Description
神経幹細胞は、自己複製能と、ニューロン及びグリア細胞への分化能を有するため、神経再生医療の分野で注目されている。しかし、分化能を維持したまま神経幹細胞を長期培養することは困難であることが知られている。例えば、成体海馬由来の野生型の神経幹細胞は、継代に伴い自己複製能及び多分化能を著しく低下させることが報告されている(非特許文献1)。
ポリイミド多孔質膜は、本出願前よりフィルター、低誘電率フィルム、燃料電池用電解質膜など、特に電池関係を中心とする用途のために利用されてきた。特許文献2〜4は、特に、気体などの物質透過性に優れ、空孔率の高い、両表面の平滑性が優れ、相対的に強度が高く、高空孔率にもかかわらず、膜厚み方向への圧縮応力に対する耐力に優れるマクロボイドを多数有するポリイミド多孔質膜を記載している。これらはいずれも、アミック酸を経由して作成されたポリイミド多孔質膜である。
[1]
神経幹細胞の分化を抑制する方法であって、
(1)神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
(2)神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法。
[2]
神経幹細胞が野生型細胞である、[1]に記載の方法。
[3]
前記工程(2)が少なくとも70日間実施される、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]
前記工程(2)において、神経幹細胞を、ポリマー多孔質膜1平方センチメートル当たりに1.0×105個以上となるまで増殖させる、[1]〜[3]のいずれか1つに記載の方法。
[5]
2以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、[1]〜[4]のいずれか1つに記載の方法。
[6]
前記ポリマー多孔質膜を
i)折り畳んで、
ii)ロール状に巻き込んで、
iii)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
iv)縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、[1]〜[5]のいずれか1つに記載の方法。
[7]
工程(2)において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の10000倍又はそれより少ない、[1]〜[6]のいずれか1つに記載の方法。
[8]
前記表面層Aの平均孔径が、5μm〜50μmである、[1]〜[7]のいずれか1つに記載の方法。
[9]
前記表面層Bの平均孔径が、20〜100μmである、[1]〜[8]のいずれか1つに記載の方法。
[10]
前記ポリマー多孔質膜の膜厚が、5〜500μmである、[1]〜[9]のいずれか1つに記載の方法。
[11]
前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、[1]〜[10]のいずれか1つに記載の方法。
[12]
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、[11]に記載の方法。
[13]
ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、250℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、[11]又は[12]に記載の方法。
[14]
前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、[1]〜[10]のいずれか1つに記載の方法。
[15]
神経幹細胞を調製する方法であって、
(1)神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
(2)神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程(2)において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法。
[16]
前記工程(2)で得られる神経幹細胞を回収する工程をさらに含む、[15]に記載の方法。
[17]
神経幹細胞を分化誘導する方法であって、
(1)神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
(2)神経幹細胞を培養し、増殖させる工程、
(3)工程(2)で得られる神経幹細胞を分化誘導条件下で培養する工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程(2)において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法。
(1)神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
(2)神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法に関する。以下で「本発明の分化抑制方法」とも呼ぶ。
(1)神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
(2)神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程(2)において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法に関する。以下で「本発明の調製方法」とも呼ぶ。
(1)神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
(2)神経幹細胞を培養し、増殖させる工程、
(3)工程(2)で得られる神経幹細胞を分化誘導条件下で培養する工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程(2)において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法に関する。以下で「本発明の分化誘導方法」とも呼ぶ。
本明細書において「神経幹細胞」とは、自己複製能と、ニューロン及びグリア細胞への分化能を有する細胞のことである。
限定されるわけではないが、本発明の方法において、神経幹細胞のポリマー多孔質膜への適用は、例えば、以下のような態様を含む。
(B)前記ポリマー多孔質膜の乾燥した表面に神経幹細胞懸濁液を載せ、
放置するか、あるいは前記ポリマー多孔質膜を移動して液の流出を促進するか、あるいは表面の一部を刺激して、神経幹細胞懸濁液を前記膜に吸い込ませ、そして、
神経幹細胞懸濁液中の神経幹細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様;並びに、
(C)前記ポリマー多孔質膜の片面又は両面を、細胞培養液又は滅菌された液体で湿潤し、
前記湿潤したポリマー多孔質膜に神経幹細胞懸濁液を装填し、そして、
神経幹細胞懸濁液中の神経幹細胞を前記膜内に留め、水分は流出させる、
工程を含む、態様。
本発明で使用される神経幹細胞の培養は、細胞をポリマー多孔質膜に接着させる接着培養で行われても良いし、細胞を培養培地中に浮遊させる浮遊培養で行われても良い。大量培養が可能であるという観点から、浮遊培養が好ましい。
本発明で使用されるポリマー多孔質膜中の表面層A(以下で、「A面」又は「メッシュ面」とも呼ぶ)に存在する孔の平均孔径は、特に限定されないが、例えば、その下限は、0.01μm以上、0.1μm以上、1μm以上、2μm以上、3μm以上、4μm以上、5μm以上、6μm以上、7μm以上、8μm以上、9μm以上又は10μm以上であり、その上限は、200μm未満、150μm以下、100μm以下、50μm以下、40μm以下、30μm以下、20μm以下又は15μm以下である。表面層Aに存在する孔の平均孔径は、好ましくは0.01μm〜50μmであり、より好ましくは1μm〜50μmであり、特に好ましくは5μm〜50μmである。
1)1,4−ジアミノベンゼン(パラフェニレンジアミン)、1,3−ジアミノベンゼン、2,4−ジアミノトルエン、2,6−ジアミノトルエンなどのベンゼン核1つのべンゼンジアミン;
2)4,4’−ジアミノジフェニルエーテル、3,4’−ジアミノジフェニルエーテルなどのジアミノジフェニルエーテル、4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’−ジメチル−4,4’−ジアミノビフェニル、2,2’−ジメチル−4,4’−ジアミノビフェニル、2,2’−ビス(トリフルオロメチル)−4,4’−ジアミノビフェニル、3,3’−ジメチル−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’−ジカルボキシ−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、3,3’,5,5’−テトラメチル−4,4’−ジアミノジフェニルメタン、ビス(4−アミノフェニル)スルフィド、4,4’−ジアミノベンズアニリド、3,3’−ジクロロベンジジン、3,3’−ジメチルベンジジン、2,2’−ジメチルベンジジン、3,3’−ジメトキシベンジジン、2,2’−ジメトキシベンジジン、3,3’−ジアミノジフェニルエーテル、3,4’−ジアミノジフェニルエーテル、4,4’−ジアミノジフェニルエーテル、3,3’−ジアミノジフェニルスルフィド、3,4’−ジアミノジフェニルスルフィド、4,4’−ジアミノジフェニルスルフィド、3,3’−ジアミノジフェニルスルホン、3,4’−ジアミノジフェニルスルホン、4,4’−ジアミノジフェニルスルホン、3,3’−ジアミノベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジクロロベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジメトキシベンゾフェノン、3,3’−ジアミノジフェニルメタン、3,4’−ジアミノジフェニルメタン、4,4’−ジアミノジフェニルメタン、2,2−ビス(3−アミノフェニル)プロパン、2,2−ビス(4−アミノフェニル)プロパン、2,2−ビス(3−アミノフェニル)−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス(4−アミノフェニル)−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、3,3’−ジアミノジフェニルスルホキシド、3,4’−ジアミノジフェニルスルホキシド、4,4’−ジアミノジフェニルスルホキシドなどのベンゼン核2つのジアミン;
3)1,3−ビス(3−アミノフェニル)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニル)ベンゼン、1,4−ビス(3−アミノフェニル)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニル)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,4−ビス(3−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェノキシ)ベンゼン、1,3−ビス(3−アミノフェノキシ)−4−トリフルオロメチルベンゼン、3,3’−ジアミノ−4−(4−フェニル)フェノキシベンゾフェノン、3,3’−ジアミノ−4,4’−ジ(4−フェニルフェノキシ)ベンゾフェノン、1,3−ビス(3−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニルスルフィド)ベンゼン、1,3−ビス(3−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,3−ビス(4−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,4−ビス(4−アミノフェニルスルホン)ベンゼン、1,3−ビス〔2−(4−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼン、1,4−ビス〔2−(3−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼン、1,4−ビス〔2−(4−アミノフェニル)イソプロピル〕ベンゼンなどのベンゼン核3つのジアミン;
4)3,3’−ビス(3−アミノフェノキシ)ビフェニル、3,3’−ビス(4−アミノフェノキシ)ビフェニル、4,4’−ビス(3−アミノフェノキシ)ビフェニル、4,4’−ビス(4−アミノフェノキシ)ビフェニル、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕エーテル、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕ケトン、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルフィド、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕スルホン、ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕メタン、2,2−ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕プロパン、2,2−ビス〔3−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔3−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔4−(3−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパン、2,2−ビス〔4−(4−アミノフェノキシ)フェニル〕−1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロプロパンなどのベンゼン核4つのジアミン。
(i)ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
(ii)テトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス(アミノフェノキシ)フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド、
及び/又は、
(iii)ビフェニルテトラカルボン酸単位及びピロメリット酸単位からなる群から選ばれる少なくとも一種のテトラカルボン酸単位と、ベンゼンジアミン単位、ジアミノジフェニルエーテル単位及びビス(アミノフェノキシ)フェニル単位からなる群から選ばれる少なくとも一種の芳香族ジアミン単位とからなる芳香族ポリイミド。
対数粘度0.5〜1.0のポリエーテルスルホンの0.3質量%〜60質量%と有機極性溶媒40質量%〜99.7質量%とを含むポリエーテルスルホン溶液を、フィルム状に流延し、ポリエーテルスルホンの貧溶媒又は非溶媒を必須成分とする凝固溶媒に浸漬又は接触させて、空孔を有する凝固膜を作製する工程、及び
前記工程で得られた空孔を有する凝固膜を熱処理して前記空孔を粗大化させて、PES多孔質膜を得る工程
を含み、前記熱処理は、前記空孔を有する凝固膜を、前記ポリエーテルスルホンのガラス転移温度以上、若しくは240℃以上まで昇温させることを含む、方法で製造されてもよい。
前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた、膜平面方向の平均孔径が10μm〜500μmである複数のマクロボイドとを有し、
前記マクロボイド層の隔壁は、厚さが0.1μm〜50μmであり、
前記表面層A及びBはそれぞれ、厚さが0.1μm〜50μmであり、
前記表面層A及びBのうち、一方が平均孔径5μm超200μm以下の複数の細孔を有し、かつ他方が平均孔径0.01μm以上200μm未満の複数の細孔を有し、
表面層A及び表面層Bの、一方の表面開口率が15%以上であり、他方の表面層の表面開口率が10%以上であり、
前記表面層A及び前記表面層Bの前記細孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記PES多孔質膜は、総膜厚が5μm〜500μmであり、かつ空孔率が50%〜95%である、
PES多孔質膜である。
ポリマー多孔質膜を用いた細胞培養のモデル図を図1に示す。図1は理解を助けるための図であり、各要素は実寸ではない。本発明の方法では、ポリマー多孔質膜に神経幹細胞を適用し、培養することにより、ポリマー多孔質膜の有する内部の多面的な連結多孔部分や表面に、大量の神経幹細胞が生育するため、大量の神経幹細胞を簡便に培養することが可能となる。また、本発明の方法では、細胞培養に用いる培地の量を従来の方法よりも大幅に減らしつつ、大量の神経幹細胞を培養することが可能となる。また、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和に対して、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積を著しく減らすことも可能となる。
ポリマー多孔質膜と、
2以上の培地流出入口を有し、前記ポリマー多孔質膜が収容されたケーシングと
を備えた細胞培養モジュールであって、
ここで、前記ケーシング内に
(i)2以上の独立した前記ポリマー多孔質膜が、集約されて、
(ii)前記ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
(iii)前記ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び/又は、
(iv)前記ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
収容されている、細胞培養モジュールを用いて行われても良い。本明細書において、「細胞培養モジュール」とは、細胞培養容器、細胞培養装置及び細胞培養システム、特に浮遊培養に用いられる細胞培養容器、細胞培養装置及び細胞培養システムに適用可能な、細胞培養基材をいう。神経幹細胞を含む懸濁液を当該細胞培養モジュールと接触させることにより、神経幹細胞がポリマー多孔質膜に接着する。神経幹細胞を増殖させた後、スフェロイドとして放出されるものを回収もしくは再播種することで、大量の神経幹細胞の回収が実行可能となる。
(i)2以上の独立したポリマー多孔質膜が、集約されて、
(ii)ポリマー多孔質膜が、折り畳まれて、
(iii)ポリマー多孔質膜が、ロール状に巻き込まれて、及び/又は、
(iv)ポリマー多孔質膜が、縄状に結ばれて、
収容されている。
一実施形態において、本発明の方法で培養された神経幹細胞は回収される。回収方法は特に限定されないが、例えば、スフェロイドを形成してポリマー多孔質膜上から培養培地中に遊離した神経幹細胞を回収してもよい。あるいは、ポリマー多孔質膜上に接着している神経幹細胞のスフェロイドをピペッティングなどによりポリマー多孔質膜から遊離させることによって回収しても良い。また、アキュターゼ(商標)(ナカライテスク社)等の酵素によりポリマー多孔質膜を処理する方法によっても、効率的に神経幹細胞を回収、もしくは再播種する事が可能となる。
本発明の分化誘導方法において、ポリマー多孔質膜上で増殖した神経幹細胞は、分化誘導条件下で培養することで分化誘導がなされる。神経幹細胞の分化誘導に関する具体的な工程は特に限定されない。本明細書に記載の工程を含め、膜状の担体に生育する神経幹細胞を分化誘導培地等の分化誘導環境に接触させるのに適した任意の手法を採用することが可能である。
ポリイミド多孔質膜上での神経幹細胞の培養
野生型マウス(C57BL/6J、日本クレア社より入手)の歯状回を含む海馬から神経幹細胞を採取した。細胞培養培地(D-MEM/Ham’s F-12、和光純薬工業社製)10mlを含む容器(ベントキャップ付組織培養用フラスコ(付着性細胞用表面処理済)、旭硝子社製)中で、上記で採取した神経幹細胞を8日間培養した。神経幹細胞のスフェロイドを培地から回収し、それを酵素(アキュターゼ (商標)(ナカライテスク社))で処理することよってスフェロイドを分解し、神経幹細胞を含む細胞培養培地懸濁液を調製した。滅菌した1.8cm角の正方形のポリイミド多孔質膜と培養培地(D-MEM/Ham’s F-12、和光純薬工業社製)とを含む容器(組織培養用ディッシュ(付着性細胞用表面処理済)、旭硝子社製)に上記の神経幹細胞の懸濁液を添加し、培養を開始した。培養を開始してから10日後にポリイミド多孔質膜を新しい細胞培養培地を含む容器に移し替えた。その後は3日経過するごとに、ポリイミド多孔質膜を新しい細胞培養培地を含む容器に移し替えた。培養を開始してから10日後の神経幹細胞の光学顕微鏡写真を図2に示す。また、培養開始10日後及び70日後に、培養培地中に遊離した神経幹細胞のスフェロイドを回収し、免疫染色を行った。免疫染色は4%PFAで細胞を固定の上、0.1%triton X−100で処理し、ブロッキングを行った後、一次抗体を4℃にて一晩反応させ、二次抗体を室温にて一時間反応させた。顕微鏡写真を図3及び4に示す。70日経過後であっても、神経幹細胞が未分化のままで維持された(図4)。また、培養開始30日後にポリイミド多孔質膜上で成長しているスフィロイドにDNA合成指示薬であるEdUを短時間取り込ませ、スフィロイド中の分裂S期細胞核を蛍光ラベルした(図5及び6)。ポリイミド多孔質膜内外で細胞が増殖していることが示された。
ポリイミド多孔質膜上で培養した神経幹細胞の分化誘導
上記実施例1で培養開始10日後および70日後に回収された神経幹細胞のスフェロイドに対して、分化誘導剤(PDGF、フォルスコリンまたはBMP2)を添加し、5日間培養した後に免疫染色を行った。顕微鏡写真を図7〜13に示す。培養を開始してから70日経過後の神経幹細胞であっても、分化能を維持していることが示された(図10〜13)。
ポリイミド多孔質膜上での神経幹細胞の長期間培養、及び長期間培養後の神経幹細胞の分化誘導
上記実験例1に準じて、1.8cm角の正方形のポリイミド多孔質膜上で神経幹細胞を培養した。培養開始30日後、別途用意した1.8cm角の正方形のポリイミド多孔質膜を、神経幹細胞を培養させたポリイミド多孔質膜の上に、両方のポリイミド多孔質膜のA面同士が重なるように配置し、培養を継続した。新たに追加したポリイミド多孔質膜によって、細胞培養可能な空間が増大した。その後7日毎に、別途用意した1.8cm角の正方形のポリイミド多孔質膜を、神経幹細胞を培養させたポリイミド多孔質膜の上に、両方のポリイミド多孔質膜のA面同士が重なるように配置して培養空間を適宜増大させながら培養を継続することにより、最終的に神経幹細胞を225日間培養することができた。
Claims (16)
- 神経幹細胞の分化を抑制する方法であって、
(1)神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
(2)少なくとも70日間、神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通している、前記方法。 - 神経幹細胞が野生型細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(2)において、神経幹細胞を、ポリマー多孔質膜1平方センチメートル当たりに1.0×105個以上となるまで増殖させる、請求項1又は2に記載の方法。
- 2以上のポリマー多孔質膜を、上下又は左右に細胞培養培地中に積層して用いる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリマー多孔質膜を
i)折り畳んで、
ii)ロール状に巻き込んで、
iii)シートもしくは小片を糸状の構造体で連結させて、あるいは、
iv)縄状に結んで
細胞培養容器中の細胞培養培地中で浮遊もしくは固定させて用いる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。 - 工程(2)において、細胞培養容器中に含まれる細胞培養培地の総体積が、細胞生存域を含むポリマー多孔質膜体積の総和の10000倍又はそれより少ない、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面層Aの平均孔径が、5μm〜50μmである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記表面層Bの平均孔径が、20〜100μmである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリマー多孔質膜の膜厚が、5〜500μmである、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポリマー多孔質膜がポリイミド多孔質膜である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリイミドを含む、ポリイミド多孔質膜である、請求項10に記載の方法。
- ポリイミド多孔質膜が、テトラカルボン酸二無水物とジアミンとから得られるポリアミック酸溶液と着色前駆体とを含むポリアミック酸溶液組成物を成形した後、250℃以上で熱処理することにより得られる着色したポリイミド多孔質膜である、請求項10又は11に記載の方法。
- 前記ポリマー多孔質膜が、ポリエーテルスルホン多孔質膜である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 神経幹細胞を調製する方法であって、
(1)神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、及び
(2)少なくとも70日間、神経幹細胞を培養し、増殖させる工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程(2)において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法。 - 前記工程(2)で得られる神経幹細胞を回収する工程をさらに含む、請求項14に記載の方法。
- 神経幹細胞を分化誘導する方法であって、
(1)神経幹細胞をポリマー多孔質膜に適用する工程、
(2)少なくとも70日間、神経幹細胞を培養し、増殖させる工程、
(3)工程(2)で得られる神経幹細胞を分化誘導条件下で培養する工程
を含み、
ここで、前記ポリマー多孔質膜が、複数の孔を有する表面層A及び表面層Bと、前記表面層A及び表面層Bの間に挟まれたマクロボイド層とを有する三層構造のポリマー多孔質膜であり、ここで前記表面層Aに存在する孔の平均孔径は、前記表面層Bに存在する孔の平均孔径よりも小さく、前記マクロボイド層は、前記表面層A及びBに結合した隔壁と、当該隔壁並びに前記表面層A及びBに囲まれた複数のマクロボイドとを有し、前記表面層A及びBにおける孔が前記マクロボイドに連通しており、
前記工程(2)において神経幹細胞の分化は抑制される、前記方法。
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