KR100832592B1

KR100832592B1 - 폴리머 막을 이용한 줄기세포와 피더세포의 공배양방법

Info

Publication number: KR100832592B1
Application number: KR1020060077478A
Authority: KR
Inventors: 박현숙; 이순례
Original assignee: 박현숙
Priority date: 2006-08-17
Filing date: 2006-08-17
Publication date: 2008-05-27
Also published as: US20100075418A1; KR20080016000A; WO2008020675A1; US8257973B2; JP2010500878A

Abstract

본 발명은 피더(Feeder)세포를 이용하여 줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 피더세포와 줄기세포를 복수의 포어(pores)를 가지는 폴리머 막(membrane)으로 분리하여 두개의 공간으로 나누어 배양하는 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 줄기세포와 피더세포가 독립된 공간에서 세포의 상호작용에 필수적인 물질 이동만 허용하고, 각각 최적 조건에서 배양되므로 줄기세포에 더욱 최적화한 배양조건이 제공되어 이 상태에서 줄기세포를 거의 분화됨 없이 미분화상태를 유지하면서 배양할 수 있고, 줄기세포의 계대배양이 필요한 시점까지 피더세포를 무제한 제공할 수 있으며, 피더세포에 방사선 조사나 마이토마이신처리와 같은 세포성장저해제 처리를 할 필요가 없고, 치료용으로 이용되는 줄기세포를 피더세포의 오염 없이 배양할 수 있다는 점에서 임상적용 시 유용한 방법으로 활용될 수 있다.

Description

폴리머 막을 이용한 줄기세포와 피더세포의 공배양방법 {Method for co-culture of stem cells and feeder cells using a polymer membrane}

도 1 은 반투막을 이용한 줄기세포 공배양의 모식도이다.

도 2 는 배양 조건에 따른 배아줄기세포 콜로니의 형태를 보여주는 위상차 현미경 사진이다. 배율은 40 배, scale bar는 0.5 mm. 배아줄기세포는 HSF6 (72 계대). 5 일 배양.

도 3 은 배양 조건에 따른 배아줄기세포의 미분화 상태를 확인하기 위하여 시행한 알칼린포스파타제 염색 결과이다. 배율은 40 배, scale bar는 0.5 mm. 배아줄기세포는 HSF6 (72 계대). 5 일 배양.

도 4 는 배양 조건에 따른 배아줄기세포의 미분화 상태를 확인하기 위하여 미분화 줄기세포 표지자인 Nanog의 전사 RNA 발현양을 확인하기 위하여 시행한 실시간 역전사중합효소연쇄반응의 그래프이다. 배아줄기세포는 HSF6 (72 계대). 5 일 배양.

도 5 는 배양 조건에 따른 배아줄기세포의 미분화 및 분화 여부를 확인하기 위하여 housekeeping 유전자인 b-actin, 미분화 줄기세포 표지자인 Nanog, 내배엽 표지자인 a-FP, 중배엽 표지자인 KDR, 외배엽 표지자인 NACM의 전사 RNA 발현양을 확인하기 위하여 역전사중합효소연쇄반응을 시행하고 그 산물을 agarose gel 상에 서 전기영동한 결과이다. 배아줄기세포는 HSF6 (72 계대). 5 일 배양.

도 6 은 배양 조건에 따른 배아줄기세포의 증식 속도를 확인하기 위하여 genomic DNA량을 측정한 결과이다. 배아줄기세포는 HSF6 (72 계대). 5 일 배양.

도 7 은 반투성막을 이용한 공배양 후 다시 일반적인 방법으로 배아줄기세포를 배양하여도 미분화 유지가 증가되어 있는지 미분화 줄기세포 표지자인 Nanog의 전사 RNA 발현양을 실시간 역전사중합효소연쇄반응으로 확인한 그래프이다. 배아줄기세포는 HSF6 (72 계대). 5 일 배양.

도 8 은 배양 조건에 따른 배아줄기세포의 분화능력을 확인하기 위해 레티노산 처리 후 분화 여부를 알칼린포스파타제 염색으로 확인한 결과이다. 배율은 40 배, scale bar는 0.5 mm. 배아줄기세포는 HSF6 (72 계대). 5 일 배양.

본 발명은 피더(Feeder)세포를 이용하여 줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로 피더세포와 줄기세포를 복수의 포어(pores)를 가지는 폴리머 막(membrane)으로 분리하여 두개의 공간으로 나누어 배양하는 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 두 종류의 세포가 독립된 공간에서 세포의 상호작용에 필수적인 물질 이동만 허용하고, 각각 최적 조건에서 배양되므로 줄기세포에 더욱 최적화한 배양조건이 제공된다.

1981 년 처음으로 생쥐의 배아 줄기세포가 시험관에서 배양이 가능해졌고, 1988 년에는 생쥐배아줄기세포의 시험관 배양 기술이 유전자 적중 기술과 융합, 최초로 유전자 적중 생쥐가 만들어지게 되었다. 유전자 적중 생쥐 기술은 이후 유전자의 기능 연구 및 인간의 질환 모델을 수립하는 데에 없어서는 안 될 중요한 기술로서 생명과학/의학의 발달에 견인차 역할을 해왔다(Smith AG, Annu Rev Cell Dev Biol 17:435-62, 2001). 인간 배아 줄기세포의 시험관 배양이 가능해진 것은 생쥐에 비하여 17 년이나 늦은 1998 년으로, 위스콘신대학의 톰슨박사가 인간 배아줄기세포주를 처음으로 수립하였다(Thomson JA, Science 282(5391): 1145-7, 1998). 생쥐 배아 줄기세포에 비하여 인간 배아 줄기세포는 시험관 배양이 더욱 어렵고 조작이 불편하여 세포를 대량 배양하여 유전자 조작 혹은 시험관 조작하여 세포 치료제로 이용하거나 연구를 하는 데에 많은 어려움을 안고 있다. 따라서 용이하고 대량 배양이 가능하고 세포의 품질관리가 가능한 배양 기술의 수립이 매우 절실하다.

현재 이용되는 배아줄기세포의 배양법은 톰슨이 수립한 방법을 토대로 하고 있으며, 기본 배양법은 마이토마이신을 처리하거나 방사선을 조사하여 성장을 억제시킨 생쥐유래 태아섬유아세포를 먼저 접종하여 이들 피더세포로부터 배아줄기세포 성장에 필요한 세포외 기질 및 싸이토카인을 발현시킨 후 그 위에 인간배아줄기세포를 접종하여 배양하는 방법이다. 배아줄기세포와 피더세포의 최적 배지 조성은 서로 다르다. 즉, 배아줄기세포의 배지 조성은 기본 배지에 혈청대체물(serum replacement, Invitrogen Inc.)을 20% 첨가하고, 피더세포의 배지 조성은 기본 배지에 우태아혈청 20%를 첨가한다. 섬유아세포의 생존에 우태아혈청은 매우 중요한 역할을 하므로 우태아혈청 대신 혈청대체물이 첨가된 배아줄기세포용 배지에서 피 더 섬유아세포는 피더로서의 역할을 하기 매우 어렵다는 문제점을 안고 있다. 이외에도, 현재 배아줄기세포 배양의 다른 문제점은 피더세포에 마이토마이신이나 방사선을 조사하므로 피더세포의 생존이 5-7 일 정도로 제한되는 점이다. 줄기세포를 처음 수립하는 경우나 줄기세포의 성장이 느려 계대가 5-7 일 이상이 걸리는 경우 피더세포가 5-7 일 이상 생존할 수 없으므로 불가피하게 아직 계대시기에 이르지 못한 줄기세포를 계대 배양해야 한다. 또한 마이토마이신을 피더에 처리하는 경우 약물의 잔류에 의한 안전성에 대한 고려가 있을 수 있다. 다른 문제점은 줄기세포와 피더세포가 동일 배양접시에서 배양되기 때문에 줄기세포의 계대배양 시 피더세포가 섞여 들어가는 일을 피할 수 없다. 특히 임상적용 시 피더세포의 오염은 심각한 문제를 야기할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 폴리머 막을 이용하여 줄기세포와 피더세포를 공배양하는 경우 두 종류의 세포가 독립된 공간에서 세포의 상호작용에 필수적인 물질 이동만 허용하고, 각각 최적 조건에서 배양되므로 줄기세포에 더욱 최적화한 배양조건이 제공될 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 종래 줄기세포의 배양 방법의 문제점을 극복하기 위한 것으로, 줄기세포를 미분화상태로 유지할 뿐만 아니라 피더세포를 최적 조건으로 배양가능한 줄기세포와 피더세포의 효율적인 공배양 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 줄기세포와 피더세포의 효율적인 공배양을 돕는 배양 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 종래의 공배양법을 줄기세포 배양 및 치료용 세포 배양에 적용한 것이다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 피더(Feeder)세포를 이용하여 줄기세포를 배양하는 방법에 있어서, 피더세포와 줄기세포를 복수의 포어(pores)를 가지는 폴리머 막(membrane)으로 분리하여 두개의 공간으로 나누어 배양하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 배양방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 피더 세포는 줄기세포가 자라는데(self-renewal) 필요한 영양분을 공급하고 줄기세포가 특정한 세포로 분화되는 것을 억제하는 등의 역할을 하는 세포로서, 종래 줄기세포 배양에 사용되어오던 예컨대, 생쥐와 같은 동물유래 또는 인간유래의 섬유아세포와 같은 어떤 피더세포도 사용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 피더세포와 줄기세포가 폴리머 막에 의해 분리되므로 종래 쥐 세포를 피더세포로 사용할 경우 줄기세포가 동물 세포에 오염돼 순수한 인간 줄기세포를 얻기 힘들었던 문제점을 극복할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리머 막은 배양중인 세포에 독성이 없으며 막으로 성형성을 갖는 어떠한 생체적합성(biocompatible) 고분자도 재료로 될 수 있으며, 예컨대, 합성고분자인 PLA(poly(lactic acid)), PGA(poly(glycolic acid)), Poly(ethylene terephtalate)(PET), 불화에틸렌수지(polytetrafluoroethylene: PTFE), 우레탄수지(polyurethane:PU), 메틸메타아크릴산중합체(PMMA), 폴리에스터(polyester) 또는 폴리카보네이트(polycarbonate)를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 상기 폴리머 막은 바람직하게는 폴리에스터(polyester), 폴리카보네이트(polycarbonate) 또는 불화에틸렌수지(polytetrafluoroethylene), 가장 바람직하게는 폴리에스터(polyester)를 주성분으로 하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 폴리머는 합성 폴리머만으로 이루어지거나, 젤라틴이나 콜라겐 등이 코팅되어 있을 수도 있다

본 발명에 있어서, 상기 포어 크기는 피더세포 또는 줄기세포가 통과하지 못하고 피더세포에서 분비되는 줄기세포 증식 인자나 분화 억제 인자 등의 바이오분자를 통과시킬 수 있는 0.1 um 내지 1 um 크기이면 충분하나, 바람직하게는 0.2 um 내지 0.5 um인 것을 특징으로 한다. 상기 크기 범위에서는 피더세포에서 분비하는 바이오분자들은 통과하나 배지 조성의 고분자(macromolecules)은 통과시키지 못하므로 배지의 상호오염을 방지할 수 있다. 본 발명에서는 상기와 같은 포어 크기를 갖는 폴리머 막을 세포를 투과시키는 완전투과와 구별되는 의미에서 반투과성 막(semi-permeable membrane)이라고 칭하였다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리머 막은 배양접시를 두개의 공간으로 구분하며, 피더세포와 줄기세포가 상기 폴리머 막을 중심으로 어떠한 위치에 놓일 수도 있으나, 바람직하게는 배양접시의 공간을 상하로 나누어 폴리머 막 아래에 피더세포를 배양하고 폴리머 막 위에 줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 한다. 상기의 경우, 줄기세포가 더 많이 증식하고 분화도 더 효과적으로 억제됨을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 배양을 위해 피더세포를 필요로 하는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포와 같은 어떤 줄기세포도 될 수 있으나, 바람직하게 는 배아줄기세포인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 줄기세포에는 치료용 복제 줄기세포도 포함된다. 또한, 본 발명의 줄기세포 배양은 줄기세포의 수립(derivation) 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 피더세포 배양공간은 혈청(serum) 함유 배지를 사용하고, 줄기세포 배양공간은 무혈청(serum-free or serum-replacement) 배지를 사용하는 것을 특징으로 한다. 종래 피더세포와 줄기세포를 같은 공간에서 배양하는 경우에는 혈청이 줄기세포의 자연분화를 유발할 수 있으므로 무혈청 배지를 사용할 수 밖에 없어서, 피더세포의 배양에는 최적조건이 될 수 없었다. 그러나, 본 발명에 따르면, 배양공간이 폴리머 막에 의해 구분되므로 서로 다른 배지조건을 사용할 수 있으므로, 피더세포 배양공간은 혈청(serum) 함유 배지를 사용함으로써 피더세포의 배양에 최적환경을 조성할 수 있다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 피더세포는 세포증식억제제(cytostatic agent)로 전처리되지 않은 것을 특징으로 한다. 종래에는 피더세포가 과증식되어 줄기세포의 증식을 방해하는 것을 방지하기 위하여 피더세포에 마이토마이신 C 혹은 방사선(radiation)과 같은 세포증식억제제를 전처리할 수밖에 없어서 피더세포의 생존기간이 짧았고 잔류 성분이 줄기세포의 증식을 방해할 가능성이 있었다. 그러나, 본 발명에 따르면, 배양공간이 폴리머 막에 의해 구분되어 피더세포의 증식이 줄기세포의 증식을 방해할 가능성이 없으므로, 피더세포를 세포증식억제제로 전처리할 필요성이 없다. 따라서, 피더세포의 세포수를 높게 유지할 수 있고 피더세포의 생존기간을 장기간으로 할 수 있으므로, 통상 2주정도 걸리는 줄 기세포의 생성 1계대에서 피더세포의 사멸로 인해 할수없이 5-7일에 계대를 해야만 하는 문제점을 해결할 수 있다.

본 발명자들은 기존 배양방법 혹은 새로운 공배양법으로 배양한 인간배아줄기세포의 미분화 유지를 위상차현미경 사진(도 2), 알칼린포스파타제(alkaline phosphatase) 염색(도 3), Naonog의 real time PCR (도 4), 3 배얍성 분화 표지자에 대한 PCR(도 5)로 확인하였고, 성장속도를 DNA 총량(도 6)으로 비교하였으며, 분화능을 레티노산 처리 후 알칼린포스파타제염색(도 7)으로 확인하였다. 새로운 공배양법으로 배양 후 기존 배양법으로 다시 배양하는 경우를 Naonog의 real time PCR (도 8)로 확인하였다. 새로운 공배양법으로 미분화 상태를 유지하며 배양할 수 있는지 5 계대 이상 확인하였다. 공배양용 막은 폴리에스터(polyester), 폴리카보네이트(polycarbonate), 콜라겐코팅 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene) 3 가지를 사용하여 비교하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 대조군의 배아줄기세포 배양

임신 13.5일째 되는 생쥐(CF1, C57BL6)에서 추출 일차배양한 생쥐태아섬유아세포를 피더세포로 사용하기 위해 성장 억제제로 마이토마이신(Mitomycin C, Sigma, Cat.No.M-4287)를 10 ug/ml농도로 1시간 30 분 동안 처리한 후 4 X 10⁴/cm² 의 밀도로 접종하고 다음 날 배아줄기세포(HSF6) 조각을 접종하여 배양한다. 배지 조성은 DMEM/F12배지 (GIBCO, USA, Cat.No. 12500-062)에 3.069g/l sodium bicarbonate (Sigma, USA, Cat.No. S5761), 2 mM L-glutamine (Sigma, Cat.No. S8540), 1% penicillin(50U/ml)(Sigma, Cat.No. P4687)/streptomysin (50ug/ml)(Sigma, USA, Cat.No.S1277), 20% Knock-Out serum replacement (SR; Invitrogen BRL, Cat.No.10828-028), 4 ng/ml Basic Fibroblasts Growth Factor (bFGF; Invitrogen BRL, Cat.No. 13256-029)이다. 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지 교환은 매일 시행하였다.

실시예 2: 반투성막을 이용한 배아줄기세포 공배양

공배양은 일반적인 폴리스티렌 배양접시와 상업화된 공배양시스템인 코닝사의 transwell을 사용하여 실시하였다. 우선 피더세포인 생쥐태아섬유아세포를 피더로 사용하기 위해 성장 억제제로 마이토마이신(Mitomycin C, Sigma, Cat.No.M-4287)를 10 ug/ml농도로 배양액에 첨가하여 1시간 30 분 동안 처리한 후 4 X 10⁴/cm² 의 밀도로 접종하거나 마이토마이신처리 하지 않은 채 5 X 10³/cm² 의 밀도로 접종하고, 다음날 위칸에 배아줄기세포용 배지를 첨가하여 위칸과 아래칸 사이의 배지의 평형이 이루어졌는지 확인 후 막 위에 배아줄기세포(HSF6)를 접종했다. 배지 조성은 24 well 배양접시에는 피더용 배지인 DMEM(GIBCO, USA, Cat.No. )에 3.7 g/l sodium bicarbonate (Sigma, USA, Cat.No. S5761), 2 mM L-glutamine (Sigma, Cat.No. S8540), penicillin(50U/ml)(Sigma, Cat.No. P4687)/streptomysin (50ug/ml)(Sigma, USA, Cat.No.S1277), 10 % Fetal Bovine Serum (FBS; Hyclone, Cat.No. SH30070.03)이 혼합된 배지를 1.5 ml 첨가했다. 24 well 위에 삽입하는 막에는 DMEM/F12배지 (GIBCO, USA, Cat.No. 12500-062)에 2.44g/l sodium bicarbonate (Sigma, USA, Cat.No. S5761), 2 mM L-glutamine (Sigma, Cat.No. S8540), penicillin(50U/ml)(Sigma, Cat.No. P4687)/streptomysin (50ug/ml)(Sigma, USA, Cat.No.S1277), 20 % Knock-Out serum replacement (SR; Invitrogen BRL, Cat.No.10828-028), 4 ng/ml Basic Fibroblasts Growth Factor (bFGF; Invitrogen BRL, Cat.No. 13256-029)가 혼합된 배아줄기세포용 배지를 0.5 ml 첨가했다. 경우에 따라 피더세포와 배아줄기세포 접종 위치를 바꾸기도 하였다. 배지교환은 매일 시행하였다. 도 1 은 반투막을 이용한 줄기세포 공배양의 모식도이다. ‘대조군’은 반투막을 이용하지 않고 피더세포와 배아줄기세포를 공배양한 것이고, ‘폴리스티렌’은 폴리스티렌 배양접시위에 배아줄기세포를 깔고 폴리에스터 반투막위에 피더세포를 깔아 공배양한 것이고, ‘폴리에스터’는 폴리스티렌 배양접시위에 피더세포를 깔고 폴리에스터 반투막위에 배아줄기세포를 깔아 공배양한 것이고, ‘폴리카보네이트’는 폴리스티렌 배양접시위에 피더세포를 깔고 폴리카보네이트 반투막위에 배아줄기세포를 깔아 공배양한 것이고, ‘콜라겐코팅 폴리테트라플루오로에틸렌’은 폴리스티렌 배양접시위에 피더세포를 깔고 콜라겐코팅 폴리테트라플루오로에틸렌 반투막위에 배아줄기세포를 깔아 공배양한 것이다.

실시예 3: Alkaline phosphatase 염색

인간배아줄기세포는 alkaline phosphatase 염색을 통하여 염색이 되는 콜로니는 미분화, 염색이 안되는 콜로니는 분화 콜로니로 계수한다. Alkaline phosphatase 염색은 pH 9.5 Tris-Cl에 NBT/BCIP (Roche, Germany, Cat.No. 1 681 451) 용액을 99:1의 비율로 섞어 반응시켜 발색을 확인하였다(도 3, 8, 실험결과 1, 2 참조).

실시예 4: 역전사중합효소연쇄반응과 실시간 역전사중합효소연쇄반응

각각의 실험군으로부터 인간 배아 줄기세포를 떼어낸 후 인산완충용액으로 먼저 세척하고 원심분리기에서 3,000 rpm으로 5 분간 원심 분리한 후 상등액은 버리고 세포 덩어리를 Trizol (Invitrogen, Rockville, Cat.No. 15596-018)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 약 500 ng의 RNA를 랜덤 헥사머(random hexamer)를 프라이머로 이용하여 역전사 중합효소 연쇄반응을 시행하기 위하여 역전사효소, AMV (Roche, Germany, Cat.No. 10 109 118 001)를 이용하여 cDNA를 만들고, 만들어진 cDNA 100-200 ng을 센스 프라이머와 안티센스 프라이머(b-actin, a-FP, KDR, NCAM 용), PCR 프리믹스(PerMix, BioNEER, Korea, Cat.No.K-2016) 그리고 물을 혼합하여 20-30회의 PCR 증폭을 시행하였다. PCR 조건은 94°C 45sec, 60°C 45sec 및 72°C 45sec이었다. PCR 산물 5㎕를 1% 아가로오스겔 상에서 전기 영동하여 결과를 분석하였다(도 5, 실험결과 1 참조).

실시간 역전사 중합효소 연쇄반응은 역전사 중합효소 연쇄반응과 같은 방법으로 RNA를 얻어 cDNA를 만들고, cDNA 100-200ng을 센스 프라이머와 안티센스 프라 이머(Nanog 용), 형광 PCR 프리믹스(iQ^TM SYBR^ⓡ Green Supermix, BIO-RAD, CA), 그리고 물을 혼합하여 BIO-RAD 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 기계를 이용하여 30-40회의 실시간 PCR증폭을 시행하고 그 결과를 분석하였다.

실시예 5: Genomic DNA 추출 및 정량

각각의 실험군으로부터 인간 배아 줄기세포를 떼어낸 후 인산완충용액으로 먼저 세척하고 원심분리기에서 3,000 rpm으로 5 분간 원심 분리한 후 상등액은 버리고 세포 덩어리에서 Trizol을 이용하여 Genomic DNA를 추출하였고 Absorbance를 측정하여 분석하였다(도 6, 실험결과 2 참조).

실시예 6: 레티노산을 이용한 분화 유도

세포 분화 유도는 인간 배아줄기세포가 자리를 잡고 콜로니를 형성하기 시작하는 접종 2 일 째부터 시행하였다. 레티노산(all-trans-retinoic acid)의 경우 DMSO용액에 녹여 최종농도가 10^-6M 되도록 배지에 혼합하여, 이 후 3 일 동안 매일 처리하였다. 4 일 동안 매일 신선한 배지로 배지 교환을 시행하였다. 대조군은 5 일 동안 배지 교환을 매일 시행하면서 아무런 처리도 하지 않았다 (도 8, 실험결과 4 참조).

실험결과 1. 반투막을 이용한 공배양에 의한 줄기세포의 미분화 유지

반투막을 이용한 공배양 조건에서도 줄기세포가 부착하는 재질의 종류에 따라 미분화 유지 정도에 차이를 보였다. 폴리에스터막을 경계로 줄기세포와 피더세포를 배양하는 경우 동일한 공배양 조건인데도 줄기세포가 폴리스티렌 배양접시 표 면에서 자라고 피더가 폴리에스터막 위에서 자라는 경우(도1, 폴리스티렌) 반대의 경우 (도1, 폴리에스터) 줄기세포의 상태가 매우 다르게 관찰되었다. 폴리에스터막 위에서 줄기세포는 증식이 활발하여(도6) 콜로니의 경계가 식별이 안될 만큼 막표면을 5 일 내에 다 뒤덮어 버렸고 세포의 크기도 미분화세포 특유의 핵 대 세포질 비율이 높고 조밀한 반면, 폴리스티렌 위에서 자란 줄기세포는 미분화세포 특유의 특징인 조밀하고 작은 세포와 조밀한 세포가 모여 볼록하게 융기된 콜로니의 특성을 띄지 않고 콜로니가 바닥에 바짝 붙어있는 형태로 자랐다(도2). 대조군의 줄기세포도 폴리스티렌 표면 위에서 자란다고 볼 수 있으나 이 경우에는 피더가 깔린 위에 배아줄기세포를 접종하므로 피더세포에 의해 제공된 세포외 기질이 폴리스티렌표면과 줄기세포 사이에 놓여 있다고 볼 수 있다. 반투막을 이용한 배양의 경우나 대조군 모두 알칼린포스파타제 염색을 통해 미분화 상태를 확인한 결과 모두 양성으로 큰 차이를 보이지 않았다(도3). 그러나 미분화상태를 보다 상세하게 확인한 결과 배양 조건에 따른 차이가 관찰되었다. 미분화표지자인 Nanog 전사 RNA 발현 수준을 실시간 역전사중합효소연쇄반응에 의해 확인한 결과 폴리스티렌은 대조군보다 월등히 낮았다(역치사이클수 대조군, 12.4 vs. 폴리스티렌 15, 도 4). 이와 같은 결과는 반투성막을 통한 공간분할에 의한 공배양 그 자체 뿐 아니라 줄기세포가 접종된 재질도 중요한 요인이 된다는 것을 입증하는 결과이다. 폴리에스터 외의 다른 재질인 폴리카보네이트나 콜라겐코팅된 폴리테트라플루오로메틸렌의 경우 Nanog 전사 RNA 발현 수준을 실시간 역전사중합효소연쇄반응에 의해 확인한 결과 모두 폴리스티렌이나 대조군보다 높았다(도 4).

[표 1] 미분화 표지자인 Nanog의 실시간 역전자중합효소연쇄반응의 threshold cycle

주) Threshold cycle 수는 해당 유전자 발현량에 반비례.

그러나 폴리에스터를 제외한 나머지 재질이나 폴리스티렌은 모두 내배엽(alpha-fetoprotein, a-FP) 및 외배엽(NACM) 분화도 동시에 진행되었다(도 5). 이를 통해, 폴리에스터 재질의 막 위에서 배아줄기세포를 배양하며 배양접시에 피더세포를 공배양하는 경우 배아줄기세포의 전분화능 유지(도 4, 도 5)가 가장 잘 이루어짐을 알 수 있다. 피더 세포의 상태가 대조군에 비해 공배양 시 더욱 건강한 것으로 보아 공배양의 장점 중 하나는 피더세포가 자신에게 최적화한 배지에서 배양되어 좋은 상태를 유지하므로 피더역할을 잘 해낼 수 있는 것도 한 원인이라 사료된다.

실험결과 2. 반투막을 이용한 공배양에 의한 줄기세포의 증식속도 향상

폴리에스터막을 경계로 줄기세포와 피더세포를 배양하는 경우 역시 동일한 공배양 조건인데도 줄기세포가 폴리스티렌 배양접시 표면에서 자라고 피더가 폴리에스터막 위에서 자라는 경우(도1, 폴리스티렌) 반대의 경우 (도1, 폴리에스터) 줄 기세포의 증식 속도가 다르게 관찰되었다. 즉, 폴리에스터막 위에서 줄기세포는 증식이 활발하여(도6) 콜로니의 경계가 식별이 안될 만큼 막표면을 5 일 내에 다 뒤덮어 버린 데 비해 폴리스티렌 위에서 줄기세포 콜로니 크기 증가가 적었고 이러한 결과는 genomic DNA 량으로도 일관된 결과를 확인할 수 있었다. 즉, 폴리에스터 재질의 막 위에서 DNA 량이 1.8 배 가량 높았고 대조군보다 2.7 배 가량 높았다(도 6). 이를 통해, 폴리에스터 재질의 막 위에서 배아줄기세포를 배양하며 배양접시에 피더세포를 공배양하는 경우 배아줄기세포의 증식(도 6)이 가장 빠름을 알 수 있다.

실험결과 3. 반투막을 이용한 공배양 조건으로 배양한 줄기세포를 다시 일반 줄기세포 배양방법으로 배양해도 미분화 유지가 증가해있음을 확인

폴리에스터막을 경계로 줄기세포와 피더세포를 2 계대 배양 후 다시 일반적인 배양방법으로 배양한 경우 Nanog 전사 RNA 발현 수준을 실시간 역전사중합효소연쇄반응에 의해 확인한 결과 오히려 폴리에스터나 대조군보다 높았고(도 7) 줄기세포 콜로니의 형태도 미분화세포 특성을 더욱 잘 유지하고 있었다. 따라서 폴리에스터 재질의 막 위에서 배아줄기세포를 배양하며 배양접시에 피더세포를 공배양하는 방법을 1-2 계대 시행 후 다시 일반 배양으로 되돌아가더라도 미분화 유지가 월등히 더 우수해짐을 알 수 있다.

[표 2] 미분화 표지자인 Nanog의 실시간 역전자중합효소연쇄반응의 threshold cycle

주) Con = 대조군, Est = 폴리에스터, Tcon = 폴리에스터(2계대)+대조군

Threshold cycle 수는 해당 유전자 발현량에 반비례.

실험결과 4. 반투막을 이용한 공배양 조건으로 배양한 줄기세포의 분화능

대조군과 폴리에스터, 폴리에스터 2 계대 후 일반적인 방법으로 배양한 3 개 그룹의 줄기세포에 레티노산 10^-6M을 처리하고 분화 여부를 알칼린포스파타제 염색으로 확인하였다(도 8). 세 그룹 모두 레티노산 처리에 의하여 분화가 진행되어 알칼린포스파타제 음성으로 관찰되었으나 폴리에스터 그룹에서는 분화가 줄기세포 콜로니 반원의 중간 이상에서만 진행되어 알칼린포스파타제 음성이고 안쪽은 여전히 알칼린포스파타제 양성으로 분화가 일어나지 않았다(도 8). 이러한 결과는 폴리에스터막 위에서 줄기세포가 자라는 쪽이 분화를 상당히 지연시키고 있음을 의미한다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 줄기세포와 피더세포가 독립된 공간에서 세포의 상호작용에 필수적인 물질 이동만 허용하고, 각각 최적 조건에서 배양되므로 줄기세포에 더욱 최적화한 배양조건이 제공되어 이 상태에서 줄기세포를 거의 분화됨 없이 미분화상태를 유지하면서 배양할 수 있고, 줄기세포의 계대배양 이 필요한 시점까지 피더세포를 무제한 제공할 수 있으며, 피더세포에 방사선 조사나 마이토마이신처리와 같은 세포성장저해제 처리를 할 필요가 없고, 치료용으로 이용되는 줄기세포를 피더세포의 오염 없이 배양할 수 있다는 점에서 임상적용 시 유용한 방법으로 활용될 수 있다.

Claims

피더(Feeder)세포를 이용하여 줄기세포를 배양하는 방법에 있어서, 피더세포와 줄기세포를 복수의 포어(pores)를 가지는 폴리머 막(membrane)으로 분리하여 두개의 공간으로 나누어 배양하고, 상기 피더세포는 세포증식억제제(cytostatic agent)로 전처리되지 않은 것을 특징으로 하는 줄기세포의 배양방법.
제 1항에 있어서, 상기 폴리머 막은 폴리에스터(polyester)를 재료로 만들어진 것을 특징으로 하는 줄기세포의 배양방법.
제 1항에 있어서, 상기 포어 크기는 0.2 um 내지 0.5 um인 것을 특징으로 하는 배양방법.
제 1항에 있어서, 상기 폴리머 막 아래에 피더세포를 배양하고 폴리머 막 위에 줄기세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포인 것을 특징으로 하는 배양방법.
제 1항에 있어서, 상기 피더세포 배양공간은 혈청(serum) 함유 배지를 사용하고, 줄기세포 배양공간은 무혈청(serum-free or serum-replacement) 배지를 사용 하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
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