KR20090085019A

KR20090085019A - 줄기세포 및 피더세포의 공배양용 배지 조성물

Info

Publication number: KR20090085019A
Application number: KR1020097001645A
Authority: KR
Inventors: 박현숙; 이순례; 이정미
Original assignee: 주식회사 엠씨티티
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2007-06-14
Publication date: 2009-08-06
Also published as: WO2008018684A1

Abstract

본 발명은 줄기세포 및 피더세포의 공배양용 배지조성물 혹은 일차배양세포의 배양용 배지조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 기존의 배지성분보다 저렴하고 간편하게 피더세포와 줄기세포 모두에 최적화한 배지로 줄기세포를 거의 분화됨 없이 미분화상태를 유지하면서 배양할 수 있고, 특히 냉동 보존된 줄기세포의 초기 접착 및 미분화 유지배양에 월등히 좋은 효과를 내므로, 이 배양 성분으로 줄기세포를 대량 배양하는 데에 유용하게 활용할 수 있으며 이 배지 조성이 줄기세포와 일차배양 섬유아세포에 모두 최적화한 배지인 것으로 보아 종류에 무관하게 일차배양 세포에 모두 보편적으로 최적화된 배지로 활용될 수 있을 것이다.

Description

줄기세포 및 피더세포의 공배양용 배지 조성물{CULTURE MEDIUM FOR CO-CULTURING OF HUMAN STEM CELLS AND THEIR FEEDER CELLS}

본 발명은 줄기세포 및 피더세포의 공배양용 혹은 일차배양세포의 배양용 배지 조성물에 관한 것으로서, 줄기세포 및 피더세포의 두 종류의 세포에 대해 공통적으로 최적화한 배양을 가능하게 하는 배지의 조성에 관한 것이다.

1981 년 처음으로 생쥐의 배아 줄기세포가 시험관에서 배양이 가능해졌고, 1988 년에는 생쥐배아줄기세포의 시험관 배양 기술이 유전자 적중 기술과 융합, 최초로 유전자 적중 생쥐가 만들어지게 되었다. 유전자 적중 생쥐 기술은 이후 유전자의 기능 연구 및 인간의 질환 모델을 수립하는 데에 없어서는 안 될 중요한 기술로서 생명과학/의학의 발달에 견인차 역할을 해왔다(Smith AG, Annu Rev Cell Dev Biol 17:435-62, 2001). 인간 배아 줄기세포의 시험관 배양이 가능해진 것은 생쥐에 비하여 17 년이나 늦은 1998 년으로, 위스콘신대학의 톰슨박사가 인간 배아줄기세포주를 처음으로 수립하였다(Thomson JA, Science 282(5391): 1145-7, 1998). 생쥐 배아 줄기세포에 비하여 인간 배아 줄기세포는 시험관 배양이 더욱 어렵고 조작이 불편하여 세포를 대량 배양하여 유전자 조작 혹은 시험관 조작하여 세포 치료제로 이용하거나 연구를 하는 데에 많은 어려움을 안고 있다. 따라서 용이하고 대량 배양이 가능하고 세포의 품질관리가 가능한 배양 기술의 수립이 매우 절실하다.

현재 이용되는 배아줄기세포의 배양법은 톰슨이 수립한 방법을 토대로 하고 있으며, 기본 배양법은 마이토마이신을 처리하거나 방사선을 조사하여 성장을 억제시킨 생쥐유래 태아섬유아세포를 먼저 접종하여 이들 피더세포로부터 배아줄기세포 성장에 필요한 세포외 기질 및 싸이토카인을 발현시킨 후 그 위에 인간배아줄기세포를 접종하여 배양하는 방법이다. 배지의 조성은 표 1에 나타난 바와 같이 기본배지에 첨가하는 성분에 따라 크게 두 종류로 나뉜다. 즉, DMEM이나 DMEM/F12(1:2)에 섬유아세포성장인자와 글루타민, 베타머캅토에탄올을 첨가한 기본 배지에 혈청대체물(serum replacement, Invitrogen Inc.)을 20％ 첨가하거나 우태아혈청 20％와 인슐린, 트란스페린, 셀레늄을 첨가한다. 혈청대신 혈청대체물이 들어간 배지는 피더 섬유아세포가 생존하기에 적합하지 않고, 우태아혈청이 들어간 배지는 줄기세포의 분화를 많이 유도하는 경향이 있다. 일반적으로 피더세포인 섬유아세포의 생장배지에는 우태아혈청이 10％ 첨가되어 있고 우태아혈청은 섬유아세포의 생존에 매우 중요한 역할을 한다. 따라서 배아줄기세포를 배양하는 우태아혈청 대신 혈청대체물이 첨가된 배지에서 피더 섬유아세포는 피더로서의 역할을 하기 매우 어려운 조건임을 알 수 있다(도9-11, 실험결과 3 참조). 따라서 배아줄기세포 배양에 최적화한 배지 란 줄기세포와 피더세포 에 모두 최적화한 배지 조성을 가지고 있어야 할 것이다.

[표 1] 배아줄기세포 배양액 조성

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 기본배지에 특정 성분비의 우태아혈청(FBS), 혈청대체물(SR) 및 섬유아세포성장인자(bFGF)를 첨가 한 배지조성물을 사용한 경우, 줄기세포 및 피더세포의 성장을 최적화하고 줄기세포의 미분화상태를 유지할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

Technical Problem

본 발명의 목적은 종래 인간배아 줄기세포의 배양 방법의 문제점을 극복하기 위한 것으로, 인간배아 줄기세포 배양에서 줄기세포 뿐 아니라 피더세포의 생존에도 최적화한 배지 성분을 개발함으로서 피더세포의 역할을 극대화하여 전분화능 줄기세포의 전분화능을 최대한 유지할 수 있게 하며, 냉동 보존된 줄기세포의 해동 후 세포 부착 및 성장을 향상시키는 데 있다.

또한, 본 발명의 상기 전분화능 줄기세포가 아니더라도 섬유아세포의 성장을 새로 개발된 배지가 더욱 촉진시킨 점을 볼 때 다른 종류의 성체 줄기세포 및 일차배양 미분화 세포의 성장에도 최적화한 배지 조성이 될 수 있다.

Technical Solution

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 인간 전분화능 줄기세포의 성장 및 자기 복제(self renewal)를 돕는 배지 성분을 제공한다. 본 발명의 방법은 종래의 배지 조성을 변형한 것으로서 기본 배지 조건에 섬유아세포성장인자 및 우태아혈청, 혈청대체물을 적정 비율 혼합하였다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 기본배지에 1-10％ 우태아혈청(FBS), 1-20％ 혈청대체물(SR) 및 0.1-4 ng/ml 섬유아세포성장인자(bFGF)를 첨가한 것을 특징으로 하는 줄기세포 및 피더세포의 공배양용 배지 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 기본배지에 1-10％ 우태아혈청(FBS), 1-20％ 혈청대체물(SR) 및 0.1-4 ng/ml 섬유아세포성장인자(bFGF)를 첨가한 것을 특징으로 하는 일차배양세포의 배양응 배지 조성물을 제공한다.

본 발명에서 새롭게 수립된 배양액은 피더세포로 이용되는 일차배양된 섬유아세포 배양에도 효과적인 것으로 확인되었다. 또한, 이 배양액의 조성은 MSC (mesenchymal stem cell : 간충직줄기세포) 혹은 SVF (stroma vascular fraction, 지방전구세포), 일차배양된 피부섬유아세포를 배양하는 데도 효과적인 것으로 나타났다. 일차배양세포의 배지조성물은 low glucose라는 것만 제외하고는 줄기세포와 똑같다.

본 발명의 배지조성물에 있어서, 상기 기본배지는 동물세포 배양에 필요한 각종 아미노산, 비타민, 무기염류 등을 포함하는 기본배지(Basic media)로서, 시중에서 구입할 수 있는 어떤 기본배지도 사용될 수 있으나, 바람직하게는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) 혹은 DMEM/F12 (DMEM + Nutrient Mixture)인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 혈청대체물(serum replacement)은 동물 혈청을 대체하기 위해 만들어진 것으로 열처리된 bovine serum albumin, bovine transferriu 및 bovine insulin 등을 함유한다. 혈청 대체물은 시중에서 구입가능한 어떤 혈청대체물 (Omni Serum; Advanced Biotechnologies Inc., Columbia, Md. 등)도 사용가능하나, 본 발명의 실시예에서는 Invitrogen사의 Knockout^TM Serum Replacement(WO098/30679 참조)를 사용하였다.

본 발명의 배지조성물에 있어서, 바람직하게는 상기 기본배지에 1-5％ 우태아혈청(FBS), 5-15％ 혈청대체물(SR) 및 1-4 ng/ml 섬유아세포성장인자(bFGF)를 첨가한 것을 특징으로 한다. 상기 배지조성비에서 더욱 우수한 세포 성장율 및 미분화 유지 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 배지조성물에 있어서, 상기 줄기세포 혹은 일차배양세포는 태아 또는 성인 조직으로부터 유래되는 것을 특징으로 한다. 즉, 줄기세포는 다양한 세포로 분화할 수 있는 태아유래의 배아줄기세포 또는 성인 조직유래의 성체줄기세포일 수 있다. 또한, 일차배양세포도 미분화된 상태로 배양을 필요로 하는 어떤 일차배양세포도 포함한다.

본 발명의 배지조성물에 있어서, 상기 줄기세포는 냉동보존 후 해동된 줄기세포인 것을 특징으로 한다. 종래 배지 조성물의 경우에는 냉동보존 후 해동된 줄기세포의 세포 부착률이나 미분화 유지가 어렸으나, 본 발명의 배지조성물은 냉동보존된 줄기세포의 해동 후 세포 부착률 및 미분화유지를 최적화시킬 수 있다.

본 발명의 배지조성물에 있어서, 상기 피더세포는 줄기세포 혹은 일차배양세포의 성장을 돕기 위해 각종 영양분 및 사이토카인 등을 분비하는 세포로서, 동물 또는 사람유래이거나, 태아 또는 성인 조직으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 생쥐에서 추출된 태아섬유아세포(MEF)를 사용하였다.

본 발명의 배지조성물에 있어서, 바람직하게는 니코틴아미드를 3-30ug/ml 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 니코틴아미드를 1Oug/ml로 넣었을 때 대조구에 비해 미분화능을 더 잘 유지하였으나, 5Oug/ml로 넣었을 때는 오히려 나쁜 효과를 나타내었다 (도 27참조).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 배지조성물을 이용하여 줄기세포 또는 일차배양세포 및 피더세포의 성장을 최적화하는 방법을 제공한다. 여기서 최적화란 줄기세포 또는 일차배양세포의 성장뿐만 아니라 피더세포의 성장도 함께 촉진시키는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 배지조성물을 이용하여 피더세포의 성장 및 피더역할을 최적화하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 배지조성물을 이용하여 줄기세포 또는 일차배양세포의 자기 본연의 특성을 유지하면서 배양하는 방법을 제공한다. 상기 자기 본연의 특성을 유지하는 것이란 줄기세포가 평상시에는 미분화상태를 유지하다가, 필요한 경우에 3배엽으로의 분화능을 가질 수 있음을 의미한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 배지조성물을 이용하여 냉동보존된 줄기세포의 해동 후 세포 부착률 및 미분화유지를 최적화하는 방법을 제공한다. 여기서 최적화란 냉동보존된 줄기세포의 해동후 세포 부착률 및 미분화유지를 증진시키는 것을 의미한다.

본 발명자들은 새로운 배지와 기존의 섬유아세포배지에서 배양한 섬유아세포의 성장률을 세포수 측정 및 세포군 면적 측정으로 비교하였고 (도 1-8, 실험결과 1, 2), 근섬유아세포로의 교차분화율을 알파민무늬근액틴에 대한 면역염색으로 비교 확인하였으며 (도 12, 실험결과 4), 성장억제제로 마이토마이신 처리 후 섬유아세포의 생존률을 세포군 면적 측정에 의하여 확인하였다 (도 9-11, 실험결과 3). 섬유아세포는 피더세포로 많이 이용되는 두 종류의 생쥐 스트레인 (CF1과 C57/Black)의 일차배양 태아섬유아세포를 이용하였고 스트레인에 관계없이 일관된 결과를 확인하였다. 인간배아줄기세포에 대한 배지의 영향은 기존 배아줄기세포용 배지 및 새로 개발된 배지에서 냉동 보존된 배아줄기세포를 해동하여 초기 부착률 및 세포의 미분화유지비율을 확인하였고 (도 13, 실험결과 5), 그 이후 8 계대 이상 배양하면서 미분화 유지를 확인하였다 (도 16, 실험결과 6). 이 때 인간배아줄기세포는 HSF6와 Miz4, Miz6의 세 개 세포주를 사용하였다. 분화여부는 줄기세포 콜로니의 형태적 특성 및 알칼린포스파타제(alkaline phosphatase) 염색으로 확인하였다 (도 17).

도 1 은 다양한 배양액 성분으로 피더세포(CF1, P5) 를 60 시간 배양 후 세포수 변화를 나타낸 그래프이다. (a) 단위 ㎠ 당 1,000 개의 세포를 접종하였을 때, (b) 단위 ㎠ 당 2,000 개의 세포를 접종하였을 때.

도 2 는 배양액 성분의 비율을 더욱 세분화해서 각배양성분의 여러 가지 비율에 따른 피더세포 성장/세포분열의 차이를 배양시간에 따른 피더세포수 변화로 나타낸 그래프이다. 이 때 피더세포 접종수는 단위 ㎠ 당 2,000 개로 고정하였다. (a) CF1 생쥐유래 섬유아세포 5 계대, (b) C57/Black 생쥐유래 섬유아세포 6 계대.

도 3 은 다양한 배지성분에서 60 시간 배양한 생쥐태아섬유아세포 (도 2)의 위상차 현미경사진이다. 배율은 40 배. (a) CF1 생쥐유래 섬유아세포 5 계대, (b) C57/Black 생쥐 유래 섬유아세포 6 계대.

도 4 는 섬유아세포의 일반적인 피더세포 배양액(10％ FBS)과 새로이 개발한 배양액(2％ FBS, 10％ SR, bFGF), 배아줄기세포용 배양액(20％ SR, bFGF)의 3 종류만을 비교해서 도 2의 그래프를 다시 그린 그래프이다. (a) CF1 생쥐유래 섬유아세포 5 계대, (b) C57/Black 생쥐유래 섬유아세포 6 계대.

도 5 는 배양액 성분의 비율을 더욱 세분화해서 각배양성분의 여러 가지 비율에 따른 피더세포 성장/세포분열의 차이를 배양시간에 따른 피더세포수 변화로 나타낸 그래프이다. 피더세포수 변화는 CellScreen (Innovatis, Inc.)을 이용하여 배양접시 위의 세포가 차지하는 면적의 변화로 확인하였다. 이 때 세포 접종수는 단위 ㎠당 2,000 개로 고정하였다. (a) CF1 생쥐유래 섬유아세포 5 계대, (b) C57/Black 생쥐유래 섬유아세포 6 계대.

도 6 은 다양한 배지성분에서 자라는 생쥐태아섬유아세포의 성장을 보여주는 도 5의 CellScreen image이다. (a) CF1 생쥐유래 섬유아세포 5 계대, (b) C57/Black 생쥐유래 섬유아세포 6 계대.

도 7 은 섬유아세포의 일반적인 피더세포 배양액(10％ FBS)과 새로이 개발한 배양액(2％ FBS, 10％ SR, bFGF), 배아줄기세포용 배양액(20％, SR, bFGF)의 3 종류만을 비교해서 도 5의 그래프를 다시 그린 그래프이다. (a) CF1 생쥐유래 섬유아세포 5 계대, (b) C57/Black 생쥐유래 섬유아세포 6 계대.

도 8 은 다양한 배지성분에서 자라는 생쥐태아섬유아세포의 성장을 보여주는 도 7의 CellScreen image이다. (a) CF1 생쥐유래 섬유아세포 5 계대, (b) C57/Black 생쥐유래 섬유아세포 6 계대.

도 9 는 생쥐태아섬유아세포에 마이토마이신을 1 시간 30 분 처리하여 세포 성장을 중지시킨 조건에서 배양액에 따른 세포생존률의 차이를 CellScreen (Innovatis, Inc.)을 이용하여 확인한 그래프이다. 이는 배아줄기세포의 피더로 사용하는 조건에서 피더세포의 생존률이 배지 조성에 따라 어떻게 달라지는지 확인하는 한 방법이다. (a) CF1 생쥐유래 섬유아세포 5 계대, (b) C57/Black 생쥐유래 섬유아세포 6 계대.

도 10 은 섬유아세포의 일반적인 피더세포 배양액(10％ FBS)과 새로이 개발한 배양액(2％ FBS, 10％ SR, bFGF), 배아줄기세포용 배양액(20％ SR, bFGF)의 3 종류만을 비교해서 도9의 그래프를 다시 그린 그래프이다. (a) CF1 생쥐유래 섬유 아세포 5 계대, (b) C57/Black 생쥐유래 섬유아세포 6 계대.

도 11 은 마이토마이신 처리 후 세포의 생존률 변화를 보여주는 도 9의 CellScreen image이다. (a) CF1 생쥐유래 섬유아세포 5 계대, (b) C57/Black 생쥐유래 섬유아세포 6 계대.

도 12 는 배양액 조성에 따른 생쥐태아섬유아세포의 근섬유아세포로의 교차분화율을 비교한 결과이다. 생쥐태아섬유아세포를 알파민무늬근액틴에 대한 면역형광염색을 실시하여 교차분화 세포를 확인하였다. 배율 40배. (a)(b) CF1 생쥐유래 섬유아세포 5 계대, (c)(d) C57/Black 생쥐유래 섬유아세포 6 계대.

도 13 은 일반적인 배아줄기세포세포 배양액(20％ 혈청대체물, 섬유아세포성장인자) 혹은 새로 개발한 배양액(2％ FBS, 10％ SR, bFGF)에서 냉동된 인간배아줄기세포 해동 후 세포 부착률 및 미분화 유지율을 비교한 그래프이다. (a) HSF6 세포주, (b) Miz4 세포주.

도 14는 새로 개발된 배양액으로 배양된 인간배아줄기세포를 질소탱크에 동결 보존 후 적어도 한달 이후 해동하여 세포의 부착률 및 분화율을 측정한 그래프이다.

도 15는 새로 개발된 배양액으로 배양과 동결 및 해동을 반복한 다음 미분화 표지자인 SSEA4, Tral-60, Oct4를 이용하여 형광염색한 결과이다.

도 16은 일반적인 배아줄기세포세포 배양액(20％ 혈청대체물, 섬유아세포성장인자) 혹은 새로 개발한 배양액(2％ FBS, 10％ SR, bFGF)에서 인간배아줄기세포 계대배양 시의 세포 부착률 및 미분화 유지율을 비교한 그래프이다. (a) HSF6 세포 주, (b) Miz4 세포주, (c) Miz6 세포주.

도 17은 일반적인 배차줄기세포세포 배양액(20％ 혈청대체물, 섬유아세포성장인자) 혹은 새로 개발한 배양액(2％ FBS, 10％ SR, bFGF)에서 인간배아줄기세포 계대배양 시의 배아줄기세포의 미분화 유지를 확인한 결과이다. (a) alakaline phospharase 염색, (b) 일반적인 인간배아줄기세포배양액에서의 SSEA4, Tral-60, Oct4의 면역형광염색, (c) 새롭게 수립된 인간배아줄기세포 배양액에서의 SSEA4, Tral-60, Oct4의 면역형광염색.

도 18은 유세포분석기(Flow cytometry)를 이용하여 미분화 표지자인 Tral-60의 세포표면발현을 확인한 것이다.

도 19는 RT-PCR 결과로 미분화 표지자인 Nanog, Rex1, SOX2의 RNA수준의 발현을 확인한 그림이다.

도 20은 새로 개발된 배양액으로 배양된 인간배아줄기세포의 핵형을 분석한 결과로 염색체 이상여부를 확인하기 위한 것이다.

도 21은 새롭게 수립된 배양액으로 배양후 동결시킨 인간배아줄기세포를 재해동하여 배양한 뒤 염색체 이상여부를 확인하기 위하여 핵형분석을 실시한 결과이다.

도 22는 배양액에 따른 인간 배아줄기세포의 세포사멸 정도에 대하여 알아보기 위한 것으로 일반적으로 알려진 조성의 배양액과 새로 개발된 배양액에서 배양된 세포의 Tunel 분석을 실시한 결과이다.

도 23은 새로 개발된 배양액에서 배양된 인간배아줄기세포가 3배엽성의 분화 능을 가지는지 확인하기 위해 배상체를 만든 것이다.

도 24는 새로 개발된 배양액에서 배양된 인간배아줄기세포의 배상체를 이용하여 3배입성 분화 가능성을 확인하고자 RT-PCR을 이용하여 RNA수준에서 aFP(내배엽 표지자), FLK1(KDR, 중배엽 표지자), NCAM1(외배엽 표지자)의 발현을 분석한 결과이다.

도 25는 새로 개발된 배양액에서 배양된 인간배아줄기세포가 3배엽 분화능을 가짐을 확인하기 위하여 배상체를 만들고 각각의 분화표지자를 이용하여 형광염색을 실시하여 Cytokeratin (케라틴, 3배엽 혼재표지자 및 상피세포표지자), aFP (알파꿰토프로틴, 내배엽표지자),SMA (Smooth muscle actin,중배엽표지자), Tuj1 (bⅢ-Tublin, 외배엽표지자)의 단백질 발현을 분석한 결과이다.

도 26은 새로 개발된 배양액의 구성 성분중 니코틴 아마이드 처리에 따른 인간배아 줄기세포의 배양 상태에 대한 그림이다.

도 27은 새로 개발된 배양액에 니코틴 아미드를 0, 10, 50, 100ug/ml로 넣은 후 인간배아줄기세포를 배양하여 RT-PCR을 수행한 결과로 HSF6와 Miz4 두 가지 세포주를 이용하여 실시한 것이다. Oct4, REX1, SOX2는 모두 미분화표지자이다.

도 28은 MSC(mesenchylmal stem cell : 중배엽 기원줄기세포)를 단위면적당 8000개의 세포를 깔아주고 5일동안 기른 후 그 표현형을 관찰한 사진이다.

도 29는 5일동안 배양된 MSC의 세포수를 계수한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

Mode for the Invention

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 세포 배양 및 배지 조성

임신 135일째 되는 생쥐(CF1, C57BL6)에서 추출된 태아섬유아세포(murine embryonic fibroblasts: MEF)를 일차 분리하여 다음 배지에서 배양하였다. 배지 조성은 DMEEM/F12배지 (GIBCO, USA, Cat.No. 12500-062)에 3.069g/l sodium bicarbonate (Sigma, USA, Cat.No. S5761), 2 mM L-glutamine (Sigma, Cat.No. S8540), penicillin(50U/ml)(Sigma, Cat.No. P4687)/streptomysin (50ug/ml)(Sigma, USA, Cat.No.S1277)를 기본 배지로 하여 여기에 10％ Fetal Bovine Serum (FBS; Hyclone, Cat.No. SH30070.03) 혹은 Knock-Out serum replacement (SR; Invitrogen BRL, Cat.No.10828-028), Basic Fibroblasts Growth Factor (bFGF; Invitrogen BRL, Cat.No. 13256-029), Insulin-Transferrin-Sodium Selenite Media Supplement(ITS; Sigma, cat.No. I-1884)이 다양한 조성으로 들어 있는 배지에서 37℃, 5％ CO ₂ 배양기에서 배양하였다 (표 2, 표 3a 참조). 적정 접종 세포수를 확인하기 위하여 단위 cm²당 1,000개와 2,000개의 세포를 접종하여 적정 세포수를 확인하였다 (실험결과 1 참조). 확인결과 단위 cm²당 2,000개가 더욱 적정한 수로 확인되어 이후 항상 2,000 개의 세포를 접종하였고, 배지 교환은 2일에 한 번 시행하였다.

실시예 2: 세포수 측정

배양 세포를 해당 시간에 배양을 중단하고 인산완충용액으로 세척 후 0.25 ％ Trypsin(2.5 g/L)-EDTA(0.38 g/L)(Invitrogen BRL, Cat.No.25200-114)을 처리하여 세포를 떼어낸 후 0.4％ Trypau blue (Sigma, Cat.No. T8154)용액으로 염색하여 haematocytometer에서 살아있는 세포수를 측정하였다(도 1, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 실험결과 1, 2 참조).

실시예 3: Alkaline phosphatase 염색

인간배아줄기세포는 alkaline phosphatase 염색을 통하여 염색이 되는 콜로니는 미분화, 염색이 안되는 콜로니는 분화 콜로니로 계수한다 (도 13, 14, 실험결과 5, 6 참조). Alkaline phosphatase 염색은 pH 9.5 Tris-Cl에 NBT/BCIP (Roche, Germany, Cat.No. 1 681 451) 용액을 99:1의 비율로 섞어 반응시켜 발색을 확인하였다.

실시예 4: CellScreen 분석

생쥐태아섬유아세포를 96 well plate에 단위 cm²당 2,000개 씩 접종하여 시간에 따라(배양 시작 후 14, 26, 40, 52, 65, 84 시간) 자란 세포가 차지하는 면적을 ％로 환산하였고 (도 5, 7, 9, 10, 실험결과 2, 3 참조) 시간변화에 따른 세포분포를 이미지로 나타내었다 (도 6, 8, 11, 실험결과 2, 3 참조). 실험 장비는 CellScreen (Innovatis Inc.)이다.

실시예 5: 마이토마이신처리

생쥐태아섬유아세포를 배아줄기세포의 피더로 사용하기 위해서는 성장을 억제하기 위해 Mitomycin C (Sigma, Cat.No.M-4287)를 10 ug/ml농도로 배양액에 첨가하여 1시간 30분 동안 처리한다. 배지 조성에 따라 마이토마이신처리 생쥐태아섬유아세포의 세포생존 및 사멸이 영향을 받는지 CellScreen장비를 이용하여 각각 14 시간, 28 시간, 48 시간 후 확인하였다(도 9-11, 실험결과 3 참조).

실시예 6: 면역형광염색

단일 클론항체인 알파민무늬근액틴(DAKO)을 섬유아세포의 근섬유아세포로의 교차분화 확인을 위하여 (도 12, 실험결과 4 참조), SSEA4 (Chemicon, Cat.No.90231), TRAl-60 (Chemicon, Cat.No. MAB436O), OCT4 (Santa cruz, Cat.No.sc-5279)을 인간배아줄기세포의 미분화여부를 확인하기 위하여 이용하였다(도 17, 실험결과 6 참조). 또한 3배엽 분화능을 알아보기 위하여 인간배아줄기세포를 배상체로 만든 후 aFP(내배엽 표지자; Zymed, Cat.No.18-0003),SMA(중배엽 표지자; DAKO, Cat.No.U7033), Tuj1(외배엽 표지자; Sigma, Cat.No.c-4385)항체를 이용하였다. 각각의 배양 세포는 면역형광염색을 위하여 먼저 4％ 포름알테히드로 고정하고 permeabilization (PBS-T; 1％ PBS, 0.1％ Tween-20)을 수행한 후 blocking solution (1％ PBS, 0.1 Bovine serum albumin)을 처리하여 비특이적인 항체반응을 차단하였다. 1차 항체(a-smooth muscle actin)는 4℃에서 Overnight 반응시킨 후 2차 항체인 형광 표지자(FITC)가 결합된 2 차 항체(Vector Laboratories)를 이용하여 염색하였다.

실시예 7: 배아줄기세포 해동 및 배양

냉동 배아줄기세포는 해동 후, 마이토마이신을 처리하여 성장을 억제시킨 생쥐배아섬유아세포가 접종되어 하루가 지난 배양접시 위에 접종하였다. 계대 배양도 같은 방법으로 수행하였다. 배지 조성은 일반적인 배아줄기세포용 배지, 20 ％ SR 혹은 새로 개발된 배지 2％ FBS, 10％ SR 두 가지를 비교하였다 (도 13, 16, 실험결과 5, 6). 배지 교환은 매일 시행하였다.

실시예 8: 배상체 형성(Embryoid Body)

충분히 자란 배아줄기세포의 콜론을 적당한 크기로 잘라서 세포가 붙지않도록 특수 처리된 배양접시(hydrocell, japan) 위에서 bFGF를 첨가하지 않은 Knockout Serum replacement 10％, 2％ FBS, DMEM/F12 배양액을 이용하여 콜론포를 띄워서 배양하여 배상체가 형성되도록 하였다.

실시예 9: RT-PCR

Trizol®reagent (invitrogen, Cat.No.15596-018)를 이용하여 새로 개발된 배양액으로 배양된 인간배아줄기세포주와 배상체에서 RNA를 추출한 후 AMV revers-transcriptase를 이용하여 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA를 만들었다. 만들어진 cDNA는 목적에 따라 β-Actin, Nanog, Rex1, SOX2, aFP, FLK1, NCAM1 Primer를 이용하여 95℃ 45sec, 55℃ 45sec, 72℃ 45sec, 30cycles로 PCR을 수행하였다.

실시예 10: Flow cytometry

일반적으로 알려진 조성의 배양액과 새롭게 개발된 배양액으로 기른 인간배아줄기세포를 단일세포로 분리한 뒤 인산완충용액(PBS)에 1％ 우혈청알부민(BSA; Bovine serum albumin)을 섞은 용액에 미분화 표지자인 Tral-60(Chemicon, Cat.No.MAB4360)을 넣어 저온(4℃)에서 3시간 이상 반응시킨 후 2차 항체인 FITC anti-mouse(JacksonImmunoResearch, Cat.No.315-095-033)를 50min동안 반응시켰다. paraformaldehyde로 고정한 후 유세포분석기(Flow cytometry, BD)로 분석하였다.

실시예 11: 핵형분석(Cytogenetic Analysis)

염색체이상의 유무를 확인하기 위해 핵형분석(karyotype)을 실시하였다. 우선, 새로 개발된 배양액에서 여러 계대를 배양한 배아줄기세포(도20)와 새로 개발된 배양액에서 배양과 동결보관 그리고 재해동 및 배양을 반복한 배아줄기세포(도21)를 충분히 자랄때까지 배양한 후에 3시간 동안 콜세미드(0.1ug/ml, invitrogen)를 처리하고 이를 단일세포로 분리한 후 고정하여 유리 슬라이드에서 G-band를 관찰하였다. 핵형분석은 최소 25 cases를 대상으로 하였다. 그 결과, 새로 개발된 배양액은 안정적인 것으로 염색체에 아무 이상이 없는 것으로 확인되었다.

실시예 12: 세포사멸분석(Tunel assay)

충분히 자란 배아줄기세포를 paraformnaldehyde로 고정한 후 0.1％ Triton-X100을 처리하여 Tunel 시약이 세포내로 잘 침투하도록 하였다. Tunel 반응시약과 완충용액(Roche, Cat.No.11-684-795-910, Germany)을 1:9로 섞어 처리하고 1시간 30분이상 37℃ 암조건에서 반응시킨 후 DAPI를 5분간 반응시켜 핵염색을 실시하였다. 형광현미경 하에서 형광 발현 정도를 확인하였다.

실시예 13: Nicotiuamide 처리에 따른 인간배아줄기세포 분석

새로 개발된 인간배아줄기세포 배양액에 니코틴아미드(Nicotinamide)를 10ug/ml, 50ug/ml, 100ug/ml로 첨가하여 줄기세포를 배양하였다. 표현형으로 볼 때 , 6계대 이상부터 니코틴아미드의 효과가 뚜렷하게 나타나기 시작하였으며 RT-PCR 결과, 니코틴아미드 10ug/ml의 경우에 인간 배아줄기세포는 가장 미분화능을 잘 유지하였다.

실험결과 1. 섬유아세포의 성장 및 세포 분열에 적합한 배지조성

섬유아세포를 혈청, ITS, SR, bFGF를 조합하여 세포의 성장/증식에 미치는 영향을 60 시간 후 세포수 측정으로 확인하였다. 초기 접종 세포수는 단위 cm²당 1,000 개와 2,000개를 깔아 초기 접종 세포수에 따른 차이도 비교하였다.

초기 접종 세포수가 2,000 개를 접종한 경우 60 시간 후 적어도 4배 이상 증가하는 데에 비해 1,000 개를 접종한 경우 60 시간 후 2 배 정도 밖에 증가하지 않았다. 따라서 적정 초기접종 세포수는 2,000 개 정도로 사료되어 향후 모든 실험에서 초기 접종 세포수를 2,000 개로 고정하였다.

도 1에 나타난 바와 같이 혈청만으로는 세포수의 증가가 충분치 알았다. 우태아혈청에 SR이나 ITS를 첨가할 때 세포의 증식이 활발함을 알 수 있었고 이 중 섬유아세포의 증식에 가장 적절한 조건은 혈청과 SR, bFGF 가 혼합된 배지조성(표 2의 5번 배지)임을 알 수 있다 (도 1).

[표 2] MEF (CF1) cell growth at various media components (도 1)

실험결과 2. 섬유아세포의 성장 및 세포 분열에 적합한 배지성분의 비율

우태아혈청의 비율을 2-10％, 우태아혈청에 부가적으로 ITS, SR, bFGF를 다양한 조성으로 참가, 다양한 비율의 SR 배지에 bFGF를 첨가하여 섬유아세포의 성장을 비교하였다 (도 2-6).

그 결과 우태아혈청에 SR, bFGF가 첨가된 배지 조성 (표 3a의 7 번 8번 배지)에서 섬유아세포의 증식이 가장 활발하였고, SR 배지에서 섬유아세포의 증식이 가장 저조하였다. 세포수 측정과 CellScreen을 이용한 세포면적측정법이 정확히 일치하였다. 두 종류의 생쥐 strain인 CF1과 C57Black이 모두 일관된 결과를 보여주었다.

[표 3a] MEF (CF1) cell growth at various media components, plated at 2,000 cells/cm²(도 2a)

[표 3b] MEF (C57Black) cell growth at various media components, plated at 2,000 cells/cm² (도 2b)

[표 4a] MEF (CF1) cell growth in conventional feeder mcdia(10％ FBS), optimized media(2％FBS+10％SR+bFGF) and ES media(20％SR+bFGF), plated at 2,000 cells/cm² (도 4a)

[표 4b] MEF (C57Black) cell growth in conventional feeder media(10％ FBS), optimized media(2％FBS+10％SR+bFGF) and ES medis(20％SR+bFGF), plated at 2,000 cells/cm² (도 4b)

[표 5a] MEF (CF1) cell growth measured by 'CellScreeu (Innovatis inc.)' (도 5a)

[표 5b] MEF (C57Black) cell growth measured by 'CellScreen (Innovatis iuc.)' (도 5b)

[표 6a] MEF (CF1) cell growth measured by 'CellScreen (Innovatis inc.)' in conventional feeder media, optimized media and ES media, plated at 2,000 cells/cm² (도 7a)

[표 6b] MEF (C57Black) cell growth measured by 'CellScreen (Innovatis inc.)' in conventional feeder media, optimized media and ES media, plated at 2,000 cells/cm² (도 7b)

피더세포로 이용되는 생쥐 섬유아세포의 경우에도 새롭게 수립된 배양액이 우수한 것으로 확인되었다. 도 8a는 시간에 따라 섬유아세포(CF1)의 growth area를 cell screen machine을 이용하여 사진을 찍은 것이다. FBS 10％ 배양액은 일반적인 생쥐섬유아세포 배양액으로 알려진 조성이고, FBS 2％+SR 10％+bFGF는 새롭게 수립 된 배양액이며, 20％ SR+bFGF는 일반적인 인간배아줄기세포 배양액 조성이다. 이로부터, 새롭게 수립된 인간배아줄기세포 배양액이 생쥐섬유아세포를 기르는데도 좋은 것으로 확인되었다.

실험결과 3. 배지 조성에 따른 마이토마이신처리 섬유아세포의 생존률 비교

7번과 8번 배지에서만 46 시간 까지 세포수가 줄지 않았고 나머지 배지에서는 모두 세포수가 감소하였다(도9-11). 특히 배아줄기세포용 배지에서 마이토마이신처리 섬유아세포의 세포수 감소가 급격하게 높은 것으로 보아 일반적인 배아줄기세포 배양 조건에서 피더세포의 생존이 매우 어렵고 이와 같은 배양 조건은 피더세포가 피더 역할을 하는 데에 큰 장애가 될 것으로 사료된다. 이와 같은 현상은 CF1과 C57Black 두 종류의 strain에서 모두 동일하게 관찰되었다.

[표 7a] MEF (CF1) cell number change at 1.5 hr after MMC treatment measured by 'CellScreen (Innovatis inc.)' (도 9a)

[표 7b] MEF (C57Black) cell number change at 1.5 hr after MMC treatment measured by 'CellScreen (Innovatis inc.)' (도 9b)

[표 8a] MEF (CF1) cell number chauge at 1.5 hr after MMC treatment measured by 'CellScreen (Innovatis inc.)' in conventional feeder media, optimized media and ES media. (도 10a)

[표 8b] MEF (C57Black) cell number change at 1.5 hr after MMC treatment measured by 'CellScreen (Innovatis inc.)' in conventional feeder media, optimized media and ES media. (도 10b)

인간배아줄기세포를 기르기 위해서는 미토마이신 C를 처리하여 피더세포의 세포분열을 억제시키는데, 피더세포로 이용되는 섬유아세포에 미토마이신 C를 처리한 후 각 배양액에서 세포의 유지 정도를 관찰하였다. 도 11a는 CF1 Cell Screen results이다: MMC Treatment 1hr30min. Cell screen machine으로 분석한 결과 새로 수립된 배양액이 우수한 것으로 나타났다.

실험결과 4. 배지 조성에 따른 섬유아세포의 특성유지

섬유아세포는 TGF-b가 존재하거나 혈청, 장기배양에 따른 노화, 저밀도 배양에 의해 근섬유아세포로 교차분화할 수 있다. 세포의 상태가 좋을 때 이와 같은 교차분화는 잘 일어나지 않는다. 따라서 섬유아세포의 상태를 근성유아세포의 교차분화율을 통해 확인하였다. 7번과 8번, 9-11 번 배지에서 교차분화는 현저하게 낮았다 (도 12). 이와 같은 현상은 CF1과 C57Black 두 종류의 strain에서 모두 동일하게 관찰되었다.

실험결과 5. 배지조성에 따른 인간배아줄기세포의 해동 후 세포부착 및 미분화 유지

두 종류의 인간배아줄기세포주 (HSF6, 50 계대와 Miz4 32 계대)를 일반적인 배아줄기세포용 배지 (20 ％ SR, 4 ng/ml bFGF)와 새로 개발된 배지(2％ FBS + 10％ SR, 2 ng/ml bFGF)에서 해동하여 배양접시 당 20 개의 세포 덩어리를 접종하였다. 미분화여부는 알칼라인 포스파타아제 염색을 통하여 확인하였다. 해동 후 접종 24 시간 후 확인하였을 때 부착률에서 새로 개발된 배지가 더욱 우수하였고 5 일 후 미분화를 유지하는 콜로니 수에서 2 배 이상 새 배지가 높음을 알 수 있었다(도 13).

또한, 새로 수립된 배양액(10％Sr+2％FBS)으로 배양한 인간배아 줄기세포를 냉동시킨 후 다시 해동하여 먹이세포에 잘 부착되는지, 미분화비율을 얼마나 유지되는지를 측정하였다. 도 14는 새로 개발된 배양액으로 배양된 인간배아줄기세포를 질소탱크에 동결 보존후 적어도 한달 이후 해동하여 세포의 부착률 및 분화율을 측정한 그래프이다. 도 13a,b의 경우는 이미 얼려져 있는 세포를 해동하여 부착과 분화 여부를 본것이고 도 14는 새로 개발된 배양액으로 계속 배양하다가 이를 동결한 다음 한달이후에 해동하여 부착과 분화여부를 계수한 것이다.

새롭게 수립된 배양액(10％SR+2％FBS)을 이용하여 배양된 인간 배아세포를 냉동시킨 후 재해동하여 배양한 뒤 미분화표지자로 형광 염색하였다. 인간 배아세포는 정상적으로 미분화 표지자를 발현하였다. 도 15는 새로 개발된 배양액으로 배양과 동결 및 해동을 반복한 다음 미분화 표지자인 SSEA4, Tral-60, Oct4를 이용하여 형광염색한 결과이다. (HSF6 : scale bar 10um) 도 15는 도 17b,c와 달리 새로 개발된 배양액으로 지속적으로 배양하다가 이를 동결한 다음 한달이후에 해동하여 새로 개발된 배양액으로 배양하여 미분화 표지인자로 형광염색한 결과이다.

실험결과 6. 배지조성에 따른 인간배아줄기세포의 계대 배양 시 세포부착 및 미분화 유지

세 종류의 인간배아줄기세포주 (HSF6, 57 계대와 58 계대, Miz4 44 계대, Miz6 35 계대)를 일반적인 배아줄기세포용 배지 (20 ％ SR, 4 ng/ml bFGF)와 새로 개발된 배지(2％ FBS + 10％ SR, 2 ng/ml bFGF)에서 계대 배양하여 배양접시 당 20 개의 세포 덩어리를 접종하였다. 접종 24 시간 후 확인하였을 때 부착률에서 새로 개발된 배지가 우수하였고 5 일 후 미분화를 유지하는 콜로니 수도 새 배지가 현저하게 우수함을 알 수 있었다(도 16). 새로이 개발된 배지에서 인간배아줄기세포가 미분화상태를 유지함을 8 계대 째에 면역염색 및 alkaline phosphatase로 확인하였고(도 17), 13 계대 이상 계대 배양 가능함을 확인하였다. 도 17b 및 17c는 인간배아줄기세포의 미분화 확인인자로 형광염색한 결과이다. SSEA4, Tral-60, Oct4는 모두 미분화인자이다. 도 17b: 일반적인 인간배아줄기세포배양액(20％SR), 도 17c: 새롭게 수립된 인간배아줄기세포 배양액 (10％SR+2％FBS)

또한, 유세포분석법(Flow Cytometric Aualysis)을 통하여 미분화 인자인 Tral-60의 세포표면발현을 확인하였다. 도 18은 유세포분석기(Flow cytometry)를 이용하여 미분화 표지자인 Tral-60의 세포표면발현을 확인한 것이다. (Flow Cytometric Analysis : Tral-60) 새로 수립된 배양액에서 tral-60이 정상적으로 발현되고 있음을 확인할 수 있다.

또한, 새롭게 수립된 배양액에서 RT-PCR방법을 통하여 미분화 인자들을 확인하였다. 도 19는 RT-PCR 결과로 미분화 표지자인 Nanog, Rex1, SOX2의 RNA수준의 발현을 확인한 그림이다. (Expression of self-renewal maker in 10％SR+2％FBS medium) 미분화 표지자가 정상적으로 발현되고 있음을 확인 할 수 있다.

실험결과 7. 인간배아줄기세포의 핵형분석

새롭게 수립된 인간배아줄기세포 배양액에서 길러진 인간배아줄기세포의 핵형분석을 실시하였다. 염색체 이상이 전혀 나타나지 않는 것으로 보아 안전한 배양액이라 판단된다. 도 20은 새로 개발된 배양액으로 배양된 인간배아줄기세포의 핵 형을 분석한 결과로 염색체 이상여부를 확인하기 위한 것이다. 새롭게 수립된 배양액으로 배양 후 냉동시킨 인간배아줄기세포를 재해동하여 배양한 뒤 핵형분석을 실시하였다. 도 21은 새롭게 수립된 배양액으로 배양후 동결시킨 인간배아줄기세포를 재해동하여 배양한 뒤 염색체 이상여부를 확인하기 위하여 핵형분석을 실시한 결과이다. 분석결과 염색체 이상이 전혀 나타나지 않아 정상적인 것으로 해석되었다. 이것으로서 새로 수립된 배양액이 안정적인 것으로 확인 되었다.

실험결과 8. 인간배아줄기세포의 세포사멸 분석

배양액에 빠른 인간 배아줄기세포의 세포사멸 정도를 알아보기 위하여 Tunel 분석을 실시하였다. 형광현미경 하에서 형광정도를 확인한 결과 일반적인 인간배아줄기세포 배양액에 비하여 새로 수립된 인간 배아줄기세포의 배양액에서 형광이 더 적게 나타나 새로 수립된 배양액의 조성에서 배아줄기세포가 더 건강한 것으로 나타났다. 도 22는 배양액에 따른 인간 배아줄기세포의 세포사멸 정도에 대하여 알아보기 위한 것으로 일반적으로 알려진 조성의 배양액과 새로 개발된 배양액에서 배양된 세포의 Tunel 분석을 실시한 결과이다. (Scale bar : 10um)

실험결과 9. 인간배아줄기세포의 3배엽 분화능 분석

인간배아줄기세포가 3배엽 분화능을 가짐을 확인하기 위하여 배상체(Embryoid body : EB)를 만들고 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR결과 RNA수준에서 3배엽 표지자가 모두 발현되는 것으로 보아 새로 수립된 배양액은 인간배아 줄기세포의 기본적인 특성을 유지하면서 배양하는데 적합한 배양액으로 판단된다. b-actin : control, aFP : 내배엽 표지자, FLK1(KDR) : 중배엽 표지자, NCAM1 : 외배엽 표 지자. 도 23은 새로 개발된 배양액에서 배양된 인간배아줄기세포가 3배엽성의 분화능을 가지는지 확인하기 위해 배상체를 만든 것이다. (Whole mount, scale bar : 500um) 도 24는 새로 개발된 배양액에서 배양된 인간배아줄기세포의 배상체를 이용하여 3배엽성 분화 가능성을 확인하고자 RT-PCR을 이용하여 RNA수준에 서 aFP(내배엽 표지자), FLK1(KDR, 중배엽 표지자), NCAM1(외배엽 표지자)의 발현을 분석한 결과이다. (scale bar : 500um)

인간배아줄기세포가 3배엽 분화능을 가짐을 확인하기 위하여 배상체를 만들고 일주일간 배양한 후에 3배엽 분화표지자를 이응하여 형광염색을 실시하였다. 그 결과 3배엽성 표지자가 모두 발현하고 있으며, 내배엽, 중배엽, 외비엽 혼재 표지자도 모두 발현하고 있어 새로 수립된 배양액에서 배양된 인간배아줄기세포는 배아줄기세포의 기본적인 특성을 모두 유지하고 있는 것으로 보인다. 도 25는 새로 개발된 배양액에서 배양된 인간배아줄기세포가 3배엽 분화능을 가짐을 확인하기 위하여 배상체를 만들고 각각의 분화표지자를 이용하여 형광염색을 실시하여 Cytokeratin (케라틴, 3배엽 혼재표지자 및 상피세포표지자), aFP(알파페토프로틴, 내배엽표지자),SMA (Smooth muscle actin,중배엽표지자), Tuj1(bⅢ-Tublin, 외배엽표지자)의 단백질 발현을 분석한 결과이다.

실험결과 10. Nicotinamide 처리에 따른 인간배아줄기세포의 분석

인간배아줄기세포는 HSF6와 Miz4 두가지 세포주를 이용하였으며, 표현형을 관찰하였을 때, 니코틴아미드를 10-5Oug/ml 의 경우에 최적의 상태를 보였으며 특히 50ug/ml을 넣었을 때 세포의 표현형이 더 좋아지는 것으로 나타났다. 그러나 100ug/ml을 넣었을 경우는 계대배양이 계속될수록 분화율이 높게 나타났다. 대조군은 새로 개발된 배양액에 니코틴아미드를 넣지 않은 것을 이용하였다. 반면, 미분화 표지자(Oct4, Rex1, SOX2)를 확인한 RT-PCR결과[도27]는 대조군과 니코틴아미드를 10ug/ml로 넣었을 경우에 미분화를 잘 유지하고 특히 니코틴 아미드 10ug/ml에서 최적의 상태를 보이는 것으로 나타났다. 도 26은 새로 개발된 배양액의 구성 성분중 니코틴 아마이드 처리에 따른 인간배아줄기세포의 배양 상태에 대한 그림이다. 도 27은 새로 개발된 배양액에 니코틴 아미드를 0, 10, 50, 100ug/ml로 넣은 후 인간배아줄기세포를 배양하여 RT-PCR을 수행한 결과로 HSF6와 Miz4 두 가지 세포주를 이용하여 실시한 것이다. Oct4, REX1, SOX2는 모두 미분화 표지자이다.

실험결과 11. 인간성체줄기세포의 배양 분석

새로 개발된 배양액의 조성은 MSC (mesenchymal steln cell : 중배엽 기원줄기세포) or SVF (stroma vescylar fraction) 이나 지방전구세포 등을 배양하는 데에도 효과적인 것으로 나타났는데 이 경우 기초 배양액을 low glucose로 해주면 된다. MSC 세포를 단위면적 당(cm²) 8000개의 세포가 되도록 배양접시에 일정한 수로 깔아주고 일반적인 배양액과 새로 개발된 배양액을 이용하여 5일간 배양한 후에 세포의 형태[도 28]와 자라는 속도[도 29]를 관찰하였다. 세포수 계수는 trypan blue(sigma, Cat.No.T8-154) 염색 후 실시하였으며 그 결과 새로 개발된 배양액의 경우 더 빠른 속도로 자라는 것으로 확인 되었다. 도 28은 MSC(mesenchymal stem cell : 중배엽 기원줄기세포)를 단위면적당 8000개의 세포를 깔아주고 5일동안 기 른 후 그 표현형을 관찰한 사진이다. 도 29는 5일동안 배양된 MSC의 세포수를 계수한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명에 따르면, 새롭게 수립된 배양액에서 인간배아줄기세포가 더 건강하고 전분화능도 잘 유지하며 염색체 이상도 전혀 나타나지 않는 것으로 나타났다. 또한, 새롭게 수립된 배양액은 피더세포로 이응되는 섬유아세포 배양에도 효과적인 것으로 확인되었다. 또한, 이 배양액의 조성은 MSC (mesenchymal stem cell : 간충직줄기세포) 혹은 SVF (stroma vascular fraction, 지방전구세포), 일차배양 된 피부섬유아세포(data not shown)를 배양하는 데에도 효과적인 것으로 나타났다. 따라서 기존의 배지성분보다 저렴하고 간편하게 피더세포와 줄기세포 모두에 최적화한 배지로 줄기세포를 거의 분화됨 없이 미분화상태를 유지하면서 배양할 수 있고, 이 배양 성분으로 줄기세포를 대량 배양하는 데에 유용하게 활용할 수 있으며 이 배지 조성이 줄기세포와 일차배양 섬유아세포에 모두 최적화한 배지인 것으로 보아 종류에 무관하게 일차배양 세포에 모두 보편적으로 최적화된 배지로 활용될 수 있을 것이다.

Claims

기본배지에 1-10％ 우태아혈청(FBS), 1-20％ 혈청대체물(SR) 및 0.1-4 ng/ml 섬유아세포성장인자(bFGF)를 첨가한 것을 특징으로 하는 줄기세포 및 피더세포의 공배양용 배지 조성물.
기본배지에 1-10％ 우태아혈청(FBS), 1-20％ 혈청대체물(SR) 및 0.1-4 ng/ml 섬유아세포성장인자(bFGF)를 첨가한 것을 특징으로 하는 일차배양세포의 배양용 배지 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 기본배지는 DMEM 혹은 DMEM/F12 인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 기본배지에 1-5％ 우태아혈청(FBS), 5-15％ 혈청 대체물(SR) 및 1-4 ng/ml 섬유아세포성장인자(bFGF)를 첨가한 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 줄기세포는 냉동보존 후 해동된 줄기세포인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제 1항에 있어서, 니코틴아미드를 3-30ug/ml 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제 1항의 배지조성물을 이용하여 줄기세포 및 피더세포의 성장을 최적화하는 방법.
제 1항의 배지조성물을 이용하여 피더세포의 성장 및 피더역할을 최적화하는 방법.
제 1항의 배지조성물을 이용하여 줄기세포의 자기 본연의 특성을 유지하면서 배양하는 방법.
제 1항의 배지조성물을 이용하여 냉동보존된 줄기세포의 해동 후 세포 부착률 및 미분화유지를 최적화하는 방법.