KR101446328B1

KR101446328B1 - 중간엽줄기세포 배양액을 포함하는 수정란 배양용 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101446328B1
Application number: KR1020130145458A
Authority: KR
Inventors: 김은영; 박세필
Original assignee: 주식회사 미래셀바이오; 제주대학교 산학협력단
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2014-10-07

Abstract

본 발명은 수정란 배양용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 중간엽줄기세포의 배양액을 포함하는 수정란 배양용 조성물에 관한 것으로서, 이를 이용하여 양질의 우수한 수정란을 생산할 수 있다.

Description

중간엽줄기세포 배양액을 포함하는 수정란 배양용 조성물 및 이의 제조방법{COMPOSITION FOR CULTURE OF EMBRYO COMPRISING MESENCHYMAL STEM CELLS MEDIUM AND METHOD FOR PREPARING THE SAME COMPOSITION}

돼지는 가축으로서뿐만 아니라 장기이식, 형질전환동물 생산 및 줄기세포 연구 분야에서 그 중요도가 매우 높다(Prather 등 2003). 특히 양질의 돼지 수정란은 연구분야의 수요가 많아 높은 생산효율이 요구된다. 그러나 기존의 돼지수정란배양에 사용되고 있는 North Carolina State University (NCSU-23 or NCSU-37, Reed at al. 1992) 배양액 또는 porcine zygote medium (PZM-3 or PZM-5, Yoshioka 등. 2002) 배양액은 발달율이 저조하고 수정란의 세포 수 또한 체내수정란에 비해 현저히 낮다는 문제점이 있어왔다. (Zijlstra 등. 2008).

이에 대하여 체외수정란 발달을 향상시키기 위한 일환으로 이들 배양액에 BSA또는 소태아혈청을 첨가하는 연구가 보고되었으며 BSA와 소태아혈청이 삼투압과 수소이온농도 조절 및 에너지원이 되는 아미노산을 포함하고 있어(Gardner 와 Lane 1997) 수정란 발달율 향상에 가장 효과적인 요소로 알려져 있다. 하지만 이러한 점에도 불구하고 (Carolan 등. 1995) 체외수정란 배양에 사용되었을 때 체내수정란에 비해 세포수 및 발달율이 낮다는 문제점이 여전히 존재한다. 특히 소태아혈청은 발달 초기에 사용했을 때 소태아혈청내에 들어있는 과 영양성분으로 인해 수정란의 발달을 저하시키는 것으로 알려져 있다 (Pinyopummintr 와 Bavister 1991). 따라서 양질의 돼지수정란을 다수 확보할 수 있는 안정된 배양환경 시스템 개발이 요구된다.

최근 줄기세포는 다양한 계열의 특정세포로 분화할 수 있는 만능세포로 치료용 세포로 이용 가능하다고 보고되고 있으며 특히 지방조직유래 중간엽줄기세포는 쉽게 획득될 수 있으며 골수유래 세포와 비교했을 때 증식이 40 배 이상 빠른 것으로 알려져 있다(Boquest 등 2006). 지방조직유래 중간엽줄기세포는 interleukin (IL)-10 과 basic fibroblast growth factor (bFGF) 와 같은 성장인자를 분비하여 (Heo 등 2010; Ivanova-Todorova 등 2012), 이들 성장인자들은 화장품이나 제약산업에 활용될 수 있다는 장점을 갖는다.

기존의 수정란 배양에 사용되고 있는 배양액은 발달율이 저조하고 수정란의 세포 수 또한 체내수정란에 비해 현저히 낮다는 문제점이 있어왔고, 이를 해결하기 위하여 배양액에 BSA또는 소태아혈청을 첨가하는 연구가 행하여지고 있으나, 이를 체외수정란 배양에 사용되었을 때 체내수정란에 비해 세포수 및 발달율이 낮다는 문제점이 여전히 존재한다. 특히 소태아혈청은 발달 초기에 사용했을 때 소태아혈청내에 들어있는 과영양성분으로 인해 수정란의 발달을 저하시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 양질의 돼지수정란을 다수 확보할 수 있는 안정된 배양환경 시스템 개발이 요구된다.

본 발명의 제1 측면은, 중간엽줄기세포 배양액을 포함하는 수정란 배양용 조성물을 제공한다.

상기 중간엽줄기세포 배양액은 혈청 배지 또는 무혈청 배지에서 3내지 5 계대 배양하여 얻어진 중간엽줄기세포 배양액의 상층액일 수 있다.

상기 혈청 배지는 DMEM 또는 DMEM/F12 배지일 수 있다.

상기 중간엽줄기세포 배양액은 인체 지방조직, 골수조직, 양막조직, 탈락막조직, 제대조직 및 태반조직 중 어느 하나로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 중간엽줄기세포 배양액은 상기 수정란 배양용 조성물 중 5 내지 15 부피% 일 수 있다.

본 발명의 제2 측면은, 조직을 계대배양으로 증식하는 단계; 상기 증식된 조직으로부터 중간엽줄기세포를 획득하는 단계; 상기 중간엽줄기세포의 성장을 억제시키면서 상기 중간엽줄기세포를 배양한 후, 그 상층액을 회수하여 여과하는 단계; 및 상기 중간엽 줄기세포 배양액을 수정란 배양용 조성물에 첨가하는 단계;를 포함하는 수정란 배양용 조성물 제조방법을 제공한다.

상기 조직은 인체 지방조직, 골수조직, 양막조직, 탈락막조직, 제대조직 및 태반조직 중 어느 하나로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 제3 측면은, 중간엽줄기세포 배양액을 포함하는 수정란 배양용 조성물에서 수정란을 배양하는 수정란 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 중간엽줄기세포 배양액을 포함하는 수정란 배양용 조성물을 제공하며, 이의 제조방법 및 이를 이용한 수정란 배양방법을 제공한다. 이러한 수정란 배양용 조성물은 수정란의 배양에 있어서, 중간엽줄기세포 배양액을 포함함으로서 기존에 사용되던 BSA (bovine serum albumin, 소혈청알부민) 와 소태아혈청 (fetal bovine serum, 소태아혈청) 보다 효율적으로 양질의 우수한 수정란을 다량으로 생산할 수 있는 효과를 갖는다.

도 1은, 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포의 증식된 상태의 모양을 나타낸 것이다.
도 2는, 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포를 검증하기 위하여 중간엽줄기세포마커 (CD90 및 CD105) 및 조혈모세포마커 (CD34 및 CD45)로 처리하였을 때 형광물질의 발현을 나타낸 것이다 (Scale bars: 200 ㎛).
도 3은, 미토콘드리아 및 핵을 염색한 것으로 녹색은 미토콘드리아이며, 파란색은 핵을 나타낸다 (Scale bars; 100 ㎛).
도 4는, ZFN software를 통해 미토콘드리아 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다 (*p<0.05, **p<0.01).
도 5는, 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 처리에 따른 배반포배의 상대적 유전자 발현 양을 나타낸 것이다. (*p<0.05, **p<0.01)

줄기세포란 미분화 세포로서, 오랜 기간 동안 분열을 하고 자기 갱신 (self-renewal)을 할 수 있으며, 어떤 조건이 주어지면 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 줄기세포는 배반포(blastocyst)의 내부세포괴(inner cell mass)로부터 분리되는 배아줄기세포(embryonic stem cell) 및 성체 조직으로부터 분리되는 성체줄기세포(adult stem cell)로 크게 분류할 수 있는데 잠재 능력은 배아줄기세포보다 한정적인 단점이 있으나, 윤리적 문제가 없고 부작용이 없는 성체 줄기세포를 대상으로 많은 치료제가 연구되고 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 성체 줄기세포를 이용하고, 이는 시판되는 줄기세포나 생체조직으로부터 분리한 줄기세포를 이용할 수 있다.

본 발명은 중간엽줄기세포 배양액을 포함하는 수정란 배양용 조성물을 제공한다.

상기 수정란 배양용 조성물이란, 해당 종의 수정란이 배양되는 난관이나 자궁의 체액성분을 바탕으로 분석되고 삼투압 (260~300) 과 수소이온농도 (7.4~8.0) 의 균형을 맞추어 제조된 것으로서, 기본적으로 무기염류 (NaCl, KCl, KH₂PO₄, MgSO₄, NaHCO₃. 외에도 기타 추가될 수 있는 염류로서 CaCl₂, NaH₂PO₄, MgCl₂6H₂PO₄), 에너지원 (Na-pyruvate, lactate, L-glutamine, Glucose), 아미노산 [필수아미노산(BME-AA), 비필수아미노산 (MEM-NEAA)], 항생제 (Gentamicin, penicillin G 또는 streptomycin), 단백질(Albumin 외 단백질 여러 종류 또는 FBS) 및 그 외 첨가물 [성장인자 (EGF, IGF, FGF 등), Insulin, Transferrin, 타우린, 비타민 등] 등이 함유될 수 있으며, 수정란 배양용 조성물의 구성성분들이 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 중간엽 줄기세포는 포유동물에서 유래된 배아 줄기세포뿐만 아니라 성체 줄기세포를 포함하며, 성체 줄기세포는 모든 조직의 성체줄기세포에서 유래한 것일 수 있다. 예를 들면 성체 줄기세포는 골수 유래, 제대혈 유래, 혈액 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래, 신경 유래, 부신 유래, 상피 유래 및 자궁 유래 등으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 지방조직 (Fat tissue), 골수조직(bone marrow), 양막조직 (amniotic tissue), 탈락막조직 (decidual tissue), 제대조직 (umbilical cord tissue) 또는 태반조직 (placental tissue) 등에서 분리된 줄기세포일 수 있다.

바람직하게는 상기 중간엽줄기세포는 인체 지방조직으로부터 유래된 줄기세포일 수 있다. 인체 지방 유래 줄기세포는 인간의 지방조직으로부터 분리된 일종의 성체 줄기세포이다. 지방조직의 획득은 통상적으로 시행되는 지방흡입(liposuction) 과정, 분만 과정 또는 환자의 수술과정에서 개복부위 등에서 부수적으로 얻을 수 있어 충분한 양의 줄기세포를 용이하게 얻고 배양할 수 있다는 장점이 있으며, 또한 골수 채취에 비해 안전성이 우수하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 인체지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 사용하여 중간엽줄기세포 배양액을 제조하였으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, '중간엽줄기세포 배양액'이란 중간엽줄기세포를 배지에서 계대배양하여 얻어진 중간엽줄기세포 배양액의 상층액 부분을 의미하며, 이와 구별하여, 본 명세서에 기술된 '기본 배양액' 또는 '배양액'은 줄기세포를 배양하기 위하여 넣어주는 배양액을 자체를 의미한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한, 중간엽줄기세포 배양액을 포함하는 수정란 배양용 조성물에 있어서, 상기 중간엽줄기세포 배양액은 바람직하게는 혈청 배지 또는 무혈청 배지에서 3내지 5 계대배양하여 얻어진 중간엽줄기세포 배양액의 상층액일 수 있다.

상기 줄기세포 배양을 위한 배지는 당업계에 알려진 기본 배지를 제한 없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 혈청 배지 또는 무혈청 배지를 사용할 수 있다. 상기 혈청 배지는 혈청 (FBS, fetal bovine serum)이 들어간 배양액이며, 무혈청 배지는 혈청대체제 (SR, serum replacement)이 들어간 배양액으로서, 바람직하게는 혈청 배지를 사용할 수 있다. 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 DMEM 또는 DMEM/F12 를 사용할 수 있다.

또한, 상기 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 첨가할 수 있는데, 이러한 보조성분으로는 태아 송아지, 말 또는 사람 등의 혈청을 비롯하여, 미생물의 오염을 막기 위한 페니실린 G (Penicillin G), 스트렙토마이신 설페이트 (streptomycin sulfate) 및 젠타마이신 (gentamycin) 등의 항생제, 암포테리신 B(amphotericin B) 및 니스타틴 (nystatin) 등의 항진균제 (antifungal agent) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 성분 중 하나 이상을 사용할 수 있다.

상기 중간엽줄기세포 배양액은, 수정란 배양용 조성물 중 5 내지 15 부피% 농도일 수 있다. 중간엽줄기세포 배양액의 농도가 5 부피% 미만이면 중간엽줄기세포 배양액을 첨가하지 않은 수정란 배양용 조성물에 비하여 현저한 효과가 나타나지 않을 수 있으며, 중간엽줄기세포 배양액의 농도가 15 부피% 초과인 경우에도, 과농도로 인하여 오히려 수정란 배양의 효율을 저하시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 수정란 배양용 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 이러한 제조방법은 조직을 계대배양으로 증식하는 단계; 증식된 조직으로부터 중간엽줄기세포를 획득하는 단계; 중간엽줄기세포의 성장을 억제시키면서 중간엽줄기세포를 배양한 후, 그 상층액을 회수하여 여과하는 단계; 및 중간엽 줄기세포 배양액을 수정란 배양용 조성물에 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 중간엽줄기세포의 성장을 억제시키기 위하여 배양억제제가 사용될 수 있으며, 배양억제제로 세포의 성장을 억제시킨 후 기본 배양액으로 다시 교체하는 것이 바람직하다.

상기 조직은 인체 지방조직, 골수조직, 양막조직, 탈락막조직, 제대조직 및 태반조직 중 어느 하나로부터 유래된 것이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 인체 지방조직을 사용하여 중간엽줄기세포 배양액을 제조하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 중간엽줄기세포 배양액을 포함하는 수정란 배양용 조성물에서 수정란을 배양하는 수정란 배양 방법이 제공되며, 상기 중간엽줄기세포 배양액은, 인체 지방조직, 골수조직, 양막조직, 탈락막조직, 제대조직 및 태반조직 중 어느 하나로부터 유래된 것이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 인체 지방조직이 사용될 수 있다.

이하, 실시 예를 통해서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시 예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

1. 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 제조

i) 인체지방조직세포의 배양

지방조직은 동의 받은 환자의 수술 중 개복부위 피하지방으로부터 채취되었다. 세포 배양을 위해 지방조직은 세포분리 효소인 0.1% 콜라게나제 type I (Invitrogen) 용액에 넣고 36℃ 교반배양기(shaking incubator)에서 1시간 동안 반응시켜 세포덩어리 (cell clumps) 나 세포 (cell) 로 분리하였다. 분리된 세포의 배양을 위해 배양액 [90% Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Nutrient Mixture F-12 (1:1, Gibco), 10% 소태아혈청 (Gibco), 0.1 mM β-mercaptoethanol, 1% nonessential amino acids, and 8 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF, KOMA Biotech, Inc), 75 ug/mL potassium penicillin G, 50 ug/mL streptomycin sulfate] 으로 2번 세척하여 세포분리 효소 잔재물을 제거하고 새로운 배양액에 넣어 지름 100mm 배양접시에 대략 1 x 10⁶ 농도로 접종하였다. 계대배양을 위해 7일 에서 10일 동안 초기 배양 (primary cell culture)에서 자라난 세포는 단일 세포분리용 효소인 TrypLE (Gibco) 용액을 넣어 5분간 처리하여 분리하고 1 x 10⁶ 의 세포수로 새 배양 접시에 다시 접종하였다. 이러한 과정을 3회에서 5회 실시함으로써 지방조직세포를 대량 증식하였다.

ii) 인체지방조직세포로부터 중간엽줄기세포 획득

대량 증식된 지방조직세포로부터 중간엽줄기세포를 획득하기 위해 세포 CD271 마이크로비드 키트 (MACS, Mitenyl Biotech GmbH, Germany)를 이용하였다. 그리고 획득된 세포가 중간엽줄기세포임을 검증하기 위해서 CD90 (ab133350, Abcam, 1:100), CD105 (ab114052, Abcam, 1:100), CD34 (ab81289, Abcam, 1:200), 및 CD45 (ab30470, Abcam, 1:200) 항체를 이용하여 면역세포화학염색법을 실시하였다.

iii) 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 제조

지방조직 유래 중간엽줄기세포를 cm² 당 30,000개씩 배양접시에 접종하고 배양용기 내에 세포수가 90% 정도 찼을 때 다시 말하면 배양용기에 세포 부착 후 대략 2일 정도 되어 세포가 왕성하게 성장하는 양상을 나타내는 세포가 되었을 때, 배양억제제 10 ug/ml mitomycin-C (Sigma)로 세포의 성장을 억제시킨 다음 기본 배양액으로 새로이 교체 후 5일간 배양하면서 매일 그 상층액을 회수하고 0.22 ㎛ 필터로 필터링하여 완성하였다. 제조된 인체지방조직 유래 중간엽 줄기세포 배양농축액은 -80℃ 에서 보관하였다.

iv) 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포의 분리 검증

도 1은 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포의 증식된 상태의 모양을 나타낸 것이다.

도 1에서 보는 바와 같이, 분리된 중간엽줄기세포를 증식시켜 도립현미경 (Inverted microscope) 하에서 관찰하였을 때 그 부착된 모습이 섬유아세포와 유사하였다.

중간엽줄기세포의 존재를 확인하기 위하여, 형광물질이 부착된 항체를 이용하여 확인하는 면역세포화학염색법을 실시하였다.

도 2는 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포를 검증하기 위하여 중간엽줄기세포마커 (CD90 및 CD105) 및 조혈모세포마커 (CD34 및 CD45)로 처리하였을 때 형광물질의 발현을 나타낸 것이다 (Scale bars: 200 ㎛).

도 2에서 보는 바와 같이, 중간엽줄기세포는 중간엽줄기세포마커인 항체 CD105 및 CD90에는 반응하는 반면 조혈모세포 마커인 CD34 및 CD45에는 반응하지 않았다.

2. 인체지방조직유래 중간엽줄기세포 배양액을 이용하여 돼지 수정란 생산

i) 체외성숙

도축장에서 도축된 돼지의 난소에서 10 ml 주사기에 18G 주사침을 이용하여 직경 3 내지 7 mm 난포로부터 돼지 미성숙난자를 채취하였다. 채취된 난자는 실체현미경 하에서 난구세포가 치밀하게 부착되고 세포질이 균일한 난자만을 선별하여 체외성숙에 공시하였다. 회수된 돼지 미성숙난자는 1 mg/ml 소혈청 알부민이 들어있는 TL-HEPES 버퍼로 3회 이상 충분히 세척하고 10% porcine follicular fluid, 10 ng/mL EGF, 0.5 ㎍/mL LH, 및 0.5 ㎍/mL FSH 들어간 TCM-199 (Gibco-BRL) 체외성숙용 배양액에 넣어 38.8℃ 온도와 5% 이산화탄소 조건의 배양기내에서 44시간 동안 성숙 배양하였다.

ii) 단위발생

0.1 mg/mL hyaluronidase (Sigma) 를 이용하여 44시간 성숙된 난자로부터 난구 세포를 제거한 후 5 μM Ca² ⁺-ionomycin으로 5분 동안 처리하고, 7.5 μg/mL cytochalasin B 에 옮겨 38.8℃ 온도와 5% 이산화탄소 조건의 배양기 내에서 4시간 동안 배양함으로써 단위발생을 유도하였다.

iii) 체외배양

단위 발생 처리된 난자는 4 mg/mL FAF-BSA가 포함된 PZM5 배양액 (108 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.35 mM KH₂PO₄, 0.4 mM MgSO₄ _·7H₂O, 25.07 mM NaHCO₃, 0.2 mM Na-pyruvate, 2 mM Ca-(lactate)_2·5H₂O, 2 mM L-Glutamine, 5 mM Hypotaurine, 20 mL/L Basal Medium Eagle amino acids, 10 mL/L Minimum Essential Medium nonessential amino acids, 0.05 mg/mL Gentamicin) 으로 옮겨 4일간 배양되었으며, 4일 이후 실험조건에 따라 4 mg/mL FAF-BSA (대조군), 10% 소태아혈청, 5-15% 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 이 각각 첨가된 PZM5 배양액에 다시 3일간 배양하였다.

3. 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 처리효과

i) 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액의 생리활성물질 분석

인체지방조직 유래 중간엽줄기세포로부터 제조된 중간엽줄기세포 배양액 내에 들어있는 생리활성물질의 총 단백질 농도 및 특정 요소(4개의 adipocytokines-TNF-α, IL-6, Leptin, 및 Adiponectin 과 1개의 cytokine- IFN-γ 그리고 2개의 성장인자- bFGF 및 VEGF) 의 농도를 multiplex ELISA를 이용하여 조사하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액(4.56 ± 0.196 mg/mL) 의 총 단백질 농도는 기본 배양액(4.3 ± 0.21 mg/mL)과 유사한 반면 두 종류의 소태아혈청 (GIBCO, 30.46 ± 0.4 mg/mL; Hyclone, 30.3 ± 0.3 mg/mL) 보다는 현저히 낮았다. Leptin 과 INF-γ는 모든 샘플에서 검출되지 않았으며 TNF-α (인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액, 0.71 ± 28.1 pg/mL; 배양액, 1.04 ± 21.4 pg/mL; 소태아혈청-GIBCO, 0.71 ± 48.5 pg/mL; 소태아혈청-Hyclone, 0.51 pg/mL) 는 모든 샘플에서 낮은 농도로 존재하는 반면 Adiponectin (인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액, 28,685.3 ± 13.1; 배양액, 31,166 ± 6.67; 소태아혈청-GIBCO, 24,573.91 ± 5.9; 소태아혈청-Hyclone, 21,386.01 ± 5.1)은 높은 수준으로 모든 샘플에 존재하였으나 샘플간의 유의적 차는 발견되지 않았다. 그러나 특이하게도 bFGF와 VEGF 그리고 IL-6는 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액에서만 유의적으로 높게 나타남을 확인할 수 있었다. (표 1) 이는 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액이 기본 배양액을 통해 사람의 지방조직 유래 중간엽줄기세포로부터 새롭게 제조된 생리활성 물질임을 증명하며 기존 보고를 통해 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액에 존재하는 요소들이 돼지의 체외 발달에 효과적임이 보고된 바 체외배양에 새로운 첨가물로서의 사용가능성을 제시한다.

표 1. 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액의 생리활성물질 조성

ii) 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액의 농도에 따른 돼지 수정란 발달에 미치는 영향

대조군과 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 처리군에서 체외배양 7일째 발달된 배반포기배의 총 세포 수 차이를 비교하기 위해 10 μg/mL Hoechst 33342를 이용하여 15분 동안 핵을 염색하고, 염색된 배반포기배는 글리세롤에 넣어 여분의 형광물질을 제거한 다음 슬라이드 그라스에 올려 놓고 커버슬립으로 덮어 형광 현미경의 UV 필터 하에서 관찰하여 세포 수를 세는 방식을 사용하였다.

인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액의 처리 농도에 따른 수정란 발달율을 조사하기 위해 단위발생 유래 발달 4일 째 수정란을 PZM5 배양액에 각각 4 mg/mL fatty acid free-bovine serum albumin (FAF-BSA, control)과 5, 10, 15 부피%의 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액을 첨가된 처리군으로 나누어 3일 더 배양하고 7일째 발달율 및 총 세포수를 측정하였다. 7일째 발달율은 10 부피% 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 (40.2%) 처리군이 가장 높았으며 (p<0.05) 대조군(26.5%)군과 5 부피%, 15 부피% 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액(29.4% or 30.4%) 처리군 간의 유의적 차이는 관찰되지 않았다. 세포 수 또한 동일한 경향으로 10 부피% 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 처리군에서 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. (표 2, 대조군, 52.0 ± 4.6; 5 부피% 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액, 53.9 ± 18.0; 10 부피% 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액, 79.0 ± 15.4; 및 15 부피% 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액, 61.0 ± 21.9, p<0.05). 따라서 10 부피% 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액이 돼지수정란 발달을 증진시키는 데에 효과적인 적정 농도임을 확인하였다.

표 2. 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 처리 농도에 따른 돼지 수정란의 발달

iii) 미토콘드리아 염색 및 이미지 분석을 통한 세포활성도 비교

처리군의 세포활성도 비교 목적으로 미토콘드리아 염색을 위해 배양 7일 째 발달된 배반포기배를 3.7% formaldehyde가 포함된 dPBS/PVA에서 1시간 동안 고정시킨 후 MitoTracker Green FM (Molecular Probes, Inc.)를 이용하여 20분 동안 염색을 실시하였다. 핵은 Hoechst 33342를 이용하여 염색하였으며 염색된 배반포기배는 글리세롤에 넣어 여분의 형광물질을 제거한 다음 슬라이드 그라스에 올려 놓고 커버슬립으로 덮어 laser scanning confocal microscopy (Leica Laser Technik GmbH)를 이용하여 이미지를 얻었다. 각 처리 그룹당 최소 10개의 배반포기배가 이용되었으며 상대적인 밝기는 총 밝기를 총 세포수로 나누어 나타내는 방법을 사용하였다.

돼지수정란을 생산함에 있어서 10 부피% 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액을 기존에 가장 효과가 있다고 알려진 10 부피% 소태아혈청과 비교하였다.

도 3은 미토콘드리아 및 핵을 염색한 것으로 녹색은 미토콘드리아이며, 파란색은 핵을 나타낸 것(Scale bars; 100 ㎛)이고, 도 4는 ZFN software를 통해 미토콘드리아 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다 (*p<0.05, **p<0.01).

미토콘드리아는 ATP 합성 및 세포 내 칼슘의 항상성, 세포 사멸등과 같은 다양한 활동에 관여하는 세포 소기관으로 (Duchen 2000) 수정란 발달의 필수 요인으로 여겨진다(Dumollard 등 2007). 따라서 미토콘드리아의 분포 및 활성을 MitoTracker 와 형광현미경을 통해 확인한 결과, 비록 소태아혈청 처리군의 미토콘드리아 활성이 대조군에 비해 유의적으로 증가되기는 하였으나 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액(0.79 ± 0.17) 처리군의 활성이 대조군 (0.33 ± 0.05) 과 소태아혈청 처리군(0.49 ± 0.11) 에 비해 가장 높게 나타남을 확인할 수 있었다(도 3 및 도 4).

iv) Real- time PCR을 이용한 유전자발현 비교

mRNA는 마그네틱 비드(Dynabeads mRNA purification kit; Dynal, Oslo, Norway)를 이용하여 추출하였다. 동일한 수의 배아(대략 15개)를 100 ul 용해/결합용 버퍼 [100 mM Tris-HCl(pH 7.5), 500 mM LiCl, 10 mM EDTA (pH 8.0), 1% LiDS, 5 mM DTT]에 넣어 실온에서 5분간 교반하면서 반응을 유도하고, 여기에 50 ul oligo(dT)25 마그네틱 비드 용액을 넣어 다시 5분간 반응시켰다. 마그네틱 비드에 결합된 mRNA는 세척용 버퍼 A [10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA, 1% LiD]로 2회 세척하고, 버퍼 B [10 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.15 M LiCl 및 1 mM EDTA]로 1회 세척한 다음 DEPC water 15 ul에 pellet을 녹여 마그네틱 비드로부터 mRNA 시료를 획득하였다. cDNA 합성은 추출한 mRNA로 부터 oligo(dT) 12-18 프라이머와 superscript reverse transcriptase(Invitrogen)를 이용하여 이루어졌다. Real-time PCR(Bio-Rad, Chromo4)에 사용된 프라이머는 표 3에 나타낸 바와 같다. 모든 실험에서 GAPDH mRNA를 기준으로 사용하였다. 결과는 DyNAmo SYBR green qPCR 키트를 사용하였다. PCR 과정은 94℃에서 3분간 변성 과정을 거친 다음, 증폭과 정량을 위해 94℃에서 30초간, 50~56℃ 30초간, 72℃ 30초간으로 40회수를 반복하였고, 형광 측정을 했다. 이때의 melting curve는 65~95℃, heating rate는 0.2℃/sec이다. SYBR green 형광 결과는 PCR 과정의 extension 단계 후에 측정되었다.

유전자의 발현 또한 수정란 발달 과정에서 나타나는 주요 반응으로 유전자 발현의 작은 변화는 양질의 배반포배 생산에 관여하므로 (Pomar 등. 2005) 발달에 관여하는 주요 7가지 유전자 (Oct4, Sox2, Cdx2, Caspase3, Survivin, 및 Bcl2) 의 프라이머 (표 3)를 이용하여 상대적 발현양을 확인하였다.

도 5는 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 처리에 따른 배반포배의 상대적 유전자 발현 양을 나타낸 것이다 (*p<0.05, **p<0.01).

Oct4 와 Sox2는 배반포배 내부 세포괴와 영양막세포 에서 모두 발현되는 반면 Cdx2는 영양막 세포에서 특이적으로 발현되는 유전자로 비록 Oct4 유전자의 발현의 차이는 관찰되지 않았고 (대조군; 1 ± 0.4, 소태아혈청 처리군; 1.2 ± 0.05, 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 처리군; 1.13 ± 0.2) Sox2와 Cdx2의 경우 control에 비해 소태아혈청 처리군에서도 향상되었으나 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 처리군에서 가장 높게 발현됨을 확인할 수 있었다. 또한 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액 처리군에서 pro-apoptosis (Caspase 3)유전자의 발현은 유의적으로 감소하는 반면 anti-apoptosis (Survivin 과 Bcl2)유전자의 발현은 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었다(*p<0.05, **p<0.01)(도 4). 이는 인체지방조직 유래 중간엽줄기세포 배양액이 초기 수정란 발달에 있어서 분자적 수준에서 세포사멸을 억제함으로써 수정란 발달에 관여하는 것으로 보여진다.

표 3. Primer 목록

Claims

세포 배양 시 세포의 증식을 억제시키는 배양억제제를 사용하여 중간엽줄기세포의 성장을 억제시키면서 배양된, 중간엽줄기세포 배양액을 포함하는, 돼지수정란 배양용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포 배양액은, 혈청 배지 또는 무혈청 배지에서 3내지 5 계대 배양하여 얻어진 중간엽줄기세포 배양액의 상층액인, 돼지수정란 배양용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 혈청 배지는 DMEM 또는 DMEM/F12 배지인, 돼지수정란 배양용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포 배양액은, 인체 지방조직, 골수조직, 양막조직, 탈락막조직, 제대조직 및 태반조직 중 어느 하나로부터 유래된 것인, 돼지수정란 배양용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포 배양액은, 상기 돼지수정란 배양용 조성물 중 5 내지 15 부피% 인 것인, 돼지수정란 배양용 조성물.
조직을 계대배양으로 증식하는 단계;
상기 증식된 조직으로부터 중간엽줄기세포를 획득하는 단계;
세포 배양 시 세포의 증식을 억제시키는 배양억제제를 사용하여 상기 중간엽줄기세포의 성장을 억제시키면서 상기 중간엽줄기세포를 배양한 후, 그 상층액을 회수하여 여과하는 단계; 및
상기 중간엽 줄기세포 배양액을 수정란 배양용 조성물에 첨가하는 단계;를 포함하는, 돼지수정란 배양용 조성물 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 조직은 인체 지방조직, 골수조직, 양막조직, 탈락막조직, 제대조직 및 태반조직 중 어느 하나로부터 유래된 것인, 돼지수정란 배양용 조성물 제조방법.
세포 배양 시 세포의 증식을 억제시키는 배양억제제를 사용하여 중간엽줄기세포의 성장을 억제시키면서 배양된, 중간엽줄기세포 배양액을 포함하는 돼지수정란 배양용 조성물에서 돼지수정란을 배양하는, 돼지수정란 배양 방법.
제8항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포 배양액은, 인체 지방조직, 골수조직, 양막조직, 탈락막조직, 제대조직 및 태반조직 중 어느 하나로부터 유래된 것인, 돼지수정란 배양 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양억제제는, 핵산 합성 저해 항생물질인 것인, 돼지수정란 배양용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양억제제는, 미토마이신-C (mitomycin-C) 인 것인, 돼지수정란 배양용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양억제제는, 기본 배양액 기준 5 내지 15 ㎍/㎕로 사용되는 것인, 돼지수정란 배양용 조성물.