JP2024006674A - 精巣体細胞様細胞の製造方法、精巣体細胞様細胞、精子の形成方法、中期中胚葉様細胞を精巣体細胞様細胞に分化誘導する方法、精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメント、及び精巣体細胞様細胞の製造用培地キット - Google Patents
精巣体細胞様細胞の製造方法、精巣体細胞様細胞、精子の形成方法、中期中胚葉様細胞を精巣体細胞様細胞に分化誘導する方法、精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメント、及び精巣体細胞様細胞の製造用培地キット Download PDFInfo
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Abstract
【課題】生体組織に依存せずに精子形成支持能を有する精巣体細胞様細胞が得られる精巣体細胞様細胞の製造方法、前記製造方法で得られる精巣体細胞様細胞、及び前記精巣体細胞様細胞を用いた精子の形成方法を提供する。【解決手段】精巣体細胞様細胞の製造方法は、中期中胚葉様細胞をＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地で培養する工程を含む。精巣体細胞様細胞は、前記製造方法により得られる。精子の形成方法は、前記製造方法で得られた精巣体細胞様細胞と、前記精巣体細胞様細胞と同種由来の雄性生殖細胞とを共培養することを含む。【選択図】なし
Description
本発明は、精巣体細胞様細胞の製造方法、精巣体細胞様細胞、精子の形成方法、中期中胚葉様細胞を精巣体細胞様細胞に分化誘導する方法、精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメント、及び精巣体細胞様細胞の製造用培地キットに関する。
生殖細胞系列は、種の存続を支える唯一の細胞系列である。生殖細胞系列の発生及び分化には、性分化を始め、エピゲノム情報の再構成、減数分裂等、様々な特徴的な過程が含まれる。
これまで、生殖細胞系列の発生過程を明らかにするため、多能性幹細胞から生殖細胞系列の細胞を試験管内で誘導する試みが行われている。例えば、２０１１年に発明者らによって、多能性幹細胞から精子や卵子の元となる始原生殖細胞（ＰＧＣｓ）を誘導する手法が確立されている（例えば、非特許文献１等参照）。これ続いて、オス、メス各々について配偶子分化過程の再現を目指す研究がなされている。メスについては、多能性幹細胞から始原生殖細胞を経て卵子を試験管内で誘導する手法が報告されている（例えば、非特許文献２等参照）。一方、オスについては、多能性幹細胞から始原生殖細胞を経て、精子の前段階の細胞である、精子幹細胞を誘導する再構成精巣法が報告されている（例えば、非特許文献３等参照）。
発明者らは、ＥＳ細胞から始原生殖細胞様細胞（ＰＧＣＬＣｓ）を誘導し、再構成精巣法を用いて、精子の元である精子幹細胞様細胞の長期培養株であるＧｅｒｍｌｉｎｅ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ－ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ（ＧＳＣＬＣｓ）を誘導することに成功している。さらに、マウスＥＳ細胞由来のＧＳＣＬＣｓを、試験管内で健常な産仔に寄与する精子まで誘導することに成功している（例えば、非特許文献４等参照）。しかしながら、この方法では、精子を育てるための精巣体細胞を生体から採取する必要がある。そのため、精巣組織の採取が困難なヒトを含めた様々な動物において、精子の再生をすることが難しい。
上記課題を解決すべく、培地組成や培養条件を調整することで、多能性幹細胞から精巣体細胞を分化誘導する方法が検討されている（例えば、非特許文献５～７等参照）。
一方、最近、発明者らは、マウスＥＳ細胞から卵巣体細胞様細胞を試験管内で誘導する方法を確立している。得られた卵巣体細胞様細胞から卵巣を試験管内で再構築し、ＰＧＣｓ又はＰＧＣＬＣｓと共培養することで、卵子形成を進行させることに成功している（例えば、非特許文献５等参照）。
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しかしながら、非特許文献５～７に記載の手法では、遺伝子発現プロファイルのみに基づいて精巣体細胞様細胞が得られたことが示されているだけで、精子形成をサポートできる機能的な精巣体細胞であるかまでは具体的に検討されていない。このように、現段階において、生体組織を使用することなく、多能性幹細胞の使用のみで機能的な精子の作製に成功した例はない。そのため、生体細胞を一切使用しない、機能的な精子の作製技術が望まれている。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、生体組織に依存せずに精子形成支持能を有する精巣体細胞様細胞が得られる精巣体細胞様細胞の製造方法、中期中胚葉様細胞を精巣体細胞様細胞に分化誘導する方法、精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメント、及び精巣体細胞様細胞の製造用培地キットを提供する。また、前記製造方法で得られる精巣体細胞様細胞、及び該精巣体細胞様細胞を用いた精子の形成方法を提供する。
発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、中期中胚葉様細胞から精巣体細胞様細胞へ分化誘導する際に、メス化を抑制することを目的としてＷＮＴシグナル阻害剤存在下で中期中胚葉様細胞を培養することで、誘導効率よく精巣体細胞様細胞が得られ、また、得られた精巣体細胞様細胞が精子形成支持能を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） 中期中胚葉様細胞をＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、精巣体細胞様細胞の製造方法。
（２） 前記培地が線維芽細胞増殖因子９、及び骨形成因子４からなる群より選ばれる１種以上を更に含む、（１）に記載の精巣体細胞様細胞の製造方法。
（３） 前記ＷＮＴシグナル阻害剤がＩＷＲ－１又はＩＷＰ－２である、（１）又は（２）に記載の精巣体細胞様細胞の製造方法。
（４） 前記培地中の前記ＷＮＴシグナル阻害剤の濃度が１０μＭ以上４０μＭ以下である、（１）～（３）のいずれか一つに記載の精巣体細胞様細胞の製造方法。
（５） （１）～（４）のいずれか一つに記載の精巣体細胞様細胞の製造方法で得られた、精巣体細胞様細胞。
（６） （１）～（４）のいずれか一つに記載の精巣体細胞様細胞の製造方法で得られた精巣体細胞様細胞と、前記精巣体細胞様細胞と同種由来の雄性生殖細胞とを共培養することを含む、精子の形成方法。
（７） 中期中胚葉様細胞をＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地で培養することを含む、中期中胚葉様細胞を精巣体細胞様細胞に分化誘導する方法。
（８） ＷＮＴシグナル阻害剤を含む、精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメント。
（９） 基礎培地と、
（８）に記載の精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメントと、
を備える、精巣体細胞様細胞の製造用培地キット。
（１） 中期中胚葉様細胞をＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、精巣体細胞様細胞の製造方法。
（２） 前記培地が線維芽細胞増殖因子９、及び骨形成因子４からなる群より選ばれる１種以上を更に含む、（１）に記載の精巣体細胞様細胞の製造方法。
（３） 前記ＷＮＴシグナル阻害剤がＩＷＲ－１又はＩＷＰ－２である、（１）又は（２）に記載の精巣体細胞様細胞の製造方法。
（４） 前記培地中の前記ＷＮＴシグナル阻害剤の濃度が１０μＭ以上４０μＭ以下である、（１）～（３）のいずれか一つに記載の精巣体細胞様細胞の製造方法。
（５） （１）～（４）のいずれか一つに記載の精巣体細胞様細胞の製造方法で得られた、精巣体細胞様細胞。
（６） （１）～（４）のいずれか一つに記載の精巣体細胞様細胞の製造方法で得られた精巣体細胞様細胞と、前記精巣体細胞様細胞と同種由来の雄性生殖細胞とを共培養することを含む、精子の形成方法。
（７） 中期中胚葉様細胞をＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地で培養することを含む、中期中胚葉様細胞を精巣体細胞様細胞に分化誘導する方法。
（８） ＷＮＴシグナル阻害剤を含む、精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメント。
（９） 基礎培地と、
（８）に記載の精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメントと、
を備える、精巣体細胞様細胞の製造用培地キット。
上記態様の製造方法によれば、生体組織に依存せずに精子形成支持能を有する精巣体細胞様細胞が得られる。
本明細書において、「多能性幹細胞」とは、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞を意味する。多能性幹細胞としては、以下に限定されないが、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、始原生殖細胞に由来する胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、精巣組織からのＧＳ細胞の樹立培養過程で単離されるｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ＳＴＥＭ細胞（ｍＧＳ細胞）、骨髄間葉系細胞から単離されるＭｕｓｅ細胞等が挙げられる。上記に列挙した多能性幹細胞は、それぞれ公知の方法により得ることができる。
多能性幹細胞としては、哺乳動物に由来するものを用いる。哺乳動物の例としては、マウス、ラット、ヒト、サル、マーモセット、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、モルモット、ハムスター等が挙げられるが、好ましくはマウスである。
なお、本明細書における「ｉＰＳ細胞」とは、分化した体細胞にいくつかの遺伝子を導入することによって様々な組織や器官の細胞へのリプログラミングが可能となった細胞を意味する。本実施形態の方法において、始原生殖細胞を分化誘導するために用いられるｉＰＳ細胞は、適当なドナーから採取した体細胞の初代培養細胞由来であってもよく、樹立細胞株由来であってもよい。ｉＰＳ細胞は、いかなる胚葉系細胞にも分化誘導が可能であることから、ｉＰＳ細胞の調製に用いる体細胞は、原則的には外胚葉系及び内胚葉系のいずれの胚葉系細胞由来のものであってもよい。侵襲性が低く採取が容易な皮膚、髪の毛、歯肉、血液等の細胞は、ｉＰＳ細胞の調製に用いる体細胞として好適である。ｉＰＳ細胞の調製方法については、当該分野で公知の方法に従えばよい。具体的には、例えば、「Okita K. et al., “Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.”, Nature, Vol. 448, p313-317, 2007.」（参考文献１）、「Hamanaka S. et al., “Generation of germline-competent rat induced pluripotent stem cells.”, PLoS One, Vol. 6, Issue 7, e22008, 2011.」（参考文献２）等の公知の文献に記載されている調製方法を利用できる。
また、ＥＳ細胞は、公知の方法により得ることができる。例えば、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を採取し、当該内部細胞塊を繊維芽細胞に由来するフィーダー細胞上で培養することによって樹立することができる。その他、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞も使用することができる。
また、本明細書において「エピブラスト様細胞（ＥｐｉＬＣｓ）」とは、多能性幹細胞に由来する、原腸陥入前のエピブラスト細胞と同等の特性を有する細胞である。より詳細には、ＥｐｉＬＣｓは、以下の特性のいずれか又は両方を有する細胞として定義される。
（１）分化誘導前の多能性幹細胞と比較して、ＦＧＦ５、ＷＮＴ３及びＤＮＭＴ３Ｂからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子発現の上昇。
（２）分化誘導前の多能性幹細胞と比較して、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＳＯＸ１７及びＢＬＩＭＰ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子発現の低下。
（１）分化誘導前の多能性幹細胞と比較して、ＦＧＦ５、ＷＮＴ３及びＤＮＭＴ３Ｂからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子発現の上昇。
（２）分化誘導前の多能性幹細胞と比較して、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、ＳＯＸ１７及びＢＬＩＭＰ１からなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子発現の低下。
ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞からＥｐｉＬＣｓを分化誘導する方法は、公知の方法、例えば、国際公開第２０１２／０２０６８７号（参考文献３）、非特許文献１、「Hayashi K et al., “Offspring from oocytes derived from in vitro primordial germ cell-like cells in mice.”, Science, Vol. 338, Issue 6109, pp. 971-975, 2012.」（参考文献４）等を参考にして行うことができる。
≪精巣体細胞様細胞の製造方法≫
本実施形態の精巣体細胞様細胞の製造方法（以下、単に「本実施形態の製造方法」と称する場合がある）は、中期中胚葉様細胞をＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地で培養する工程（以下、「精巣体細胞様細胞誘導工程」と称する場合がある）を含む。
本実施形態の精巣体細胞様細胞の製造方法（以下、単に「本実施形態の製造方法」と称する場合がある）は、中期中胚葉様細胞をＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地で培養する工程（以下、「精巣体細胞様細胞誘導工程」と称する場合がある）を含む。
後述する実施例に示すように、従来の製造方法（非特許文献８）では、細胞のメス化が進行してしまい、精巣体細胞はほとんど分化誘導されない。しかしながら、本実施形態の製造方法によれば、後述する実施例に示すように、ＷＮＴシグナル阻害剤存在下で中期中胚葉様細胞を培養することで、メス化を抑制して、効率的に精巣体細胞様細胞を得ることができる。すなわち、本実施形態の製造方法は、中期中胚葉様細胞を精巣体細胞様細胞に分化誘導する方法ということもできる。
本実施形態の製造方法に含まれる工程について以下に詳細を説明する。
＜精巣体細胞様細胞誘導工程＞
精巣体細胞様細胞誘導工程では、中期中胚葉様細胞をＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地で培養する。
精巣体細胞様細胞誘導工程では、中期中胚葉様細胞をＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地で培養する。
精巣体細胞様細胞誘導工程で用いられる培地は、ＷＮＴシグナル阻害剤を必須添加成分として含む。
ＷＮＴシグナル阻害剤としては、ＩＷＲ－１（４－［（３ａＲ，４Ｓ，７Ｒ，７ａＳ）－１，３，３ａ，４，７，７ａ－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１，３－ｄｉｏｘｏ－４，７－ｍｅｔｈａｎｏ－２Ｈ－ｉｓｏｉｎｄｏｌ－２－ｙｌ］－Ｎ－８－ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ－ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ－２、ＸＡＶ９３９、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ蛋白、Ｗｎｔ抗体、カゼインキナーゼ阻害剤等が挙げられるが、これらに限定されない。中でも、ＩＷＲ－１又はＩＷＰ－２が好ましい。
培地中に含まれるＷＮＴシグナル阻害剤の濃度は、通常、０．１μＭ以上５０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以上４０μＭ以下、より好ましくは２０μＭ以上３０μＭ以下である。
精巣体細胞様細胞誘導工程で用いられる培地は、線維芽細胞増殖因子９（ＦＧＦ９）、及び骨形成因子４（ＢＭＰ４）からなる群より選ばれる１種以上を更に含むことができる。
培地中に含まれるＦＧＦ９の濃度は、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上である。また、ＦＧＦ９の濃度は、好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは２００ｎｇ／ｍＬ以下である。
培地中に含まれるＢＭＰ４の濃度は、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは２ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは２０ｎｇ／ｍＬ以上である。ＢＭＰ４の濃度が上記下限値以上であることで、Ｎｒ５ａ１陽性の精巣体細胞様細胞をより効率的に得ることができる。また、ＢＭＰ４の濃度の上限は、特に限定されないが、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以下である。
精巣体細胞様細胞誘導工程で用いられる培地は、高分子ポリマーを更に含むことができる。高分子ポリマーを含むことで、撹拌等の物理的な力を与えなくても細胞が浮遊し、沈殿せずに均一に細胞を分散しながら培養することができる。このような高分子ポリマーとしては、例えば、脱アシル化ジェランガムを主成分として含有する、日産化学社製の「ＦｃｅＭ（登録商標）」シリーズの製品等が挙げられる。「ＦｃｅＭ（登録商標）」シリーズを用いた培養については、例えば、特許第５６２９８９３号公報（参考文献５）の記載を参考に行うことができる。
精巣体細胞様細胞誘導工程で用いられる基礎培地としては、例えば、αＭＥＭ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｂａｓａｌ培地、ＮＳ－Ａ培地、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、最小必須培地（ＭＥＭ）、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ（ＧＭＥＭ）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４ＳＦＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、ＨＴＦ培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ培地、及びこれらの混合培地等が挙げられるが、これらに限定されない。
培地は、血清含有培地であってもよく、無血清培地であってもよい。無血清培地が好ましく使用される。無血清培地（ＳＦＭ）とは、未処理又は未精製の血清をいずれも含まない培地を意味し、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（増殖因子等）を含有する培地が挙げられる。血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清等）の濃度は、０ｖ／ｖ％以上２０ｖ／ｖ％以下とすることができ、好ましくは０ｖ／ｖ％以上５ｖ／ｖ％以下、より好ましくは０ｖ／ｖ％以上２ｖ／ｖ％以下、さらに好ましくは０ｖ／ｖ％（すなわち、無血清）である。ＳＦＭは任意の血清代替物を含んでもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン、組換えアルブミン等のアルブミン代替物；植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物等）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオグリセロール、及びこれらの均等物等が挙げられる。また、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標） Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（登録商標）等が挙げられる。これらは単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
培地は、その他公知の添加物を含んでもよい。添加物は特に限定されないが、例えば、上記以外の成長因子、ポリアミン類、ミネラル、糖類（例えば、グルコース等）、有機酸（例えば、ピルビン酸、乳酸等）及びその塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、Ｌ－グルタミン等）、還元剤（例えば、２－メルカプトエタノール等）、ビタミン類（例えば、アスコルビン酸、ｄ－ビオチン等）、ステロイド、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン等）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ等）、栄養添加物（例えば、Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＳｔｅｍＰｒｏ－Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ等）が挙げられる。これらを単独で、又は２種以上を組み合わせて使用することができる。各添加物は公知の濃度範囲で含むことができる。
精巣体細胞様細胞誘導工程における培養条件としては、例えば公知の細胞非接着性又は低接着性培養容器に中期中胚葉様細胞を播種し、培養することにより行うことができる。
培養条件は以下に限定されないが、例えば、１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の二酸化炭素及び９０ｖ／ｖ％以上９９ｖ／ｖ％以下の大気の雰囲気下で行うことができる。
培養温度は約３０℃以上４０℃以下であり、好ましくは約３７℃である。
培養期間は、４日未満、好ましくは約２日間（例えば、４８±１２時間、好ましくは４８±６時間）である。
培養条件は以下に限定されないが、例えば、１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の二酸化炭素及び９０ｖ／ｖ％以上９９ｖ／ｖ％以下の大気の雰囲気下で行うことができる。
培養温度は約３０℃以上４０℃以下であり、好ましくは約３７℃である。
培養期間は、４日未満、好ましくは約２日間（例えば、４８±１２時間、好ましくは４８±６時間）である。
精巣体細胞様細胞誘導工程で得られた細胞が精巣体細胞様細胞に分化していることは、ＡＭＨ等のマーカー遺伝子の発現レベルを、免疫染色、ＦＡＣＳ解析、定量ＰＣＲ、ＲＮＡｓｅｑ等の公知の方法を用いて分析することにより確認できる。
＜中期中胚葉様細胞誘導工程＞
本実施形態の製造方法は、精巣体細胞様細胞誘導工程の前に、中期中胚葉様細胞誘導工程を有することができる。
本実施形態の製造方法は、精巣体細胞様細胞誘導工程の前に、中期中胚葉様細胞誘導工程を有することができる。
中期中胚葉様細胞は、例えば、非特許文献８、参考文献１（Rore et al.,“Testicular somatic cell-like cells derived from embryonic stem cells induce differentiation of epiblasts into germ cells.”, Commun Biol., Vol. 4, Issue 1, Article No. 802, pp. 1-12, 2021.）、参考文献２（Seol et al.,“In Vitro Derivation of Functional Sertoli-Like Cells from Mouse Embryonic Stem Cells.”, Cell Transplant., Vol. 27, Issue 10, pp. 1523-1534, 2018.）、参考文献３（Taguchi et al.,“Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.”, Cell Stem Cell, Vol. 14, Issue 1, pp. 53-67, 2014.）、参考文献４（Mae et al., “Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells.”, Nat Commun., Vol. 4, Article No. 1367, pp. 1-23, 2013.）等に記載の方法を用いて、多能性幹細胞から誘導することができる。
具体的には、例えば、中期中胚葉様細胞誘導工程は、以下の工程を含むことができる。
多能性幹細胞から誘導されたＥｐｉＬＣｓを、ＢＭＰ４及びＷＮＴシグナル活性化剤存在下で培養して初期中胚葉様細胞を誘導する工程１；
得られた前記初期中胚葉様細胞を、ヘッジホッグシグナル活性化剤、ＢＭＰ４、レチノイン酸、及びＭＥＫ阻害剤存在下で培養して中期中胚葉様細胞を誘導する工程２。
多能性幹細胞から誘導されたＥｐｉＬＣｓを、ＢＭＰ４及びＷＮＴシグナル活性化剤存在下で培養して初期中胚葉様細胞を誘導する工程１；
得られた前記初期中胚葉様細胞を、ヘッジホッグシグナル活性化剤、ＢＭＰ４、レチノイン酸、及びＭＥＫ阻害剤存在下で培養して中期中胚葉様細胞を誘導する工程２。
［工程１］
工程１では、多能性幹細胞から誘導されたＥｐｉＬＣｓを、ＢＭＰ４及びＷＮＴシグナル活性化剤存在下で培養して初期中胚葉様細胞を誘導する。
工程１では、多能性幹細胞から誘導されたＥｐｉＬＣｓを、ＢＭＰ４及びＷＮＴシグナル活性化剤存在下で培養して初期中胚葉様細胞を誘導する。
工程１で用いられる培地は、ＢＭＰ４及びＷＮＴシグナル活性化剤を必須添加成分として含む。
培地中に含まれるＢＭＰ４の濃度は、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬ以上である。また、ＢＭＰ４の濃度は、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは３ｎｇ／ｍＬ以下である。
ＷＮＴシグナル活性化剤としては、ＷＮＴファミリータンパク質、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体活性化物質、内在性ＷＮＴアンタゴニストの阻害剤、細胞内β－カテニン抑制物質の阻害剤、細胞内β－カテニン分解の阻害剤等が挙げられる。好ましくはＧＳＫ－３β阻害剤であり、より好ましくはＣＨＩＲ９９０２１である。
培地中に含まれるＷＮＴシグナル活性化剤の濃度は、好ましくは３μＭ以上、より好ましくは５μＭ以上であり、さらに好ましくは１０μＭ以上である。また、ＷＮＴシグナル活性化剤の濃度は、好ましくは５０μＭ以下、より好ましくは２０μＭ以下である。
工程１で用いられる培地は、上皮成長因子（ＥＧＦ）を更に含むことができる。
培地中に含まれるＥＧＦの濃度は、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ以上である。また、ＥＧＦの濃度は、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ以下である。
培地中に含まれるＥＧＦの濃度は、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ以上である。また、ＥＧＦの濃度は、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは７０ｎｇ／ｍＬ以下である。
工程１では、上述した添加剤を基礎培地に添加して用いることができる。基礎培地としては、上記精巣体細胞様細胞誘導工程で例示されたものと同じものを用いることができる。また、培地に添加されるその他添加剤としては、上記精巣体細胞様細胞誘導工程で例示されたものと同じものを用いることができる。
工程１の培養は、例えば公知の細胞非接着性又は低接着性培養容器にＥｐｉＬＣｓを播種し、培養することにより行うことができる。
中でも、培養容器としては、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）等の細胞培養面に微細なウェルを有し、培養面に平坦な面を有さず、且つ、培養面がタンパク質等によって低接着コートされている培養容器を好ましく用いることができる。このような培養容器を用いることで、１つの培養容器で７００個程度の大量の細胞塊を作製することができる。また、従来の９６ウェルプレートを用いた場合には、一つ一つのウェルの培地交換を手作業で行う必要があり、６０個の細胞塊に対して培地交換に３０分間程度要していた。これに対して、上記培養容器では、７００個の細胞塊の培地交換を１０分間程度に短縮することができる。
中でも、培養容器としては、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）等の細胞培養面に微細なウェルを有し、培養面に平坦な面を有さず、且つ、培養面がタンパク質等によって低接着コートされている培養容器を好ましく用いることができる。このような培養容器を用いることで、１つの培養容器で７００個程度の大量の細胞塊を作製することができる。また、従来の９６ウェルプレートを用いた場合には、一つ一つのウェルの培地交換を手作業で行う必要があり、６０個の細胞塊に対して培地交換に３０分間程度要していた。これに対して、上記培養容器では、７００個の細胞塊の培地交換を１０分間程度に短縮することができる。
培養条件は以下に限定されないが、例えば、１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の二酸化炭素及び９０ｖ／ｖ％以上９９ｖ／ｖ％以下の大気の雰囲気下で行うことができる。
培養温度は約３０℃以上４０℃以下であり、好ましくは約３７℃である。
培養期間は、４日未満、好ましくは約２日間（例えば、４８±１２時間、好ましくは４８±６時間）である。
培養温度は約３０℃以上４０℃以下であり、好ましくは約３７℃である。
培養期間は、４日未満、好ましくは約２日間（例えば、４８±１２時間、好ましくは４８±６時間）である。
工程１で得られた細胞が初期中胚葉様細胞に分化していることは、ＯＳＲ１、ＴＢＸＴ等のマーカー遺伝子の発現レベルを、免疫染色、ＦＡＣＳ解析、定量ＰＣＲ、ＲＮＡｓｅｑ等の公知の方法を用いて分析することにより確認できる。
［工程２］
工程２では、初期中胚葉様細胞を、ヘッジホッグシグナル活性化剤、ＢＭＰ４、レチノイン酸、及びＭＥＫ阻害剤存在下で培養して中期中胚葉様細胞を誘導する。
工程２では、初期中胚葉様細胞を、ヘッジホッグシグナル活性化剤、ＢＭＰ４、レチノイン酸、及びＭＥＫ阻害剤存在下で培養して中期中胚葉様細胞を誘導する。
工程２で用いられる培地は、ヘッジホッグシグナル活性化剤、ＢＭＰ４、レチノイン酸、及びＭＥＫ阻害剤を必須添加成分として含む。
ヘッジホッグシグナル活性化剤とは、ソニックヘッジホッグ・パスウェイを活性化し、Ｗｎｔシグナル伝達を阻害する物質であり、好ましくはソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）である。
培地中に含まれるヘッジホッグシグナル活性化剤の濃度は、好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以上である。また、ヘッジホッグシグナル活性化剤の濃度は、好ましくは３００ｎｇ／ｍＬ以下であり、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ以下である。
培地中に含まれるＢＭＰ４の濃度は、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ以上である。また、ＢＭＰ４の濃度は、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは２ｎｇ／ｍＬ以下である。
培地中に含まれるレチノイン酸の濃度は、好ましくは０．１μＭ以上、より好ましくは１μＭ以上である。また、レチノイン酸の濃度は、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは５μＭ以下である。
ＭＥＫ阻害剤マイトジェン活性化細胞外シグナル関連キナーゼに対する阻害活性を有する化合物である。そのような化合物としては、例えば、ＰＤ０３２５９０１（ＣＡＳ番号：３９１２１０－１０－９）、トラメチニブ（商品名「メキニスト」、ＣＡＳ番号：８７１７００－１７－３）、セルメチニブ（ＣＡＳ番号：６０６１４３－５２－６）、ＭＥＫ１６２（ＣＡＳ番号：６０６１４３－８９－９）、ＣＨ４９８７６５５（ＣＡＳ番号：８７４１０１－００－５）等が挙げられるが、これに限定されない。これらの中でも、ＰＤ０３２５９０１が好ましい。
培地中に含まれるＭＥＫ阻害剤の濃度は、好ましくは０．１μＭ以上、より好ましくは０．５μＭ以上である。また、ＭＥＫ阻害剤の濃度は、好ましくは１０μＭ以下、より好ましくは５μＭ以下である。
工程２で用いられる培地は、ＥＧＦを更に含むことができる。
培地中に含まれるＥＧＦの濃度は、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは５ｎｇ／ｍＬ以上である。また、ＥＧＦの濃度は、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ以下である。
培地中に含まれるＥＧＦの濃度は、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは５ｎｇ／ｍＬ以上である。また、ＥＧＦの濃度は、好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ以下、より好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ以下である。
工程２で用いられる培地は、高分子ポリマーを更に含むことができる。高分子ポリマーを含むことで、撹拌等の物理的な力を与えなくても細胞が浮遊し、沈殿せずに均一に細胞を分散しながら培養することができる。このような高分子ポリマーとしては、上記精巣体細胞様細胞誘導工程で例示されたものと同じものを用いることができる。
工程２では、上述した添加剤を基礎培地に添加して用いることができる。基礎培地としては、上記精巣体細胞様細胞誘導工程で例示されたものと同じものを用いることができる。また、培地に添加されるその他添加剤としては、上記精巣体細胞様細胞誘導工程で例示されたものと同じものを用いることができる。
工程２の培養は、例えば公知の細胞非接着性又は低接着性培養容器に霊長類多能性幹細胞を播種し、培養することにより行うことができる。
培養条件は以下に限定されないが、例えば、１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の二酸化炭素及び９０ｖ／ｖ％以上９９ｖ／ｖ％以下の大気の雰囲気下で行うことができる。
培養温度は約３０℃以上４０℃以下であり、好ましくは約３７℃である。
培養期間は、４日未満、好ましくは約２日間（例えば、４８±１２時間、好ましくは４８±６時間）である。
培養条件は以下に限定されないが、例えば、１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の二酸化炭素及び９０ｖ／ｖ％以上９９ｖ／ｖ％以下の大気の雰囲気下で行うことができる。
培養温度は約３０℃以上４０℃以下であり、好ましくは約３７℃である。
培養期間は、４日未満、好ましくは約２日間（例えば、４８±１２時間、好ましくは４８±６時間）である。
≪精巣体細胞様細胞≫
本実施形態の精巣体細胞様細胞は、上述した製造方法で得られたものである。
本実施形態の精巣体細胞様細胞は、上述した製造方法で得られたものである。
本実施形態の精巣体細胞様細胞は、従来の製造方法で得られた精巣体細胞様細胞とは異なり、生体から採取された精巣体細胞と遺伝子発現プロファイル（ＡＭＨ遺伝子の発現が上昇しており、ＦＯＸＬ２遺伝子の発現がほとんどみられないこと）が類似しているだけでなく、後述する実施例に示すように、精子形成支持能を有するものである。よって、本実施形態の精巣体細胞様細胞は、生体内の精巣体細胞により近しい機能を有するものであると考えられる。しかしながら、遺伝子発現プロファイルの相違等により、生体内の精巣体細胞やその他従来の製造方法で得られた精巣体細胞様細胞との相違を特定し、本実施形態の精巣体細胞様細胞を特定することは非常に困難であり、実際的ではない。このため、製造方法により特定することが現実的である。
≪精子の形成方法≫
本実施形態の精子の形成方法は、上述した製造方法で得られた精巣体細胞様細胞と、前記精巣体細胞様細胞と同種由来の雄性生殖細胞とを共培養することを含む。
本実施形態の精子の形成方法は、上述した製造方法で得られた精巣体細胞様細胞と、前記精巣体細胞様細胞と同種由来の雄性生殖細胞とを共培養することを含む。
本実施形態の精子の形成方法によれば、後述する実施例に示すように、ＳＣＰ３遺伝子及びＰＮＡ遺伝子等のマーカー遺伝子が発現している精子が得られる。
精巣体細胞様細胞と共培養する該精巣体細胞様細胞と同種由来の雄性生殖細胞に代えて、始原生殖細胞、精原細胞、一次精母細胞、及び二次精母細胞からなる群より選ばれる１種以上の細胞を用いてもよい。
本明細書において、「始原生殖細胞」とは、生殖細胞へ分化する予定の細胞であり、卵原細胞又は精原細胞を経て卵子又は精子へと分化する細胞をいう。始原生殖細胞は、生体由来のものであっても、多能性幹細胞より分化した始原生殖細胞様細胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｌｉｋｅ ｃｅｌｌｓ：ＰＧＣＬＣｓ）であってもよい。
また、始原生殖細胞には、生体由来の始原生殖細胞及び多能性幹細胞由来のＰＧＣＬＣｓが含まれ、さらに、これら細胞の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した細胞も含まれる。
また、始原生殖細胞には、生体由来の始原生殖細胞及び多能性幹細胞由来のＰＧＣＬＣｓが含まれ、さらに、これら細胞の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した細胞も含まれる。
多能性幹細胞、特にｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞からＰＧＣＬＣｓを分化誘導する方法は、例えば、非特許文献１等を参考にして行うことができる。
また、共培養の開始の前に、雄性生殖細胞と精巣体細胞様細胞とからなる凝集塊を作製する培養工程を行うことが好ましい。雄性生殖細胞と精巣体細胞様細胞ととからなる凝集塊を作製する方法は、例えば、参考文献５（Yokonishi T et al., “In Vitro Reconstruction of Mouse Seminiferous Tubules Supporting Germ Cell Differentiation.”, Biol Reprod., Vol. 89, Issue 1, Article No. 15, pp. 1-6,2013.）等を参考にして行うことができる。
具体的には、例えば、ＡＫ１０培地（ａＭＥＭに１０ｖ／ｖ％ ＫＳＲ、１×ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１００Ｕ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び０．１ｍｇ／ｍＬ ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ)を添加した培地）中で、雄性生殖細胞と精巣体細胞様細胞とを混合し凝集させて培養することで実施することができる。培養には低吸着の培養皿を用いることが好ましい。例えば、凝集塊を作製するための培養期間を１日間以上４日間以下することができ、好ましくは２日間である。次いで、凝集塊をＡＫ１０培地に浸漬した１．５ｗ／ｗ％アガロースゲルブロック上に静置し培養する。
また、雄性生殖細胞と精巣体細胞様細胞との混合時の割合は、作製された凝集塊が精巣組織を形成し、機能的な精子を形成する限りにおいて限定されない。
雄性生殖細胞と精巣体細胞様細胞との共培養に用いられる基礎培地としては、精巣体細胞様細胞誘導工程において例示された基礎培地と同じものを使用することができ、これに血清、又は血清代替物を添加して用いることができる。血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ヒト血清等）の濃度は、通常０．１ｖ／ｖ％以上２０ｖ／ｖ％以下、好ましくは２ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下である。
また、雄性生殖細胞と精巣体細胞様細胞との共培養に用いられるその他の添加剤としては、精巣体細胞様細胞誘導工程において例示されたその他の添加剤と同じものを使用することができる。
雄性生殖細胞と精巣体細胞様細胞との共培養において、精子を形成するための培養条件は、以下に限定されないが、例えば、１ｖ／ｖ％以上１０ｖ／ｖ％以下の二酸化炭素及び９０ｖ／ｖ％以上９９ｖ／ｖ％以下の大気の雰囲気下で行うことができる。
培養温度は約３０℃以上４０℃以下であり、好ましくは約３４℃である。
培養期間は予め作製した凝集塊の培養開始から数えて１１日間以上５０日間以下培養することが好ましい。なお、雄性生殖細胞と精巣体細胞様細胞との共培養の期間は、培養する雄性生殖細胞の由来する動物種等により異なるが、生体内で精巣において始原生殖細胞から精子を形成するまでの期間を目安とすることが好ましい。
培養温度は約３０℃以上４０℃以下であり、好ましくは約３４℃である。
培養期間は予め作製した凝集塊の培養開始から数えて１１日間以上５０日間以下培養することが好ましい。なお、雄性生殖細胞と精巣体細胞様細胞との共培養の期間は、培養する雄性生殖細胞の由来する動物種等により異なるが、生体内で精巣において始原生殖細胞から精子を形成するまでの期間を目安とすることが好ましい。
このようにして得られた精子は、通常の体外受精に用いることができる。また、後述する実施例に示すように、得られた精子は、妊孕能を有する。
≪精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメント≫
本実施形態の精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメント（以下、単に「本実施形態の培地サプリメント」と称する場合がある）は、ＷＮＴシグナル阻害剤を含む。
本実施形態の精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメント（以下、単に「本実施形態の培地サプリメント」と称する場合がある）は、ＷＮＴシグナル阻害剤を含む。
本実施形態の培地サプリメントによれば、生体組織に依存せずに精子形成支持能を有する精巣体細胞様細胞が得られる。
また、別の実施形態において、本発明は、以下の培地サプリメント１～３を備える、多能性幹細胞から精巣体細胞様細胞への分化誘導用培地サプリメントセットを提供する。
ＢＭＰ４及びＷＮＴシグナル活性化剤を含む培地サプリメント１；
ヘッジホッグシグナル活性化剤、ＢＭＰ４、レチノイン酸、及びＭＥＫ阻害剤を含む培地サプリメント２；
ＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地サプリメント３。
ＢＭＰ４及びＷＮＴシグナル活性化剤を含む培地サプリメント１；
ヘッジホッグシグナル活性化剤、ＢＭＰ４、レチノイン酸、及びＭＥＫ阻害剤を含む培地サプリメント２；
ＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地サプリメント３。
培地サプリメント１は、多能性幹細胞から初期中胚葉様細胞への分化誘導用培地サプリメントである。
培地サプリメント２は、初期中胚葉様細胞から中期中胚葉様細胞への分化誘導用培地サプリメントである。
培地サプリメント３は、中期中胚葉様細胞から精巣体細胞様細胞への分化誘導用培地サプリメントである。
これら培地サプリメント１～３は、上記「精巣体細胞様細胞の製造方法」に記載の各種添加剤を更に含むことができる。
≪精巣体細胞様細胞の製造用培地キット≫
本実施形態の精巣体細胞様細胞の製造用培地キット（以下、単に「本実施形態の培地キット」と称する場合がある）は、基礎培地と、上述した精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメントと、を備える。
本実施形態の精巣体細胞様細胞の製造用培地キット（以下、単に「本実施形態の培地キット」と称する場合がある）は、基礎培地と、上述した精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメントと、を備える。
本実施形態の培地キットによれば、生体組織に依存せずに精子形成支持能を有する精巣体細胞様細胞が得られる。
また、別の実施形態において、本発明は、以下の構成を備える、多能性幹細胞から精巣体細胞様細胞への分化誘導用培地キットを提供する。
基礎培地；
ＢＭＰ４及びＷＮＴシグナル活性化剤を含む培地サプリメント１；
ヘッジホッグシグナル活性化剤、ＢＭＰ４、レチノイン酸、及びＭＥＫ阻害剤を含む培地サプリメント２；
ＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地サプリメント３。
基礎培地；
ＢＭＰ４及びＷＮＴシグナル活性化剤を含む培地サプリメント１；
ヘッジホッグシグナル活性化剤、ＢＭＰ４、レチノイン酸、及びＭＥＫ阻害剤を含む培地サプリメント２；
ＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地サプリメント３。
基礎培地としては、上記「精巣体細胞様細胞の製造方法」において例示されたものと同様のものを用いることができる。また、上述したキットには培養に必要なその他の試薬、培養容器等の器具等を含むこともできる。
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜多能性幹細胞から精巣体細胞様細胞への誘導＞
［実施例１］
図１に示すプロトコールに従って、マウスＥＳ細胞からエピブラスト様細胞（ＥｐｉＬＣｓ）へ（工程１）、ＥｐｉＬＣｓから初期中胚葉様細胞へ（工程２）、初期中胚葉様細胞から中期中胚葉様細胞（精巣前駆細胞様細胞）へ（工程３）、中期中胚葉様細胞（精巣前駆細胞様細胞）から精巣体細胞へ（工程４）、順を追って誘導した。
［実施例１］
図１に示すプロトコールに従って、マウスＥＳ細胞からエピブラスト様細胞（ＥｐｉＬＣｓ）へ（工程１）、ＥｐｉＬＣｓから初期中胚葉様細胞へ（工程２）、初期中胚葉様細胞から中期中胚葉様細胞（精巣前駆細胞様細胞）へ（工程３）、中期中胚葉様細胞（精巣前駆細胞様細胞）から精巣体細胞へ（工程４）、順を追って誘導した。
工程２～工程４に使用する基礎培地（以下、「ＧＫ１５」と称する場合がある）としては、１５ｖ／ｖ％のＫＳＲ（ＫｎｏｃｋＯｕｔＴＭ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｖａｔｅ、０．１ｍＭ ２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１００Ｕ／ｍＬのｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、０．１ｍｇ／ｍＬのｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、及び２ｍＭ Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅを含有するＧＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。
（工程１：多能性幹細胞からＥｐｉＬＣｓへの誘導）
多能性幹細胞からＥｐｉＬＣｓへの誘導は、非特許文献１に記載の方法に従って、行なった。
多能性幹細胞からＥｐｉＬＣｓへの誘導は、非特許文献１に記載の方法に従って、行なった。
使用したＥＳ細胞は、Ｓｏｘ９－ＧＦＰ及びＮｒ５ａ１－ｈＣＤ２７１が遺伝子導入されたマウス（ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社製）の胚盤胞より樹立したＥＳ細胞株である。なお、Ｓｏｘ９は幹細胞のマーカー遺伝子であり、Ｎｒ５ａ１（ＳＦ１）は中期中胚葉のマーカー遺伝子である。また、使用したＥＳ細胞の核型は、４０本の染色体（３８ＸＹ）を有する雄の細胞である。
予め、ＥＳ細胞は２ｉ（０．４μＭのＰＤ０３２５９０１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社製）、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社製））及びＬＩＦ（１０００μｍｏｌ／ｍＬ）を含むＮ２Ｂ２７培地を用いて、フィーダーフリー、５ｖ／ｖ％ＣＯ２、９５ｖ／ｖ％空気、３７℃の条件下で２日間培養した。
次いで、ヒト血漿由来フィブロネクチンでコーティングした培養皿と、Ａｃｔｉｖｉｎ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（１２ｎｇ／ｍＬ）、及び、ＫＳＲ（１ｖ／ｖ％）を含むＮ２Ｂ２７培地と、を用いて、ＥＳ細胞を４３時間培養することによりＥｐｉＬＣｓに分化させた。
（工程２：ＥｐｉＬＣｓから初期中胚葉様細胞への誘導）
工程１で得られたＥｐｉＬＣｓは、ＢＭＰ４（１ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＣＨＩＲ９９０２１（１４μＭ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、及び、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含むＧＫ１５、並びに、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）（ＡＧＣテクノグラス社製、型番４０００－９０４ＳＰ）を用いて培養を行い、初期中胚葉様細胞へ分化誘導した、ＥＳ細胞は、３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈでＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）に播種した。
工程１で得られたＥｐｉＬＣｓは、ＢＭＰ４（１ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＣＨＩＲ９９０２１（１４μＭ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、及び、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含むＧＫ１５、並びに、ＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）（ＡＧＣテクノグラス社製、型番４０００－９０４ＳＰ）を用いて培養を行い、初期中胚葉様細胞へ分化誘導した、ＥＳ細胞は、３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｄｉｓｈでＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）に播種した。
（工程３：初期中胚葉から中期中胚葉様細胞への誘導）
工程２における培養開始から４３時間後（工程２の培養開始から２日目）に、細胞塊を低吸着９６ｗｅｌｌ培養皿（ＮＵＮＣ社製）に移し、且つ、培地を、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）（３０ｎｇ／ｍＬ;Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＢＭＰ４（１ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ（３μＭ；Ｓｉｇｍａ社製)、ＰＤ０３２５９０１（１μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社製)、及び、ＦｃｅＭ（登録商標）（２ｖ／ｖ％、日産化学社製）を含むＧＫ１５に換えて培養を行い、中期中胚葉様細胞へと分化誘導した。
工程２における培養開始から４３時間後（工程２の培養開始から２日目）に、細胞塊を低吸着９６ｗｅｌｌ培養皿（ＮＵＮＣ社製）に移し、且つ、培地を、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）（３０ｎｇ／ｍＬ;Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＢＭＰ４（１ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、Ｒｅｔｉｎｏｉｃ Ａｃｉｄ（３μＭ；Ｓｉｇｍａ社製)、ＰＤ０３２５９０１（１μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社製)、及び、ＦｃｅＭ（登録商標）（２ｖ／ｖ％、日産化学社製）を含むＧＫ１５に換えて培養を行い、中期中胚葉様細胞へと分化誘導した。
（工程４：中期中胚葉様細胞から精巣体細胞様細胞への誘導）
工程３における培養開始から４９時間後（工程２の培養開始から４日目）に、培地を、ＦＧＦ９（２ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＩＷＲ１（２０μＭ；Ｓｉｇｍａ社製）、及び、ＦｃｅＭ（登録商標）（２ｖ／ｖ％以上２．６ｖ／ｖ％以下、日産化学社製）を含むＧＫ１５に換えて培養を行い、精巣体細胞様細胞へと分化誘導した。対照として、ＩＷＲ１を含まず、ＦＧＦ９（２ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、及び、ＦｃｅＭ（登録商標）を含むＧＫ１５に換えて培養を行ったものも準備した。
工程３における培養開始から４９時間後（工程２の培養開始から４日目）に、培地を、ＦＧＦ９（２ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＩＷＲ１（２０μＭ；Ｓｉｇｍａ社製）、及び、ＦｃｅＭ（登録商標）（２ｖ／ｖ％以上２．６ｖ／ｖ％以下、日産化学社製）を含むＧＫ１５に換えて培養を行い、精巣体細胞様細胞へと分化誘導した。対照として、ＩＷＲ１を含まず、ＦＧＦ９（２ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、及び、ＦｃｅＭ（登録商標）を含むＧＫ１５に換えて培養を行ったものも準備した。
工程４における培養開始から４８時間後（工程２の培養開始から６日目）に、ＦＡＣＳ解析を行い、Ｓｏｘ９陽性及びＮｒ５ａ１陽性の精巣体細胞様細胞を選別した。結果を図２に示す。
図２に示すように、Ｅ１４（１４日齢の雄マウスの精巣体細胞）と同様に、Ｓｏｘ９陽性及びＮｒ５ａ１陽性の精巣体細胞様細胞が得られたことが確認された。また、工程４においてＩＷＲ１を含有する培地で培養した群では、ＩＷＲ１を含まない培地で培養した群よりも、Ｓｏｘ９陽性及びＮｒ５ａ１陽性細胞の誘導効率が優れていた。
選別された各Ｓｏｘ９陽性及びＮｒ５ａ１陽性細胞について、精巣体細胞のマーカーであるＡｍｈ（抗ミュラー管ホルモン）遺伝子及び卵巣体細胞のマーカーであるＦｏｘｌ２遺伝子の発現量を定量ＰＣＲ法により確認した。結果を図３に示す。
図３に示すように、Ｅ１４（１４日齢の雄マウスの精巣体細胞）と同様に、ＩＷＲ１を含有する培地で培養した群では、Ａｍｈ遺伝子の発現が上昇し、且つ、Ｆｏｘｌ２遺伝子の発現が低下していた。一方で、ＩＷＲ１を含まない培地で培養した群では、Ａｍｈ遺伝子の発現がほとんどみられず、その代わりにＦｏｘｌ２遺伝子の発現が上昇していた。この結果から、従来の分化誘導法では、細胞のメス化が進行することで、セルトリ細胞を含む精巣体細胞が十分に誘導できないことが示された。
以上の結果から、中期中胚葉から精巣体細胞様細胞への分化誘導時に、ＩＷＲ１等のＷＮＴシグナル阻害剤を使用することで、メス化を抑制し、精巣体細胞様細胞への誘導を効率的に行えることが明らかとなった。
＜精巣体細胞様細胞を用いた精子形成＞
［実施例２］
ＥＳ細胞から誘導された精巣体細胞様細胞について、ｉｎ ｖｉｔｒｏセルトリ細胞置換法により、該精巣体細胞様細胞の精子形成支持能を確認した。具体的には、図４に示すプロトコールに従って、実験を行なった。
［実施例２］
ＥＳ細胞から誘導された精巣体細胞様細胞について、ｉｎ ｖｉｔｒｏセルトリ細胞置換法により、該精巣体細胞様細胞の精子形成支持能を確認した。具体的には、図４に示すプロトコールに従って、実験を行なった。
（セルトリ様細胞の選別）
まず、実施例１と同様の方法を用いて、精巣体細胞様細胞を作製した。工程２の培養開始から９日目にＦＡＣＳ解析を行なった。図４に示すように、中胚葉細胞の表面マーカーであるＣＤ１４０ａ（ＰＤＧＦＲα）陽性及びＮｒ５ａ１陽性細胞を選別し、更に、当該ＣＤ１４０ａ陽性及びＮｒ５ａ１陽性細胞の中から、Ｓｏｘ９陽性及びＮｒ５ａ１陽性細胞であるセルトリ様細胞を選別した。
まず、実施例１と同様の方法を用いて、精巣体細胞様細胞を作製した。工程２の培養開始から９日目にＦＡＣＳ解析を行なった。図４に示すように、中胚葉細胞の表面マーカーであるＣＤ１４０ａ（ＰＤＧＦＲα）陽性及びＮｒ５ａ１陽性細胞を選別し、更に、当該ＣＤ１４０ａ陽性及びＮｒ５ａ１陽性細胞の中から、Ｓｏｘ９陽性及びＮｒ５ａ１陽性細胞であるセルトリ様細胞を選別した。
（ｉｎ ｖｉｔｒｏセルトリ細胞置換による精細管の再構築）
次いで、ジフテリア毒素（ＤＴ）処理により任意の時期にセルトリ細胞を特異的に除去できるＡＭＨ－ＴＲＣＫトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの精巣を採取し、上記セルトリ様細胞の懸濁液（１μＬ以上２μＬ以下程度；１×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬ）を注入した。次いで、精巣を１．５ｗ／ｗ％アガロースゲル（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）ブロック上に静置し、５ｎｇ／ｍＬのＤＴを含むαＭＥＭ培地（１０ｖ／ｖ％ＫＳＲ含有）、３４℃で８日間培養し、精細管が再構築されるか確認した。
次いで、ジフテリア毒素（ＤＴ）処理により任意の時期にセルトリ細胞を特異的に除去できるＡＭＨ－ＴＲＣＫトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの精巣を採取し、上記セルトリ様細胞の懸濁液（１μＬ以上２μＬ以下程度；１×１０５ｃｅｌｌｓ／μＬ）を注入した。次いで、精巣を１．５ｗ／ｗ％アガロースゲル（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）ブロック上に静置し、５ｎｇ／ｍＬのＤＴを含むαＭＥＭ培地（１０ｖ／ｖ％ＫＳＲ含有）、３４℃で８日間培養し、精細管が再構築されるか確認した。
図５に示すように、培養８日目において、移植したセルトリ様細胞のＳＯＸ９－ＧＦＰの蛍光が検出された。
次いで、精巣の切片について抗ＳＣＰ３抗体及び蛍光標識ｐｅａｎｕｔ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＮＡ）レクチンを用いた蛍光免疫染色を行なった。また、同時に核染色（ＤＡＰＩ）も行なった。ＳＣＰ３は、精母細胞のマーカーである。ＰＮＡは精子先体マーカーである。結果を図６に示す。
図６に示すように、セルトリ様細胞のサポートによって、分化した精子細胞が確認された。この精子細胞の妊孕能を調べるため、卵へ顕微授精を行ったところ健康な産仔を得た（図７）。
以上のことから、ＥＳ細胞から誘導されたセルトリ様細胞は、精子形成支持能を有することが確認された。
＜工程４におけるＦＧＦ９濃度の検討＞
［実施例３］
工程４における培地組成の最適化の一つとして、ＦＧＦ９の濃度をふった検討を行った。
［実施例３］
工程４における培地組成の最適化の一つとして、ＦＧＦ９の濃度をふった検討を行った。
（工程１～工程３）
工程１～工程３については、実施例１と同様の方法を用いて、マウスＸＹ型ＥＳ細胞から中期中胚葉様細胞を得た。
工程１～工程３については、実施例１と同様の方法を用いて、マウスＸＹ型ＥＳ細胞から中期中胚葉様細胞を得た。
（工程４：中期中胚葉様細胞から精巣体細胞様細胞への誘導）
工程３における培養開始から４９時間後（工程２の培養開始から４日目）に、培地を、ＦＧＦ９（０、２、１００、又は２００ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＩＷＲ１（２０μＭ；Ｓｉｇｍａ社製）、及び、ＦｃｅＭ（登録商標）（２ｖ／ｖ％、日産化学社製）を含むＧＫ１５に換えて培養を行い、精巣体細胞様細胞へと分化誘導した。
工程３における培養開始から４９時間後（工程２の培養開始から４日目）に、培地を、ＦＧＦ９（０、２、１００、又は２００ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＢＭＰ４（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＩＷＲ１（２０μＭ；Ｓｉｇｍａ社製）、及び、ＦｃｅＭ（登録商標）（２ｖ／ｖ％、日産化学社製）を含むＧＫ１５に換えて培養を行い、精巣体細胞様細胞へと分化誘導した。
工程４における培養開始から４８時間後（工程２の培養開始から６日目）に、ＦＡＣＳ解析を行い、Ｓｏｘ９陽性及びＮｒ５ａ１陽性の精巣体細胞様細胞を選別した。結果を図８に示す。
図８に示すように、ＦＧＦ９濃度の違いによって、Ｓｏｘ９陽性及びＮｒ５ａ１陽性細胞の分化誘導効率に大きな違いはなかった。
以上の結果から、工程４において、ＦＧＦ９は必須の培地成分ではないことが明らかとなった。
＜工程４におけるＢＭＰ４濃度の検討＞
［実施例４］
工程４における培地組成の最適化の一つとして、ＢＭＰ４の濃度をふった検討を行った。
［実施例４］
工程４における培地組成の最適化の一つとして、ＢＭＰ４の濃度をふった検討を行った。
（工程１～工程３）
工程１～工程３については、実施例１と同様の方法を用いて、マウスＸＹ型ＥＳ細胞から中期中胚葉様細胞を得た。
工程１～工程３については、実施例１と同様の方法を用いて、マウスＸＹ型ＥＳ細胞から中期中胚葉様細胞を得た。
（工程４：中期中胚葉様細胞から精巣体細胞様細胞への誘導）
工程３における培養開始から４９時間後（工程２の培養開始から４日目）に、培地を、ＦＧＦ９（２ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＢＭＰ４（０、２、２０、又は１００ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＩＷＲ１（２０μＭ；Ｓｉｇｍａ社製）、及び、ＦｃｅＭ（登録商標）（２ｖ／ｖ％、日産化学社製）を含むＧＫ１５に換えて培養を行い、精巣体細胞様細胞へと分化誘導した。
工程３における培養開始から４９時間後（工程２の培養開始から４日目）に、培地を、ＦＧＦ９（２ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＢＭＰ４（０、２、２０、又は１００ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、ＩＷＲ１（２０μＭ；Ｓｉｇｍａ社製）、及び、ＦｃｅＭ（登録商標）（２ｖ／ｖ％、日産化学社製）を含むＧＫ１５に換えて培養を行い、精巣体細胞様細胞へと分化誘導した。
工程４における培養開始から４８時間後（工程２の培養開始から６日目）に、ＦＡＣＳ解析を行い、Ｓｏｘ９陽性及びＮｒ５ａ１陽性の精巣体細胞様細胞を選別した。結果を図９に示す。
図９に示すように、ＢＭＰ４濃度の違いによって、Ｓｏｘ９陽性及びＮｒ５ａ１陽性細胞の分化誘導効率に劇的な変化はみられなかったが、ＢＭＰ４濃度の上昇に伴って、Ｎｒ５ａ１陽性細胞の比率が高まる傾向がみられた。
以上の結果から、工程４において、ＢＭＰ４濃度が２ｎｇ／ｍＬ以上であることで、Ｎｒ５ａ１陽性細胞の分化誘導効率が特に優れることが明らかとなった。
本実施形態の製造方法によれば、生体組織に依存せずに精子形成支持能を有する精巣体細胞様細胞が得られる。また、本実施形態の製造方法で得られた精巣体細胞様細胞を用いることで、生体外において精子を形成することができる。
Claims (9)
- 中期中胚葉様細胞をＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、精巣体細胞様細胞の製造方法。
- 前記培地が線維芽細胞増殖因子９、及び骨形成因子４からなる群より選ばれる１種以上を更に含む、請求項１に記載の精巣体細胞様細胞の製造方法。
- 前記ＷＮＴシグナル阻害剤がＩＷＲ－１又はＩＷＰ－２である、請求項１又は２に記載の精巣体細胞様細胞の製造方法。
- 前記培地中の前記ＷＮＴシグナル阻害剤の濃度が１０μＭ以上４０μＭ以下である、請求項１又は２に記載の精巣体細胞様細胞の製造方法。
- 請求項１又は２に記載の精巣体細胞様細胞の製造方法で得られた、精巣体細胞様細胞。
- 請求項１又は２に記載の精巣体細胞様細胞の製造方法で得られた精巣体細胞様細胞と、前記精巣体細胞様細胞と同種由来の雄性生殖細胞とを共培養することを含む、精子の形成方法。
- 中期中胚葉様細胞をＷＮＴシグナル阻害剤を含む培地で培養することを含む、中期中胚葉様細胞を精巣体細胞様細胞に分化誘導する方法。
- ＷＮＴシグナル阻害剤を含む、精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメント。
- 基礎培地と、
請求項８に記載の精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメントと、
を備える、精巣体細胞様細胞の製造用培地キット。
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| JP2022107795A Pending JP2024006674A (ja) | 2022-07-04 | 2022-07-04 | 精巣体細胞様細胞の製造方法、精巣体細胞様細胞、精子の形成方法、中期中胚葉様細胞を精巣体細胞様細胞に分化誘導する方法、精巣体細胞様細胞の製造用培地サプリメント、及び精巣体細胞様細胞の製造用培地キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2024006674A (ja) |
-
2022
- 2022-07-04 JP JP2022107795A patent/JP2024006674A/ja active Pending
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