JP2009502124A - 生殖系列幹細胞の療法的再プログラミング - Google Patents
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Abstract
多能性の療法的にプログラミングされた細胞、およびこうした細胞を作製するための方法を提供する。多能性の療法的にプログラミングされた細胞は、出生後幹細胞であり、これらは、刺激因子に接触した後、より分化した状態、またはより分化していない状態のいずれかに相当するように、成熟している細胞である。多能性の療法的に再プログラミングされた細胞は、細胞再生療法に適しており、そしてより拘束された細胞系譜に分化する潜在能力を有する。出生後幹細胞を療法的に再プログラミングするための培地もまた、開示する。
Description
関連出願に対するクロス・リファレンス
[0001]本出願は、35 U.S.C.§119(e)に基づいて、2005年7月15日出願の米国仮特許出願第60/699,680号に優先権を請求し、そして2006年4月13日出願の米国特許出願第11/279,611号の一部継続出願であり、該出願は、35 U.S.C.§119(e)に基づいて、2005年4月15日出願の仮特許出願第60/671,826号に優先権を請求する。本出願はまた、2005年2月16日出願の米国特許出願第11/060,131号の一部継続出願でもあり、該出願は、35 U.S.C.§119(e)に基づいて、2004年7月15日出願の仮特許出願第60/588,146号に優先権を請求する。上に言及する出願はすべて、その全体が本明細書に援用される。
[0001]本出願は、35 U.S.C.§119(e)に基づいて、2005年7月15日出願の米国仮特許出願第60/699,680号に優先権を請求し、そして2006年4月13日出願の米国特許出願第11/279,611号の一部継続出願であり、該出願は、35 U.S.C.§119(e)に基づいて、2005年4月15日出願の仮特許出願第60/671,826号に優先権を請求する。本出願はまた、2005年2月16日出願の米国特許出願第11/060,131号の一部継続出願でもあり、該出願は、35 U.S.C.§119(e)に基づいて、2004年7月15日出願の仮特許出願第60/588,146号に優先権を請求する。上に言及する出願はすべて、その全体が本明細書に援用される。
発明の分野
[0002]本発明は、療法的に再プログラミングされた細胞の分野に関する。具体的には、加齢プロセスによって損なわれておらず、免疫適合性であり、そして適切な出生後細胞環境において機能して、移植後に機能する細胞を生じるであろう、療法的に再プログラミングされた細胞を提供する。
[0002]本発明は、療法的に再プログラミングされた細胞の分野に関する。具体的には、加齢プロセスによって損なわれておらず、免疫適合性であり、そして適切な出生後細胞環境において機能して、移植後に機能する細胞を生じるであろう、療法的に再プログラミングされた細胞を提供する。
発明の背景
[0003]幹細胞は、他の種類の細胞を生じさせる未分化細胞である。前駆細胞とも称される、いくつかの種類の幹細胞がある。全能性細胞は、ヒト胚に栄養を与える胎盤を加えて、体のすべての細胞を生成するのに必要な遺伝子情報をすべて含有するため、体の「マスター」細胞と見なされる。ヒト細胞は、受精卵の最初の数回の分裂の間のみ、この全能性を有する。全能性細胞が3〜4回分裂した後、細胞が次第に特殊化する、一連の段階が続く。分裂の次の段階は、多能性(pluripotent)細胞を生じ、これらの細胞は非常に万能であり、そして胎盤または子宮の他の支持組織の細胞を除いて、いかなる細胞種も生じさせうる。次の段階で、細胞は多分化性(multipotent)となり、これは、これらの細胞が、いくつかの他の細胞種を生じさせうるが、これらの種類の数が限定されることを意味する。多分化性細胞の例は、造血細胞−いくつかの種類の血液細胞に発生可能であるが、脳細胞には発生不能である血液細胞−である。胚を作り上げる、細胞分裂の長い連鎖の最後は、「最終的に分化した」細胞−特定の機能に永久に拘束されたと見なされる細胞−である。
[0003]幹細胞は、他の種類の細胞を生じさせる未分化細胞である。前駆細胞とも称される、いくつかの種類の幹細胞がある。全能性細胞は、ヒト胚に栄養を与える胎盤を加えて、体のすべての細胞を生成するのに必要な遺伝子情報をすべて含有するため、体の「マスター」細胞と見なされる。ヒト細胞は、受精卵の最初の数回の分裂の間のみ、この全能性を有する。全能性細胞が3〜4回分裂した後、細胞が次第に特殊化する、一連の段階が続く。分裂の次の段階は、多能性(pluripotent)細胞を生じ、これらの細胞は非常に万能であり、そして胎盤または子宮の他の支持組織の細胞を除いて、いかなる細胞種も生じさせうる。次の段階で、細胞は多分化性(multipotent)となり、これは、これらの細胞が、いくつかの他の細胞種を生じさせうるが、これらの種類の数が限定されることを意味する。多分化性細胞の例は、造血細胞−いくつかの種類の血液細胞に発生可能であるが、脳細胞には発生不能である血液細胞−である。胚を作り上げる、細胞分裂の長い連鎖の最後は、「最終的に分化した」細胞−特定の機能に永久に拘束されたと見なされる細胞−である。
[0004]科学者らは、分化した細胞が天然に拘束されている方法以外のいずれかの方法で、こうした細胞が振舞うように改変することも、またそうした振舞いを引き起こすことも不可能であるという意見を、長年持っていた。しかし、最近の幹細胞実験において、科学者らは、ニューロンのように振舞うように血液幹細胞を促すことが可能になった。したがって、研究はまた、多分化性細胞を多能性種にする方法にも重点を置くようになってきている(Kanatsu−Shinohara M.ら Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis. Cell 119:1001−12, 2004)。
[0005]幹細胞は、臓器維持および機能に必要な広い範囲の細胞組織種を生じさせうる稀な細胞集団である。これらの細胞は、2つの基本的な特性;(i)自己再性能を有し、(ii)成熟表現型を持つ1以上の特殊化細胞種に分化する能力も有する特性を有する、未分化細胞と定義される。幹細胞には3つの主な群;(i)すべての出生後生物に存在する成体または体性(出生後)、(ii)前胚性(pre−embryonic)または胚性発生段階に由来してもよい胚性、および(iii)発生中の胎児から単離可能な胎児幹細胞(出生前)がある。幹細胞の各群は、細胞再生療法に関して、特に分化潜在能力および適切なまたはターゲットとされる細胞環境において新たに移植されそして機能する能力において、それ自体の利点および不都合な点を有する。
[0006]出生後の動物においては、細胞系譜に拘束された前駆幹細胞および細胞系譜に拘束されていない多能性幹細胞である細胞があり、これらは結合組織中に住して、連続する臓器または臓器系維持および修復に必要な細胞を、出生後生物に提供する。これらの細胞は、体性または成体幹細胞と呼ばれ、そして休止していることもまたは休止していないこともありうる。典型的な成体幹細胞は、2つの特性:(i)長期間に渡ってそれ自体の同一コピーを作製可能であり(長期自己複製);そして(ii)特徴的な形態および特殊化された機能を有する成熟細胞種を生じさせうる特性を共有する。
[0007]幹細胞生物学の理解の多くは、造血幹細胞、および骨髄移植後のその振舞いから得られている。骨髄ニッチ内には、いくつかの種類の成体幹細胞があり、これらは各々、その細胞環境に関連して、ユニークな特性および可変性の分化能を有する。免疫前ヒツジ胎児中に子宮内移植された、ヒト骨髄から単離された体性幹細胞は、多数の組織内に異種移植する能力を有する。やはり骨髄ニッチ内にあるのは間充織幹細胞であり、この細胞は、骨、軟骨、脂肪、腱、肺、筋肉、骨髄間質、および脳組織を含む、広範囲の非造血分化能を有する。さらに、神経幹細胞、膵臓、筋肉、脂肪、卵巣および精原幹細胞が発見されてきている。骨髄移植の使用を通じて、体性または出生後幹細胞の療法的有用性が立証されてきており、そして理解されてきている。しかし、成体体性幹細胞は、加齢および細胞分裂によって改変されているゲノムを有する。加齢は、フリーラジカル損傷、または酸化損傷の集積を生じ、こうした損傷は、細胞に新生物を形成させる傾向があるか、細胞分化能を減少させるか、またはアポトーシスを誘導する可能性もある。細胞分裂の反復は、細胞の機能上の寿命を決定する究極の細胞時計であるテロメア短縮に直接関連する。その結果、成体体性幹細胞は、胚性および出生前幹細胞に見られる生理学的に最高の状態とは十分に異なったゲノムを有する。
[0008]不運なことに、成体動物の体内の実質的にすべての体細胞は、幹細胞を含めて、時間および細胞分裂反復によって破壊されたゲノムを所持する。したがって、今日まで、損傷を受けていないか、または最高の状態の生理学的ゲノムを有する幹細胞を得るための唯一の手段は、中絶された胚またはin vitro受精技術を用いて形成された胚から幹細胞を回収することであった。しかし、科学的および倫理的懸念から、胚性幹細胞を用いた幹細胞研究の進行は遅れてきた。胚性幹細胞株の生成は、研究および療法の両方のための胚性幹細胞の再生可能供給源を提供すると考えられてきたが、最近の報告によって、現存する細胞株には、免疫原性の動物分子が混入していることが示されている(Martin M.ら, Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nature Medicine 11:228−32, 2005)。
[0009]成体幹細胞を用いることに関連する別の問題は、これらの細胞が免疫学的に特権を与えられていないか、または移植後にその免疫学的特権を失いうることである。(用語「免疫学的に特権を与えられている」は、レシピエントの免疫系がその細胞を異質(foreign)と認識しない状態を称するように用いられる)。したがって、成体幹細胞を用いる場合はほとんど、自己移植のみが可能である。したがって、幹細胞療法の大部分の現在想定される形は、本質的にカスタマイズされた医学的方法であり、そしてしたがって、こうした方法に付随する経済的要因によって、その広い範囲の潜在能力が限定される。現在入手可能なものの使用に対するさらなる障壁。
[0010]さらに、幹細胞は、療法剤として有用となるために、望ましい臓器または細胞種に成熟するよう誘導されなければならない。in vivoの幹細胞成熟に影響を及ぼす要因は、ほとんど理解されておらず、そしてex vivoではさらにより理解されていない。したがって、現在の成熟技術は、管理する科学者またはレシピエントの制御を超えて、ほとんど、幸運および生物学的プロセスに頼る。
[0011]現在の研究は、細胞再生療法における使用のため、全能性または多能性の免疫学的に特権を与えられた細胞の供給源として、発生中の胚性幹細胞に重点を置く。しかし、胚性幹細胞は、移植後に奇形腫を形成するため、それ自体、直接移植に適していない可能性もあるため、移植に適した、カスタマイズされた多能性、多分化性または拘束細胞に分化することも可能な「普遍的ドナー」として提唱されている。さらに、ヒト胚からの胚性幹細胞の単離と関連する道徳的および倫理的問題がある。
[0012]再生医学において安全に使用可能である多能性細胞株の生成は、バイオテクノロジーに大きな影響を有する。これに関連して、胚性幹(ES)細胞は、無制限に増殖可能であり、そして3つの胚葉すべての表現型に分化可能であるため、細胞置換療法の潜在的な細胞供給源となりうる。しかし、ES細胞適用が実現可能となりうる前に、倫理的問題を解決しなければならず、そしてES細胞またはその派生物の移植後の奇形腫の形成を克服しなければならない。多様な組織から生じる成体幹細胞は、移植後に奇形腫を形成せず、そして同じ系譜の表現型に分化する柔軟性を維持するため、細胞に基づく療法の代替供給源と見なされる。これらは、異なる系譜の細胞種にトランス分化するように誘導されるか、または臨床適用のため、多能性幹細胞になるよう再プログラミングされることさえ可能である。すべての成体幹細胞の中で、生殖系列幹細胞(GSC)のみが、遺伝情報を子孫に伝える能力を保持する。GSCが正常発生中の再プログラミング・プロセスを通じて、多能可能性を獲得することを示唆するいくつかの系列の証拠もある。したがって、GSCは、療法目的のために多能性細胞株を生成するための優れた成体幹細胞モデルとして見なされる。最近、ES細胞様細胞が新生マウス精巣から生成された。これらの細胞は、ES細胞と類似の分子特性および機能特性を示し、そして免疫低下マウスの精巣に注入すると奇形腫を生じる。しかし、これらのES様細胞は、成体精巣からは生成不能であり、療法目的に関する価値が減少する。
[0013]したがって、生理学的にほぼ最高の状態であるゲノムを有する、生物学的に有用な多能性幹細胞の供給源に対する必要性がある。さらに、療法的に有用であるために十分な期間に渡って、レシピエントにおいて、免疫学的特権を維持する、生理学的にほぼ最高の状態であるゲノムを有する、生物学的に有用な多能性幹細胞の供給源に対する必要性がある。さらに、移植された幹細胞が、意図される組織へと成熟する潜在能力を最大にするため、in vivoまたはex vivoのいずれかで幹細胞移植片を適切な状態にする必要がある。
発明の概要
[0014]本発明は、ヒト出生後幹細胞から生じ、最小限の酸化損傷、および損傷を受けていない出生前または胚性幹細胞のテロメア長と好適に匹敵するテロメア長を有する、生物学的に有用な多能性の療法的に再プログラミングされたヒト細胞を提供する(すなわち本発明の療法的に再プログラミングされたヒト細胞は、ほぼ最高の生理学的状態のゲノムを所持する)。さらに、本発明の療法的に再プログラミングされたヒト細胞は、免疫学的に特権を与えられており、そしてしたがって、療法的適用に適している。さらに、本発明には、本発明の解説にしたがって作製されたヒト出生後幹細胞を、特定の宿主組織へと成熟させるための関連方法も含まれる。
[0014]本発明は、ヒト出生後幹細胞から生じ、最小限の酸化損傷、および損傷を受けていない出生前または胚性幹細胞のテロメア長と好適に匹敵するテロメア長を有する、生物学的に有用な多能性の療法的に再プログラミングされたヒト細胞を提供する(すなわち本発明の療法的に再プログラミングされたヒト細胞は、ほぼ最高の生理学的状態のゲノムを所持する)。さらに、本発明の療法的に再プログラミングされたヒト細胞は、免疫学的に特権を与えられており、そしてしたがって、療法的適用に適している。さらに、本発明には、本発明の解説にしたがって作製されたヒト出生後幹細胞を、特定の宿主組織へと成熟させるための関連方法も含まれる。
[0015]本発明の態様において、ヒト幹細胞を療法的に再プログラミングするための細胞培地であって、細胞培養増殖培地基剤;複数のビタミン類およびミネラル類、ならびに複数の細胞増殖および成熟因子を含む、前記培地を提供する。
[0016]本発明の別の態様において、細胞培地は血清不含であり、そしてPM−10、PM−20またはPM−100と称され;複数の細胞増殖および成熟因子は、組換えヒト上皮増殖因子、組換えヒト線維芽細胞増殖因子2、組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子およびヒト白血病阻害因子からなる群より選択される因子を含む。組換えヒト上皮増殖因子は、およそ10ng/ml〜およそ40ng/mlの間、好ましくはおよそ20ng/mlの濃度で存在する。組換えヒト線維芽細胞増殖因子2は、およそ1ng/ml〜およそ120ng/mlの間の濃度で存在する。組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子は、およそ2ng/ml〜およそ40ng/mlの間、好ましくはおよそ10ng/ml(PM−10およびPM−100)〜およそ20ng/ml(PM−20)の間の濃度で存在する。ヒト白血病阻害因子は、およそ1,000単位/ml〜およそ10,000単位/mlの間、好ましくはおよそ1,000単位/mlの濃度で存在する。
[0017]本発明の別の態様において、細胞培地は低濃度の血清または血清代替物を含有し、そしてPM−1、PM−5またはPM−101と称され;血清構成要素は、およそ1%〜およそ5%の間、好ましくはおよそ1%の濃度のヒト血清またはウシ胎児血清である。複数の細胞増殖および成熟因子は、組換えヒト上皮増殖因子、組換えヒト線維芽細胞増殖因子2、組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子およびネズミ白血病阻害因子からなる群より選択される因子を含む。組換えヒト上皮増殖因子は、およそ10ng/ml〜およそ40ng/mlの間、好ましくはおよそ20ng/mlの濃度で存在する。組換えヒト線維芽細胞増殖因子2は、およそ10ng/ml〜およそ120ng/mlの間の濃度で存在する。組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子は、およそ2ng/ml〜およそ40ng/mlの間、好ましくはおよそ2ng/mlの濃度で存在する。ネズミ白血病阻害因子は、およそ1,000単位/ml〜およそ10,000単位/mlの間、好ましくはおよそ1,000単位/mlの濃度で存在する。
[0018]本発明の態様において、細胞培地は、高濃度の血清または血清代替物を含有し、そしてPM−3と称され;血清構成要素は、およそ10%〜およそ15%の間、好ましくはおよそ12%の濃度のヒト血清またはウシ胎児血清である。複数の細胞増殖および成熟因子は、組換えヒト上皮増殖因子、組換えヒト線維芽細胞増殖因子2、組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子およびネズミ白血病阻害因子からなる群より選択される因子を含む。組換えヒト上皮増殖因子は、およそ10ng/ml〜およそ40ng/mlの間、好ましくはおよそ20ng/mlの濃度で存在する。組換えヒト線維芽細胞増殖因子2は、およそ10ng/ml〜およそ40ng/mlの間、好ましくはおよそ10ng/mlの濃度で存在する。組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子は、およそ2ng/ml〜およそ40ng/mlの間、好ましくはおよそ2ng/mlの濃度で存在する。ネズミ白血病阻害因子は、およそ1,000単位/ml〜およそ10,000単位/mlの間、好ましくはおよそ1,000単位/mlの濃度で存在する。
[0019]本発明の別の態様において、細胞培地は拡大培地と称され;血清構成要素はおよそ12%〜およそ17%の間、好ましくはおよそ15%の濃度のヒト血清またはウシ胎児血清または血清代替物である。複数の細胞増殖および成熟因子は、組換えヒト上皮増殖因子、組換えヒト線維芽細胞増殖因子2、組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子およびネズミ白血病阻害因子からなる群より選択される因子を含む。ネズミ白血病阻害因子は、およそ1,000単位/ml〜およそ10,000単位/mlの間、好ましくはおよそ1,000単位/mlの濃度で存在する。
[0020]本発明の態様において:幹細胞を単離し;療法的に再プログラミングされた細胞への該幹細胞の発生を誘導する刺激因子を含む培地と、該幹細胞を接触させ;療法的に再プログラミングされた細胞を培地から回収し;そして療法的に再プログラミングされた細胞、またはそこから成熟した細胞を、療法的に再プログラミングされた細胞を必要とする宿主内に移植する工程を含む、療法的再プログラミング方法を提供する。
[0021]本発明の療法的再プログラミング法の態様において、幹細胞は、始原性細胞、例えば精原幹細胞である。
[0022]本発明の療法的再プログラミング方法の態様において、幹細胞は、始原性細胞などのヒト出生後幹細胞である。別の態様において、始原性細胞は、男性または女性出生後供給源から単離された二倍体生殖細胞である。別の態様において、始原性細胞は精原幹細胞である。
[0022]本発明の療法的再プログラミング方法の態様において、幹細胞は、始原性細胞などのヒト出生後幹細胞である。別の態様において、始原性細胞は、男性または女性出生後供給源から単離された二倍体生殖細胞である。別の態様において、始原性細胞は精原幹細胞である。
[0023]本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、培地は、PM−1、PM−3、PM−5またはPM−101培地または拡大培地を含む。
[0024]本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、培地は、PM−10、PM−20またはPM−100培地を含む。
[0024]本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、培地は、PM−10、PM−20またはPM−100培地を含む。
[0025]本発明の療法的再プログラミング方法の態様において、療法的に再プログラミングされたヒト細胞から成熟する細胞は、心筋細胞である。
[0026]本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、療法的に再プログラミングされたヒト細胞から成熟する細胞は、グリア細胞である。
[0026]本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、療法的に再プログラミングされたヒト細胞から成熟する細胞は、グリア細胞である。
[0027]本発明の別の態様において、幹細胞基礎培地、2mM L−グルタミン、MEMビタミン溶液、0.1mM MEM非必須アミノ酸、10−4Mアスコルビン酸、10μg/ml d−ビオチン、80ng/ml β−エストラジオール、60ng/mlプロゲステロン、5mg/mlウシ・アルブミン、1μl/ml DL−乳酸、30μg/mlピルビン酸、6mg/ml D−(+)−グルコース、30nM亜セレン酸ナトリウム、60μMプトレシン、100μg/mlトランスフェリン(transferring)、25μg/mlインスリン、1xペニシリン/ストレプトマイシン、10x10−5M β−メルカプトエタノール、1%ウシ胎児血清、20ng/ml組換えヒト上皮増殖因子、10ng/ml組換えヒト線維芽細胞増殖因子2、2ng/ml組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子および1,000単位のネズミ白血病阻害因子を含む改善剤(improvement)から本質的になる、PM−1と称される、幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
[0028]本発明のさらに別の態様において、ダルベッコの修飾イーグル培地、2mM L−グルタミン、0.1mM MEM非必須アミノ酸、1xペニシリン/ストレプトマイシン、0.1mM β−メルカプトエタノール、12%ウシ胎児血清、20ng/ml組換えヒト上皮増殖因子、10ng/ml組換えヒト線維芽細胞増殖因子2、2ng/ml組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子および1,000単位のネズミ白血病阻害因子を含む改善剤から本質的になる、PM−3と称される、幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
[0029]本発明の別の態様において、ダルベッコの修飾イーグル培地、2mM L−グルタミン、0.1mM MEM非必須アミノ酸、1xペニシリン/ストレプトマイシン、0.1mM β−メルカプトエタノール、15%ウシ胎児血清および1,000単位のネズミ白血病阻害因子を含む改善剤から本質的になる、拡大培地と称される、幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
[0030]本発明の別の態様において、幹細胞基礎培地、2mM L−グルタミン、MEMビタミン溶液、0.1mM MEM非必須アミノ酸、10−4Mアスコルビン酸、10μg/ml d−ビオチン、80ng/ml β−エストラジオール、60ng/mlプロゲステロン、5mg/mlウシ・アルブミン、1μl/ml DL−乳酸、30μg/mlピルビン酸、6mg/ml D−(+)−グルコース、30nM亜セレン酸ナトリウム、60μMプトレシン、100μg/mlトランスフェリン、25μg/mlインスリン、1xペニシリン/ストレプトマイシン、10x10−5M β−メルカプトエタノール、20ng/ml組換えヒト上皮増殖因子、1ng/ml組換えヒト線維芽細胞増殖因子2、10ng/ml組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子および1,000単位/mlのヒト白血病阻害因子を含む改善剤から本質的になる、PM−10と称される、幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
[0031]本発明の別の態様において、幹細胞基礎培地、2mM L−グルタミン、MEMビタミン溶液、0.1mM MEM非必須アミノ酸、10−4Mアスコルビン酸、10μg/ml d−ビオチン、80ng/ml β−エストラジオール、60ng/mlプロゲステロン、5mg/mlウシ・アルブミン、1μl/ml DL−乳酸、30μg/mlピルビン酸、6mg/ml D−(+)−グルコース、30nM亜セレン酸ナトリウム、60μMプトレシン、100μg/mlトランスフェリン、25μg/mlインスリン、1xペニシリン/ストレプトマイシン、10x10−5M β−メルカプトエタノール、1%ウシ胎児血清、20ng/ml組換えヒト上皮増殖因子、1ng/ml組換えヒト線維芽細胞増殖因子2、20ng/ml組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子および1,000単位のヒト白血病阻害因子を含む改善剤から本質的になる、PM−20と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
[0032]本発明の別の態様において、幹細胞基礎培地、2mM L−グルタミン、MEMビタミン溶液、0.1mM MEM非必須アミノ酸、10−4Mアスコルビン酸、10μg/ml d−ビオチン、80ng/ml β−エストラジオール、60ng/mlプロゲステロン、5mg/mlウシ・アルブミン、1μl/ml DL−乳酸、30μg/mlピルビン酸、6mg/ml D−(+)−グルコース、30nM亜セレン酸ナトリウム、60μMプトレシン、100μg/mlトランスフェリン、25μg/mlインスリン、1xペニシリン/ストレプトマイシン、10x10−5M β−メルカプトエタノール、20ng/ml組換えヒト上皮増殖因子、110ng/ml組換えヒト線維芽細胞増殖因子2、10ng/ml組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子および1,000単位/mlのヒト白血病阻害因子を含む改善剤から本質的になる、PM−100と称される、幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
[0033]本発明の別の態様において、幹細胞基礎培地、2mM L−グルタミン、MEMビタミン溶液、0.1mM MEM非必須アミノ酸、10−4Mアスコルビン酸、10μg/ml d−ビオチン、80ng/ml β−エストラジオール、60ng/mlプロゲステロン、5mg/mlウシ・アルブミン、1μl/ml DL−乳酸、30μg/mlピルビン酸、6mg/ml D−(+)−グルコース、30nM亜セレン酸ナトリウム、60μMプトレシン、100μg/mlトランスフェリン、25μg/mlインスリン、1xペニシリン/ストレプトマイシン、10x10−5M β−メルカプトエタノール、1%ウシ胎児血清、20ng/ml組換えヒト上皮増殖因子、2ng/ml組換えヒト線維芽細胞増殖因子2、20ng/ml組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子および1,000単位のヒト白血病阻害因子を含む改善剤から本質的になる、PM−5と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
[0034]本発明の別の態様において、幹細胞基礎培地、2mM L−グルタミン、MEMビタミン溶液、0.1mM MEM非必須アミノ酸、10−4Mアスコルビン酸、10μg/ml d−ビオチン、80ng/ml β−エストラジオール、60ng/mlプロゲステロン、5mg/mlウシ・アルブミン、1μl/ml DL−乳酸、30μg/mlピルビン酸、6mg/ml D−(+)−グルコース、30nM亜セレン酸ナトリウム、60μMプトレシン、100μg/mlトランスフェリン、25μg/mlインスリン、1xペニシリン/ストレプトマイシン、10x10−5M β−メルカプトエタノール、1%ウシ胎児血清、20ng/ml組換えヒト上皮増殖因子、10ng/ml組換えヒト線維芽細胞増殖因子2、10ng/ml組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子および1,000単位のヒト白血病阻害因子を含む改善剤から本質的になる、PM−101と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地を提供する。
[0035]本発明の1つの態様において、幹細胞を単離し;療法的に再プログラミングされた細胞への該幹細胞の発生を誘導する刺激因子を含む培地と、該幹細胞を接触させ;そして療法的に再プログラミングされた細胞を培地から回収する工程を含む、療法的再プログラミング方法を提供する。
[0036]本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、幹細胞は始原性細胞である。さらに別の態様において、始原性細胞は精原幹細胞である。
[0037]本発明の療法的再プログラミング方法のさらに別の態様において、培地はPM−1培地を含む。別の態様において、培地はPM−3培地を含む。別の態様において、培地は拡大培地を含む。
[0037]本発明の療法的再プログラミング方法のさらに別の態様において、培地はPM−1培地を含む。別の態様において、培地はPM−3培地を含む。別の態様において、培地は拡大培地を含む。
[0038]本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、療法的に再プログラミングされた細胞は、多能性生殖幹細胞である。別の態様において、療法的に再プログラミングされた細胞から成熟する細胞は、心筋細胞である。
[0039]本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、幹細胞はc−kitを発現する。
[0040]本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、方法は、前記多能性生殖幹細胞を培養する工程をさらに含む。
[0040]本発明の療法的再プログラミング方法の別の態様において、方法は、前記多能性生殖幹細胞を培養する工程をさらに含む。
[0041]本発明の療法的再プログラミング方法のさらに別の態様において、方法は、療法的に再プログラミングされた細胞、またはそこから成熟した細胞を、療法的に再プログラミングされた細胞を必要とする宿主内に移植する工程をさらに含む。
[0042]本発明の態様において、療法的に再プログラミングされたヒト出生後幹細胞を含む多能性療法組成物を提供する。別の態様において、ヒト出生後幹細胞は始原性細胞である。別の態様において、始原性細胞は、男性または女性出生後供給源から単離された二倍体生殖細胞である。さらに別の態様において、始原性細胞は精原幹細胞である。
[0043]本発明の別の態様において、療法的に再プログラミングされたヒト出生後幹細胞を含み、そして療法的に再プログラミングされたヒト出生後幹細胞が、本発明の療法的再プログラミング方法にしたがって産生される、多能性療法組成物を提供する。
用語の定義
[0072]用語の以下の定義を、読者に役立つ参考として提供する。本特許に用いる用語は、本発明に関連した際の特定の意味を有する。用語の通常のそして一般的な意味にしたがって、用語を用いる、あらゆる努力を行った。しかし、一般的な通常の意味および以下の定義の間に矛盾が存在する場合は、これらの定義が一般的な用法に優先する。
用語の定義
[0072]用語の以下の定義を、読者に役立つ参考として提供する。本特許に用いる用語は、本発明に関連した際の特定の意味を有する。用語の通常のそして一般的な意味にしたがって、用語を用いる、あらゆる努力を行った。しかし、一般的な通常の意味および以下の定義の間に矛盾が存在する場合は、これらの定義が一般的な用法に優先する。
[0073]拘束された:本明細書において、「拘束された(committed)」は、特定の機能に永久に拘束されたと見なされる細胞を指す。拘束された細胞はまた、「最終的に分化した細胞」とも称される。
[0074]脱分化:本明細書において、「脱分化」は、形状または機能における特殊化の喪失を指す。細胞において、脱分化は、より拘束されていない細胞を導く。
[0075]分化:本明細書において、「分化」は、特定の形状または機能に対する細胞の適応を指す。細胞において、分化は、より拘束された細胞を導く。
[0075]分化:本明細書において、「分化」は、特定の形状または機能に対する細胞の適応を指す。細胞において、分化は、より拘束された細胞を導く。
[0076]胚:本明細書において、「胚」は、成長および分化の初期段階にある動物を指し、これらの段階は、3つの胚葉が定義され、そして確立される、着床および原腸形成によって、そしてそれぞれの臓器および臓器系への胚葉の分化によって、特徴付けられる。3つの胚葉は、内胚葉、外胚葉および中胚葉である。
[0077]胚性幹細胞:本明細書において、「胚性幹細胞」は、全能性であり、そして子宮壁に付着する発生段階に到達した、発生中の胚に由来する、いかなる細胞も指す。これに関連して、胚性幹細胞および前胚性幹細胞は同等の用語である。胚性幹細胞様(ESC様)細胞は、胚から直接単離されたのではない、全能性または多能性細胞である。ESC様細胞は、本発明の解説にしたがって脱分化した、始原性細胞に由来してもよい。
[0078]胎児幹細胞:本明細書において、「胎児幹細胞」は、多分化性であり、そしてもはや初期または中期臓器形成中ではない、発生中の多細胞胎児に由来する細胞を指す。
[0079]生殖(germ)細胞:本明細書において、「生殖細胞」は、精母細胞または卵母細胞などの繁殖(reproductive)細胞、あるいは繁殖細胞へと分化するであろう細胞を指す。
[0080]成熟:本明細書において、「成熟」は、分化経路における順方向または逆方向いずれかの協調した段階のプロセスを指し、そして分化および脱分化の両方を指してもよい。本明細書において、成熟は、本明細書記載のプロセスに適用された場合、用語、発生する、または発生と同義である。
[0081]多分化性:本明細書において、「多分化性」は、いくつかの他の細胞種を生じうるが、こうした細胞種の数が限定されている細胞を指す。多分化性細胞の例は、造血細胞−いくつかの種類の血液細胞に発生可能であるが、脳細胞には発生不能である血液細胞−である。
[0082]多分化性成体前駆細胞:本明細書において、「多分化性成体前駆細胞」は、間充織、内皮および内胚葉系譜細胞に分化する潜在能力を有する、骨髄から単離される多分化性細胞を指す。
[0083]多能性:本明細書において、「多能性」は、胎盤の細胞または子宮の他の支持細胞を除いて、いかなる細胞種も生じさせうる細胞を指す。
[0084]多能性生殖幹細胞:本明細書において、「多能性生殖幹細胞」または「PGS」は、多能性であるように療法的に再プログラミングされ、そして培養中で維持可能な始原性細胞を指す。
[0084]多能性生殖幹細胞:本明細書において、「多能性生殖幹細胞」または「PGS」は、多能性であるように療法的に再プログラミングされ、そして培養中で維持可能な始原性細胞を指す。
[0085]出生後幹細胞:本明細書において、「出生後幹細胞」は、多分化性であり、そして誕生後の多細胞生物に由来する、いかなる細胞も指す。
[0086]前胚:本明細書において、「前胚」は、細胞分裂前の発生初期段階中の受精卵を指す。前胚段階中、卵割の最初の段階が起こる。
[0086]前胚:本明細書において、「前胚」は、細胞分裂前の発生初期段階中の受精卵を指す。前胚段階中、卵割の最初の段階が起こる。
[0087]前胚性幹細胞:上記の「胚性幹細胞」を参照されたい。
[0088]始原性細胞:本明細書において、「始原性細胞」は、雄性または雌性成熟または発生中の性腺に由来し、種を増殖させる細胞を生じることが可能であり、そして二倍体ゲノム状態を含有する、いかなる二倍体細胞も指す。始原性細胞は、休止していてもまたは能動的に分裂していてもよい。これらの細胞には、雄性原生殖細胞、雌性原生殖細胞、精原幹細胞、卵巣幹細胞、卵原細胞、A型精原細胞、B型精原細胞が含まれる。始原性細胞はまた、生殖系列幹細胞(GSC)としても知られる。
[0088]始原性細胞:本明細書において、「始原性細胞」は、雄性または雌性成熟または発生中の性腺に由来し、種を増殖させる細胞を生じることが可能であり、そして二倍体ゲノム状態を含有する、いかなる二倍体細胞も指す。始原性細胞は、休止していてもまたは能動的に分裂していてもよい。これらの細胞には、雄性原生殖細胞、雌性原生殖細胞、精原幹細胞、卵巣幹細胞、卵原細胞、A型精原細胞、B型精原細胞が含まれる。始原性細胞はまた、生殖系列幹細胞(GSC)としても知られる。
[0089]始原生殖細胞:本明細書において、「始原生殖細胞」は、生殖細胞になることが運命付けられている、初期胚形成中に存在する細胞を指す。
[0090]再プログラミング:本明細書において、「再プログラミング」は、細胞が多能性を示し、そして完全に発生した生物を産生する潜在能力を有するように、細胞の遺伝的プログラムをリセットすることを指す。
[0090]再プログラミング:本明細書において、「再プログラミング」は、細胞が多能性を示し、そして完全に発生した生物を産生する潜在能力を有するように、細胞の遺伝的プログラムをリセットすることを指す。
[0091]応答性である:本明細書において、「応答性である」は、細胞環境内で、適宜、感受性であり、そして機能しうる、細胞または細胞群の状態を指す。応答性細胞は、特定の細胞環境、組織、臓器および/または臓器系において、応答し、そして機能することが可能である。
[0092]体性幹細胞:本明細書において、「体性幹細胞」は、二倍体多分化性または多能性幹細胞を指す。体性幹細胞は、全能性幹細胞ではない。
[0093]療法的クローニング:本明細書において、「療法的クローニング」は、卵の核を、別の細胞および内部細胞塊由来の幹細胞の核と交換することを含む、核トランスファー法を用いた細胞のクローニングを指す。
[0093]療法的クローニング:本明細書において、「療法的クローニング」は、卵の核を、別の細胞および内部細胞塊由来の幹細胞の核と交換することを含む、核トランスファー法を用いた細胞のクローニングを指す。
[0094]療法的再プログラミング:本明細書において、「療法的再プログラミング」は、本発明の解説にしたがって、幹細胞を刺激因子に曝露して、多能性、多分化性または組織特異的拘束細胞を得る、成熟プロセスを指す。療法的に再プログラミングされた細胞は、病気の、損傷を受けた、欠陥がある、または遺伝的に損傷がある組織を置換するかまたは修復するため、宿主内に移植するのに有用である。本発明の療法的に再プログラミングされた細胞は、非ヒト・シアル酸残基を所持しない。
[0095]全能性:本明細書において、「全能性」は、胎盤を加えて、体のすべての細胞を生成するのに必要な遺伝子情報をすべて含有する細胞を指す。ヒト細胞は、受精卵の最初の数回の分裂中にのみ、全能性である能力を有する。
発明の詳細な説明
[0096]本発明は、出生後幹細胞から生じ、最小限の酸化損傷、および損傷を受けていない出生前または胚性幹細胞のテロメア長と好適に匹敵するテロメア長を有する、生物学的に有用な多能性の療法的に再プログラミングされた細胞を提供する(すなわち本発明の療法的に再プログラミングされた細胞は、ほぼ最高の生理学的状態のゲノムを所持する)。さらに、本発明の療法的に再プログラミングされた細胞は、免疫学的に特権を与えられており、そしてしたがって、療法的適用に適している。
発明の詳細な説明
[0096]本発明は、出生後幹細胞から生じ、最小限の酸化損傷、および損傷を受けていない出生前または胚性幹細胞のテロメア長と好適に匹敵するテロメア長を有する、生物学的に有用な多能性の療法的に再プログラミングされた細胞を提供する(すなわち本発明の療法的に再プログラミングされた細胞は、ほぼ最高の生理学的状態のゲノムを所持する)。さらに、本発明の療法的に再プログラミングされた細胞は、免疫学的に特権を与えられており、そしてしたがって、療法的適用に適している。
[0097]幹細胞は、他の種類の細胞を生じさせる未分化細胞である。前駆細胞とも称される、いくつかの種類の幹細胞がある。全能性細胞は、ヒト胚に栄養を与える胎盤を加えて、体のすべての細胞を生成するのに必要な遺伝子情報をすべて含有するため、体の「マスター」細胞と見なされる。ヒト細胞は、受精卵の最初の数回の分裂の間のみ、この全能性を有する。全能性細胞が3〜4回分裂した後、細胞が次第に特殊化する、一連の段階が続く。分裂の次の段階は、多能性細胞を生じ、これらの細胞は非常に万能であり、そして胎盤または子宮の他の支持組織の細胞を除いて、いかなる細胞種も生じさせうる。次の段階で、細胞は多分化性となり、これは、これらの細胞が、いくつかの他の細胞種を生じさせうるが、これらの種類の数が限定されることを意味する。多分化性細胞の例は、造血細胞−いくつかの種類の血液細胞に発生可能であるが、脳細胞には発生不能である血液細胞−である。胚を作り上げる、細胞分裂の長い連鎖の最後は、「最終的に分化した」細胞−特定の機能に永久に拘束されたと見なされる細胞−である。
[0098]科学者らは、分化した細胞が天然に拘束されている方法以外のいずれかの方法で、こうした細胞が振舞うように改変することも、またそうした振舞いを引き起こすことも不可能であるという意見を、長年持っていた。しかし、最近の幹細胞実験において、科学者らは、ニューロンのように振舞うように血液幹細胞を促すことが可能になった。したがって、研究はまた、多分化性細胞を多能性種にする方法にも重点を置くようになってきている(Kanatsu−Shinohara M.ら Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis. Cell 119:1001−12, 2004)。
[0099]哺乳動物発生の個体発生は、幹細胞に中心的な役割を提供する。胚形成初期、生殖細胞になることが運命付けられている近位胚盤葉上層由来の細胞(始原生殖細胞)は、生殖隆起に沿って移動する。これらの細胞は、高レベルのアルカリホスファターゼを発現するとともに、転写因子Oct−4を発現する。生殖隆起での移動およびコロニー形成に際して、始原生殖細胞は、雄性または雌性生殖細胞前駆体(始原性細胞)への分化を経る。本開示の目的のため、雄性始原性細胞(PSC)のみを論じるが、雄性および雌性始原性細胞の性質および特性は同等であり、そしていかなる制限も示されない。雄性始原性細胞発生中、始原幹細胞は、前駆体セルトリ細胞と緊密に関連するようになり、輸精索の形成開始を導く。始原生殖細胞は、輸精索に囲い込まれると、有糸分裂が休止した原生殖細胞に分化する。これらの原生殖細胞は、数日間分裂した後、細胞周期のG0/G1期で抑止される。マウスおよびラットでは、これらの原生殖細胞は、誕生後、数日以内に分裂を再開して、精原幹細胞を生じ、そして最終的に精子形成に関連する分化および減数分裂を経る。
[0100]始原性細胞は、受精に必要な細胞の生成に、そして最終的には、新たな生物を生成する新たなラウンドの胚形成に直接関与する。始原性細胞は、死ぬようにプログラムはされず、そして胚性状態のものに匹敵する性質を持つ。
[0101]胚性幹細胞は、着床前の胚盤胞段階の胚の内部細胞塊に由来する細胞であり、そして最大の分化潜在能力を有し、胚の3つの胚葉すべてに見られる細胞を適切に生じさせることが可能である。現実的な観点から、胚性幹細胞は、天然の胚盤葉上層環境において、胚形成中に一過性にしか存在しないため、細胞培養のアーチファクトである。in vitroでの胚性幹細胞の操作によって、心筋細胞、造血細胞、内皮細胞、神経、骨格筋、軟骨細胞、脂肪細胞、肝臓および膵臓島を含む、広範囲の細胞種の生成および分化が導かれてきた。成熟細胞と共培養中の増殖しつつある胚性幹細胞は、胚性幹細胞の特定の系譜への分化に影響を及ぼし、そしてこうした分化を開始することも可能である。
[0102]この議論の目的のため、臓器形成に関連した発生段階に基づいて、胚および胎児を区別する。前胚段階は、前胚が、卵割の最初の段階を経ている期間を指す。初期胚形成は、3つの胚葉が定義され、そして確立される、着床および原腸形成によって特徴付けられる。後期胚形成は、それぞれの臓器および臓器系の形成への胚葉派生物の分化によって定義される。胚から胎児への移行は、大部分の重要な臓器および臓器系の発生、その後の迅速な胎児成長によって定義される。
[0103]胚形成は、精子によって受精した卵母細胞が分裂し始め、そして卵割および胞胚形成が起こる胚形成の第一ラウンドを経る、発生プロセスである。第二ラウンド中、着床、原腸形成および初期臓器形成が起こる。第三ラウンドは、臓器形成によって特徴付けられ、そして胚がもはや胚とは呼ばれず、胎児と呼ばれる、胚形成の最終ラウンドでは、胎児成長および発生が起こる。
[0104]胚形成中、桑実胚卵割後およびコンパクションから生じる、最初の2つの組織系譜は、栄養外胚葉および未分化内胚葉であり、これらは胎盤および胚体外卵黄嚢に大きく寄与する。コンパクション後、まもなく、そして着床前に、胚盤葉上層または未分化内胚葉が発生し始める。
[0105]胚盤葉上層は、胚を適切に生じさせる細胞を提供する。多能性細胞が住し、そして発生中に、多様な発生上の仕事を行うように指示される、胚盤葉上層幹細胞ニッチが発生すると、胞胚形成は完了し、この時点で、胚は透明体から現れ、そして子宮壁に着床する。
[0106]着床後、原腸形成および初期臓器形成が続く。臓器形成の第一ラウンド終了までに、3つの胚葉はすべて、形成されているであろうし;外胚葉、中胚葉および明確な内胚葉、ならびに基本的なボディープランおよび臓器原基が確立される。初期臓器形成後、胚形成は、大規模な臓器発生によって特徴付けられ、これが完了した時点が、発生中の胚から発生中の胎児への転換の印であり、胎児は、胎児成長および臓器発生の最終ラウンドによって特徴付けられる。胚形成が完了したならば、妊娠期間は誕生によって終了し、この時点で、生物は、正常に機能し、そして出生後に生存するために必要な臓器、組織および細胞ニッチをすべて有する。
[0107]胚形成プロセスは、胚発生が起こる際のその広範囲なプロセスを記載するよう用いられるが、細胞レベルでは、胚形成を細胞成熟によって記載し、そして/または立証してもよい。
[0108]胎児幹細胞は、胎児骨髄(造血幹細胞)、胎児脳(神経幹細胞)および羊水(多能性羊水幹細胞)から単離されてきている。さらに、幹細胞は、成体雄性および雌性組織の両方で記載されてきている。胎児幹細胞は、臓器形成および胎児発生のプロセス中に多数の役割を果たし、そして最終的には体性幹細胞予備の一部になる。
[0109]成熟は、分化経路において順方向または逆方向いずれかの協調した段階のプロセスであり、そして分化および/または脱分化の両方を指してもよい。成熟プロセスの1つの例において、細胞または細胞群が、胚形成および臓器形成中に、その細胞環境と相互作用する。成熟が進行するにつれて、細胞はニッチを形成し、そしてこれらのニッチまたは微小環境には、臓器形成を導きそして制御する幹細胞が住する。誕生時に、生物が出生後に機能し、そして生存するための、細胞および適切な細胞ニッチが存在するように、成熟が進行する。発生プロセスは、異なる種間で非常に保存されており、実験室において、1つの哺乳動物種由来の成熟または分化系を、他の哺乳動物種に拡張することが可能である。
[0110]生物の一生の間、臓器および臓器系の細胞組成物は、細胞またはゲノム損傷を誘導する、広範囲の内因性および外因性因子に曝露される。紫外光は、正常の皮膚細胞に影響を及ぼすだけでなく、皮膚幹細胞集団にも影響を及ぼす。癌を治療するのに用いる化学療法薬剤は、造血幹細胞に壊滅的な影響を及ぼす。細胞代謝の副産物である反応性酸素種は、細胞のゲノム完全性を損なう内因性因子である。すべての臓器または臓器系において、細胞は絶え間なく幹細胞集団で交換されている。しかし、生物が加齢するにつれて、これらの幹細胞集団において、細胞の損傷が集積する。ゲノム突然変異のように、損傷が遺伝性であれば、すべての子孫が影響を受け、そしてしたがって損なわれる。単一の幹細胞クローンは、1年より長く、リンパおよび骨髄細胞などの系譜の生成に寄与し、そしてしたがって、幹細胞が損傷を受けているならば、幹細胞は、突然変異を伝播させる可能性を有する。体は、アポトーシスを誘導し、それによって損なわれた幹細胞をプールから除去し、そして潜在的に機能不全であるかまたは腫瘍原性である特性を防止することによって、損なわれた幹細胞に応答する。アポトーシスは、損なわれた細胞を集団から取り除くが、また、将来的に利用可能である幹細胞の数を減少させる。したがって、生物が加齢するにつれて、幹細胞の数が減少する。幹細胞プールの損失に加えて、加齢が幹細胞のホーミング機構の効率を減少させる証拠がある。テロメアは、非常に保存された、タンデムに反復されるDNA配列を含有する染色体の物理的末端である。テロメアは、直鎖DNA分子の複製および安定性に関与し、そして細胞における計数機構として働く;細胞分裂の各ラウンドとともに、テロメアの長さが短くなり、そしてあらかじめ決定された閾値で、シグナルが活性化されて、細胞老化が開始する。幹細胞および体細胞はテロメラーゼを産生し、これがテロメアの短縮を阻害するが、加齢および細胞ストレスの間、テロメアはなお次第に短縮される。
[0111]多様な疾患の治療のための細胞療法の歴史があるが、使用の大部分は、悪性腫瘍を含む、造血障害に対する骨髄移植におけるものである。骨髄移植において、個体の免疫系は、別の個体から移植された骨髄で回復される。この回復は、骨髄における造血幹細胞の作用に長く寄与してきた。
[0112]幹細胞がin vitroで特定の細胞種に分化可能であり、そして多様な組織内に移植されることによって多分化性である潜在能力を有し、そして胚葉を渡って移動することを示しうる証拠が増加しており、そしてこうしたものとして、幹細胞は細胞療法の多くの研究の対象であり続けている。移植の慣用的な種類と同様、免疫拒絶は、細胞療法の制限要因である。レシピエント個体の表現型およびドナーの表現型は、細胞または臓器移植片が免疫系によって寛容されるかまたは拒絶されるかを決定するであろう。
[0113]したがって、本発明は、細胞再生/修復療法のため、機能する免疫適合幹細胞を提供するための方法および組成物を提供する。
[0114]本発明の態様において、出生後幹細胞を療法的に再プログラミングするための方法および組成物を提供する。療法的再プログラミングは、本発明の解説にしたがって幹細胞が刺激因子に曝露され、多能性、多分化性または組織特異的拘束細胞を生じる、成熟プロセスを指す。限定されるわけではないが、療法的にクローニングされた細胞、ハイブリッド幹細胞、胚性幹細胞、胎児幹細胞、多分化性出生後幹細胞(成体前駆細胞)、脂肪由来幹細胞(ADSC)および始原性細胞を含む多様な幹細胞を用いて、療法的再プログラミングのプロセスを行ってもよい。
[0114]本発明の態様において、出生後幹細胞を療法的に再プログラミングするための方法および組成物を提供する。療法的再プログラミングは、本発明の解説にしたがって幹細胞が刺激因子に曝露され、多能性、多分化性または組織特異的拘束細胞を生じる、成熟プロセスを指す。限定されるわけではないが、療法的にクローニングされた細胞、ハイブリッド幹細胞、胚性幹細胞、胎児幹細胞、多分化性出生後幹細胞(成体前駆細胞)、脂肪由来幹細胞(ADSC)および始原性細胞を含む多様な幹細胞を用いて、療法的再プログラミングのプロセスを行ってもよい。
[0115]本発明の療法的再プログラミング方法は、限定されるわけではないが、霊長類、げっ歯類、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ等を含む多様な動物由来の細胞を再プログラミングするのに適している。1つの態様において、霊長類はヒトである。
[0116]療法的再プログラミングは、精原幹細胞および脂肪由来幹細胞のような特定の幹細胞が比較的容易に得られるという事実を利用して、そしてこれらの細胞を刺激因子に曝露することによって後成的に再プログラミングする。これらの療法的に再プログラミングされた細胞は、成熟状態をより拘束された細胞系譜またはより拘束されていない細胞系譜のいずれかに変化させる。したがって、療法的に再プログラミングされた細胞は、病気の、損傷を受けた、欠陥がある、または遺伝的に損傷がある組織を修復するかまたは再生することが可能である。
[0117]療法的再プログラミングは、限定なしに、化学薬品、生物化学薬品および細胞抽出物を含む刺激因子を用いて、細胞の後成的なプログラミングを変化させる。これらの刺激因子は、他の結果の中でも、ドナーDNAにおけるゲノムメチル化および/またはアセチル化変化を誘導する。
[0118]本発明の1つの特定の態様において、始原性細胞(PSC)を、療法的に再プログラミングする。始原性細胞は、精巣の精細管の裏打ちおよび卵巣の裏打ちに住し(それぞれ、精原細胞および卵原細胞)、加齢および細胞分裂の影響によって、著しくは損傷を受けない二倍体(2N)ゲノムを所持すると決定された。したがって、PSCは、生理学的にほぼ最高の状態のゲノムを所持する。本発明の態様で特に有用なPSCの限定されない例は、精原幹細胞である。本明細書の解説にしたがって、胚形成および臓器形成中に、発生中の胚および胎児に存在する幹細胞によって経験されるものと類似の手段を用いて、成熟プロセスのために、療法的に再プログラミングされたPSC細胞を調製する。
[0119]本発明の態様において、精原幹細胞を、フィーダー細胞の非存在下、PM−1培地中、細胞増殖促進および維持および成熟因子の存在下での培養によって、療法的に再プログラミングする(実施例3)。PM−1培地は、精原幹細胞が、多能性胚性幹細胞様細胞に療法的に再プログラミングされるのに必要なシグナルを含有する。低血清環境において、PM−1培地を用いて、PSCを療法的に再プログラミングするのに有用な細胞増殖および成熟因子には、限定されるわけではないが、上皮増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子2(FGF2)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)および白血病阻害因子(LIF)が含まれる。さらに、増殖因子、ならびに他の細胞増殖促進および維持因子を含有する拡大培地を実施例3に開示する(表4)。拡大培地は、療法的に再プログラミングされた多能性胚性幹細胞様細胞を培養するのに適している。
[0120]本発明の態様において、標準的な去勢外科手術を受け、そして長期ホルモン(エストロゲン)治療を受けているヒト男性から単離された精原幹細胞を、フィーダー細胞および血清の非存在下、PM−10、PM−20またはPM−100培地中、細胞増殖促進および維持および成熟因子の存在下での培養によって療法的に再プログラミングする(実施例8)。PM−10およびPM−20培地は、ヒト精原幹細胞が、多能性胚性幹細胞様細胞に療法的に再プログラミングされるのに必要なシグナルを含有する。血清不含環境において、PM−10およびPM−20またはPM−100培地を用いて、PSCを療法的に再プログラミングするのに有用な細胞増殖および成熟因子には、限定されるわけではないが、上皮増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子2(FGF2)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)および白血病阻害因子(LIF)が含まれる。
[0121]本発明の態様は、療法的に再プログラミングされたヒト細胞、幹細胞および始原性細胞を、出生後環境において、より拘束された細胞系譜に、さらに成熟させるかまたは分化させて、細胞再生/修復療法において使用するためのより拘束された細胞を提供するための方法を提供する。さらに、成熟および分化プロセスは、出生前および出生後臓器において損傷を受けた細胞を、治療するかまたは置換するのに使用可能な療法細胞を提供する。
[0122]本発明の1つの態様において、PM−3培地は、療法的に再プログラミングされたPSCを、拍動する心筋細胞に分化させるために用いられてきている。PM−3培地を用いて、療法的に再プログラミングされたPSCを、限定されるわけではないが、神経細胞、造血細胞、骨細胞、および他の細胞に分化させることが、本発明の範囲内である。PM−3培地を用いた、PSCおよび療法的に再プログラミングされたPSCの成熟および分化に有用な細胞増殖および成熟因子には、限定されるわけではないが、上皮増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子2(FGF2)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)および白血病阻害因子(LIF)が含まれる。
[0123]別の態様において、PM−1−AZA培地は、療法的に再プログラミングされたヒトPSCを、拍動する心筋細胞に分化させるために用いられてきている。療法的に再プログラミングされたヒトPSCを、限定されるわけではないが、神経細胞、造血細胞、骨細胞、および他の細胞に分化させることが、本発明の範囲内である。ヒトPSCおよび療法的に再プログラミングされたヒトPSCの療法的再プログラミングおよび成熟および分化に有用な細胞増殖および成熟因子には、限定されるわけではないが、EGF、FGF−2、GDNF、LIF、血小板由来増殖因子BB(PDGF−BB)、トランスフォーミング増殖因子−β3(TGF−β3)、線維芽細胞増殖因子8(FGF−8)およびソニック・ヘッジホッグ(SHH)が含まれる。
[0124]始原性細胞から産生される、療法的に再プログラミングされた細胞は、多能性生殖系列幹(PGS)細胞と称されている。出生後マウス精巣から単離された精原幹細胞(SSC)が、胚盤胞注入後に、正常な胚発生に寄与することから、これらが再プログラミングのための柔軟性を保持し、そして多能性幹細胞になることが、本発明の解説にしたがって作製されたこれらのPGS細胞によって立証される。これらはまた、in vitroで異なる細胞系譜に分化するように指示されることも可能である。
[0125]第一に、出生後マウス精巣におけるSSCの中のどの下位集団(単数または複数)が、PGS細胞形成に寄与するかに関連して、PGS細胞に再プログラミングさせるためには、c−kit陽性細胞集団が好ましい。c−kit陰性細胞は、やはり多能性マーカーおよび高いテロメラーゼ活性を示すものの、性腺系譜に拘束されている。驚くべきことに、c−kit陽性細胞も、またc−kit陰性細胞も、免疫低下マウスに移植した後、奇形腫形成を誘導しなかった。胚性幹(ES)細胞様多分化性幹細胞が奇形腫を形成するため、PGS細胞の奇形非形成性は、予期せぬものである。生殖系列幹細胞は、インプリンティングに続いて、13.5dpc(受精後の日数)後に奇形非形成性であることが見出されているため、PGS細胞は、発生段階および潜在能力の観点で、報告されるES細胞様細胞とは異なる。再プログラミングされたPGS細胞は、多能性であるが、ES細胞のレベルではない初期発生段階に達する。したがって、PGS細胞は、ESおよび成体幹細胞の限界を持たないが、利点を保持する、細胞置換療法のための優れた細胞供給源である。
[0126]インプリンティングは、ドナー細胞の遺伝的特質を保持するかまたは除去するため、細胞置換療法用の細胞の重要な特徴である。雄性生殖細胞において、ゲノム・インプリンティングは、胎児段階中に消去され、そして誕生前後に、プロ精原細胞において、雄性特異的インプリンティングが獲得され始める;このプロセスは誕生後に完了する。インプリンティング・プロセスに関与する分子事象は、再プログラミング中に生じるものに似ていると考えられる。始原生殖細胞(PGC)の胚性生殖細胞への変換は、幹細胞因子、LIFおよびbFGFを含むポリペプチド増殖因子に応じることが示されてきている。bFGF、LIF、GDNFおよびEGFなどの増殖因子は、SSCを多能性生殖細胞に変換するために重要な因子である。レポーター遺伝子追跡系を用いることによって明らかになったこのプロセスは、培養開始後のOct−4の迅速な下方制御に続く、PGSコロニー形成中のOct−4の上方制御を伴う。
[0127]PGS細胞は、ES細胞およびES様細胞に比較してSSEA−1のより低い発現を有する。SSEA−1は、炭水化物の段階特異的胚性抗原ファミリーのメンバーであり、そして腫瘍浸潤および転位に関与することが示されてきている。例えば、SSEA−1によるヒト療法PGS細胞の選択および濃縮は、移植可能なPGS集団の性質を改善しうる。in vivoで機能する表現型に分化することが可能な、出生後および成体ヒト精巣から単離された奇形非形成性PGS細胞の派生およびスケールアップした産生は、幹細胞生物学および適用に、直ちに影響を有するであろう。
[0128]本発明の解説にしたがって作製された、療法的に再プログラミングされたヒト細胞は、細胞再生/修復療法のための広範囲の療法的適用において、有用である。例えば、そして限定として意図されずに、本発明の療法的に再プログラミングされたヒト細胞を用いて、年齢、または癌放射療法および化学療法などの除去療法のために、天然幹細胞が枯渇している哺乳動物において、幹細胞を補充してもよい。別の限定されない実施例において、本発明の療法的に再プログラミングされたヒト細胞は、臓器再生および組織修復に有用である。本発明の1つの態様において、療法的に再プログラミングされたヒト細胞を用いて、ジストロフィー筋および心筋梗塞などの虚血事象によって損傷を受けた筋肉を含む、損傷を受けた筋肉組織を再活性化させてもよい。本発明の別の態様において、本明細書に開示する、療法的に再プログラミングされたヒト細胞を用いて、外傷的傷害または手術後、ヒトを含む動物における瘢痕を改善してもよい。この態様において、本発明の療法的に再プログラミングされたヒト細胞を、静脈内などで全身投与し、そしてこうした細胞は、損傷を受けた細胞によって分泌される循環サイトカインによって補充されて、新たに外傷を負わされた組織部位に移動する。本発明の別の態様において、療法的に再プログラミングされたヒト細胞を、修復または再生が必要な治療部位に、局所投与してもよい。
[0129]幹細胞は、本発明の成熟プロセスに普遍的に感受性であるわけではない。したがって、本発明者らは、出生後ヒト幹細胞が、成熟因子に感受性である状態になるように誘導される、療法的再プログラミング・プロセスを開発した。ドナー細胞を成熟のために感受性にするのに適した条件下で、そしてそれに十分な時間、刺激因子とインキュベーションすることによって、この療法的再プログラミング・プロセスを達成してもよい。
[0130]以下の実施例は、本発明の1以上の態様を例示することを意味し、そして以下に記載するものに本発明を限定することを意味しない。
実施例1
ネズミ精巣からの始原性細胞の単離
[0131]以下の方法および一般の当業者に知られるさらなる方法を用いて、出生前、胚性、出生後および成体精巣から、精巣を単離してもよい。
ネズミ精巣からの始原性細胞の単離
[0131]以下の方法および一般の当業者に知られるさらなる方法を用いて、出生前、胚性、出生後および成体精巣から、精巣を単離してもよい。
[0132]0〜3日齢OG2の雄の性腺から、雄性生殖幹細胞を単離した。トランスジェニックOG2マウスは、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する。各試験(全部で25回の試験)において、およそ30匹の仔を用いた。細かく刻んだ後、コラゲナーゼ(1mg/ml)、DNアーゼ−1(1μg/ml)およびEDTA(5mM)を含有するDPBS中で、精巣を消化した。当業者に周知の方法にしたがって、精巣細胞培養を行った。簡潔には、ゼラチンでコーティングした(0.1%)培養プレート中に細胞を配分した。翌日、浮遊細胞を収集し、そしてマウスEGF(R&D Systems、ミネアポリス)、ヒトbFGF(R&D)、ESGRO(ネズミ白血病阻害因子、Chemicon)および組換えGDNF(R&D)を含有するPM−1培地中、二次培養プレートに継代した(1.2cm2あたり1x105細胞)。培養2〜4週後、GFP陽性コロニーを、マイトマイシンCで処理したネズミ胚性線維芽細胞(MEF)フィーダーに機械的に移した。新たなMEFに機械的に移しつつ、3〜4回増殖させた後、コロニーが確立され、そして、さらなる拡大および保存のため、このコロニーは培養プレートから酵素的に除去可能であった。新生非トランスジェニックICRマウスからもまた、精巣細胞を単離し、そして新生OG2マウス精巣幹細胞におけるように培養した。さらに、4〜6週齢の成体OG2マウス(n=4)から精巣細胞を単離し、その精巣を外科的に手術して、そして精子形成30を抑止しつつ、2〜3ヶ月間、停留睾丸になるまで、腹壁に固定した。さらに、非停留睾丸成体OG2マウスを、細胞単離に用いた。また、成体マウスから単離した精巣細胞を、上述のように、PM−1培地中、MEFフィーダー上で培養する前に、GFPに関して選別した。
[0133]12.5dpc CD−1マウス胚を用いた標準法を用いて、マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダーを調製した。トリプシン処理する前に胚を取り出し、そしてプレートあたり〜1.5個の胚のプレーティング密度で、解離した細胞を150mmプレート上にプレーティングした。最初のプレーティング後、MEFを1:5にスプリットし、そして次いで凍結した(継代1)。マイトマイシンC処理前に、融解したMEF(P1)を、拡大目的のため、一度だけ継代した。cm2あたり50〜60x103の密度で、MEFフィーダーをプレーティングした。PGS細胞誘導のため、7〜10日ごとに、新鮮なMEFフィーダーを用いた。
実施例2
卵巣からの始原性細胞の単離
[0134]動物に麻酔し、そして卵巣を取り除く。あるいは、卵巣のパンチ生検から、始原性細胞(PSC)を単離してもよい。次いで、顕微鏡の補助で、PSCを単離する。始原性細胞は、幹細胞形態(すなわち大きく、丸く、そして平滑である)を有し、そして卵巣から機械的に回収される。
実施例3
生殖系列幹細胞の療法細胞への療法的再プログラミング
[0135]実施例1に記載するように、始原性細胞を単離した。次いで、PM−1培地中、200,000細胞/3.8cm2の密度で、細胞をプレーティングし、そして次いで、生殖系列幹細胞、精原幹細胞および/または始原性細胞(懸濁)から体細胞(付着)を分離する、示差接着のため、37℃で一晩インキュベーションした。この日を第0日と称した。
実施例2
卵巣からの始原性細胞の単離
[0134]動物に麻酔し、そして卵巣を取り除く。あるいは、卵巣のパンチ生検から、始原性細胞(PSC)を単離してもよい。次いで、顕微鏡の補助で、PSCを単離する。始原性細胞は、幹細胞形態(すなわち大きく、丸く、そして平滑である)を有し、そして卵巣から機械的に回収される。
実施例3
生殖系列幹細胞の療法細胞への療法的再プログラミング
[0135]実施例1に記載するように、始原性細胞を単離した。次いで、PM−1培地中、200,000細胞/3.8cm2の密度で、細胞をプレーティングし、そして次いで、生殖系列幹細胞、精原幹細胞および/または始原性細胞(懸濁)から体細胞(付着)を分離する、示差接着のため、37℃で一晩インキュベーションした。この日を第0日と称した。
[0136]StemPro(登録商標)−34完全培地(Invitrogen Corporation、カリフォルニア州カールスバッド)は、StemPro(登録商標)−34血清不含培地(SFM)およびStemPro(登録商標)−34栄養補助剤で構成され、そして米国特許第6,733,746 B2号に開示され、該特許の内容は、その全体、特に第17〜18欄の表1、2および3が本明細書に援用される。この開示の目的のため、StemPro(登録商標)−34完全培地は、幹細胞基礎培地と称される。本発明の細胞培地に用いるStemPro−34完全培地の構成要素を列挙する表2および3を、‘746特許に見られるとおりに、正確に以下に再現する。
表1
表1
表2
表3
[0137]PM−1培地は、始原性細胞(PSC)の培養および維持、ならびに多能性生殖系列幹(PGS)細胞へのPGS細胞の最初の再プログラミングのために特別に設計されている。上述のPM−1培地は、本発明の療法的再プログラミング法の例示的な態様である。当業者には、PM−1の構成要素の濃度が多様であることも可能であり、そしてなお意図する結果を達成しうることが理解されるであろう。本発明の態様において、rhEGFの濃度は、およそ10ng/ml〜およそ40ng/mlの範囲であることも可能であり、rhFGF2の濃度は、およそ10ng/ml〜およそ40ng/mlの範囲であることも可能であり、rhGDNFの濃度は、およそ2ng/ml〜およそ40ng/mlの範囲であることも可能であり、そしてESGRO(登録商標)マウスLIFの濃度は、およそ1,000単位/ml〜およそ10,000単位/mlの範囲であることも可能である。
[0138]翌日(第1日)、浮遊細胞を収集し、そして0.1%ゼラチン化プレート上にプレーティングして、そしてPM−1中で培養する。この段階で、細胞のサイズは8〜10ミクロンであり、丸く、仮足の外見を持ち、そして非接着性であった(図1A)。PM−1中で培養した細胞は、第3日〜第15日の間に形態学的変化を示した(第3日〜第7日の細胞を図1Bに示し、そして第7日〜第15日の細胞を図1Cに示す)。療法的再プログラミングのこの段階の間、細胞は分裂して目立つコロニーになり、そしてサイズはおよそ10〜15ミクロンであり、そして接着性である。コロニーのサイズは細胞総数50未満であった。
[0139]療法的再プログラミングの次の段階において、ほぼ第17日から始まって(図1D)、コロニーサイズは50〜200細胞に増加し、そして細胞は互いに緊密に接着して増殖する。療法的再プログラミングのこの段階中、細胞形態もまた異なる。細胞は丸みを失うようであり、そして10ミクロン以下の細胞しか生き残らない。
[0140]ほぼ第26日(図1E)、コロニーサイズは200細胞を超えて大きくなる。この時点の細胞のサイズはおよそ10ミクロンであり、そして多能性幹細胞マーカーOct−4を高レベルで発現した(図1F)。
[0141]次いで、療法的に再プログラミングされた細胞を摘み取り、そして不活化初代マウス胚性線維芽細胞を含有するプレート上にプレーティングした。この時点で、療法的再プログラミングは完了し、そして再プログラミングされた細胞を拡大培地(表4)中で拡大するか、またはPM−1(表1)、PM−10、PM20またはPM−101中で培養し続け、そして分化させることも可能である。
表4
表4
[0142]拡大培地は、多能性の療法的に再プログラミングされた細胞の培養および維持のために特別に設計されている。上述の拡大培地は、本発明の療法的再プログラミング法の例示的な態様である。当業者には、拡大培地の構成要素の濃度が多様であることも可能であり、そしてなお意図する結果を達成しうることが理解されるであろう。本発明の態様において、ESGRO(登録商標)マウスLIFの濃度は、およそ1,000単位/ml〜およそ10,000単位/mlの範囲であることも可能である。
実施例4
療法的再プログラミングによるネズミ多能性細胞株の評価
[0143]Oct−4ゲノム断片の遠位制御要素内に挿入されたレポーター遺伝子を用いて、マウスにおける多能性生殖系列細胞発生を視覚化した。緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するトランスジェニックOG2マウスを、生殖系列幹細胞の単離および再プログラミングに用いた。再プログラミングのため、FBS(Hyclone)、ならびにGDNF、bFGF、LIFおよびEGFを含む増殖因子を含有するPM−1培地(実施例3)中、ゼラチンでコーティングしたプレート上で、単離した精巣細胞を培養した。培養後、まもなく、GFP陽性シグナルは有意に減少し、そして数日後には消失した(図1A〜B)。その後、細胞は、鎖様構造およびコロニーを含む、目立つ形態学的変化を示した(図1C〜E)。
実施例4
療法的再プログラミングによるネズミ多能性細胞株の評価
[0143]Oct−4ゲノム断片の遠位制御要素内に挿入されたレポーター遺伝子を用いて、マウスにおける多能性生殖系列細胞発生を視覚化した。緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するトランスジェニックOG2マウスを、生殖系列幹細胞の単離および再プログラミングに用いた。再プログラミングのため、FBS(Hyclone)、ならびにGDNF、bFGF、LIFおよびEGFを含む増殖因子を含有するPM−1培地(実施例3)中、ゼラチンでコーティングしたプレート上で、単離した精巣細胞を培養した。培養後、まもなく、GFP陽性シグナルは有意に減少し、そして数日後には消失した(図1A〜B)。その後、細胞は、鎖様構造およびコロニーを含む、目立つ形態学的変化を示した(図1C〜E)。
[0144]培養3〜4週間後(図1F)、コロニー内のGFP陽性細胞の外見は、再プログラミング・プロセスが起きたことを示唆した。GFP陽性コロニーが形成されたら直ちに、これらをマウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダーに移し、そして拡大培地(実施例3)中で培養した。多能性生殖系列幹細胞(PGS)形成のためのこのプロトコルは、再現可能であり、誘導効率は〜30%であった(10回の試験から3つの細胞株が得られた;(図1G〜I))。単離および示差接着直後に、FACSによってGFP陽性単細胞を選別し、そしてMEFフィーダー細胞上で直接培養して、PGSコロニー形成をおよそ2週間前倒しすることも可能である。Oct−4−GFPシグナルは数日以内に消失するが、2週間で再出現した。
[0145]PGS細胞の性質決定には、以下の抗体および方法を用いた。以下の一次抗体をChemicon、カリフォルニア州テメキュラから得た:マウス抗SSEA−1、ヤギ抗マウス心筋トロポニン−1、マウス抗ミオシン重鎖、ウサギ抗グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、マウス抗神経フィラメント、およびマウス抗ネスチン。用いた他の抗体は:マウス抗nanog(bethyl、テキサス州モンゴメリー)、APCコンジュゲート化抗c−kit(BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ)、ヤギ抗マウスIgM−FITC(BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ)、Alexa Fluor 488コンジュゲート化ヤギ抗マウスIgG(Molecular Probes、カリフォルニア州カールスバッド)およびヤギ抗マウス・テキサスレッド(Abcam、マサチューセッツ州ケンブリッジ)。製造者のプロトコルにしたがって、StemTAGキット(Cell Biolabs、カリフォルニア州サンディエゴ)を用いて、アルカリホスファターゼ染色を行った。PBS中で緩衝された2%パラホルムアルデヒド中、培養細胞を室温で30分間固定し、そしてPBS中、4℃で保存した。免疫細胞化学のため、細胞を1xCytoperm(BD Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ)で15分間透過処理し、そして続いて、2%(w/v)ウシ血清アルブミン(Sigma、ミズーリ州セントルイス)、2%(v/v)正常ヤギ血清/1xCytoperm−PBS中で、どちらも室温で30分間、続けてインキュベーションした。一次抗体を2%BSA 2%GS/1xCytoperm−PBS中で希釈し、そして4℃で1〜3時間インキュベーションした。2回の洗浄後、蛍光二次抗体を2%BSA 2%GS/1xCytoperm−PBS中で希釈し、そして暗所中、4℃で1時間インキュベーションした。細胞を2回洗浄し、ホイルに巻いて、そして顕微鏡分析まで4℃で保存した。
[0146]Influx細胞選別装置(Cytopeia、ワシントン州シアトル)上で細胞を選別した。Oct−4−GFP構築物を含有する細胞をCD117 APC(BD Pharmingen、カリフォルニア州サンディエゴ)で染色した。488nm固相状態Coherentレーザー(Coherent、カリフォルニア州サンタクララ)でGFP励起を達成して、そして530−40二色ミラーを通じて発光を収集した。638nm固相状態CoherentレーザーでAPC励起を達成して、そして710−40二色ミラーを通じて発光を収集した。
[0147]生殖系列発生に関与する多くの因子の中で、幹細胞因子の受容体であるc−kitは、生殖細胞発生の運命において非常に重要な役割を果たす。マウス胚において、c−kitは始原生殖細胞(PGC)で高発現され、そしてPGCが原生殖細胞および精原幹細胞に分化すると、その発現が下方制御される。したがって、c−kit発現に基づいて、Oct−4−GFP陽性PGS細胞を選別し(図2A〜D)、そしてc−kit陽性およびc−kit陰性細胞の両方を、MEFフィーダー細胞上で直接培養した。
[0148]いくつかの実験のため、新鮮なPGSコロニーを解離させ、そして抗SSEA−1抗体で、その後、PE−Cy7とコンジュゲート化したヤギ抗マウスIgM(BD, Biosciences、カリフォルニア州サンノゼ)で、細胞を染色した。
[0149]PSCの異なる供給源から、3つのPGS細胞株:PG−mGSC−1(新生マウスPSCから)、PG−mGSC−2およびPG−mGSC−3(成体マウスPSCから)を生成した。成体OG2および野生型ICRマウスからもまた、PGS細胞株を生成して、成体および非トランスジェニック動物のどちらに関しても、療法的再プログラミング法の再現性を立証した。c−kit陽性細胞(4/4)からのみPGSコロニーが生成され、c−kit陰性細胞からは生成されなかった(0/4)。
[0150]Oct−4(GFP+)以外の多能性マーカーに関するPGS細胞株の性質決定によって、これらがSSEA−1およびNanog(ES細胞特異的)ならびにアルカリホスファターゼを同時発現していることが示された(図3)。さらに、RT−PCR分析によって、PGS細胞はまた、Oct−4およびNanogに加えて、2つのさらなる多能性マーカーであるRex−1およびDppa5も発現していることが確認された。すべてのPGS細胞は、生殖細胞特異的マーカーであるDAZLを発現した(図4)。フローサイトメトリーによる分析によって、PGS細胞の約20%が、低いSSEA−1発現を有することが示された(図5)。対照的に、調べたES細胞の約60%がSSEA−1を発現した(図5)。
[0151]さらに、テロメラーゼ活性および核型に関して、PGS細胞株を評価した。テロメラーゼ活性決定のため、150U/ml RNアーゼを含有するCHAPS溶解緩衝液を用いて、PGS細胞株(10回以上の継代)、新鮮に単離したOct−4+/ckit+選別細胞およびOct−4+/ckit−選別細胞から細胞抽出物を単離した。細胞溶解物を12,000xg、4℃で20分間遠心分離し、そして上清を−80℃で保存した。標準としてBSAを用い、Bradford試薬でタンパク質濃度をアッセイし、そして分光光度計で定量化した。PCRに基づくアッセイ、TRAPEZE検出キット(Chemicon)によって、テロメラーゼ活性を検出した。TRAP反応緩衝液、dNTP、基質オリゴヌクレオチド、テロメラーゼ・プライマー、内部標準プライマー、およびTaqポリメラーゼを含有する総体積50μlのPCR反応混合物に、750μg/μlの細胞抽出物2マイクロリットルを添加した。各実験試料に関して、陽性対照として、2μlのネズミ胚性幹細胞(mESC)抽出物を反応混合物に添加し、そしてCHAPS溶解緩衝液のみおよび熱不活化テロメラーゼを陰性対照として用いた。各試料を、テロメラーゼ伸長のため30℃で30分間インキュベーションし、その後、PCR増幅した。核型決定のため、増殖中の細胞を、0.1μg/ml KaryoMAX Colcemid(Invitrogen)を含む培養中で3〜4時間インキュベーションした後、低張溶液(0.075M KCl)中に再懸濁し、そして室温で10分間インキュベーションした。次いで、細胞を冷固定液(3:1メタノール:酢酸)中に再懸濁し、そして4℃で少なくとも30分間保存した。固定液で洗浄した後、細胞を清浄ガラススライドに適用し、そして風乾した。分裂中期染色体を調製し、そしてApplied Spectral Imaging Band Viewデジタル画像化系を用いて、核型を生じた。15回の継代後、細胞遺伝学的分析によって決定されるように、PGS細胞は、高いテロメラーゼ活性(図6)および正常の核型(40、XY)(図7)を示した。
[0152]多能性を定義するため、PGS細胞がin vivoでキメラを形成する能力を調べた。3つのPGS細胞株すべてから単離した未分化Oct−4−GFP陽性細胞を、アルビノCD−1マウスから生成した胚内にマイクロインジェクション(各15〜20細胞)した。PGS細胞を注入した胚盤胞の大部分の内部細胞塊で、GFP陽性細胞の取り込みが観察された(図9)。続いて、偽妊娠里親マウスの子宮内に胚を移植した(総数234の移植)。妊娠後12.5日(dpc)でレシピエント動物の何匹かを屠殺し、発生中の胚を回収し、そしてキメラ形成の指標として、GFP DNAの存在を決定するため、3つの胚葉に相当する脳、心臓および肝臓を含む胚性組織を単離した。大部分のレシピエント・マウスには、出産まで妊娠を続けさせ、そしてPCR増幅を用いて、異なる新生組織において、GFP DNAを測定した。GFP DNAは、キメラ仔の脳(22%)、心臓(36.4%)および肝臓(25%)で観察された(図8)。GFP DNAはまた、キメラ仔の47%の精巣でも見られ、PGS細胞が、生殖系列伝達可能であることが示唆された(表5)。
表5
表5
[0153]ヌードマウス(Harlan USA)における、皮下、筋内または輸精管注入によって、in vivoで奇形腫を形成する能力に関して、PGS細胞を調べた。奇形腫形成の陽性対照として、何匹かのマウスにES細胞を注入した。皮下または筋内注入では、およそ1x106細胞を注入した。輸精管マイクロインジェクションでは、輸出管を通じて、およそ2x105細胞を注入した。6週間後、マウスを屠殺し、そして形態学的および組織学的分析のため、組織を採取した。結果によって、PGS細胞が、移植後6週間、精巣において奇形腫を形成しないことが示された(0/20)。対照的に、未分化ES細胞移植を受けたレシピエント・マウスすべてで、奇形腫の形成が観察された(6/6)(図10E〜F)。
[0154]PGS細胞は、精巣から生じているため、生殖系列細胞に分化する能力を、精原細胞移植によって、さらに調べた。この方法によって、精原幹細胞が、不妊動物の空の精細管に再コロニー形成して、そして成熟精子に分化することが可能になる。新鮮に単離した細胞を、c−kitに関して選別し、そして樹立されたPGS株由来の細胞を、ブスルファン処理したヌードマウス精巣内に移植した。移植後6週間、新鮮に単離したc−kit陰性細胞のみがレシピエント・マウスにおいて精子形成を開始し(図10B、D);c−kit陽性細胞または未選別PGS細胞の移植後には精子形成はまったく観察されなかった(図10C、E)。
実施例5
PM−3培地を用いた、ネズミ生殖系列幹細胞の心臓細胞への療法的再プログラミング
[0155]実施例1および2に記載するように、ネズミ始原性細胞を単離した。次いで、細胞を、PM−3培地(表6)中、200,000細胞/3.8cm2の密度でプレーティングし、そして一晩インキュベーションした。この日を第0日と称する。
表6
実施例5
PM−3培地を用いた、ネズミ生殖系列幹細胞の心臓細胞への療法的再プログラミング
[0155]実施例1および2に記載するように、ネズミ始原性細胞を単離した。次いで、細胞を、PM−3培地(表6)中、200,000細胞/3.8cm2の密度でプレーティングし、そして一晩インキュベーションした。この日を第0日と称する。
表6
[0156]PM−3培地は、特定の系譜細胞へのPSCおよび療法的に再プログラミングされたPSCの分化および拡大のために特別に設計されている。上述のPM−3培地は、本発明の療法的再プログラミング法の例示的な態様である。当業者には、PM−3の構成要素の濃度が多様であることも可能であり、そしてなお意図する結果を達成しうることが理解されるであろう。本発明の態様において、rhEGFの濃度は、およそ10ng/ml〜およそ40ng/mlの範囲であることも可能であり、rhFGF2の濃度は、およそ10ng/ml〜およそ40ng/mlの範囲であることも可能であり、rhGDNFの濃度は、およそ2ng/ml〜およそ40ng/mlの範囲であることも可能であり、そしてESGRO(登録商標)マウスLIFの濃度は、およそ1,000単位/ml〜およそ10,000単位/mlの範囲であることも可能である。
[0157]翌日(第1日)、浮遊細胞を収集し、そして0.1%ゼラチン化プレート上にプレーティングして、そして適切な培地(PM−3)中で培養する。細胞のサイズは8〜10ミクロンであり、丸く、仮足の外見を持ち、そして非接着性である。
[0158]PM−3中で培養した細胞は、ほぼ第8日に、形態変化し始める。これは、療法的再プログラミングの第1段階であり、この間、細胞は分裂して目立つコロニーになり、そしてサイズはおよそ10〜15ミクロンであり、そして接着性である。さらに、細胞はより長くなり始め、そして先細になり、サイズは15〜20ミクロンであった。第8日までに、療法的再プログラミング段階1〜4がすでに起きており、培地PM−3中では、生殖系列幹細胞の分化可能な療法細胞への療法的再プログラミングが、PM−1中よりはるかに迅速に起こる。
実施例6
療法的に再プログラミングされた多能性生殖幹細胞の分化
[0159]PGS細胞が他の表現型に分化可能であるかどうかを決定するため、in vitroでES細胞の分化を誘導する方法を用いた。胚様体(EB)を生成するため、PGSコロニーをコラゲナーゼで解離させ、そして15%FBS(Hyclone)を含有するPM−1培地中、非接着性培養プレートに4日間プレーティングした。いくつかの実験において、EBは懸滴中で形成された。次いで、これらを神経選択のため、血清不含N1培地:ITS(インスリン、10mg/l;トランスフェリン、6.7ng/l;セレン、5.5mg/l)およびフィブロネクチン(50μg/ml)を補充したDMEM/F12(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)中で培養した。5〜7日後、神経前駆細胞の拡大のため、N2培地(ITSを含み、そして10ng/mlのbFGFを補充したDMEM/F12)中、ゼラチンでコーティングした培養プレートにEBを移した。心筋細胞に分化させるには、EBを形成し、そしてDMSO(0.06M)、5’−アザ−2’−デオキシ−シチジン(AZA、5mM)およびカルジオジェノール−C(25〜50μM)(Calbiochem、カリフォルニア州サンディエゴ)を含む異なる心臓形成化合物の存在下で、2週間培養した。分化プロセス中、細胞形態を分析し、そしてRT−PCRによる遺伝子発現分析および免疫組織化学染色の両方のため、試料を採取した。
実施例6
療法的に再プログラミングされた多能性生殖幹細胞の分化
[0159]PGS細胞が他の表現型に分化可能であるかどうかを決定するため、in vitroでES細胞の分化を誘導する方法を用いた。胚様体(EB)を生成するため、PGSコロニーをコラゲナーゼで解離させ、そして15%FBS(Hyclone)を含有するPM−1培地中、非接着性培養プレートに4日間プレーティングした。いくつかの実験において、EBは懸滴中で形成された。次いで、これらを神経選択のため、血清不含N1培地:ITS(インスリン、10mg/l;トランスフェリン、6.7ng/l;セレン、5.5mg/l)およびフィブロネクチン(50μg/ml)を補充したDMEM/F12(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)中で培養した。5〜7日後、神経前駆細胞の拡大のため、N2培地(ITSを含み、そして10ng/mlのbFGFを補充したDMEM/F12)中、ゼラチンでコーティングした培養プレートにEBを移した。心筋細胞に分化させるには、EBを形成し、そしてDMSO(0.06M)、5’−アザ−2’−デオキシ−シチジン(AZA、5mM)およびカルジオジェノール−C(25〜50μM)(Calbiochem、カリフォルニア州サンディエゴ)を含む異なる心臓形成化合物の存在下で、2週間培養した。分化プロセス中、細胞形態を分析し、そしてRT−PCRによる遺伝子発現分析および免疫組織化学染色の両方のため、試料を採取した。
[0160]未分化PGS細胞を維持し、そして20回を超える継代のため、培養中で維持し、そして増殖させる間、自発的な分化が起こる。図11は、初期心臓形成中に発現される心臓系譜マーカーである、トロポニン−1の発現によって決定されるような、心筋細胞に分化したPGS細胞培養における2つの集団を示す(図11A〜BおよびD〜E)。同じ培養中、いくつかの集団が、最長数日間続く、律動収縮を示した(図11C)。心臓特異的遺伝子Nkx2.5およびGATA−4の発現もまた提示する(図11G)。さらに、数は少ないが、多くの培養で、脂肪細胞へのPGS細胞の自発的分化が観察された(図11F)。
[0161]まず、細胞凝集後の胚様体(EB)形成によって、PGS細胞がin vitroで多数の系譜に分化する能力を評価した。PGS細胞は凝集して、そして懸濁中および懸滴中の両方でEBを形成することが可能であった。凝集後数日だけ、GFPシグナルが観察され、EBにおけるOct−4および細胞分化の下方制御が示された(図12A、C)。EBを、N1神経培地による神経選択に供し、その後、bFGFを含有するN2培地中で神経前駆細胞を拡大すると、EBから解離した細胞は、神経前駆細胞マーカー、ネスチンを発現した(図12C)。いくつかの細胞はまた、アストロサイト・マーカー、GFAP(図12D)、ならびに神経マーカー、神経フィラメント(図12E)に関しても陽性に染色された。図13Aに示すように、これらの神経遺伝子マーカーの発現をRT−PCRによって確認した。5−アザ−2−デオキシ−シチジン(AZA)またはカルジオジェノール−Cで処理した後、PGS細胞由来EBを誘導して、心筋細胞に分化させることもまた、可能である。これらの表現型は、トロポニン−1(図12C)および心臓ミオシン重鎖(図12G)、ならびに図13Bに示すように、心臓特異的遺伝子マーカー、Nkx2.5を示した。
実施例7
ヒト精巣からの始原性細胞の単離
[0162]長期ホルモン(エストロゲン)治療下にあった男性被験体から、標準的な去勢外科手術法のもとで、精巣を得た。切除し、そして被膜を取り除く(decapsulated)前に、3%過酸化水素で5分間、精巣を消毒した。細いはさみを用いて、精巣組織を細かく刻み、そして「1酵素1工程」解離法に供した。この方法は、実施例1に詳述するようなマウス・プロトコルから変更したものであった。1mg/mlの1型コラゲナーゼ(Sigma)および0.5mg/ml DNアーゼ(Sigma)を含有する培地(DMEM/F12)に、細かく刻んだ精巣組織を移した。150サイクル/分で作動する振盪水槽中、組織サイズに応じて、37℃で30〜60分間、消化を行った。FBS(最終濃度10%)で酵素活性を中和した後、調製物を100ミクロン細胞ろ過器(B−D BioScience)に通過させることによって、解離した細胞を未消化組織から単離した。細胞懸濁物を400xg、室温で10分間遠心分離し、そして24〜72時間、好ましくは48時間の示差接着のため、1%FBSを含有するPM−10培地中で、ペレットを再構成した(図15A)。
実施例7
ヒト精巣からの始原性細胞の単離
[0162]長期ホルモン(エストロゲン)治療下にあった男性被験体から、標準的な去勢外科手術法のもとで、精巣を得た。切除し、そして被膜を取り除く(decapsulated)前に、3%過酸化水素で5分間、精巣を消毒した。細いはさみを用いて、精巣組織を細かく刻み、そして「1酵素1工程」解離法に供した。この方法は、実施例1に詳述するようなマウス・プロトコルから変更したものであった。1mg/mlの1型コラゲナーゼ(Sigma)および0.5mg/ml DNアーゼ(Sigma)を含有する培地(DMEM/F12)に、細かく刻んだ精巣組織を移した。150サイクル/分で作動する振盪水槽中、組織サイズに応じて、37℃で30〜60分間、消化を行った。FBS(最終濃度10%)で酵素活性を中和した後、調製物を100ミクロン細胞ろ過器(B−D BioScience)に通過させることによって、解離した細胞を未消化組織から単離した。細胞懸濁物を400xg、室温で10分間遠心分離し、そして24〜72時間、好ましくは48時間の示差接着のため、1%FBSを含有するPM−10培地中で、ペレットを再構成した(図15A)。
[0163]さらに、精巣組織を「2酵素2工程」解離法に供してもよい。1mg/mlのI型コラゲナーゼおよび0.5mg/ml DNアーゼを含有する培地(DMEM/F12)中に精巣組織を移した。110サイクル/分で作動する振盪水槽中、37℃で10分間、消化を行った。単位重力で10分間沈降させることによって、間質細胞を分離し、そしてDMEM/F12中で洗浄した。最初の消化工程に関するものと同じ条件下で、I型コラゲナーゼ(1mg/ml)、DNアーゼ(0.5mg/ml)、およびヒアルロニダーゼ(Sigma;0.5mg/ml)の混合物中、精巣組織の基底膜構成要素の最終消化を行った。得た単細胞懸濁物を、培地、ならびに1mM EDTA(Sigma)および0.5%ウシ胎児血清を含有するPBSで、連続して洗浄した。50μmナイロンメッシュを通じて細胞懸濁物をろ過することによって、白膜の未消化の残りを取り除いた。方法全体で、すべての細胞を5℃に維持した。
[0164]さらに、精巣組織を「3酵素2工程」解離法に供してもよい。1.5mg/mlの1型コラゲナーゼおよび0.5mg/ml DNアーゼを含有する培地(DMEM/F12)に、細かく刻んだ精巣組織を移した。150サイクル/分で作動する振盪水槽中、37℃で15分間、消化を行った。FBS(最終濃度10%)で酵素活性を中和した後、調製物を100ミクロン細胞ろ過器に通過させることによって、解離した細胞を未消化組織から単離した。細胞懸濁物を400xg、室温で10分間遠心分離し、そして24〜72時間、好ましくは48時間の示差接着のため、1%FBSを含有するPM−10培地中で、ペレットを再構成した(図15B)。主に、精原幹細胞を含む精細管である、未消化組織を、3つの酵素:1.5mg/ml 1型コラゲナーゼ、1.5mg/mlヒアルロニダーゼおよび0.5mg/mlトリプシン(Sigma)の組み合わせによって、再び解離させた。150サイクル/分で作動する振盪水槽中、37℃で30〜45分間、消化を行った。FBS(最終濃度10%)で酵素活性を中和した後、調製物をまず100ミクロン細胞ろ過器に、そして次いで40ミクロン細胞ろ過器に通過させることによって、解離した細胞を未消化組織から単離した。細胞懸濁物を400xg、室温で10分間遠心分離し、そして500〜5000万細胞/ml、好ましくは1000万細胞/mlの濃度で、1〜10mlのPM−100培地中で、ペレットを再構成した。漏斗上部を用いて、クロマトグラフィー・ガラスカラム(45x450mm、ChemGlass、ニュージャージー州バインランド)上に細胞懸濁物を装填する。2〜4%のウシ血清アルブミン(BSA)−PBS溶液上、4℃で2.5時間の重力沈降によって細胞分画を達成した。流速およそ1〜3ml/分で、分画した細胞を溶出させ、そしてカラムが空になるまで、14ml分画を収集した。まず位相差で、そして次いでホフマン対物下で、各分画の細胞形態を顕微鏡的に調べて、培養のため、濃縮された精原幹細胞を含有する分画を同定した。
[0165]あるいは、性腺から精細管を切断し、10mlの1mM EDTA/DPBS(−)を含有するプレートにこれらをプレーティングし、そして室温で15分間インキュベーションすることによって、精巣から始原性細胞を単離してもよい。白膜を精細管から注意深く切断する。次いで、精細管を、DPBS(−)/コラゲナーゼ(1mg/ml)/100単位のDNアーゼIに入れ、そして穏やかに振盪しながら37℃の水槽中で20〜30分間インキュベーションする。次いで、等体積の20%FBS/DPBS(−)で消化反応を停止する。次いで、20%FBS/DPBS(−)で細胞を2回洗浄した。
[0166]上述の方法のいずれかによって単離した精巣細胞を、蛍光活性化細胞選別(FACS)によってさらに分画してもよい。0.5%FBSを含有するPBS(PBS/FBS)中に、解離した精巣細胞を再懸濁した(5x106細胞/ml)。次いで、細胞を一次抗体と氷上で20分間インキュベーションし、過剰なPBS/FBSで2回洗浄し、そしてFACS分析に用いた。一次抗体には、R−フィコエリトリン(PE)コンジュゲート化抗α6−インテグリン、アロフィコシアニン(APC)コンジュゲート化抗c−kit、およびビオチン化抗αv−インテグリンおよびヤギIgG抗GDNF受容体が含まれる。二次試薬を用いた実験のため、細胞をAPCコンジュゲート化ストレプトアビジンとさらに20分間インキュベーションして、ビオチン化抗体を検出した。すべての抗体または二次試薬を、5μg/mlで用いた。対照細胞は、抗体で処理されない。最終洗浄後、1μg/mlヨウ化プロピジウム(Sigma)を含有する2ml PBS/FBS中に細胞を再懸濁し(107細胞/ml)、35μm孔サイズのナイロンスクリーンを通じてろ過して、試験管に入れ、そして分析まで、暗所で氷上に維持した。抗体染色、およびその相対的粒度、または内部の複雑さ(側方散乱、SSC)に基づいて、細胞を選別した。488nmアルゴン(200mW)および633nmヘリウムネオン(35mW)レーザーを備えた、二重レーザーFACStar Plus(Becton Dickinson)によって、細胞選別を行った。アルゴンレーザーを用いて、PEおよびヨウ化プロピジウムを励起し、そしてPEには575 DF 26フィルター、そしてヨウ化プロピジウムには610 DF 20フィルターを用いて、発光を収集した。ネオンレーザーを用いてAPCを励起し、そして675 DF 20フィルターで発光を検出した。データ収集時、ヨウ化プロピジウム陽性事象を排除することによって、死んだ細胞を排除した。10%FBSを補充した氷冷DMEM(DMEM/FBS)2mlを含有する5mlポリスチレン試験管中に、細胞を選別して入れた。α6−インテグリン高/SSC低/c−kit(−)集団を療法的再プログラミングにさらに用いる。
実施例8
ヒト生殖系列幹細胞の療法細胞への療法的再プログラミング
[0167]始原性細胞を実施例7に記載するように単離した。次いで、単離したヒト生殖系列幹細胞を、組織培養プレートにプレーティングし、そして必要であれば、表7または8に開示するような培地中で、37℃で一晩インキュベーションして、接着細胞をさらに取り除いた。
表7
実施例8
ヒト生殖系列幹細胞の療法細胞への療法的再プログラミング
[0167]始原性細胞を実施例7に記載するように単離した。次いで、単離したヒト生殖系列幹細胞を、組織培養プレートにプレーティングし、そして必要であれば、表7または8に開示するような培地中で、37℃で一晩インキュベーションして、接着細胞をさらに取り除いた。
表7
表8
[0168]StemPro(登録商標)−34完全培地(Invitrogren Corporation、カリフォルニア州カールスバッド)は、StemPro(登録商標)−34血清不含培地(SFM)およびStemPro(登録商標)−34栄養補助剤で構成され、そして米国特許第6,733,746 B2号に開示され、該特許の内容は、その全体、特に第17〜18欄の表1、2および3が本明細書に援用される。この開示の目的のため、StemPro(登録商標)−34完全培地は、幹細胞基礎培地と称される。本発明の細胞培地に用いるStemPro−34完全培地の構成要素を列挙する表2および3を、‘746特許に見られるとおりに、正確に以下に再現する。
[0169]PM−10、PM−20およびPM−100培地は、血清不含環境における、ヒト始原性細胞(hPSC)の培養および維持、ならびに多能性胚性幹細胞様細胞への最初の再プログラミングのために特別に設計された。上述のPM−10、PM−20およびPM−100培地は、本発明の療法的再プログラミング法の例示的な態様である。当業者には、PM−10、PM−20およびPM−100培地の構成要素の濃度が多様であることも可能であり、そしてなお意図する結果を達成しうることが理解されるであろう。本発明の態様において、rhEGFの濃度は、およそ10ng/ml〜およそ40ng/mlの範囲であることも可能であり、rhFGF2の濃度は、およそ1ng/ml〜およそ120ng/mlの範囲であることも可能であり、rhGDNFの濃度は、およそ2ng/ml〜およそ40ng/mlの範囲であることも可能であり、そしてヒトLIFの濃度は、およそ1,000単位/ml〜およそ10,000単位/mlの範囲であることも可能である。
[0170]24〜72時間、示差接着させるか、幹細胞特異的抗体によって細胞選別するか、または沈降分画した後、単離精巣細胞を、0.1%〜0.2%ゼラチンおよび/またはフィーダー細胞(マウスまたはヒト線維芽細胞)でコーティングした新鮮な組織培養プレート上に再プレーティングし、そしてPM−10、PM−20またはPM−100培地中で培養した。この段階で、細胞サイズはおよそ8〜10ミクロンであり、そして非接着性であった(図15AおよびB)。続ける前に、全部で3〜17日間、細胞を培養した。
[0171]非接着性生殖系列幹細胞は、次に、接着し(図16)そして「卵様」構造に変形する(図17)。ヒト生殖系列幹細胞をさらに3〜17日間培養し、この時点で、細胞の「グレープ様」クラスターが培地中に現れる(図18)。これらのグレープ様クラスターの外見はまた、細胞をヒト胚培地(SSSを含む完全胚盤胞培地、Irvine Scientificカタログ番号9930)中で培養することによっても誘導されうる。細胞が、緊密に詰まったコロニーを形成し始めるまで、PM−10、PM−20またはヒト胚培地中で、細胞を培養し続ける(図19)。
[0172]次いで、細胞に基づく再生療法で使用するのに適した多能性生殖系列幹(PGS)細胞へのヒト生殖系列幹細胞の変換経路の最終段階において、コロニーを収集し、そしてマイトマイシンCで不活化した初代胚性線維芽細胞(ヒトまたはマウス)を場合によって含有する6cm組織培養プレート内で解離させた。胚性幹細胞によって形成されるコロニーに似た、非常に目立つ詰まったコロニー(図20)を形成することによって、生じたPGS細胞が特徴付けられた。これらの細胞は、ヒト特異的マーカー(抗ヒト・ミトコンドリア抗体[Chemicon MAB 1273]、図21)、Oct−4(Chemicon MAB 4305、図22A)およびNanog(Bethyl A300−398A、図22B)の発現によってもまた特徴付けられた。再プログラミングは、多能性幹細胞で発現されるサイン遺伝子であるOct−4の発現を伴う、制御されたプロセスである。Oct−4は、多能性細胞が分化するにつれて下方制御され、そして分化した細胞が多能性潜在能力を回復するにつれて上方制御される。マウス精巣幹細胞を多能性PGSコロニーになるように再プログラミングすると、Oct−4の発現が再出現した(実施例4)。したがって、Oct−4発現の動態の追跡をヒト精巣幹細胞培養における再プログラミングの指標として用いる。成体ヒト精巣がOct−4を発現しないことがよく立証されてきている(図23、レーン3)。精巣組織から単離し、そして酵素解離、示差接着または分画を通じてプロセシングした細胞もまた、Oct−4を発現しない(図23、レーン4)。対照的に、Oct−4発現は、培養第9〜35日の間に上方制御された(図23、レーン5〜8)。この証拠によって、成体ヒト精巣幹細胞が療法的に再プログラミングされており、血清不含培地(PM−10、PM−20またはPM−100培地)中での培養中に、Oct−4の発現によって証拠付けられるように、多能性を回復したことが立証される。Nanog(図23)、Dppa5、Sox2、アルカリホスファターゼ、SSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60およびTRA−1−81を含む、いくつかの多能性マーカーもまた、再プログラミング後に発現されていることが見出された。生殖系列特異的マーカーDAZLに対する抗体で細胞を染色することによって、ヒト生殖系列細胞の同一性を確認した(図23)。
[0173]3つのプロトコル:二次元血清不含プロトコル、二次元血清含有プロトコルおよび三次元血清不含プロトコルによって、再プログラミングされた多能性ヒト幹細胞を拡大した。二次元血清不含プロトコルにおいて、単離し、そして再プログラミングした精巣幹細胞を、1型コラゲナーゼ(1mg/ml)またはトリプシン(1mg/ml)によって解離させ、そしてゼラチン(0.1〜0.2%)でコーティングした表面またはフィーダー細胞(不活化マウスまたはヒト胚性線維芽細胞)上に再プレーティングした。PM−10、PM−20またはPM−100培地中で細胞を培養し、そして拡大した(図20)。拡大した細胞コロニーを増殖させるか、凍結するか、または特定の表現型に分化させた。
[0174]二次元血清含有プロトコルにおいて、15〜20%FBSを含有しているPM−10において、あるいはPM−5またはPM−101培地において、細胞を培養し、そして拡大した。拡大した細胞コロニーを手で摘み取るか、あるいは1型コラゲナーゼ(1mg/ml)またはトリプシン(1mg/ml)によって解離させ、ゼラチンでコーティングしたプレート(0.1〜0.2%)上、プラスチック培養フラスコ、MEFフィーダー、Matrigel(登録商標)マトリックス、またはフィブロネクチンでコーティングしたプレートまたはカバースリップにプレーティングした。拡大した細胞コロニーを増殖させるか、凍結するか、または特定の表現型に分化させた。
[0175]三次元血清不含プロトコルにおいて、単離、示差接着、および/またはBSA分画後の細胞を、回転培養しながら、バイオリアクター中、懸濁中でPM−100培地において培養した。細胞を500mlまたは250ml CytoSpinフラスコ(VWR)中に入れ、そしてそれぞれ、400mlまたは200mlのPM−100培地中で培養した。フラスコを、インキュベーター中、34〜37℃で、50〜70cpmに設定した回転速度のスターラー上に置くことによって、回転を達成した。頻繁な間隔で試料を収集して、細胞生存度、細胞数、Oct−4およびNanog発現などの多能性マーカー、ならびに細胞拡大を評価した。遠心分離および新鮮な培地中での再構成によって、バイオリアクター中の培地を5〜7日ごとに交換した。拡大した細胞コロニーを増殖させるか、凍結するか、または特定の表現型に分化させた。
実施例9
療法的に再プログラミングされたヒト多能性生殖系列幹細胞の心臓細胞への分化
[0176]実施例8由来の療法的に再プログラミングされたヒト出生後幹細胞をいくつかの異なる細胞種に分化させてもよい。実施例7に記載するように、始原性細胞を単離した。次いで、あらかじめ0.1%ゼラチンで処理した6cm組織培養プレート上に細胞をプレーティングし、そしてアザ−2’−デオキシシジチンを含有する培地中、34℃〜42℃の温度範囲で、標準的CO2細胞培養インキュベーター中、30日間培養し、培地を30日間、1日おきに交換した。
実施例9
療法的に再プログラミングされたヒト多能性生殖系列幹細胞の心臓細胞への分化
[0176]実施例8由来の療法的に再プログラミングされたヒト出生後幹細胞をいくつかの異なる細胞種に分化させてもよい。実施例7に記載するように、始原性細胞を単離した。次いで、あらかじめ0.1%ゼラチンで処理した6cm組織培養プレート上に細胞をプレーティングし、そしてアザ−2’−デオキシシジチンを含有する培地中、34℃〜42℃の温度範囲で、標準的CO2細胞培養インキュベーター中、30日間培養し、培地を30日間、1日おきに交換した。
[0177]およそ0.1μM〜9.0μMの濃度で、アザ−2’−デオキシシチジンをPM−1、PM−3、PM−10またはPM−20培地に添加した。PM−1培地は実施例3に記載され、PM−3培地は実施例6に記載され、そしてPM−10およびPM−20培地は実施例8に記載される。本明細書に記載するアザ−2’−デオキシシチジン含有培地は、本発明の療法的再プログラミング法の例示的な態様である。アザ−2’−デオキシシチジン含有培地の構成要素の濃度が多様であることも可能であり、そしてなお意図する結果を達成しうることが、当業者には理解されるであろう。本実施例の目的のため、アザ−2’−デオキシシチジン含有培地はPM−1−AZAである。
[0178]PM−1−AZA培地中でほぼ11日後、懸濁生殖系列幹細胞は、療法的再プログラミングを経て、そしてプレートに付着し、そしてコロニーを形成する(図24A)。PM−1−AZA培地中でほぼ22日後、細胞は目立つコロニーを形成した(図24B)。
[0179]PM−1−AZA培地を用いた培養中でほぼ35日後、懸濁生殖系列幹細胞は、分化し、そして心臓マーカー心筋トロポニン1(図25A〜C)、心臓アルファ・アクチン(図25D)、デスミン(図25E)および心臓ミオシン(図25F)に関して陽性に染色され、そしてNkx2.5およびGATA−4を含む心筋細胞特異的遺伝子を発現した(図25G)。
実施例10
療法的に再プログラミングされたヒト多能性生殖系列幹細胞の組織特異的細胞への分化
[0180]実施例8由来の、療法的に再プログラミングされた単離ヒト生殖系列幹細胞を、モノクローナル抗GFAP抗体(B−D BioScienceカタログ番号556329)を用いた蛍光免疫細胞化学によって、グリア細胞マーカー、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の発現に関して同定する前に、PM−SHH培地(表9)中、34℃で24日間培養した。全培養期間中に、異質な細胞は導入されなかった。培地を1日おきに新しくした。
表9
実施例10
療法的に再プログラミングされたヒト多能性生殖系列幹細胞の組織特異的細胞への分化
[0180]実施例8由来の、療法的に再プログラミングされた単離ヒト生殖系列幹細胞を、モノクローナル抗GFAP抗体(B−D BioScienceカタログ番号556329)を用いた蛍光免疫細胞化学によって、グリア細胞マーカー、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の発現に関して同定する前に、PM−SHH培地(表9)中、34℃で24日間培養した。全培養期間中に、異質な細胞は導入されなかった。培地を1日おきに新しくした。
表9
[0181]染色された細胞集団において、GFAP+細胞は、PM−SHH培地中で培養した集団においてのみ観察され(図26A)、PM−1培地中では観察されなかった(図26B)。これらの結果は、in vitroで、単離したヒト性腺幹細胞がGFAP+グリア細胞を含む神経細胞に分化するよう、指示可能であるという証拠を提供する。成体精巣において、グリア細胞が存在するという既知の証拠はないため、上に示すGFAPグリア細胞は、療法的再プログラミングを介して、性腺幹細胞(多能性細胞)から分化した。
[0182]アストログリア分化に加えて、再プログラミングされた多能性精巣幹細胞はまた、MAP−2、NF−68、およびGAD−67を含むニューロン特異的マーカーの発現によって立証されるように、PM−SHH培地中で、神経細胞にも分化可能である(図26C)。再プログラミングおよび拡大中、精巣幹細胞と胚性マウス・プレ脂肪細胞(頭蓋骨骨髄から単離された、マウスPA 6細胞;PA6細胞は、理研(Rikins)、日本から購入される)との共培養は、精巣幹細胞のニューロンならびにアストログリア細胞への分化を生じる。特定の神経細胞種が、分化後に同定され、これらには、GABA作動性ニューロン(GAD−67発現)およびドーパミン作動性ニューロン(チロシン・ヒドロキシラーゼに対する抗体によって、陽性に染色される)が含まれた。
[0183]オリゴデンドログリア細胞は、以下のように、再プログラミングされた多能性精巣幹細胞から分化した。ミエリン塩基性タンパク質(MBP)発現(図26D)に関しては、二次元血清含有法によって単離し、そして増殖させた精巣幹細胞を、10ng/ml bFGF、10ng/ml EGFおよび1ng/ml PDGFを含むN2培地中、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ上にプレーティングした。2%FBSを含み、増殖因子を含まないPM−10培地中、0.2%ゼラチンでコーティングしたカバースリップ上で、対照細胞を培養した。ガラクトセレブロシド−C(Gal−C)およびプロテオリピドタンパク質(PLP)発現を決定するため(図26E)、二次元血清含有法によって単離し、そして増殖させた精巣幹細胞を、GlutaMaxを含み、40% MCDB−201培地(Sigma)を含み、そしてITS+LA−BSA(ウシ膵臓由来の10μg/mlインスリン、5.5μg/mlヒト・トランスフェリン(実質的に鉄不含)、5ng/ml亜セレン酸ナトリウム、0.5mg/mlウシ血清アルブミンおよび4.7μg/mlリノレン酸)、1nMデキサメタゾン、100μMアスコルビン酸を補充したDMEM低グルコース中、フィブロネクチンでコーティングしたカバースリップ上にプレーティングし、そして200ng/ml SHHおよび100ng/ml FGF−8で3日間処理し、そして次いで、20ng/ml BDNFを含むN2補助剤に交換した。GlutaMaxを含み、2%FBS、MCDB−201 40%を含み、そしてITS+LA−BSA、1nMデキサメタゾンおよび100μMアスコルビン酸を補充したDMEM低グルコース中、0.2%ゼラチンでコーティングしたカバースリップ上、SHHおよびFGF−8を添加せずに、対照細胞を培養した。
[0184]心臓および神経分化に加えて、再プログラミングされた多能性精巣幹細胞はまた、軟骨細胞(図27A〜B)、骨細胞(図27C〜D)および肝細胞(図27E〜F)にも分化可能である。
[0185]軟骨細胞分化のため、二次元血清含有法によって単離し、そして増殖させた精巣幹細胞を、20%FBS、および培地交換直前に培地に添加する10ng/ml TGF−3βを含む、SingleQuots(登録商標)培地(Cambrex PT4124)中、0.2%ゼラチンでコーティングしたプレート上にプレーティングした。L−グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含み、20%FBSを補充したDMEM低グルコース中で、対照細胞を培養した。
[0186]骨細胞分化のため、二次元血清含有法によって単離し、そして増殖させた精巣幹細胞を、L−グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含み、20%FBSを補充し、そして100nMデキサメタゾン、0.25mMアスコルビン酸および10mM B−グリセロホスフェートを添加したDMEM低グルコース中、0.2%ゼラチンでコーティングしたプレート上にプレーティングした。培地交換は2〜3日ごとであった。L−グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含み、20%FBSを補充したDMEM低グルコース中、0.2%ゼラチンでコーティングしたプレート上で、対照細胞を培養した。
[0187]肝細胞分化のため、二次元血清含有法によって単離し、そして増殖させた精巣幹細胞を、GlutaMaxを含み、5%FBS、40% MCDB−201を含み、そしてITS+LA−BSA、1nMデキサメタゾン、100μMアスコルビン酸、10ng/ml FGF−4および20vng/ml HGF(肝細胞増殖因子)を補充したDMEM低グルコース中、Matrigel(登録商標)でコーティングしたプレート上にプレーティングした。2%FBSを含むDMEM中、0.2%ゼラチンでコーティングしたプレート上で、対照細胞を維持した。
[0188]別に示さない限り、明細書および請求項で用いる、分子量、反応条件等の特性である、成分の量を表すすべての数字は、すべての場合で、用語「約」によって修飾されると理解されるものとする。したがって、逆に示されない限り、明細書および付随する請求項に示す数字のパラメータは、本発明によって得ようとする所望の特性に応じて、多様であってもよい近似値である。最低限でも、そして請求項の範囲に同等である原理の適用を制限する試みとしてではなく、数字のパラメータ各々は、少なくとも、報告される有効数字の数の観点で、そして通常の丸め技術を適用することによって、解釈されなければならない。本発明の広い範囲を示す数値域およびパラメータが、近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示す数値は、可能な限り正確であるように報告される。しかし、いかなる数値も、生得的に、それぞれの試験測定値で見られる標準偏差から必然的に生じる、ある程度の誤差を含有する。
[0189]本発明を記載する文脈で(特に請求項の文脈で)用いる用語「a」、「an」および「the」、ならびに類似の指示語は、本明細書に別に示されるかまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を含むと見なされるものとする。本明細書における値の範囲の列挙は、範囲内に属する別個の値各々に個々に言及する簡単な方法として働くよう意図される。本明細書に別に示さない限り、各個々の値は、本明細書に個々に列挙されたかのように、本明細書に援用される。本明細書記載の方法はすべて、本明細書に別に示されるかまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、いかなる適切な順序で行ってもよい。本明細書で提供する、あらゆる例、または例示的な言葉遣い(例えば「など」)の使用は、本発明をよりよく解明することを単に意図し、そして別に請求する本発明の範囲に限定を課さない。明細書中の言葉遣いは、本発明の実施に本質的ないかなる非請求要素も示すと見なされるべきである。
[0190]本明細書に開示する、本発明の代替要素または態様のグループ分けは、限定として見なされないものとする。各グループメンバーを、個々に、またはグループの他のメンバーもしくは本明細書に見られる他の要素と任意に組み合わせて、称し、そして請求してもよい。便宜上および/または特許性の理由のため、グループの1以上のメンバーをグループに含めても、またはグループから除去してもよいと予期される。こうした包含または除去のいずれが起こる場合も、本明細書は、修飾されるような、したがって付随する請求項に用いられる、マーカシュ・グループの書面による記載を満たすグループを含有すると見なされる。
[0191]本発明を実行するため、本発明者に知られる最適の様式を含めて、本発明の好ましい態様を本明細書に記載する。もちろん、前述の説明を読むと、一般の当業者には、これらの好ましい態様に関する変形が明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がこうした変形を適切に使用することを期待し、そして本発明者らは、本明細書に具体的に記載するのと別の方式で本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明には、適用可能な法律によって許されるような、本明細書に付随する請求項に列挙する主題のすべての修飾および同等物が含まれる。さらに、すべてのありうる変形での上述の要素のいかなる組み合わせも、本明細書に別に示さない限り、または文脈によって明らかに否定されない限り、本発明に含まれる。
[0192]さらに、本明細書全体で、特許および印刷された刊行物に多くの言及がなされている。上に引用する参考文献および印刷された刊行物の各々は、その全体が個々に、本明細書に援用される。
[0193]締めくくりに、本明細書に開示する本発明の態様は、本発明の原理の例示であると理解されるものとする。使用可能な他の修飾が、本発明の範囲内である。したがって、例であるが、限定ではなく、本明細書の解説にしたがって、本発明の代替形態を利用してもよい。したがって、本発明は、まさに示され、そして記載されるとおりのものに限定されない。
Claims (34)
- ヒト出生後幹細胞を単離し;
療法的に再プログラミングされた細胞への前記ヒト出生後幹細胞の発生を誘導する刺激因子を含む培地と、前記ヒト出生後幹細胞を接触させる、ここで前記ヒト出生後幹細胞は、多能性ヒト幹細胞に療法的に再プログラミングされる
工程を含む、療法的再プログラミング方法。 - 前記多能性ヒト幹細胞を分化させて、組織特異的細胞を生じる工程をさらに含む、請求項1の療法的再プログラミング方法。
- 前記ヒト出生後幹細胞が始原性細胞である、請求項1の療法的再プログラミング方法。
- 前記始原性細胞が、男性または女性出生後供給源から単離された二倍体生殖細胞である、請求項3の療法的再プログラミング方法。
- 前記始原性細胞が精原幹細胞である、請求項3の療法的再プログラミング方法。
- 前記培地がPM−10培地を含む、請求項1の療法的再プログラミング方法。
- 前記組織特異的細胞が、心筋細胞、グリア、ニューロン、肝細胞、骨細胞および軟骨細胞からなる群より選択される、請求項1の療法的再プログラミング方法。
- 細胞培養増殖培地基剤;
複数のビタミン類およびミネラル類;ならびに
複数の細胞増殖および成熟因子
を含む、出生後幹細胞を療法的に再プログラミングするための細胞培地。 - 前記出生後幹細胞がヒト幹細胞である、請求項8の細胞培地。
- 前記培地が血清を含有しない、請求項8の細胞培地。
- 前記複数の細胞増殖および成熟因子が、組換えヒト上皮増殖因子(rhEGF)、組換えヒト線維芽細胞増殖因子2(rhFGF−2)、組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子(rhGDNF)およびヒト白血病阻害因子(LIF)、血小板由来増殖因子BB(PDGF−BB)、トランスフォーミング増殖因子−β3(TGF−β3)、線維芽細胞増殖因子8(FGF−8)ならびにソニック・ヘッジホッグ(SHH)からなる群より選択される因子を含む、請求項8の細胞培地。
- 前記組換えヒト上皮増殖因子が、10ng/ml〜40ng/mlの間の濃度で存在する、請求項11の細胞培地。
- 前記組換えヒト上皮増殖因子が、20ng/mlの濃度で存在する、請求項12の細胞培地。
- 前記組換えヒト線維芽細胞増殖因子2が、1ng/ml〜120ng/mlの間の濃度で存在する、請求項11の細胞培地。
- 前記組換えヒト線維芽細胞増殖因子2が、1ng/ml〜2ng/mlの間の濃度で存在する、請求項14の細胞培地。
- 前記組換えヒト線維芽細胞増殖因子2が、10ng/ml〜20ng/mlの間の濃度で存在する、請求項14の細胞培地。
- 前記組換えヒト線維芽細胞増殖因子2が、110ng/mlの濃度で存在する、請求項14の細胞培地。
- 前記組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子が、2ng/ml〜40ng/mlの間の濃度で存在する、請求項11の細胞培地。
- 前記組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子が、2ng/mlの濃度で存在する、請求項18の細胞培地。
- 前記組換えヒト・グリア細胞由来神経栄養因子が、10ng/ml〜20ng/mlの間の濃度で存在する、請求項18の細胞培地。
- 前記ヒト白血病阻害因子が、1,000単位/ml〜10,000単位/mlの間の濃度で存在する、請求項11の細胞培地。
- 前記ヒト白血病阻害因子が、1,000単位/mlの濃度で存在する、請求項21の細胞培地。
- 幹細胞基礎培地、2mM L−グルタミン、MEMビタミン溶液、0.1mM MEM非必須アミノ酸、10−4Mアスコルビン酸、10μg/ml d−ビオチン、80ng/ml β−エストラジオール、60ng/mlプロゲステロン、5mg/mlウシ・アルブミン、1μl/ml DL−乳酸、30μg/mlピルビン酸、6mg/ml D−(+)−グルコース、30nM亜セレン酸ナトリウム、60μMプトレシン、100μg/mlトランスフェリン(transferring)、25μg/mlインスリン、1xペニシリン/ストレプトマイシン、10x10−5M β−メルカプトエタノール、1%ウシ胎児血清、20ng/ml rhEGF、1ng/ml rhFGF−2、10ng/ml rhGDNFおよび1,000単位のヒトLIFを含む改善剤(improvement)から本質的になる、PM−10と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地。
- 幹細胞基礎培地、2mM L−グルタミン、MEMビタミン溶液、0.1mM MEM非必須アミノ酸、10−4Mアスコルビン酸、10μg/ml d−ビオチン、80ng/ml β−エストラジオール、60ng/mlプロゲステロン、5mg/mlウシ・アルブミン、1μl/ml DL−乳酸、30μg/mlピルビン酸、6mg/ml D−(+)−グルコース、30nM亜セレン酸ナトリウム、60μMプトレシン、100μg/mlトランスフェリン、25μg/mlインスリン、1xペニシリン/ストレプトマイシン、10x10−5M β−メルカプトエタノール、1%ウシ胎児血清、20ng/ml rhEGF、1ng/ml rhFGF−2、20ng/ml rhGDNFおよび1,000単位のヒトLIFを含む改善剤から本質的になる、PM−20と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地。
- 幹細胞基礎培地、2mM L−グルタミン、MEMビタミン溶液、0.1mM MEM非必須アミノ酸、10−4Mアスコルビン酸、10μg/ml d−ビオチン、80ng/ml β−エストラジオール、60ng/mlプロゲステロン、5mg/mlウシ・アルブミン、1μl/ml DL−乳酸、30μg/mlピルビン酸、6mg/ml D−(+)−グルコース、30nM亜セレン酸ナトリウム、60μMプトレシン、100μg/mlトランスフェリン、25μg/mlインスリン、1xペニシリン/ストレプトマイシン、10x10−5M β−メルカプトエタノール、1%ウシ胎児血清、20ng/ml rhEGF、110ng/ml rhFGF−2、10ng/ml rhGDNFおよび1,000単位のヒトLIFを含む改善剤から本質的になる、PM−100と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地。
- 幹細胞基礎培地、2mM L−グルタミン、MEMビタミン溶液、0.1mM MEM非必須アミノ酸、10−4Mアスコルビン酸、10μg/ml d−ビオチン、80ng/ml β−エストラジオール、60ng/mlプロゲステロン、5mg/mlウシ・アルブミン、1μl/ml DL−乳酸、30μg/mlピルビン酸、6mg/ml D−(+)−グルコース、30nM亜セレン酸ナトリウム、60μMプトレシン、100μg/mlトランスフェリン、25μg/mlインスリン、1xペニシリン/ストレプトマイシン、10x10−5M β−メルカプトエタノール、1%ウシ胎児血清、20ng/ml rhEGF、10ng/ml rhFGF−2、2ng/ml rhGDNFおよび1,000単位のヒトLIFを含む改善剤から本質的になる、PM−1と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地。
- 幹細胞基礎培地、2mM L−グルタミン、MEMビタミン溶液、0.1mM MEM非必須アミノ酸、10−4Mアスコルビン酸、10μg/ml d−ビオチン、80ng/ml β−エストラジオール、60ng/mlプロゲステロン、5mg/mlウシ・アルブミン、1μl/ml DL−乳酸、30μg/mlピルビン酸、6mg/ml D−(+)−グルコース、30nM亜セレン酸ナトリウム、60μMプトレシン、100μg/mlトランスフェリン、25μg/mlインスリン、1xペニシリン/ストレプトマイシン、10x10−5M β−メルカプトエタノール、12%ウシ胎児血清、20ng/ml rhEGF、10ng/ml rhFGF−2、2ng/ml rhGDNFおよび1,000単位のヒトLIFを含む改善剤から本質的になる、PM−3と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地。
- 幹細胞基礎培地、2mM L−グルタミン、MEMビタミン溶液、0.1mM MEM非必須アミノ酸、10−4Mアスコルビン酸、10μg/ml d−ビオチン、80ng/ml β−エストラジオール、60ng/mlプロゲステロン、5mg/mlウシ・アルブミン、1μl/ml DL−乳酸、30μg/mlピルビン酸、6mg/ml D−(+)−グルコース、30nM亜セレン酸ナトリウム、60μMプトレシン、100μg/mlトランスフェリン、25μg/mlインスリン、1xペニシリン/ストレプトマイシン、10x10−5M β−メルカプトエタノール、1%ウシ胎児血清、20ng/ml rhEGF、2ng/ml rhFGF−2、20ng/ml rhGDNFおよび1,000単位のヒトLIFを含む改善剤から本質的になる、PM−5と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地。
- 幹細胞基礎培地、2mM L−グルタミン、MEMビタミン溶液、0.1mM MEM非必須アミノ酸、10−4Mアスコルビン酸、10μg/ml d−ビオチン、80ng/ml β−エストラジオール、60ng/mlプロゲステロン、5mg/mlウシ・アルブミン、1μl/ml DL−乳酸、30μg/mlピルビン酸、6mg/ml D−(+)−グルコース、30nM亜セレン酸ナトリウム、60μMプトレシン、100μg/mlトランスフェリン、25μg/mlインスリン、1xペニシリン/ストレプトマイシン、10x10−5M β−メルカプトエタノール、1%ウシ胎児血清、20ng/ml rhEGF、10ng/ml rhFGF−2、10ng/ml rhGDNFおよび1,000単位のヒトLIFを含む改善剤から本質的になる、PM−101と称される、ヒト出生後幹細胞の療法的再プログラミング用の細胞培地。
- 療法的に再プログラミングされたヒト出生後幹細胞を含む、多能性療法組成物。
- 前記ヒト出生後幹細胞が始原性細胞である、請求項30の多能性療法組成物。
- 前記始原性細胞が、男性または女性出生後供給源から単離された二倍体生殖細胞である、請求項31の療法的再プログラミング法。
- 前記始原性細胞が精原幹細胞である、請求項31の多能性療法組成物。
- 前記の療法的に再プログラミングされたヒト出生後幹細胞が、請求項1の療法的再プログラミング法にしたがって産生される、請求項30の多能性療法組成物。
Applications Claiming Priority (3)
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---|---|---|---|
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