TWI392736B - 由單一分裂球取得多能幹細胞之方法 - Google Patents

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由單一分裂球取得多能幹細胞之方法
本發明係關於取得多能(pluripotent)哺乳動物幹細胞之方法。
胚胎幹細胞(ESC)可自我更新、多能且能夠產生身體所有組織種類。因此，瞭解控制ESC之多能性及自我更新之細胞及分子機制，可使對肇因於特定細胞類型喪失或失能之廣泛人類疾病之治療有所提升。此外，該等知識亦可對瞭解細胞分化、細胞自我更新之根本機制，以及與早期發育有關之機制有所幫助。因此，研究人員曾試圖由發育中之哺乳動物胚胎單離並增殖ESC。為此，已由多種物種之胚胎成功取得在貯存及活體外及活體內培養期間均維持多能性之ESC(Evans MJ,et al.(1981)Nature 292：154－156)，該等物種包括非人靈長類(Suemori H,et al.(2001)Dev Dyn 222：273－279；Thomson JA,et al.(1995)Proc Natl Acad Sci 92：7844－7848)及人類(Reubinoff BE,et al.(2000)Nat Biotechnol 18：399－404；Thomson JA,et al.(1998)Science 282：1145－1147)。已建立之取得哺乳動物多能ESC之方法包括使用整個胚泡或其所連結之內細胞團(ICM)作為起始材料。然而，該等方法對發育中之胚胎造成破壞，此手段引起關於人類胚胎之道德考量。
作為由ICM單離多能幹細胞之可能替代選擇，有些研究人員試圖由著床前之胚胎取得多能幹細胞。此方法被視為十分有利，部分係由於著床前之胚胎在移除一個分裂球後仍能正常發育(Hardy K,et al.(1996)Mol Hum Reprod 2：621－32；Handyside AH,et al.(1990)Nature 344：768－70；Hardy K,et al.(1990)Hum Reprod 5：708－14；Sermon KD,et al.(2006)Verh K Acad Geneeskd Belg 68：5－32；Matsumoto K,et al.(1989)Gamete Res 22：257－63；Papaioannou VE,et al.(1989)Development 106：817－27；Saito S,et al.(1991)Bio Reprod 44：927－36；Allen WR,et al.(1984)J Reprod Fertil 71：607－13；Chan AW,et al.(2000)Science 287：317－19；Mitalipov SM,et al.(2002)Bio Reprod 66：1449－55)。確實，研究報導指出由著床前之胚胎所單離之分裂球可取得類似ESC之細胞(Strelchenko N,et al.(2004)Reprod Biomed Online 9：623－629；Tesar PJ,et al.(2005)Proc Natl Acad Sci 102：8239－8244；Delhaise F,et al.(1996)Eur J Morphol 34：237－243)。然而，該等特定方法亦需摧毀供者胚胎。
大部分嘗試由著床前胚胎產生類似ESC之多能幹細胞涉及胚胎發育之2－細胞、4－細胞及8－細胞期。單離自該等時期胚胎之單一分裂球傳統上分別稱為1/2、1/4及1/8分裂球。尤其，當非人靈長類、人類及其他哺乳動物物種之1/8分裂球以2或4個為組培養時，該等分裂球可產生相當於ESC之多能幹細胞(美國專利公開案號2003/0106082 A1)。將分裂球與依傳統方式生產之ESC細胞株共同培養，亦可由分裂球產生ESC細胞株(Chung Y,et al.(2006)Nature 439：216－219)。單離自著床前胚胎之單一分裂球亦可用於生產具有可見ICM結構之胚泡樣結構，雖然ICM細胞之數量顯著少於在相當發育期之對照組胚胎所觀察到者。然而，於培養基中補充血清可由單一兔子分裂球取得較高數量之ICM細胞(Tao T and Niemann H(2000)Human Reproduction 15：881－89)。著床前之小鼠分裂球亦可發育為正常鼠仔。例如，使單離自16細胞胚胎之1/8分裂球或成對之分裂球與含四套染色體之4細胞胚胎聚集，並將之植入代理孕母，可生下源自供者分裂球之正常鼠仔(Tarkowski AK,et al.(2005)Int J Dev Biol 49：825－32)。類似地，可由一對分裂球取得非人靈長類之後代，該等分裂球係單離自一8細胞胚胎，置回空的透明區(zona pellucida)中，然後植入代理孕母中(Chan AWS,et al.(2000)Science 287：317－319)。該結果指出一對分裂球可產生胚胎及胚胎外組織，意味著分裂球可能實質上可歸類為全能(totipotent)幹細胞。然而，至今尚未出現無需與其他幹細胞或分裂球共同培養，即可由單一之單離分裂球產生多能幹細胞之報導。
能夠由單一之單離分裂球取得多能幹細胞將可避免許多與破壞胚胎有關之道德考量。然而，如以上所討論者，已知切割及培養分裂球之分法均無法產生具有如ESC般多能性之幹細胞(Eckert J,et al.(1997)Biol Reprod 57：552－60；Rossant J.(1976)J Embryol Exp Morphol 36：283－90；Tarkowski AK.(1959)Nature 184：1286－87)。
希望能有避免ESC相關道德考量而取得多能幹細胞之方法，其當可促進幹細胞療法之施行。
本發明係關於由著床前之哺乳動物胚胎之單一單離分裂球取得多能幹細胞之方法。在一具體實例中，本發明之多能幹細胞表現出業界已知可用於辨識ESC之細胞標記物。
用於取得多能幹細胞之分裂球係單離自胚胎發育之2－細胞、4－細胞或8－細胞期之胚胎。考慮發育之不同著床前時期之已知分化生長需求，以決定分裂球之培養條件(Gardner DK.(1998)Theriogenology 49：83－102；Gardner DK,et al.(1988)Development 104：423－29；Hardy K,et al.(1989)Hum Reprod 4：188－91)。在本發明一具體實例中，單一之單離分裂球係培養於KSOM EmbryoMax培養基(Specialty Media,Phillipsburg,NJ)中。各分裂球係培養於至少5 μl及至多500 μl之培養基中，但較佳於10 μl至50 μl之培養基中。在某些物種中，醣蛋白白血病抑制因子(LIF)可有效維持ESC之多能性(Nichols J,et al.(1990)Development 110：1341－48)，且在胚泡發育方面亦有功能(Cheng TC,et al.(2004)Biol Reprod 70：1270－76；Dunglison GF,et al.(1996)Hum Reprod 11：191－96；Lavranos TC,et al.(1995)J Reprod Fertil 105：331－38；Stewart CL,et al.(1992)Nature 359：76－9)。在一具體實例中，培養基額外包含介於每ml 10與104 I.U.間之LIF，較佳介於每ml 500與1500 I.U.間。
在上述條件下培養一至二天即形成類似桑椹胚之細胞團，通常在小鼠而言係性交後(p.c.)2.5至3天。將在上述培養條件下所形成之似桑椹胚細胞團轉移至一共同培養系統，其中該似桑椹胚細胞團係於單層之絲裂黴素C－去活化小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)上共同培養，而該等纖維母細胞係培養於以明膠被覆之組織培養盤上。在一具體實例中，本發明之共同培養系統包含ESC培養基(80% Dulbecco’s修飾Eagle培養基，補充有20%胎牛血清、0.1 mM β－巰基乙醇、1%非必要性胺基酸及2 mM麩胺酸醯胺)。在另一具體實例中，本發明之共同培養系統包含補充有介於每ml 10與104 I.U.間(較佳介於每ml 500與1500 I.U.間)之LIF之ESC培養基。
將得自分裂球之細胞培養於本發明之共同培養系統中，直到具有類似ESC外型特徵(例如高細胞核對細胞質比例，及顯著之核仁)之細胞團形成圓頂形之細胞聚落。一般而言，該等聚落在培養兩至三天時即十分明顯。在一具體實例中，得自分裂球之細胞之繼代係由本發明之共同培養系統機械性地選擇具類似ESC外型之細胞聚落，將該等聚落分離為單一細胞懸浮液，並將該等細胞如上述般導入新鮮的MEF共同培養系統中。在另一具體實例中，藉由螢光活化細胞分類(FACS)選擇供繼代之似ESC細胞，其係使用對多能幹細胞標記物具專一性之螢光標定抗體，例如對特定時期小鼠胚胎抗原(SSEA－1)具專一性之抗體。得自分裂球之似ESC細胞可經由共同培養系統繼代0至100次，但較佳為1至20次。經由共同培養系統繼代得自分裂球之多能幹細胞，直到細胞足夠用於定性、分析及冷凍保存。較佳為至少有1000個細胞可供定性及保存。然而，更佳為具有至少2×103 個細胞可供定性及冷凍保存。
本發明得自分裂球之多能幹細胞表現出一般用於辨識自我更新多能ESC之標記物。欲偵測ESC標記物之聚核苷酸，可使用任何本技藝一般技術者已知的聚核苷酸偵測方法，包括但不限於反轉錄聚合酶鏈反應(RT－PCR)、即時PCR、及北方墨點分析。類似地，欲偵測ESC標記物之多肽，可使用任何本技藝一般技術者已知的多肽偵測方法，包括但不限於免疫組織化學法、FACS分析、及西方墨點分析。在一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞表現出一POU家族轉錄因子，八聚體－4(Oct－4)。在另一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞表現出SSEA－1。在另一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞表現出Nanog。在另一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞表現出Rex－1，其亦稱為鋅手指蛋白－42(Zfp42)。在另一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞表現出鹼性磷酸酶。在另一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞表現出FOXD3。在另一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞表現出未分化胚胎細胞轉錄因子－1(UTF－1)。在另一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞可表現多於一種之任何上述ESC標記物。本發明得自分裂球之多能幹細胞亦具有正常之整倍體核型，其在持續活體外培養超過六個月後仍能維持。
本發明得自分裂球之多能幹細胞能夠產生代表內胚層、外胚層及中胚層之體細胞種類。在一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞可產生包含內胚層、外胚層及中胚層細胞種類之畸胎瘤。在另一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞可在活體外產生類胚體，其包含可加以誘發分化為各種細胞種類之細胞，該等細胞種類反映出選自內胚層、外胚層及中胚層之世系。
本發明得自分裂球之多能幹細胞亦可加以誘發分化為特定細胞種類。在一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞可加以誘發分化為神經幹細胞。作為一非限制性之實例，神經幹細胞可為表現出Sox－1、Pax－6及巢蛋白(nestin)之細胞。在另一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞可加以誘發分化為自發性跳動之心肌細胞，其特徵為收縮位點。在另一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞可加以誘發分化為肝細胞。作為一非限制性之實例，肝細胞可為表現出α－胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、轉鐵蛋白(TFN)、肝細胞核因子4α(HNF4α)及C/EBPβ之細胞。肝細胞亦可為表現出凝集素(lectin)、雙花扁豆凝集素(Dolichos biflorus agglutinin，DBA)之細胞。
本發明得自分裂球之多能幹細胞可用於在活體外培養中產生細胞結構，其重現出正常胚胎發育期間所形成之細胞結構。在一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞可產生桑椹胚，以及胚胎發育之桑椹胚期前所有的胚胎結構。在另一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞可在活體外及活體內產生胚泡，以及胚胎發育之胚泡期前所有的胚胎結構。在又一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞可與ESC聚集形成一嵌合胚胎，且可使用代理孕母令其足月。在又另一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞可在不導入額外ESC的情況下，用於產生可使用代理孕母令其足月之胚胎。在一具體實例中，用於產生嵌合或非嵌合胚胎之本發明得自分裂球之多能幹細胞為轉基因細胞，其中該轉殖基因可為導致某基因過度表現之轉殖基因，或降低某基因表現之轉殖基因。
本發明得自分裂球之多能幹細胞可用於醫療。在一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞可加以貯存，直到需要用於修復受損、生病或缺失的組織。例如，可以本發明得自分裂球之多能幹細胞治療之組織及器官包括骨、肌肉、牙齒、膀胱、乳房、腦、眼、腎上腺、心血管系統、小腸、大腸、腎、肝、肺、脾臟、皮膚、胃及甲狀腺。在另一具體實例中，本發明得自分裂球之多能幹細胞可加以貯存，直到需要作為自體組織來源用於修復已發育器官之受損、生病或缺失組織，該已發育器官係衍生自取得本發明得自分裂球之多能幹細胞之相同著床前胚胎。
本發明並不限於下述特定方法、程序、細胞株、動物種或屬、以及試劑。用於描述特定具體實例之術語並非意欲限制本發明範疇，其僅受限於後附申請專利範圍。本文中所用之單數形如「一」及「該」包括複數指稱，除非文中另有明確指示。因此，例如指稱「一細胞」係指一或多個細胞，且包括熟習本技藝者所知之同義詞。
除非另行界定，本文中所用之全部技術及科學術語具有本發明所屬技藝中一般技術者普遍理解之意義。雖然可使用任何相似或等同於本文所述之方法、裝置及材料來實施或測試本發明，此處所述者為較佳之方法、裝置及材料。本文中提及之所有出版品及專利，茲以參考方式併入本文，俾供描述及揭示例如該等出版品中所述之架構及方法，其可能用於本發明相關之用途。以上及全文中所論及之出版品完全係因其揭示早於本發明之有效日期。本文中任何內容均不應解釋為發明人承認其無權有早於該等揭示之先前發明。
定義
細胞或胚胎幹細胞之「衍生物」係指世系可追查之細胞。
「已分化細胞」係指已歩上發育之路的細胞，包括已固定世系之前驅細胞及分化末期之細胞。
本文中所用之「胚胎」(名詞或形容詞)乙詞包括尚未著床於母體子宮內膜之發育中細胞團。因此，本文中所用之「胚胎」乙詞可指已受精之卵母細胞、胞質雜交細胞(cybrid)、胚泡期前發育中細胞團、及/或處於著床於母體子宮內膜前之發育期的任何其他發育中之細胞團。本發明之胚胎可能未顯示出生殖脊。因此，「生殖細胞」係單離自及/或形成自胚胎。胚胎可代表細胞發育之多重時期。例如，一單細胞胚胎可稱為合子，源自胚胎切割之一團實心球狀細胞可稱為桑椹胚，而一具有囊胚腔之胚胎可稱為胚泡。
「胚胎幹細胞」乙詞係指得自胚泡期胚胎之多能幹細胞，或具有等同特徵，以人工手段製造之多能細胞。
「胚胎樣體」乙詞係指多能幹細胞在單層培養物中過度生長或維持於懸浮培養物中時，所出現之已分化及未分化細胞之聚集體。胚胎樣體為各種類型細胞之混合體，通常來自各個胚層，可由外型條件及可由免疫細胞化學偵測之細胞標記物分辨。
「餵養細胞」或「餵養者」乙詞係用於描述與第二種細胞共同培養之某種細胞，其可提供第二種細胞維持或增生所需之環境。餵養細胞可來自與其所支持之細胞不同的物種。例如，特定幹細胞可由小鼠胚胎纖維母細胞(來自初代培養物或端粒化(telomerized)品系)或人類似纖維母細胞或間質細胞所支持。典型上(但並非必需)，餵養細胞係經放射線照射或抗有絲分裂劑(如絲裂黴素C)處理加以去活化，以防止其長得比其所支持的細胞還好。
「多能」或「多能性」乙詞係指可產生在適當條件下可分化為不同種類細胞之後代的細胞，且其後代分化所得之細胞種類顯示出來自全部三個胚層(內胚層、中胚層及外胚層)之細胞世系之整體特徵。多能幹細胞可提供出生前、出生後或成年動物之許多或全部組織。可使用業界接受之標準試驗，例如在8－12週齡之SCID小鼠中形成畸胎瘤之能力，建立一細胞族群之多能性。該詞包括已建立之幹細胞株及得自具有如上述之多能性之初代組織的細胞。本文所揭示之多能細胞並非胚胎癌細胞，且並非得自惡性來源。
細胞「標記物」為任何可用於定性細胞或將之與其他細胞種類分別之細胞表型特徵。本發明之標記物可為蛋白質(包括分泌性、細胞表面或內部蛋白質；為細胞合成或吸收者)、核酸(例如mRNA或具有酵素活性之核酸分子)、或聚醣。包括任何細胞組分中可由對標的細胞種類具專一性之抗體、凝集素、探針或核酸擴增反應偵測之決定物。標記物亦可由取決於基因產物功能之生化或酵素分析辨識。與各標記物有關者為編碼轉譯物之基因，以及導致標記物表現之事件。
「幹細胞」乙詞係指具有自我更新、維持不分化及分化為其他細胞種類等能力之多能(pluripotent或multipotent)細胞。
「轉殖基因」乙詞泛指任何被導入動物基因組中之核酸，包括但不限於具有正常情況下不存在於基因組中之序列的基因或DNA、存在於某基因組中但正常情況下不轉錄及轉譯(「表現」)之基因、或任何其他欲導入基因組之基因或DNA。這可包括正常情況下存在於非轉基因之基因組中，但欲改變其表現之基因，或欲以改變或不同形式導入之基因。可令轉殖基因特定地瞄準一界定之基因位點、隨機地併入染色體中、或者該轉殖基因可為在染色體外複製之DNA。轉殖基因可包含一或多個轉錄調節序列，及任何其他可使所選核酸達到最佳表現之核酸(例如內子)。轉殖基因可為編碼或不編碼序列，或其組合。轉殖基因可包含能夠在適當條件下驅動一或多個轉殖基因表現之調節元素。
「轉基因細胞」乙詞係指包含轉殖基因之細胞。
實施例
本發明以下列實施例作進一步的闡明，該等實施例在任何方面均不應解讀為限制。
實施例1：胚胎的收取
對雌性C57BL/6小鼠注射5單位之懷孕牝馬血清促性腺激素(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)，48小時後再注射5單位之人類絨毛膜促性腺激素(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)，使該等小鼠進入超級排卵狀態。然後將超級排卵之雌鼠與C57BL/6公鼠配對過夜使其交配。次晨，選出具有陰道栓之雌鼠收集胚胎。典型上，在性交後(p.c.)的此時，多數胚胎應處於2－細胞或4－細胞之發育期。預期在2.5天p.c.時會形成8－細胞發育期之胚胎。以M2培養基(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)沖洗輸卵管以收集胚胎。於M2培養基中短暫清洗胚胎後，將之移至含有KSOM培養基(Specialty Media,Phillipsburg,NJ)之35 mM非附著性組織培養盤中。然後將該等組織培養盤置於一組織培養器中至少2至3分鐘，並將該培養器設定於37℃及5% CO2 。對照組係將8－細胞期之胚胎培養於KSOM培養基中，直到其達到胚泡期。然後收集該等胚胎進行ICM單離及ESC誘導。
實施例2：著床前胚胎之單一分裂球的單離及培養
將2－細胞、4－細胞或8－細胞之胚胎置於37℃下之酸化(pH 2.5)Tyrode’s培養基(MediCult，丹麥)中2至3分鐘以去除胚胎之透明區，隨後以M2培養基(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)短暫清洗二次。然後將無透明區之胚胎浸泡於37℃下之不含Ca2＋ 及Mg2＋ 之活體檢驗培養基(MediCult，丹麥)中10分鐘。以過火之玻璃顯微移液管反覆吸放無透明區之胚胎，以單離個別之分裂球。隨後，在KSOM培養基中短暫復甦後，將單離之分裂球個別轉移至20 μl小滴之KSOM培養基中，置於37℃及5% CO2 下。一般而言，在約2.5天內，該等分裂球會變成似桑椹胚之細胞團，然後便將其培養於圖1所示A、B及C三種培養條件之一。培養條件A係將分裂球持續培養於KSOM培養基中。培養條件B及C包含以移液管反覆吸放而將似桑椹胚細胞團分解為單一細胞懸浮液。然後將該等細胞共同培養於以明膠被覆之組織培養盤上之單層經絲裂黴素C去活化之小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)上。MEF之去活化係添加5 μg/ml絲裂黴素C(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)，並將細胞置於37℃下30分鐘。用於條件B之培養基為ESC培養基(80% Dulbecco’s修飾Eagle培養基，補充有20%胎牛血清、0.1 mM β－巰基乙醇、1%非必要性胺基酸及2 mM麩胺酸醯胺)。條件C與條件B相同，但是在剩餘培養期間將ESC培養基額外補充1000 I.U./ml之白血病抑制因子(LIF)(ESGRO,Chemicon,Billerica,MA)。
測定條件A、B及C下1/2、1/4及1/8分裂球衍生物之多能性潛力。使用未經處理之胚胎作為對照組。在分派至條件A、B或C前，以單一細胞狀態培養於KSOM培養基中之分裂球正常分裂之百分比類似於對照組之胚胎。就1/2、1/4及1/8分裂球而言，正常分裂之分裂球百分比分別為93%、89%及75%。
然而，當培養於條件A下時，只有極少數1/4及1/8分裂球持續增生。因此，並未對條件A下產生之分裂球衍生物加以定性。另一方面，在兩天(2.5至3天p.c.)內大多數轉移至條件B及C之分裂球衍生物形成了漂浮之似桑椹胚細胞團。形成5至10小時內，大約半數之似桑椹胚細胞團附著至MEF餵養者，隨後變平並發育為具有群落外型之結構，但未展現出形成胚泡之特徵。其餘似桑椹胚細胞團則持續發育為漂浮之胚泡樣結構。
將培養於條件B及C下之個別群落機械性地由MEF層分離，於0.1%胰蛋白酶－EDTA溶液(Invitrogen,Carlsbad,CA)中以移液管反覆吸放為單一細胞，並重新培養於含ESC培養基並以明膠被覆之組織培養盤上之經絲裂黴素C(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)處理之新鮮MEF餵養者上。該ESC培養基包含80% Dulbecco’s修飾Eagle培養基(DMEM；Invitrogen,Carlsbad,CA)，補充有20%胎牛血清(FBS；Hyclone,Logan,UT)、0.1 mM β－巰基乙醇(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)、1%非必要性胺基酸(Invitrogen,Carlsbad,CA)及2 mM麩胺酸醯胺(Invitrogen,Carlsbad,CA)。在最初的生長後，以0.1%胰蛋白酶－EDTA溶液(Invitrogen,Carlsbad,CA)分解所得群落，以移液管反覆吸放之，並培養於新的餵食者培養盤上令其進一步擴增。在第一次繼代後，只挑選具有似ESC外型之群落令其進一步繁殖。每二至三天，將似ESC之群落短暫浸泡於0.1%胰蛋白酶－EDTA溶液(Invitrogen,Carlsbad,CA)中以破壞細胞－細胞間之接觸，隨後加以離心以去除胰蛋白酶溶液，俾分散似ESC之群落。然後將細胞重新培養於具新鮮MEF餵養細胞之培養盤上，每日供以新的ESC培養基。將細胞繼代培養，直到大多數衍生自分裂球之細胞展現出似ESC之外型。典型上，各繼代相隔四至五天，且通常將細胞繼代五至十次。在最後一次繼代終結時，準備細胞俾供冷凍保存，將之保存於液態氮之貯存條件下，直到需要進一步定性或實驗時。
實施例3：分裂球衍生物的Oct－4表現
使用免疫螢光分析評估分裂球衍生物之Oct－4表現。細胞之Oct－4表現被認為與多能性有關。免疫螢光染色之程序係依下述(Kuo HC et al.(2003)Biol Reprod 68：1727－35)般進行。
將分裂球或其衍生物置於以Matrigel(Invitrogen,Carlsbad,CA)被覆之蓋玻片上，並以4%多聚甲醛於室溫下固定化20分鐘。然後添加包含PBS(Invitrogen,Carlsbad,CA)、0.1% BSA(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)、10%正常山羊血清(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)、及0.2% X－100(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)之封阻溶液至固定化之細胞。令固定化之細胞與初級抗體(表2)在含0.1% BSA(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)及10%正常山羊血清(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)之PBS中於4℃下反應過夜。於PBS/0.1% BSA中短暫清洗三次後，選擇適當之FITC－共軛二級抗體(Molecular Probes及Jackson ImmunoResearch)，然後以1：200稀釋與細胞製備物於室溫下反應30分鐘。於PBS/0.1% BSA中清洗三次後，使用300 nM之4’,6－二脒基－2－苯基吲哚二氫氯酸鹽(Molecular Probes,Eugene,OR)溶液對細胞作雙重染色。然後以含2.5%聚乙烯醇及1,4－二氮雜二環[2,2,2]辛烷(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)之甘油封片膠將蓋玻片封於載玻片上。以共軛焦顯微鏡捕捉影像。
對衍生自分裂球之細胞結構所進行之分裂球衍生物Oct－4表現免疫螢光分析顯示，分裂球衍生物之Oct－4表現類似於對照組胚胎之正常Oct－4表現。如同在正常胚胎發育所觀察到的，在由4－細胞轉變為8－細胞期時可偵測到Oct－4(圖3)。亦發現Oct－4侷限於8－細胞期、桑椹胚期、及早期胚泡期之滋養外胚層(TE)及ICM中，1/2、1/4及1/8衍生物之細胞核內。在相當於晚期胚泡之衍生自分裂球之結構中，強烈的Oct－4訊號主要與ICM之細胞核有關，且在TE細胞中即降低或消失(圖3)。
計數Oct－4＋ 細胞數以及各合格胚泡樣結構之細胞總數以測定在培養條件A、B及C下Oct－4表現為正(Oct－4＋ )之細胞數。當培養於條件A下時，衍生自1/2、1/4及1/8分裂球之胚泡樣結構之細胞總數及Oct－4＋ 細胞數均顯著降低(P<0.05)。條件C之細胞總數及Oct－4＋ 細胞數最高。然而，在ESC培養基中添加LIF(條件C)對細胞總數及Oct－4＋ 細胞數並無統計上顯著之影響。此外，Oct－4＋ 對之Oct－4－ 比例在條件C下之衍生自1/4及1/8分裂球組之胚泡樣結構中有顯著增加(P<0.05)。相反地，當分裂球衍生物培養於條件A下時，細胞總數及Oct－4＋ 細胞數顯著低於(P<0.05)培養於條件B及C下者。
實施例4：多能幹細胞的定性
在三次實驗期間總共由34個4－細胞期之胚胎單離得118個單一分裂球(單離率86.8%)。類似地，在七次實驗期間總共由75個8－細胞胚胎單離得425個單一分裂球(單離率70.8%)。排除1/4分裂球之不分裂衍生物(佔最初分裂球總數之12/118或10.8%)而不進一步培養。最終由1/4分裂球取得三個多能幹細胞株，佔了用於產生該等細胞株之單一分裂球最初數目的2.8%。將該等細胞株命名為OF－1至OF－3。類似地，由1/8分裂球產生了53個多能幹細胞株，佔單一分裂球最初數目的12.5%。將該等細胞株命名為OE－1至OE－53。所有建立之得自分裂球之多能幹細胞株均表現出未分化多能小鼠幹細胞之關鍵標記物，包括SSEA－1、Oct－4及鹼性磷酸酶，如免疫螢光分析所測得者(圖4B－C)。Oct－4之偵測係如實施例3中所述。以生物素化之抗－SSEA－1抗體(表2)偵測SSEA－1，係將抗體製備物添加至如實施例3中所述般固定化之細胞。令固定化之細胞與初級抗體(表2)在含0.1% BSA(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)及10%正常山羊血清(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)之PBS中於4℃下反應過夜。於PBS/0.1% BSA中短暫清洗三次後，在訊號擴增前以3’,3’－二胺基聯苯(DAB；Vector Laboratories)，依據生產商之說明將生物素化之二級抗體連接至生物素/親合素系統(Vectastain；Vector Laboratories,Burlingame,CA)。於PBS中清洗三次(每次清洗5分鐘)後，以4’,6－二脒基－2－苯基吲哚二氫氯酸鹽(DAPI；300 nM；Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)將細胞雙重染色。將封片之載玻片置於室溫下(為了生物素/親合素/DAB)之通風櫥中，然後以光學顯微鏡捕捉影像。
以100%乙醇固定化細胞後，使用Vector藍色套組(Vector Laboratories)依據製造商說明偵測得自分裂球之多能幹細胞的鹼性磷酸酶表現。
以RT－PCR分析測定Oct－4、Nanog、FoxD3、Rex－1 及UTF－1 表現(圖4A)。此分析之進行係如下述。使用RNAeasy萃取套組(Qiagen,Venlo，荷蘭)由細胞單離總體RNA。為去除基因組DNA造成之污染，1 μg之總體RNA以1單位之DNase I(Invitrogen,Carlsbad,CA)於25℃下處理15分鐘，隨後以pH 8.0之25 mM EDTA(Invitrogen,Carlsbad,CA)於65℃下處理10分鐘以將Dnase I去活化。使用SuperScript III One－Step RT－PCR套組(Invitrogen,Carlsbad,CA)依據製造商說明進行反轉錄及第一股cDNA之合成。對特定標記物基因使用個別引子對進行PCR以進一步擴增第一股cDNA。各引子對之序列、煉合溫度及循環數列於表1。所有PCR樣本均於含0.5 μg/ml溴化乙錠(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)之2%洋菜膠上以電泳分析。所有OF及OE細胞株均表現該等基因。
使用標準程序進行OF及OE細胞株之核型分析。簡言之，將細胞離心，溫和地將沉澱物重新懸浮於0.075 M KCl中，於37℃下放置20分鐘後以甲醇：冰醋酸(3：1)固定化，進行Giemsa染色而得到G－條紋。每一培養物檢視10至15個分散之分裂中期延展物。OF(OF1)及OE(4個細胞株：OE1－4)細胞株之核型分析顯示所有受試細胞株均具有一套正常的40個染色體(圖5)。
實施例5：多能分裂球衍生物的活體內分化
為調查OF及OE細胞株在活體內產生畸胎瘤之潛力，將OF或OE細胞(5×106 個細胞/處)注射入6至8週齡NOD－SCID小鼠之後腿肌肉中。隨機選出2個OF細胞株及5個OE細胞株進行畸胎瘤分析。當腫瘤可觸知時(注射後約5至7週)，將腫瘤切下並於4%多聚甲醛中固定化(4℃，隔夜)。製備石蠟切片並以蘇木精及曙紅(H&E)染色進行組織學分析。組織化學分析顯示所有受試細胞株均形成畸胎瘤且包含三個胚層之衍生物，如圖6所示：外胚層(神經上皮及似毛囊細胞)、中胚層(橫紋肌、骨骼及軟骨)及內胚層(GI道及呼吸上皮)。
實施例6：多能分裂球衍生物的活體外分化潛力
推定之ESC在活體外分化為外胚層、中胚層及內胚層世系，係基於已充分建立之類胚體(EB)形成方法(Kuo HC et al.(2003)Biol Reprod 68：1727－35)。EB之形成，係以1 mg/ml膠原蛋白酶IV將得自分裂球之幹細胞與MEF餵養細胞之共同培養物於37℃下處理10至20分鐘，俾使幹細胞脫離MEF細胞。然後將得自分裂球之幹細胞小心地吸入一顯微移液管中，以ESC培養基漂洗三次，然後懸浮培養於含ESC培養基之超低附著培養盤(Corning Life Science)中以產生EB。
分裂球衍生物之神經分化表示該等分裂球衍生物具有分化為外胚層細胞世系之能力，其係以兩個基本步驟進行。首先，使得自分裂球之幹細胞分化為神經前驅細胞。然後，令該等神經前驅細胞分化為成熟神經細胞及神經膠細胞。神經前驅細胞之產生，係使懸浮培養4天後之EB附著生長於以明膠被覆之培養盤之ESC培養基中。以無血清N2培養基取代ESC培養基；無血清N2培養基係由下列組成：DMEM與F12培養基(Invitrogen,Carlsbad,CA)之1：1混合物，補充有10 ng/ml FGF2(R&D Systems,Minneapolis,MN)及1% N2補充物(Invitrogen,Carlsbad,CA)。每兩天更換培養基，FGF2則每日添加。所得細胞群落中可見之玫瑰花樣結構代表早期之神經上皮(神經前驅細胞)。將該等細胞由培養物單離並培養於以Matrigel(Invitrogen,Carlsbad,CA)被覆之蓋玻片上，令其於N3培養基(補充有1×B27補充物(Invitrogen,Carlsbad,CA)之N2培養基)中持續分化。以RT－PCR對神經細胞定性(圖8A)，係依實施例4中所述一般性程序進行，並採用表1所示設計用於擴增下列神經－專一性標記物之引子對：PAX6、MSL1、OLIGO2及GFAP。早期神經細胞標記物巢蛋白、Pax6及Cox－1(7B－C)之免疫螢光分析係依實施例3中之一般性程序進行。類似地，免疫螢光分析顯示出成熟神經標記物微管－關聯蛋白(MAP)2及酪胺酸羥化酶(TH)，以及神經膠細胞標記物GFAP之表現。
分裂球衍生物之心臟分化表示該等分裂球衍生物具有分化為中胚層細胞世系之能力。分化之達成係藉由將EB於分化培養基(DM)中懸浮培養8天；DM係由90% DMEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)及10% FBS(Hyclone,Logan,UT)組成。然後將EB於含10－9 M 5－氮雜－2’－去氧胞嘧啶(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)及10－4 M抗壞血酸(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)之DM中培養4天。最後，將細胞於DM中培養20天。使用26G注射針頭將收縮細胞之跳動中心由EB生長物機械性地單離出來。在心肌分化培養基中長期培養得自OF及OE細胞株之EB，使得超過85%(n＝573；五次獨立實驗)之EB成為陽性之自發性收縮位點。為確認單離自跳動區之收縮細胞之心肌細胞表型，偵測收縮/肌小節蛋白質表現(圖8A)及心肌細胞相關基因(圖8A)。跳動細胞之RT－PCR定性係依實施例4中所述一般性程序進行，並採用表1所示設計用於擴增下列心肌細胞－專一性標記物之引子對：GATA－4、NCX－2.5、Mef－2C、NCX－1、心肌鈣蛋白(cTn)－1、Anf、MLC－2V及β－MHC。免疫螢光分析係依實施例3中之一般性程序進行，並採用表2所示下列心肌細胞－專一性抗體：α－輔肌動蛋白(actinin)及cTn－1。
分裂球衍生物肝臟分化之進行係藉由將細胞培養於ESC培養基中，並依據下列程序以逐步方式添加分化因子。在培養6天後，將20 ng/ml重組人類酸性纖維母細胞生長因子(aFGF；R&D Systems,Minneapolis,MN)及10 ng/ml重組人類鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF；R&D Systems,Minneapolis,MN)添加至EB俾啟動肝臟分化。在第8天時，添加10 ng/ml大鼠重組肝細胞生長因子(R&D Systems,Minneapolis,MN)作為中期因子，俾使肝前驅細胞擴增。然後在第14天時添加10 ng/ml重組人類制癌蛋白M(R&D Systems,Minneapolis,MN)、10－7 M地塞米松(dexamethasone；Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)及ITS(胰島素10 μg/ml、轉鐵蛋白5 μg/ml、硒5 ng/ml；Invitrogen,Carlsbad,CA)。然後將細胞額外培養3天俾誘使肝細胞成熟，其係內胚層細胞種類之代表。
實施例7：分裂球衍生物對嵌合動物發育的貢獻
為產生嵌合體，首先以M2培養基(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO)沖洗由CD－1或DCB品系之超級排卵母體子宮收集野生型分裂球。然後，將10至20個經pCCALL－2(一種Lac－Z質體表現構築體)轉染之單一OF－1或OE－5細胞顯微注射入FVB或CD－1小鼠之3.5天齡胚泡中。將所得嵌合胚胎(10至15個胚胎/宿主)移轉至E2.5假懷孕母體中(每一細胞株一個代理孕母)，並令其發育完全。為確認子代之嵌合性，由尾部切片萃取基因組DNA並使用eGFP或LacZ專一性引子進行PCR分析。隨後，令毛皮顏色顯示出嵌合性之雄性子代與對應之雌性交配，以測試生殖系的傳送。由OF－1品系生下8隻仔鼠，由其毛皮顏色判斷其中4隻為嵌合體(圖10A)。由OE－5生下之3隻仔鼠中1隻為嵌合體(圖10B)。
圖1顯示三種建立得自分裂球之多能幹細胞之程序。由2－、4－或8－細胞期之胚胎分離出單一分裂球並培養於所示之三種培養條件下：條件A、條件B及條件C。
圖2顯示單一分裂球發育為胚胎樣之細胞結構，生長於ESC培養基中及MEF餵養者層上。圖2A1－A7：1/4分裂球於活體外重現之發育期。所示為4－細胞期、8－細胞期、桑椹胚、早期囊胚及晚期囊胚發育之三個時期。圖2B1－B7：1/8分裂球於活體外重現之發育期。所示為4－細胞期、8－細胞期、桑椹胚、早期胚泡及晚期胚泡發育之三個時期。圖2C1－C5：對照組4－細胞胚胎之發育期。所示為4－細胞期、8－細胞期、桑椹胚、早期囊胚及晚期囊胚發育之一個時期。
圖3顯示分裂球衍生物的Oct－4表現。Oct－4蛋白質表現之顯像係使用FITC(綠色)之免疫組織化學分析。細胞核係以DAPI染色(藍色)顯像。圖3A1－A4：1/4分裂球及其衍生物(包括胚泡樣細胞結構及中間結構)之Oct－4表現。圖3B1－B3：1/8分裂球及其衍生物(包括胚泡樣細胞結構及中間結構)之Oct－4表現。圖3C1－C4：對照組胚胎在4－細胞、8－細胞、桑椹胚及擴增胚泡期之Oct－4表現。
圖4顯示得自單一單離分裂球之細胞的多能幹細胞標記物表現。圖4A：多能幹細胞標記物基因POUSF1、NANOG、FOXD3、REX1、SOX2及UTF1之RT－PCR表現分析。所示結果為胚胎幹細胞株D3、得自單一單離分裂球之多能幹細胞株OF－1及OE－1、及MEF細胞(其係作為負對照組)。圖4B－E：OF－1及OE－1細胞株之Oct－4及SSEA－1表現免疫染色分析。
圖5顯示得自單一分裂球之多能幹細胞株具GTG條紋之分裂中期延展物之核型分析。圖5A：OF－1細胞株之整倍40－XY核型。圖5B：OE－31細胞株之整倍40－XX核型。
圖6顯示由得自單一單離分裂球之多能幹細胞株OF－1(A－D)及OE－1(E－H)所產生之畸胎瘤的組織學分析。圖6A：得自OF－1之神經上皮(外胚層)。圖6B：得自OF－1之肌肉組織(中胚層)。圖6C：得自OF－1之骨骼樣結構(中胚層)。圖6D：得自OF－1之呼吸道上皮(內胚層)。圖6E：得自OE－1之皮膚樣組織(外胚層)。圖6F：得自OE－1之毛囊樣結構(外胚層)。圖6G：得自OE－1之軟骨組織(中胚層)。圖6H：得自OE－1之胃腸道上皮(內胚層)。條狀物：20 μm。
圖7顯示OF－1及OE－1細胞株經活體外神經分化後的神經分化標記物表現。圖7A：神經細胞標記物PAX6、MSL1、OLIGO2及GFAP之RT－PCR表現分析。所示結果為經活體外神經分化之得自單一單離分裂球之多能幹細胞株OF－1及OE－1。圖7B：由得自單一單離分裂球之多能幹細胞株所得之神經前驅細胞之早期神經細胞標記物，巢蛋白及Pax6的免疫螢光分析。圖7C：由得自單一單離分裂球之多能幹細胞株所得之神經前驅細胞之早期神經細胞標記物，巢蛋白及Sox－1的免疫螢光分析。圖7D：得自單一單離分裂球之神經前驅細胞衍生物之成熟神經及神經膠細胞標記物，GFAP及微管－關聯蛋白(MAP)2的免疫染色分析。圖7E：得自單一單離分裂球之神經前驅細胞衍生物之成熟神經及神經膠細胞標記物，酪胺酸羥化酶及MAP2的免疫染色分析。
圖8顯示OF－1及OE－1細胞株經活體外心肌細胞分化後的心肌細胞分化標記物表現。圖8A：心肌細胞標記物GATA－4、NCX－2.5、Mef－2C、NCX－1、心肌鈣蛋白(cTn)－1、Anf、MLC－2V及β－MHC之RT－PCR表現分析。所示結果為經活體外心肌細胞分化之得自單一單離分裂球之多能幹細胞株OF－1及OE－1。圖8B：由得自單一單離分裂球之多能幹細胞株所得之心肌細胞之α－輔肌動蛋白表現的免疫染色分析。圖8C：由得自單一單離分裂球之多能幹細胞株所得之心肌細胞之cTn－1表現的免疫染色分析。
圖9顯示OF－1及OE－1細胞株經活體外肝細胞分化後的肝細胞分化標記物表現。圖9A：肝細胞標記物白蛋白、α－胎蛋白、brachyury、HNF4α、Hex、Sox17、Fox2a及GATA4之RT－PCR表現分析。所示結果為經活體外肝細胞分化之得自單一單離分裂球之多能幹細胞株OF－1及OE－1。圖9B：由得自單一單離分裂球之多能幹細胞株所得之肝細胞之α－胎蛋白表現的免疫染色分析。圖9C：由得自單一單離分裂球之多能幹細胞株所得之肝細胞之轉鐵蛋白表現的免疫染色分析。圖9D：由得自單一單離分裂球之多能幹細胞株所得之肝細胞之白蛋白表現的免疫染色分析。圖9E：由得自單一單離分裂球之多能幹細胞株所得之肝細胞之C/EBPβ表現的免疫染色分析。圖9F：由得自單一單離分裂球之多能幹細胞株所得之肝細胞之HNF4α表現的免疫染色分析。圖9G：由得自單一單離分裂球之多能幹細胞株所得之肝細胞的DBA反應性分析。
圖10顯示得自分裂球之多能幹細胞對嵌合小鼠之貢獻。圖10A：雌性嵌合小鼠顯示出得自1/4分裂球之多能幹細胞株OF－1對毛皮顏色之貢獻。圖10B：雌性嵌合小鼠顯示出得自1/8分裂球之多能幹細胞株OE－5對毛皮顏色之貢獻。
表格簡單說明
表1顯示用於定性得自分裂球之未分化及已分化多能幹細胞之PCR引子的DNA序列。
表2顯示用於定性得自分裂球之未分化及已分化多能幹細胞之抗體。
表3顯示得自1/2、1/4及1/8分裂球且培養於不同條件下之分裂球衍生物的總體細胞數、總體OCT＋ 細胞數、及OCT－4＋ 對OCT－4－ 之比例
<110> 中央研究院，基因體研究中心及細胞與個體生物學研究所
<120> 由單一分裂球取得多能幹細胞之方法
<150> US 60/815,842
<151> 2006-06-23
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<170> PatentIn 3.3版
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Claims (8)

  1. 一種由哺乳動物單一分裂球產生多能幹細胞之方法，包含下列步驟：由著床前2-細胞期或4-細胞期之胚胎分離出單一分裂球；及培養至少一個該單一分裂球以產生多能幹細胞，其中該培養之步驟包括：(i)在一含有白血病抑制因子(LIF)之胚胎培養基中懸浮培養單一分裂球直到形成似桑椹胚細胞團；(ii)分離該似桑椹胚細胞團以得到來自於該分裂球之單一細胞；及(iii)移轉該來自於該分裂球之單一細胞至餵養細胞(feeder cells)培養盤，於幹細胞培養基中共同培養，直到形成包含多能幹細胞之群落；其中該幹細胞係藉由Oct-4、Nanog、Sox2、FoxD3、SSEA-1及鹼性磷酸酶(AP)之細胞標記物之表現予以鑑定。
  2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一個分裂球係得自小鼠胚胎。
  3. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一個分裂球係得自人類胚胎。
  4. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一個分裂球係得自非人靈長動物之胚胎。
  5. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一個分裂球係得自牛胚胎。
  6. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一個分裂球係得自綿羊胚胎。
  7. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一個分裂球係得自山羊胚胎。
  8. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該至少一個分裂球係得自豬胚胎。
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