KR101538089B1 - 배아줄기세포-유사 세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다음 단계를 포함하는 배아줄기세포(ESC)-유사 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다: (a) 포유동물 조직 또는 체액으로부터 성체줄기세포를 포함하는 제1세포군을 수득하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서의 포유동물 조직과 상이한 포유동물 조직으로부터 상기 제1세포군과 상이한 제2체세포군을 수득하는 단계; (c) 상기 제1세포군 또는 상기 제2체세포군으로부터 콜로니를 형성하기 위하여 충분한 시간동안 상기 제1세포군 및 상기 제2체세포군을 배지에서 공동배양 하는 단계; 및 (d) ESC-유사 세포를 제조하기 위하여 충분한 시간동안 상기 콜로니의 세포를 계대 배양하는 단계.
줄기세포, ESC-유사 세포, 섬유아세포, 콜로니-형성 세포

Description

배아줄기세포-유사 세포{Embryonic Stem Cell-Like Cells}
본 발명은 전능성을 가지는 배아줄기세포-유사 세포 제조 방법 및 포유동물 조직-유래 배아줄기세포-유사세포에 관한 것이다.
환자-특이적 체세포 핵 치환(specific somatic cell nuclear transfer , SCNT)이 면역 거부 반응이 없는 세포 치료법을 개발하기 위한 절대적 방법이라 하더라도, 몇몇 방법은 인간 클로닝을 회피하기 위하여 SCNT를 대체하기 위해 제안되어 왔다1-10. 그러나, 각 대안 방법은 환자-특이적 치료 요법으로 개발하는데 있어서 다양한 한계점을 가지고 있었다. 난모세포 처녀 생식이 가능성 있는 하나의 대안이다. 배아줄기(Embryonic stem: ES)세포는 영장류((Vrana, K.E. et al. Nonhuman primate parthenogenetic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 11911-11916 (2003))에 배란된 난모 세포의 처녀생식으로부터 유래되었으며 최근에는 인간(Brevini et al., ESHRE annual meeting in 2006)으로부터 유래되고 있다. 우리는 전강 난모세포(PCT/KR2006/001891)로부터 수득된 미성숙 난모세포의 처녀 생식을 통하여 자가 ES 세포를 확립하였다. 그러나, 이런한 방법들은 인간 클로닝의 필요성을 완전히 제거하지 못한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
이와 같이, 본 발명자들은 종래 기술에 있어서의 문제점을 해결하고자 연구 노력하였고, 그 결과 배아 및 생식 세포(gamete) 없이 전능성을 가지는 배아 줄기 세포(ESC)-유사 세포를 성공적으로 제조하는 신규한 방법을 개발하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 배아 줄기 세포(ESC)-유사 세포 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 포유류 조직 또는 체액-유래 배아 줄기 세포(ESC)-유사 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전능성을 가지지 않은 포유동물 세포를 전능성을 가지는 배아 줄기 세포(ESC)-유사 세포로 탈분화시키기 위한 배양 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목적은 포유동물 조직 세포로부터 배아 줄기 세포(ESC)-유사 세포를 생산하기 위한 배양 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 배아줄기세포(ESC)-유사 세포 제조방법을 제공한다. (a) 포유동물 조직 또는 체액으로부터 성체줄기세포를 포함하는 제1세포군을 수득하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서의 포유동물 조직과 다른 포유동물 조직으로부터 상기 제1세포군과 다른 제2체세포군을 수득하는 단계; (c) 상기 제1세포군 또는 상기 제2세포군으로부터 콜로니를 형성하기 위하여 충분한 시간 동안 상기 제1세포군 및 상기 제2세포군을 배지에서 공동배양 하는 단계; 및 (d) 상기 ESC-유사 세포를 제조하기 위하여 충분한 시간동안 상기 콜로니로부터 세포를 계대 배양하는 단계.
본 발명은 SCNT 실행 및 배아 이용뿐만 아니라 생식 세포 없이도 포유동물 조직 세포로부터 전능성(pluripotency)을 가지는 배아줄기세포(ESC)-유사 세포를 확립하는 신규한 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 방법은 배아를 이용하지 않고 ESC-유사 세포를 제조하는 방법을 제시한다. 본 발명은 인간 복제 없이 면역 반응-부재 및 환자-특이적 세포 치료 확립에 대한 가능성 및 실현을 가능하게 한다. 지금까지 우리가 알고 있는 한, 본 발명은 생식세포 조작의 도움 없이 포유동물 세포(예를 들면, 분화된 체세포)로부터 ESC-유사 세포의 생산을 최초로 제공한다. 본 방법에 따르면, 배양 조건 및/또는 환경을 조절함으로써 두 세포군이 ESC-유사 세포를 형성하도록 유도될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어“배아줄기세포(ESC)-유사 세포”는 본 방법에 의해 유도된 전능성을 가지는 세포를 의미하며, 형질전환 없는 증식, 무한증식, 자가-재생산 및 3종류의 모든 배아 층으로부터 유래된 어떠한 세포로 발달할 수 있는 능력을 포함하는 배아 줄기 세포의 특성을 의미하나, 이에 제한되지는 않는다. 즉, 본 방법에 의해 유도된 상기 ESC-유사 세포는 배아-유사 단계를 가진다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 기술한다.
성체줄기세포를 포함하는 제1세포군의 제조
성체줄기세포를 포함하는 제1세포군은 수많은 기원으로부터 다양한 종래 방법에 의해 수득될 수 있다. 상기 성체줄기세포를 포함하는 제1세포군에 대한 근원은 종래에 성체줄기세포를 포함하는 것으로 알려진 포유동물 조직 또는 체액을 포함한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 “성체줄기세포”는 분화된 조직에서 발생하고, 자가 재생산하며, 유래 조직의 모든 세포 타입으로 분화될 수 있는 미분화된 세포를 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 성체줄기세포를 포함하는 제1세포군에 대한 근원으로서 상기 포유동물 조직 또는 체액은 난소, 정소, 골수, 말초 혈액, 제대혈, 양수, 뇌, 혈관, 골격근, 피부 또는 위장관의 상피, 각막, 치아의 치수, 망막, 간, 비장 또는 췌장으로부터 유래된다. 예를 들면, 뇌로부터 유래한 줄기 세포는 뇌실하 영역(subventricular zone), 뇌실 영역(ventricular zone) 및 CNS (central nervous system)의 해마(hippocampus)로부터 분리된다. 척수는 조혈모세포 및 중간엽 줄기세포를 가지는 것으로 보고되고 있다.
보다 바람직하게는, 성체줄기세포를 포함하는 제1세포군에 대한 근원으로서 상기 포유동물 조직 또는 체액은 난소, 간, 위, 피부 또는 비장으로부터 유래 되며, 가장 바람직하게는 난소로 부터 유래 된다.
ESC-유사 세포를 제조하기 위하여 성체줄기세포를 포함하는 상기 제1세포군은 종래 기술 분야에서 잘 알려진 다양한 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 세포는 컨플루언트(confluent) 단일 층을 수득할 때까지 세포를 배양하여 단일 세포 현탁액을 수득될 때까지 기계적 방법(예를 들면, 자르기 또는 다지기) 또는 효소적 방법(예를 들면, 트립신 처리)을 이용하여 조직의 분리를 통해 수득될 수 있다. 그 다음 세포를 회수하고 동결보존 시킨다. 체세포(예를 들면, 난소 세포)의 분리는 실시예 부분에 자세히 기술되어 있다.
성체줄기세포를 포함하는 상기 제1세포군은 유전체 또는 유전 물질(예를 들면, 핵산)을 포함하는 체세포 및 생식 세포를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 용어 “체세포”는 분화된 세포를 의미한다. 상기 세포는 체세포 또는 체세포 계통에 포함된 세포이고, 바람직하게는 본 발명에 있어서 유용한 세포는 분화된 체세포이다.
상기 제1세포군은 발전단계 예를 들면, 사춘기 후의 포유동물 조직, 미성숙-배아, 배아, 수정 후의 신생아 또는 태아 조직에 있는 조직으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1세포군은 출산 후(after birth) 발달 단계에 있는 포유동물 조직 또는 체액으로부터 수득하고, 보다 바람직하게는 사춘기 후의 포유동물의 조직 또는 체액으로부터 수득된다. 본 명세서의 용어 “사춘기 후의 포유동물”은 포유동물의 발달에 있어서 사춘기 단계 후의 포유동물을 의미한다. 즉, 용어 “사춘기 후의 포유동물”은 본 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 “성체 포유동물”과 동일한 의미를 가진다. “사춘기 후의 포유동물”과 “성체 포유동물” 사이에 의도된 구별은 없으며, 본 용어는 상호 교환가능하게 사용될 것이다. 예를 들면, 마우스, 소, 돼지 및 인간의 사춘기 평균 연령은 각각 대략 3-4주, 10-14개월, 2-3개월 및 10-15년이다.
바람직하게는, 난소 특히, 난소 세포를 이용하는 경우에는 난소 기질 세포, 난모 세포, 전강 난포 및 강 난포가 실질적으로 제거된다. 난소 세포로부터 난모 세포, 전강 난포 및 강 난포는 40 ㎛ 세포 여과기를 이용하여 제거할 수 있다. 본 발명에서 이용되는 성체줄기세포를 포함하는 난소 세포는 성체 체세포, 중간엽 줄기세포, 원시 난포 및/또는 난소 줄기 세포를 포함할 수 있다.
상기 제1세포군은 ESC-유사 세포로의 형질전환(탈분화)에 있어서 적합한 미세환경(니치)을 제2체세포군에 제공한다. 이론에 의해 확립되지는 않았지만, 니치(niche)는 탈분화를 유도하는데 필요로 하는 인자(요소)를 분비 및/또는 제공할 수 있다고 판단된다. 본 명세서에서 사용하는 용어 “니치(niche)”는 줄기 세포 및 그 외 체세포와 같은 조직 세포의 발달 및 증식을 지원하는 조직 또는 기관(예를 들면, 난소)으로 구성된 구성 요소(세포 및/또는 물질)를 의미한다. 난소 세포를 이용하는 경우에, 난소 니치가 공급된다.
이와 대조적으로, 적당한 조건 및 환경 하에서 제1세포군은 제2체세포군의 탈분화를 위해서 니치를 제공하기 보다는 스스로 ESC-유사 세포로 탈분화된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1세포군은 2이상의 세포 타입을 포함하는 이종 세포군이다. 예를 들면, 상기 제1세포군이 난소로부터 유래하는 경우, 성체줄기세포, 원시 난포 및/또는 난소 줄기 세포뿐만 아니라 중간엽 줄기세포를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 상기 제1세포군은 인간, 소, 양, 돼지, 말, 토끼, 염소, 마우스, 햄스터 또는 랫트(rat)로부터 발생되고, 보다 바람직하게는 인간, 마우스 또는 랫트로부터 유래된다.
본 발명에서 이용하는 제1세포군의 유전체는 예를 들면,자연적으로 발생하는 유전체일 수 있으며, 또는 상기 유전체는 이식유전자 서열을 포함하여 유전적으로 변경될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 제1세포군은 자연적으로 발생하는 유전체 특히, 세포 이식 치료를 위한 유전체를 가진다.
제2체세포군의 제조
본 발명에 있어서, 상기 제2체세포군의 타입은 상기 제1세포군과 상이하다는 것은 필수적이다.
상기 제2체세포군은 본 기술 분야에 잘 알려진 다양한 방법에 의하여 수득할 수 있다. 예를 들면, 세포 현탁액을 수득될 때까지 기계적 방법(예를 들면, 자르기 또는 다지기) 또는 효소적 방법(예를 들면, 트립신 처리)을 이용하여 조직의 분리르 하고, 컨플루언트(confluent) 단일 층을 수득할 때까지 세포를 배양한다. 그 다음 세포를 회수하고 동결보존 시킨다. 체세포(예를 들면, 난소 세포)의 분리는 실시예 부분에 자세히 기술되어 있다.
상기 세포는 유전체 또는 유전 물질(예를 들면, 핵산)을 포함하는 체세포일 수 있다. 본 명세서에서 사용하는 용어 “체세포”는 분화된 세포를 의미한다. 상기 세포는 체세포 또는 체세포 계통에 포함된 세포이고, 바람직하게는 본 발명에 있어서 유용한 세포는 분화된 체세포이다. 상기 체세포는 포유동물로부터 유래 되거나 세포 및/또는 조직 배양 시스템으로부터 유래될 수 있다. 만약 포유동물로부터 유래하는 경우에는, 상기 동물은 임의의 발전 단계 예를 들면, 배, 태아 또는 성체일 수 있다. 추가적으로, 본 발명은 배아 체세포를 이용한다.
적합한 체세포는 섬유아세포(예를 들면, 원시 섬유아세포), 상피 세포, 근 세포, 난구 세포, 신경 세포 및 유선 세포를 포함한다. 또 다른 체세포는 간세포 및 췌도 세포를 포함한다. 바람직하게는, 상기 제2체세포군은 섬유아세포 및 상피 세포를 포함하고, 가장 바람직하게는 섬유아세포를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 상기 세포는 인간, 소, 양, 돼지, 말, 토끼, 염소, 마우스, 햄스터 또는 랫트(rat)로부터 발생되고, 보다 바람직하게는 인간, 마우스 또는 랫트로부터 유래된다.
본 발명에서 이용하는 체세포의 유전체는 예를 들면, 자연적으로 발생하는 지놈(genome)일 수 있으며, 또는 상기 지놈은 이식유전자 서열을 포함하여 유전적으로 변경될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 체세포는 자연적으로 발생하는 유전체 특히, 세포 이식 치료를 위한 유전체를 가진다. 본 발명에서 이용하는 상기 세포는 2배체 핵형을 갖는 체세포가 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 유사 분열적으로 불활성인 세포가 상기 제2체세포군에 대한 세포 기원으로서 이용된다. 유사 분열적으로 불활성인 세포는 본 기술 분야에서 잘 알려진 다양한 방법으로 세포 주기를 저지하여 쉽게 제조될 수 있다. 예를 들면, 유사 분열적으로 불활성인 세포는 감마 방사선(예를 들면, 감마선의 4000 Rads)에 노출시키거나 마이토마이신 C(mitomycin C)를 처리하여 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제2체세포군은 배양 플레이트(plates)에 접착성을 가진다. 이러한 접착 포텐셜(potential)은 상기 제2체세포가 상기 제1세포군의 성장을 유지시킬 수 있도록 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제2체세포군은 하나의 체세포 타입을 포함하는 실질적으로 상동군(homogenous population)이다.
상기 제2체세포군은 상기 제1세포군의 지원으로 ESC-유사 세포로 탈분화 된다.
이와 대조적으로, 적합한 조건과 환경에서 상기 제2체세포군은 스스로 ESC-유사 세포로 탈분화하는 것이라기보다 상기 제1세포군의 탈분화를 위한 환경을 제공한다. 이런 경우에, 상기 제2체세포군은 공급 세포(feeder cell)로서 작용한다.
ESC-유사 세포를 포함하는 콜로니 형성을 위한 공동배양
그 다음, 상기 제조된 2가지의 타입 세포 특히, 제1세포군 및 제2체세포군은 전능성(pluripotency) ESC-유사 세포를 포함하는 콜로니를 형성하기 위하여 충분한 시간동안 배지에서 공동배양 된다.
바람직하게는, 상기 배지는 세포 분화를 억제하는 인자를 포함한다. 상기 분화 억제 인자는 백혈병 억제 인자 및 nm23-H2/뉴클레오시드 디포스페이트 키나아제(diphosphate kinase)를 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 공동배양 배지는 백혈병 억제 인자이다.
이론에 의해 확립되지는 않았지만, 상기 제1세포군 또는 제2체세포군 및 백혈병 억제 인자 특히, 백혈병 억제 인자의 고 투여량은 세포가 전능성 ESC-유사 세포로의 형질전환(탈분화)에 있어서 적합한 미세환경(또는 니치)을 상기 세포에 공급한다고 판단된다. 또한, 미세환경(또는 니치)은 세포간 상호작용을 유발하고 전능성을 갖기 위하여 필요한 인자들을 분비할 수 있다고 판단된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 공동배양 단계는 백혈병 억제 인자(LIF)의 고 농도에서 실시된다. LIF와 관련하여 사용된 용어 “고 농도”는 LIF 3,000 unites/㎖ 이상의 농도를 의미하며, 바람직하게는 LIF 4,000 unites/㎖ 이상의 농도를 의미하고, 보다 바람직하게는 LIF 5,000 unites/㎖ 이상의 농도를 의미하며, 보다 더 바람직하게는 LIF 4,000-6,000 unites/㎖의 농도를 의미하고, 가장 바람직하게는 LIF 5,000 unites/㎖의 농도를 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)에서의 배양은 LIF 3,000 unites/㎖ 이상의 농도에서 실시되며, 보다 바람직하게는 LIF 4,000 unites/㎖ 이상의 농도에서 실시되고, 보다 더 바람직하게는 LIF 4,000-6,000 unites/㎖ 이상의 농도에서 실시되며, 가장 바람직하게는 LIF 5,000 unites/㎖의 농도에서 실시된다. LIF의 고 농도는 전능성 줄기세포를 생산하는데 있어 보다 높은 생산성을 가지며 상대적으로 매우 유리하다.
본 단계에서 이용하는 배지는 본 기술 분야에서 포유동물의 ES 세포를 수득하는데 이용하는 일반적인(보편적인) 배지를 포함한다. 예를 들면, 상기 배지는 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), 녹-아웃 DMEM(knock-out DMEM), 우태아 혈청이 포함된 DMEM, 혈청 대체물, Chatot, Ziomek 및 Bavister(CZB) 배지가 포함된 DMEM, 소아혈청(FCS)이 포함된 Ham's F-10, Tyrodes-albumin-latate-pyruvate(TALP), Dulbecco's phosphate buffered saline(PBS), Eagle's 및 Whitten's 배지이다. 바람직하게는, 상기 배양 배지는 β-머캅토에탄올, 비필수 아미노산, L-글루타민, 항체들(바람직하게, 페니실린 및 스트렙토마이신) 및/또는 FBS가 보충된 LIF(백혈병 억제 인자)를 포함하는 DMEM 배지이다. 상기 배지들의 상세한 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York, WO 97/47734 및 WO 98/30679에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
콜로니를 형성하기 위한 충분한 시간은 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 4-9일이며, 보다 바람직하게는 6-8일이고, 가장 바람직하게는 약 7일이다.
상기 콜로니는 상기 제1세포군 또는 제2체세포군으로부터 유래될 수 있다. 이론에 의해 확립되지는 않았지만, 상기 콜로니는 유전적 배경, 환경 감수성 및/또는 세포 타입에 의해 결정된다.
실시예에 예시하였듯이, 탈분화되는 세포는 세포의 유전적 배경에 기초하여 결정된다. 보다 구체적으로는, 제1세포군으로서 난소 세포를 B6CBA1 마우스(C57BL/6 마우스와 CBA/Ca 마우스의 교미에 의해 생산된)로부터 수득하고 제2체세포군으로서 섬유아세포를 B6D2F1 마우스(C57BL/6 마우스와 DBA2 마우스의 교미에 의해 생산된)로부터 수득한 경우에는, 상기 제2체세포군은 ESC-유사 세포로 탈분화가 된다. 상기 제1세포군으로서 난소 세포를 B6D2F1 마우스로부터 수득하고 상기 제2체세포군으로서 섬유아세포를 ICR 마우스로부터 수득한 경우에는, 상기 제1세포군은 ESC-유사 세포로 탈분화가 될 가능성은 없다. 이러한 결과는 두 타입의 세포를 공동배양 하는데 있어서 세포의 유전적 배경이 ESC-유사 세포로의 탈분화를 결정한다는 것을 증명한다. 실시예에서, B6D2F1 마우스로부터 유래한 세포는 ESC-유사 세포로 탈분화 되었다.
또한, 본 발명자들은 B6D2F1 마우스 세포의 특성을 조사하였으며 스트레스-억제 유전자들(예를 들면, Hspa9a, Bmi1, Hspa1b, Pdha2 및 Txrnd3)가 상대적으로 낮게 발현되고 활성 산소 종(Reactive oxigen species)이 상대적으로 높게 발현되는 것을 알았다. 즉, B6D2F1 마우스 유래 세포는 높은 환경 감수성을 나타낸다. 이러한 분석 결과를 토대로, 두 가지 타입의 세포를 공동배양 하는데 있어서 환경 감수성이 세포의 ESC-유사 세포로 탈분화를 결정하다는 것을 알 수 있다. 공동배양 시스템에서의 두 가지 타입의 세포들에 있어서, 높은 환경 감수성을 갖는 세포가 ESC-유사 세포로 탈분화될 가능성이 높다.
ESC-유사 세포를 제조하기 위한 콜로니 세포의 계대배양
ESC-유사 세포를 제조하기 위하여, 콜로니-형성 세포를 충분한 시간동안 배지에서 계대배양 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 계대배양 단계는 백형병 억제 인자(LIF)의 상대적으로 낮은 농도에서 실시된다. 보다 바람직하게는, 상기 계대배양은 LIF의 2,000 units/㎖의 농도 이하에서 실시되며, 보다 더 바람직하게는 800-1,200 units/㎖의 농도에서 실시되고, 가장 바람직하게는 1000 units/㎖의 농도에서 실시된다.
계대배양을 위한 배지와 피더 세포층에 대한 상세한 기술은 상기 기술된 단계 (c) 배양과 공통되므로, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에 의해 제조된 상기 ESC-유사 세포는 25번 계대하면서 3개월간 유지될 수 있다. 따라서, 계대배양이 오랜 시간동안 실질적으로 변화(예를 들면, 유전학적으로 또는 생물학적으로) 없이 실시하는 경우에는, 본 발명은 전능성을 가지는 ESC-유사 세포 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, ESC-유사 세포가 상기 제2체세포군-유래 콜로니로부터 제조되는 경우, 상기 ESC-유사 세포는 4배체 핵형을 갖는다. 상기 4배체 핵형을 가지는 ESC-유사 세포가 분화되는 경우, 상기 ESC-유사 세포는 2배체 핵형을 가지게 된다. 본 발병에 따르면, 2배체에서 4배체로 그리고 4배체에서 2배체로의 변환은 각각 세포재설정화(reprograming) 및 탈재분화에 의한 줄기성 획득과 체세포로 분화하는 동안 발생한다. 이러한 신규한 결과는 본 발명을 뒷받침하는 메카니즘 및 이론을 형성한다.
이와 대조적인 면에 있어서, 상기 ESC-유사 세포가 상기 제1세포군으로부터 유래하는 경우에는, 상기 ESC-유사 세포 2배체 핵형을 가진다.
전능성 ESC-유사 세포는 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase: AP), 항-SSEA-1, 항-SSEA-3 및 항-SSEA-4 항체와 같은 항-단계-특이적 배아 항원(anti-stage-specific embryonic antigen: SSEA) 항체, 항-인테그린 α6 항체 및 항-인테그린 β1항체를 이용하는 마커 분석으로 확인 할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 최종적으로 제조되는 전능성 줄기 세포는 LIF 및 테라토마 없이 배아체를 형성하는 잠재성을 분석함으로써 확인될 수 있다. 반면, 최종적으로 생산된 ESC-유사 세포의 염색체 분석 및 DNA 미세위성(microsatellite)분석을 통하여 탈분화된 타겟 조직 세포(예를 들면, 난소 세포 또는 섬유아세포)를 알 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1세포군 또는 제2체세포군으로부터 유래된 ESC-유사 세포는 알카라인 포스파타아제에 양성 반응을 나타내며, 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase: AP), 단계 특이적 배아 항원(SSEA)-1, 인테그린 α6 및 인테그린 β1 및 OCt-4의 각각의 항체에 양성 반응을 나타내고, 각 SSEA-3 및 SSEA-4에 대한 항체에 대하여 음성 반응을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 방법에 의해 생산된 전능성 ESC-유사 세포는 Oct-4, Nanog, Rex-1, Cripto, Dnmt3b, Tert, Lif Rc, Stat3, Bmp4, Fgf4, Foxd3, Sox2, CD9 및 Gdf3으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 줄기-세포 특이적 유전자를 발현한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 방법에 의해 생산된 ESC-유사 세포는 조직-특이적 줄기 세포 마커(중간엽 줄기세포에 대한 Sca-1 및 CD44, 상피 줄기 세포에 대한 CD34, 조혈 줄기 세포에 대한 CD45 및 생식세포주 줄기 세포에 대한 Fragilis 및 Vasa)에 대한 항체에 대해서는 음성 반응을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 확립된 ESC-유사 세포는 난포 세포-특이적 마커(예를 들면, AMH (anti-mullerian hormone)에 대한 항체에 대하여 무반응을 나타낸다.
상술한 기술을 토대로, 본 방법은 포유동물 조직 세포를 이용하여 ESC-유사 세포를 제조하는 2가지 방법을 제공한다.
첫 번째 방법은 포유동물 조직 또는 체액으로부터 유래한 니치(niche)를 이용한다. 보다 구체적으로, 첫 번째 방법은 다음 단계를 포함 한다: (a) 포유동물 난소로부터 성체줄기세포를 포함하는 난소 니치(niche)를 수득하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서의 난소 니치와 상이한 탈분화된 포유동물 조직으로부터 상기 난소 니치와 상이한 체세포군을 수득하는 단계; (c) 상기 체세포군으로부터 콜로니를 형성하기 위하여 충분한 시간동안 상기 난소 니치 및 체세포를 배지에서 공동배양 하는 단계; 및 (d) ESC-유사 세포를 제조하기 위하여 충분한 시간동안 상기 콜로니의 세포를 배지에서 계대배양 하는 단계.
특히, 두 번째 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 포유동물 조직 또는 체액으로부터 성체줄기세포를 포함하는 제1세포군을 수득하는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서의 포유동물 조직과 상이한 포유동물 조직으로부터 상기 제1세포군과 상이한 제2체세포군을 수득하는 단계; (c) 상기 제1세포군으로부터 콜로니를 형성하기 위하여 충분한 시간동안 백혈병 억제 인자를 포함하는 배지에서 상기 제1세포군 및 제2체세포군을 공동 배양하는 단계; 및 (d) 상기 ESC-유사 세포를 제조하기 위하여 충분한 시간동안 백혈병 억제 인자를 포함하는 배지에서 상기 콜로니의 세포를 계대 배양하는 단계.
첫 번째 및 두 번째 방법의 상세한 기술은 상술된 ESC-유사 세포를 제조하는 본 발명의 방법에 따른다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전능성을 가지며 사춘기 후의 포유동물 조직으로부터 세포를 배양하여 제조되고; 체세포 핵치환에 의해 제조되지 않은 포유동물 조직-유래 배아줄기세포-유사 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전능성을 가지고; (ⅰ)포유동물 조직 또는 체액으로부터 성체줄기세포를 포함하는 제1세포군과 (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 포유동물 조직과 다른 포유동물 조직으로부터의 제2체세포군을 공동 배양하여 제조되며; 체세포 핵 치환에 의해 제조되지 아니한 포유동물 조직 또는 체액-유래 배아줄기세포(ESC)-유사 세포를 제공한다.
본 발명의 추가적인 양태에 따르면, 본 발명은 전능성을 가지고; (ⅰ)포유동물 조직 또는 체액으로부터 성체줄기세포를 포함하는 제1세포군과 (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 포유동물 조직과 다른 포유동물 조직으로부터의 제2체세포군을 공동 배양하여 제조되며; 체세포 핵 치환에 의해 제조되지 아니한 포유동물 조직 또는 체액-유래 배아줄기세포(ESC)-유사 세포주를 제공한다.
본 발명의 상기 포유동물 조직-유래 전능성 배아줄기세포(ESC)-유사 세포는 인간 복제 및 SCNT없이 최초로 제시된 것이다. 체세포가 환자로부터 유래되는 경우, 전능성 ESC-유사 세포는 면역 거부 반응을 나타내지 않으며 인간 복제 및 SCNT없이 환자-특이적 세포 치료를 제공할 수 있다.
상기 ESC-유사 세포는 전능성이다. 용어“ 전능성(pluripotent)”은 세포가 모든 3배엽으로부터 유래하는 어떠한 세포로도 발달할 수 있는 능력을 가진다는 것을 의미한다. SCID 마우스로 이식되는 경우, 성공적인 체세포-유래 전능성 줄기 세포는 모든 3배엽으로부터 유래된 세포 분화할 것이다. 또한, LIF없이 배양하는 경우에는, 상기 체세포-유래 전능성 줄기 세포는 모든 3배엽에 특이적인 마커(외배엽인 경우 신경 카드헤린 접착 분자(neural cadherin adhesion molecular) 및 S-100, 중배엽인 경우 근육 액틴(muscle actin) 및 데스민(desmin) 및 내배엽인 경우 α-페토프로틴(α-fetoprotein) 및 트로마-1(Troma-1))에 대해 양성을 갖는 배아체를 형성한다.
용어 “ESC-유사 세포주”는 전능성 ESC-유사 세포의 장기 배양을 통해 수득된 세포 배양을 의미한다. 상기 ESC-유사 줄기 세포주는 실질적으로 변화(예를 들면, 유전학적으로 또는 생물학적으로)를 받지 않고 상당한 시간동안 배양될 수 있는 면에서 안정하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 성체줄기세포를 포함하는 제1세포군에 있어서 포유동물 조직 및 체액은 난소, 골수, 말초 혈액, 제대혈, 양수, 뇌, 혈관, 골격근, 피부 또는 위장관의 상피, 각막, 치아의 치수, 망막, 간, 비장 또는 췌장으로부터 유래된다. 가장 바람직하게는, 상기 포유동물 조직은 난소로부터 유래된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1세포군은 2이상의 세포 타입을 포함하는 이종 군(heterogeneous population)이다. 바람직하게는, 상기 제2체세포군은 1이상의 체세포 타입을 포함하는 실질적으로 상동군(homogenous population)이다. 바람직하게는, 상기 체세포는 섬유아세포 또는 상피세포이다. 상기 제2체세포군은 유사 분열적으로 불활성 세포이다. 또한, 상기 제2체세포군은 배양 플레이트에 대하여 접착성을 가진다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 제1세포군은 사춘기 후의 포유동물 조직 또는 체액으로부터 수득된다.
바람직하게는, 줄기세포를 포함하는 상기 제1세포군은 난소 세포이며, 보다 바람직하게는, 실질적으로 난소 기질 세포, 난모 세포, 전강 난포(preantral follicles) 및 강 난포(antral follicles)가 제거된 난소 세포이다.
상기 ESC-유사 세포는 다양한 동물로부터 유래되며, 바람직하게는 인간, 소, 양, 돼지, 말, 토끼, 염소, 마우스, 햄스터 또는 랫트(rat)로부터 유래된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ESC-유사 세포가 상기 제2체세포군으로부터 유래되는 경우에는, 상기 ESC-유사 세포는 4배체 핵형을 가진다. 상기 4배체 핵형을 가지는 상기 ESC-유사 세포가 분화 유도되는 경우에는, 상기 ESC-유사 세포는 2배체 핵형을 가진다.
상기 ESC-유사 세포가 상기 제1세포군으로부터 유래되는 경우에는, 상기 ESC-유사 세포는 2배체 핵형을 가지지 않는다.
상기 포유동물 조직 세포-유래 ESC-유사 세포는 전구 세포(progenitor cell)와 동일한 유전자형(genotype)을 가진다. 또한, 상기 ESC-유사 세포는 배아줄기세포와 공통된 특성, 예를 들면, 알카라인 포스파타아제에 안정하고, 배아체 및 테라토마(teratoma)를 형성할 수 있는 능력을 나타낸다.
베아 줄기세포를 언급하면 사용된 용어 “염색 가능한”은 세포가 AP, 항-SSEA 항체, 항-인테그린 α6 및 항-인테그린 β1 항체와 같은 세포 표면 결합 리간드에 양성으로 염색되거나 반응을 나타낸 것을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ESC-유사 세포가 상기 제1세포군으로부터 유래하는 경우에는, 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase: AP), 단계 특이적 배아 항원(SSEA)-1, 인테그린 α6 및 인테그린 β1 및 Oct-4의 각각의 항체에 양성 반응을 나타내고, 각 SSEA-3 및 SSEA-4에 대한 항체에 대하여 음성 반응을 나타낸다. 바람직하게는, 상기 ESC-유사 세포는 Oct-4, Nanog, Rex-1, Cripto, Dnmt3b, Tert, Lif Rc, Stat3, Bmp4, Fgf4, Foxd3, Sox2, CD9 및 Gdf3으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 줄기-세포 특이적 유전자를 발현한다. 보다 바람직하게는, 상기 ESC-유사 세포는 Sca-1, CD44, CD34, CD45, Fragilis, Vasa 및/또는 AMH (anti-mullerian hormone)에 대한 항체에 대하여 음성반응을 나타낸다.
대표적으로, 상기 제1세포군으로부터 유래된 ESC-유사 세포는 OSC-B6D2-SNU-1로 명명하였고, 한국세포주 연구재단으로부터 기탁 번호 KCLRF-BP-00148을 부여받았다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ESC-유사 세포는 상기 제2체세포군으로부터 유래하는 경우에는, 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase: AP), 단계 특이적 배아 항원(SSEA)-1, 인테그린 α6 및 인테그린 β1 및 Oct-4의 각각의 항체에 양성 반응을 나타내고, 각 SSEA-3 및 SSEA-4에 대한 항체에 대하여 음성 반응을 나타낸다.
상기 제2체세포군으로부터 유래된 대표적인 ESC-유사 세포는 OSC-B6D2-SNU-1로 명명하였고, 한국세포주 연구재단으로부터 기탁 번호 KCLRF-BP-00148을 부여받았다.
줄기세포 또는 줄기세포-유사 세포는 여러 타입의 세포로 분화하는 능력이 있다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 줄기세포-유사 세포는 다양한 타입의 세포를 제공하는 좋은 소스(source)이다. 예를 들면, 상기 ESC-유사 세포는 세포 분화를 위한 조건의 배지에서 배양하여 조혈세포, 신경 세포, 베타 세포, 간 세포, 연골 세포, 상피 세포, 요로 세포 및 이의 유사 세포로 분화 유도될 수 있다. ES 세포가 분화하기 위한 배지 조건 및 방법은 Palacios, et al., PNAS. USA, 92:7530-7537(1995), Pedersen, J. Reprod. Fertil. Dev., 6;543-552(1994), 및 Bain et al., Dev. Biol, 168:342-357(1995)에 개시되어 있다.
상기 ESC-유사 세포는 이식을 통해서 수 많은 치료 응용될 수 있다. 상기 ESC-유사 세포는 당뇨병, 파킨스 병, 알츠하이머 병, 암, 척수 손상, 다발성 경화, 근위축성 측삭 경화증(루게릭병), 근이영양증, 간 질환, 즉, 고 콜레스테롤 혈증, 심장 질환, 연골 대체, 창상, 족부 궤양, 위장병, 혈관질환, 신장 질환, 요로 질환, 노화 관련 질환 및 상태와 같은 수많은 질병 또는 질환 치료에 응용할 수 있다.
본 발명의 보다 추가적인 양태에 따르면, 본 발명은 포유동물 조직 또는 체액의 세포군을 포함하며 상기 세포군은 성체줄기세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 전능성을 갖지 않는 포유동물 세포를 전능성 배아줄기세포(ESC)-유사 세포로 탈분화시키기 위한 배양 배지를 제공한다.
또한, 상기 배양 배지는 용어 “배양 시스템”으로 사용되어 서술될 수 있으며, 이 두 용어는 서로 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
상기 배양 배지 또는 배양 시스템은 상술된 ESC-유사 세포를 생산하기 위한 방법에 있어서 사용되기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위해서, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 포유동물 조직 또는 체액은 난소, 골수, 말초 혈액, 제대혈, 양수, 뇌, 혈관, 골격근, 피부 또는 위장관의 상피, 각막, 치아의 치수, 망막, 간, 비장 또는 췌장으로부터 유래된다. 보다 바람직하게는, 상기 포유동물 조직은 난소로부터 유래된다. 바람직하게는, 상기 세포군은 2이상의 세포 타입을 포함하는 이종 군이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 배지는 백혈병 억제 인자 3,000 units/㎖ 이상을 추가적으로 포함하고, 보다 바람직하게는, 상기 배지는 백혈병 억제 인자 4,000 units/㎖ 이상을 추가적으로 포함하며, 가장 바람직하게는, 상기 배지는 백혈병 억제 인자 4,000-6,000 units/㎖를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 포유동물 세포는 체세포이며, 보다 바람직하게는, 유사 분열적으로 불활성 체세포이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 백혈병 억제 인자 3,000 units/㎖ 이상을 포함하며 포유동물 조직 세포로부터 배아줄기세포(ESC)-유사 세포를 생산하기 위한 배양 배지를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 배지는 백혈병 억제 인자 4,000 units/㎖ 이상을 포함하고, 보다 바람직하게는, 상기 배지는 백혈병 억제 인자 4,000-6,000 units/㎖ 이상을 추가적으로 포함하며, 가장 바람직하게는, 상기 배지는 백혈병 억제 인자 5,000 units/㎖를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 포유동물 조직 세포는 사춘기 후의 포유동물로부터 수득한 세포이다.
바람직하게는, 상기 포유동물 조직 세포는 난소, 골수, 말초 혈액, 제대혈, 양수, 뇌, 혈관, 골격근, 피부 또는 위장관의 상피, 각막, 치아의 치수, 망막, 간, 비장 또는 췌장으로부터 유래된다. 가장 바람직하게는, 상기 포유동물 조직은 난소로부터 유래된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 포유동물 조직 세포는 체세포이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 배지는 유사 분열적으로 불활성인 피더층(feeded layer)과 같은 유사 분열적으로 불활성인 세포층을 추가적으로 포함한다.
상기 배양 배지 또는 시스템은 본 기술 분야에서 잘 알려진 포유동물 줄기세포를 수득하기 위하여 이용되는 보편적인 배지에 포함된 성분을 추가적으로 포함한다. 예를 들면, 상기 배지는 비유기 염(예를 들면, CaCl2, Fe(NO3)3, MgSO4, NaCl, NaHCO3 및 NaH2PO4), 에너지 원(예를 들면, 포도당), 완충액, 아미노산 및/또는 비타민(예를 들면, D-Ca Panothenate, 염화 콜린, 엽산, 니코틴아미드)을 추가적으로 포함하고, 바람직하게는 β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol), 비필수 아미노산, L-글루타민, 항체(바람직하게는, 페니실린 및 스트렙토마이신) 및/또는 FBS (fetal bovine serum)로 보충된다. 배지 조성은 DMEM, 녹-아웃 DMEM, 우태아 혈청이 포함된 DMEM, 혈청 대체물이 포함된 DMEM, Chatot, Ziomek 및 Bavister(CZB) 배지가 포함된 DMEM, 우태아혈청(FCS)이 포함된 Han’s F-10, TALP, PBS, Eagle's 및 Whitten's 배지와 같은 일반적인 배지에 포함된 조성에 따라 제조 될 수 있다.
본 발명은 전능성을 가지는 ESC-유사 세포가 미세환경(니치) 존재하에서 여러 타입의 세포 특히, 성체 체세포로부터 유래될 수 있다는 것을 증명한다. 다시 말하면, 상기 미세환경은 ESC-유사 세포을 생산하기 위한 신규한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 체세포 핵치환 및 생식세포 조작 없이 자가 ESC-유사 세포를 확립한 최초의 발명이다. 이러한 연구 방법은 생존하는 배아의 발달 능력을 가진 배란된 모든 난모 세포의 희생을 피할 수 있다.
본 발명은 SCNT를 하지 않고 인간 조직으로부터 전능성 세포를 확립하기 위한 새로운 방법을 제공한다. 면역-특이적 전능성 세포는 개개인의 어떠한 세포로부터 유래될 수 있기에, 이러한 특징은 세포/조직 치료에 있어 윤리 문제에 대하여 우회할 수 있는 장점이 된다.
도 1은 Oct-4 및 Nanog mRNA 발현의 검출을 위한 난소 조직의 접합 보인법(in situ hybriddization) 및 줄기세포, 생식 세포, 난포성 세포 및 중간엽 줄기세포에 각각의 Oct-4, Vasa, AMH, 및 CD44 마커에 대한 Oct-4-양성 난소 조직-분리된 세포의 이중 면역염색을 나타낸 이미지이다. (a) 8주령 성체 마우스(B6CBAF1; C57BL/6 x CBA/Ca)로부터 회수된 난소와 Oct-4- 및 Nanog-특이적 mRNA 프로브를 함께 접합보인법을 실시한 것이다. Oct-4 및 Nanog mRNA 발현은 혈관(OM)에 가까운 많은 난소 수질(medullae)에서 발견된다. 또한, 상이한 단계의 난소 난포 (OF)의 포막 세포 부위에서 mRNA 발현을 나타낸다. (CL)은 황체(corpus luteum)를 의미한다. Scale bar= 100 ㎛. (b) 상기 분리된 난소 조직 세포는 즉시 이중 면역염색을 실시하였다. 상기 Oct-4-양성적 세포를 항-Nanog, 항-Vasa 또는 항-CD44 항체로 동시에 면역염색이 되나, AMH 염색에 대해서는 양성을 나타내지 않는다(공촛점 현미경 이미지). Oct-4-양성인 위상차 이미지를 Nanog-, Vasa- 또는 CD44-양성 세포 및 AMH-양성이나 OCt-4에 음성인 세포에 부가한다. Scale bar= 10 ㎛.
도 2는 성체 난소 세포 및 배아 섬유아세포의 공동배양에 의해 유래된 배아 줄기 세포(ESC)-유사 세포의 형태학적 이미지이다. (a)는 E14 세포 주의 콜로니-형성하는 배아줄기세포이고, (b)는 초기 배양 7일째의 콜로니-형성하는 배아줄기세포이며, (c)는 10번 계대배양(배양 37일째) 후 및 (d) 50번 계대배양(배양 157일 째)후의 배아줄기세포이다. Scale bar= 50 ㎛.
도 3은 마이토마이신 C(mitomycin C)를 처리한(c, d) 또는 마이토마이신 C(mitomycin C)를 처리하지 않은 B6D2F1 (C57BL/6 x DBA2; a, c) 및 ICR (b, d) 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)를 항-Oct-4 (embryonic stem cell-specific), 항-Nanog (embryonic stem cell-specific), 항-Vasa (germ cell-specific), 항-Fragilis (germ cell-specific), 항-CD44 (mesenchymal stem cell-specific) 또는 항-AMH (follicular cell-specific)로 면역 염색을 한 이미지이다. 각 세포주의 MEFs는 내부 기관, 머리, 및 전체 말단을 제거한 후 13.5일 되는 태아로부터 수득하였다. 컨플루언트 단일 층(confluent monolayer)이 형성된 MEFs를 면역 염색 하였다. 컨플루언트 단일 층을 검출하였지만, 테스트한 어 떠한 마커에 대해서도 양성반응을 나타내지 않았다. Scale bar= 100 ㎛.
도 4는 분리된 난소 세포, 확립된 배아 줄기 세포(ESC)-유사 세포 및 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 핵형(karyotype)을 나타낸 것이다. 사이토비젼(Cytovision)을 사용하여 자연-건조된 염색체를 제조하였으며, 큰 군집 세포의 염색체 분석은 세포 분석기(flow cytometry)를 사용하였다. X 염색체-특이적 Xist 및 Y 염색체-특이적 Zfy1 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 추가적으로 실시하였다. 난소 조직(a, b) 및 MEF (g)으로부터 세포를 즉시 분리하였으며, 초기(6-9번 계대; c, d) 및 후기 (30번 계대; e, f) 계대로부터 콜로니-형성 세포(tScB6CD-SNU-l)를 수득하였다. 분리된 세포는 2배체 염색체를 가진 반면, 초기 및 후기 계대로부터 수득된 ESC-유사 세포는 4배체 염색체를 가졌다. (h)는 후기 계대 콜로니-형성 세포의 PCR 분석을 나타낸다. 1번 레인: X 및 Y 염색체를 가진 E14 세포; 2번 레인: ScB6CD-SNU-l; 3번 레인: ScB6CD-SNU-2 세포주; 4번 레인: ScBCD-SNU-3 세포주; 5번 레인: ScBCD-SNU-4 세포주; 6번 레인: ScBCD-SNU-5 세포주; 7번 레인: 확립된 ScBCD-SNU-6 세포주. 여섯 개의 모든 세포 주의 ESC-유사 세포는 X 염색체-특이적 Xist 유전자에서를 발현하였으나 Zfy1 유전자는 발현하지 않았다.
도 5a-5b는 Fl (B6D2F1; C57BL/6 x DBA2) 배아 섬유아세포 및 성체 Fl (B6CBAF1; C57BL/6 x CBA/Ca) 난소 세포의 공동배양으로부터 유래한 배아 줄기 세포(ESC)-유사 세포의 특징을 나타낸 것이다. 도 5a는 E14 ES 세포주와 유사한 ESC-유사 세포가 SSEA-I, Oct-4, 인테그린 α6, 인테그린 β1, 및 AP에 대하여 양성 반응을 나타낸 것이다. 그러나, E14 ES 세포 및 확립된 세포 모두 SSEA-3 및 SSEA-4에 대하여 음성을 나타내었다. Scale bar= 50 μm. 도 5b는 모든 타입의 세포들은 전능성인 세포-특이적 Oct-4, Nanog, Rex-1, Cripto, Dnmt3b, Tert, LIf Rc, Stat3, Bmp4, Foxd3, Sox2, CD9, 및 Gdf3 유전자를 발현한다. +는 분리된 모든 RNA를 이용한 역전사한 것이고, -는 분리된 모든 RNA를 이용한 역전사를 하지 않은 것이다.
도 6은 TRAP(telomeric repeat amplication protocol) 분석을 통하여 확립된 배아 줄기 세포(ESC)-유사 세포의 텔로머라제(Telomerase) 활성을 측정한 것이다. 6개의 세포 주를 실험하였다. PCR에 의해 중폭된 텔로머라제 산물의 래더(ladder)는 별표로 나타낸 부분에서 50개 뉴클레오타이드에서 시작하는 6개 염기의 증폭분으로 나타내었다. 모든 세포 주들은 높은 텔로머라제 활성을 나타낸다. 1번 레인: 양성 대조군(E14 배아 줄기 세포); 2번 레인: MEFs; 3번 레인: 주형의 추가없는 PCR 대조군; 4-9번 레인: tScB6CD-SNU-l, tScB6CD-SNU-2, tScB6CD-SNU-3, tScB6CD-SNU-4, tScB6CD-SNU-5 및 tScB6CD-SNU-6.
도 7은 중간엽 줄기세포-특이적 마커 (a) CD44와 (b) Sca-1, 상피 줄기세포-특이적 마커 (c) CD34와 (d) 조혈모 줄기세포-특이적 마커 CD45를 사용하는 FACS(fluorescence activated cell sorting) 분석에 의해 배아줄기세포-유사 세포를 특성화한 것이다. 적색은 대조군으로서 사용된 MSCs의 피크를 나타낸다. E14 ES 및 확립된 ESC-유사 세포는 항-CD44, 항-Sca-1, 항-CD34 및 항-CD45 항체에 대하여 모두 음성을 나타내었다.
도 8은 생식 세포-특이적 마커 Vasa 및 Fragilis과 난포 세포-특이적 마커 AMH를 사용하여 배아 줄기 세포(ESC)-유사 세포의 면역 염색을 나타낸 것이다. 확립된 모든 6개의 ESC-유사 세포주를 분석하였다. 상기 8번째 계대에서 회수한 콜로니-형성 세포는 Vasa (a), Fragilis (b), 및 AMH (c)에 대해서 양성을 나타내지 않았다. (a, b) Scale bar= 50 ㎛, (c) 100 ㎛ .
도 9a-9b는 Fl (B6D2F1; C57BL/6 x DBA2) 배아 섬유아세포 및 성체 Fl (B6CBAF1; C57BL/6 x CBA/Ca) 난소 세포의 공동배양으로부터 유래한 배아 줄기 세포(ESC)-유사 세포의 In vitro 분화를 나타낸 것이다. 배아체(EBs)로 분화시키는 백혈병 억제 인자(LIF)-부재 배지에서 ESC-유사 세포 콜로니를 배양하였다. 도 9a는 백혈병 억제 인자(LIF)-부재 배지에서 4일째 배양에서 관찰된 EBs를 나타낸 것이다. S-100 (b; 외배엽), 네스틴 (c; 외배엽), 평활근 액틴 (d; 중배엽), 데스민 (e; 중배엽), α-페토프로틴 (f; 내배엽), and 트로마-1 (g; 내배엽-특이적)의 특이적 마커를 사용하여 3배엽-특이적 분화를 검출하기 위하여 EBs의 면역세포화학법을 이용하였다. 도 9b는 줄기세포-특이적 또는 3배엽-특이적 유전자의 발현을 확인하기 위하여 (h) E14 ES 세포 또는 (i) ESC-유사 세포로부터 유래한 EBs의 실시간 PCR 분석한 것이다. 줄기세포-특이적 Oct-4 및 Nanog 유전자 또는 3배엽-특이적 Ncam(외배엽), 네스틴(외배엽), 평활근 액틴(중배엽), 데스민(중배엽), α-페토프로틴(내배엽) 및 트로마-1(내배엽) 유전자를 이용하여 배양 0일째(d0; ES 또는 ESC-유사 세포), 배양 7일째(d7; EBs), 배양 21일째(d21; EBs)에 실시간 PCR 분석을 하였다. EBs 근원과 상관없이, Oct-4와 Nanog 유전자 발현은 EB 배양 시간이 증가함에 따라 감소하였다. 이와 반대로, Ncam, 네스틴, 평활근 액틴, 데스 민, α-페토프로틴 및 트로마-1 유전자는 7일째의 ESC-유사 세포 또는 EB에서보다 21일째에 높게 나타났다. (h) E14 ES 세포 및 EBs 유래한 E14 ES 세포; (i) ESC-유사 세포 및 EBs 유래한 ESC-유사 세포. N/D는 검출되지 않은 것을 의미한다. Scale bar= 100 ㎛.
도 10은 NOD-SCID 마우스로 피하이식을 한 후 배아 줄기 세포(ESC)-유사 세포의 in vivo 분화를 나타낸 것이다. 테라토마(teratoma)는 (a) 외배엽, 신경상피 로제트 (scale bar= 100 ㎛), (b) 외배엽, 케라틴화층이 형성된 편평 상피 세포 (scale bar= 100 ㎛), (c) 중배엽, 골질 분화를 나타내는 골섬(osteoid islands) (scale bar=100 ㎛), (d) 중배엽 근육 (scale bar= 50 ㎛), (e) 내배엽, 췌장 조직 (scale bar= 50 ㎛), 및 (f) 중배엽, 섬모원주 상피세포 (화살표) (scale bar= 50 ㎛)를 포함한다. 도 10은 ScB6CD-SNU-1의 이식으로부터 발생된 테라토마 이미지이다.
도 11은 Fl (B6D2F1; C57BL/6 x DBA2) 배아 섬유아세포 및 ICR 세포주의 8개-세포 배아가 있는 성체 Fl (B6CBAF1; C57BL/6 x CBA/Ca) 난소 세포로부터 유래한 배아 줄기 세포(ESC)-유사 세포의 응집에 의한 체세포 키메라(chimera)을 나타낸 것이다. ESC-유사 세포(10 내지 15개의 세포들)는 8개-세포 배아와 응집되었으며 응집된 배아로부터 유래한 낭포는 대리모의 자궁각(uterine horn)으로 트랜스퍼되었다. 다른 종류의 피부와 색을 가지는 자손은 체세포 키메라(somatic chimera)로 결정 된다. 별표와 화살표는 각각 대리모와 10일 된 키메릭(chimeric) 자손을 의미한다.
도 12는 확립된 배아 줄기 세포(ESC)-유사 세포, in vivo-분화된 테라토마, 및 분화 후 7, 14 및 21일째의 배아체(EBs)에 대한 염색체 분석을 나타낸 것이다. ScB6CD-SNU-l 세포주의 확립된 ESC-유사 세포 염색체 분석을 위하여 FACS 분석을 이용하였으며, (a)는 후기 계대(30 계대)로부터 획득한 ESC-유사 세포이고, (b)는 SCID 마우스로 이식한 후 8주에서 회수한 테라토마이며, (c)는 백혈병 억제 인자-부재 배지에서 배양 7일째의 EBs이고, (d)는 백혈병 억제 인자-부재 배지에서 배양 14일째의 EBs이며, (e)는 백혈병 억제 인자-부재 배지에서 배양 7일째의 EBs이다. ESC-유사 세포는 4배체성인 반면, 테라토마에서는 4배체성 세포는 존재하지 않는다. 2배체성 세포 수는 in vitro 자발적인 분화에 의해 21일까지 증가한다.
도 13은 난소 니치(ovarian niche)에 의한 성체 줄기 세포를 포함하는 ESC-유사 세포 제2체세포군 제조 과정의 실시예를 대략적으로 나타낸 것이다.
도 14는 성체 줄기 세포를 포함하는 ESC-유사 세포 제1세포군 제조 과정의 실시예를 대략적으로 나타낸 것이다.
도 15a-15b는 성체 마우스의 다양한 조직에서 다능성에 관련된 유전자의 발현을 나타낸 것이다. 도 15a는 8주령 된 암컷 마우스로부터 회수한 뇌, 심장, 폐, 간, 위, 신장, 난소, 소장, 피부 및 비장에서 Oct-4, Nanog, Rex-1 및 Cripto 유전자의 발현을 나타낸 것이다. Oct-4 발현은 난소, 소장, 및 비장에서 검출되었으나, Nanog 유전자는 모든 조직에서 발현되었다. 위 및 피부를 제외한 대부분의 기관은 Cripto 유전자를 발현하였다. 도 15b는 8주령 된 암컷 마우스로부터 회수한 각각의 난소에서 Oct-4, Nanog, Rex-1, Cripto, Dnmt3b, Tert, 및 Lif Rc 유전자의 발현을 나타낸 것이다. 대조군 세포로 E14 배아 줄기세포를 사용하였다. 테스트한 모든 유전자들은 E14 ESCs에서 발현되었다. +는 분리된 전체 RNA를 이용하여 역전사한 것을 의미하고; -는 분리된 전체 RNA를 이용하여 역전사시키지 않은 것을 의미한다.
도 16은 다른 동물로부터 회수된 마우스 난소에서의 전능성-특이적 유전자 발현량을 나타낸 것이다. 다른 마우스에서 회수된 난소에서의 (a) Oct-4, (b) Nanog, (c) Rex-1, (d) Cripto, (e) Tert, (f) Lif Rc 및 (g) Dnmt3b 유전자의 발현 수준을 실시간 PCR로 측정하였다. E14 배아 줄기 세포는 양성 대조군 세포로 이용하였다. 유전자 발현의 다른 수준은 시험된 난소 사이에서 검출되었다. N/D는 검출되지 않은 것을 의미한다.
도 17은 (a) 비장, (b) 소장 및 (c) 난소로부터 분리한 세포를 줄기 세포-특이적 Oct-4 및 Nanog로 면역 염색한 결과를 나타낸 것이다. 효소를 처리하여 각각의 기관 세포들은 분리한 다음에 분리된 1 x 103 세포를 항-Oct-4 (녹색 형광) 또는 항-Nanog (적색 형광) 항체를 사용하여 염색하였다. 공초점 현미경 이미지는 비장 및 소장 세포에서 Oct-4-양성반응을 보이는 세포가 있었으나, Nanog-양성 반응을 보이는 세포는 확인되지 않았다는 것을 보여준다. 난소 세포는 Oct-4 및 Nanog 모두에 양성으로 염색되었다. 위상차 이미지는 Oct-4- 및 Nanog-에 양성 반응을 보이는 세포(화살표)가 몇 가지 유형의 세포들과 혼합되었다는 것을 나타낸다. Scale bar= 20 ㎛.
도 18은 마우스의 성체 난소 세포 및 배아 섬유아세포의 공동배양에서 유래한 콜로니-형성 세포의 형태를 나타낸 것이며, a는 E14 배아 줄기 세포이고, b는 초기 배양 7일째에서의 콜로니-형성 세포를 나타낸 것이다. c는 10번의 계대배양(c: 배양 37일)을 한 후의 콜로니-형성 세포를 의미하고, d는 20번의 계대배양(d: 배양 76일)을 한 후의 콜로니-형성 세포를 의미한다. Scale bar= 50 ㎛.
도 19는 Oct-4 및 Nanog mRNA 발현과 줄기 세포-특이적 Nanog, 생식 세포-특이적 Vasa, 난포 세포-특이적 AMH (anti-mullerian hormone) 또는 Oct-4와 동시에 중간엽 세포-특이적 CD44에 양성을 나타내는 분리된 난소 조직 세포의 이중 면역염색 검출을 위한 성체 난소 조직의 접합보인법(in situ hybridization)을 나타낸 것이다. (a)는 접합보인법 후에 난소 조직의 이미지를 나타낸 것이다. Oct-4- 및 Nanog-특이적 mRNA 프로브를 사용하는 혼성화에 8주령 Fl 혼성 마우스로부터 회수된 난소를 이용된다. Oct-4 및 Nanog mRNA는 난소 수질(OM)에서 발현하는 반면, 다양한 크기의 난소 난포(OF)는 말초(theca cell) 부분에서 mRNA가 발현된다. (CL)은 corpus luteum을 의미한다. Scale bar = 100 ㎛. (b)는 난소 세포를 분리한 후 즉시 이중-면역 염색한 이미지이다. Nanog-, Vasa- 또는 CD44-양성 반응을 보이는 세포들은 항-Oct-4 항체에 대하여 모두 면역 염색되었으나, AMH-양성 반응을 보이는 세포들은 Oct-4에 대하여 양성반응을 나타내지 않았다. Nanog-, Vasa-, CD44- 또는 AMH-양성 반응을 보이는 세포(화살표)의 위상차 이미지에서 Vasa-양성 반응을 보이는 세포가 다른 세포들보다 작게 나타났다. Scale bar= 10 ㎛.
도 20은 마우스 성인 난소 세포 및 배아 섬유아세포의 공동배양에서 유래한 콜로니-형성 세포의 특징을 나타낸 것이다. a는 배아 줄기 세포(ESC)-특이적 마커를 사용한 것이다. 단계-특이적 배아 항원(SSEA)-1, SSEA-3, 및 SSEA-4, 및 Oct-4, 인테그린 α6, 및 인테그린 β1, 뿐만 아니라 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)에 대한 항체를 사용하였으며, E14 ESC 세포주를 양성 대조군으로 사용하였다. E14 ESCs와 유사하게, 콜로니-형성 세포들은 SSEA-1, Oct-4, 인테그린 α6, 인테그린 β1, 및 AP에 대하여 양성 반응을 나타내었다. 그러나, E14 ESCs 및 확립된 세포들 모두 SSEA-3 및 SSEA-4에 대하여 음성 반응을 나타내었다. Scale bar = 50 ㎛. b는 E14 ESCs 및 상기 콜로니-형성 세포들의 전능성 세포-특이적 유전자 발현을 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR)으로 확인한 것이며, 유사한 유전자 발현이 확인되었다. 확립된 세포주 모두에 대해 특성을 기술하였지만, OSC-B6D2-SNU-1의 이미지를 대표적으로 기술하였다.
도 21은 TRAP(telomeric repeat amplification protocol)분석을 통하여 콜로니-형성 세포의 텔로머라제 활성을 나타낸 것이다. 두 개의 세포주를 측정하였다. PCR에 의해 증폭된 텔로머라제 산물의 래더는 별표로 표시된 부분에서 50 뉴클레오티드를 시작으로 6개의 염기 증가분로 나타내었다. 모든 세포주는 높은 수준의 텔로머라제 활성을 나타낸다. 1 레인은 양성 대조군(E14 배아 줄기 세포); 2 레인은 MEFs; 3-4 레인은 각각 OSC-B6D2-SNU-1 및 OSC-B6D2-SNU-2의 콜로니-형성 세포; 레인 5는 주형이 없는 PCR 대조군을 각각 나타낸다.
도 22는 확립된 콜로니-형성 세포의 핵형 분석 및 성별을 나타낸 것이다. (a) 확립된 콜로니-형성 세포에서 자연 건조된 염색체의 G-밴딩에 대하여 핵형 분석을 하였으며, (b) 2배체를 가지는 세포군은 유세포 분석(flow cytometry)를 이용하여 평가하였다. a 및 b에서, OSC-B6D2-SNU-1 이미지를 대표적으로 나타내었다. (c) X 염색체-특이적 Xist 및 Y 염색체-특이적 Zfy1 프라이머(1 레인: XX를 가진 테일 세포(tail cells), 2 레인, XY를 가진 신생아 피부 섬유아세포; 3 레인, OSC-B6D2-SNU-1; 4 레인, OSC-B6D2-SNU-2; 5 레인 정소세포)를 이용하여 PCR 분석을 추가적으로 실시하였다. 확립된 세포주 모두에서 이배체를 확인하였으며 두 개의 세포주 모두 X 염색체-특이적 Xist 유전자가 발현되었지만, Zfy1 유전자는 발현되지 않았다.
도 23은 중간엽 줄기세포(MSC)-특이적 마커 (a) CD44 및 (b) Sca-1, 상피 줄기 세포-특이적 마커 (c) CD34 그리고 (d)조혈모 세포-특이적 마커 CD45를 이용하여 FACS(fluorescence activated cell sorting)를 통하여 콜로니-형성 세포의 특징을 나타낸 것이다. MSCs의 피크를 나타내는 녹색은 대조군으로 사용하였다. E14 배아 줄기 세포 및 콜로니-형성 세포는 항-CD44, 항-Sca-1, 항-CD34 및 항-CD45 항체에 대해 모두 음성 반응을 나타내었다.
도 24는 생식 세포-특이적 마커 Vasa 및 Fragilis와 난포 세포-특이적 마커 AMH를 사용하여 콜로니-형성 세포의 면역 염색 결과를 나타낸 것이다. 두 개의 콜로니-형성 세포주를 염색하였고, 씨딩(seeding) 전의 난소 세포와 E14 배아 줄기 세포(ESCs)는 대조군으로서 제공되었다. 난소 세포에서는 (a) Vasa, (b) Fragilis 또는 (c) AMH 염색에 대하여 양성 반응을 보이는 반면, 20번째 계대배양 에서 회수된 콜로니-형성 세포 및 E14 ESCs는 음성 반응을 나타내었다. Scale bar= 50 ㎛.
도 25는 in vitro 및 in vivo 에서 콜로니-형성 세포의 자발적인 분화를 나타낸 것이다. a는 백혈병 저해 인자 부재-배양 배지에서 콜로니-형성 세포가 배아체로의 in vitro 분화하는 배양 4일째에 관찰한 것이다. 3배엽-특이적 분화를 확인하기 위하여 (a2) S-IOO(외배엽), (a3) 네스틴(외배엽), (a4) 평활근세포 액틴(중배엽), (a5) 데스민(중배엽), (a6) α-페토프로틴(내배엽), 및 (a7) 트로마-1 (내배엽-특이적)과 같은 특이적인 마커를 이용하여 EBs의 면역세포화학법을 실시하였다. Scale bar= 100 ㎛. b는 NOD-SCID 마우스의 피하 이식을 통해 콜로니-형성 세포의 in vivo 분화를 나타낸 것이다. 테라토마는 (bl) 내배엽, 샘 상피-배상 세포 유사(glandular epithelium-Goblet cell like (화살표 머리부분)), (b2) 내배엽, 외분비선의 췌장, (b3) 외배엽, 성층된 편평상피세포(화살표), (b4) 외배엽, 신경상피세포 로제트(rossettes), (b5) 중배엽, 골격근 다발(bundles), 및 (b6) 중배엽, 골조직(화살표)을 포함한다. Scale bar= 50 ㎛. 모든 세포주에 대해서 특성을 기술하였지만, OSC-B6D2-SNU-1의 이미지를 대표적으로 표현하였다.
도 26은 마우스 성체 난소 세포 및 배아 섬유아세포의 공동배양으로부터 유래한 콜로니-형성 세포의 신경 세포 분화를 나타낸 것이다. 피브로넥틴에 리플레이팅(replating)한 후 (a) 네스틴-양성 및 (b) Tujl-양성 반응을 보이는 뉴런은 14일째에 발생하였다. (c) O4-양성 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)는 8일째에 발생하였고 (d) GFAP-양성 성상세포는 리플레이팅 후 15일째에 발생하였다. (e)- (h)는 변형된 N2B27 배지에서 콜로니-형성 세포가 네스틴-양성 뉴런, O4-양성 희소돌기아교세포 및 GFAP-양성 성상세포로 분화되는 각각의 위상차이미지이다. 확립된 세포주 모두 신경 세포로의 분화에 제공되었지만, OSC-B6D2-SNU-1 이미지를 대표적으로 표현하였다(Scale bar= 10 ㎛).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Ⅰ. 섬유아세포로부터 유래한 ESC-유사 세포
재료 및 방법
실험동물
본 실험에 제공된 동물은 대한민국 서울대학교 배아학 및 줄기 세포 생물학 실험실에서 빛(14L:10D), 온도(20-22℃), 습도(40-60%)로 조건으로 사육하였다. C57BL/6 암컷 마우스와 CBA/Ca 수컷 마우스를 교미시켜 F1 혼성 암컷 마우스(B6CBAF1)를 생산하였으며 8주령 암컷 마우스를 난자 기증자로 이용하였다. 초기 배양 및 계대 배양을 위한 MEFs의 기원으로 DBA2 수컷 마우스 또는 비 근친교배 마우스(ICR)와 교미시킨 후 13.5일이 되는 시점에서 임신한 C57BL/6 암컷을 안락사 시켰다. 동물 관리, 사육 및 수술에 있어서 모든 과정은 서울대학교의 표준수술 프로토콜을 따랐으며, 서울대학교 실험동물자원 심사위원회는 동물 이용 및 관련 실험과정(승인번호 SNU-050331-2)을 승인하였다. 실험 시료를 적합하게 관리되었으며, 실험 설비 및 장치의 품질 관리를 유지 하였다.
접합보인법(In situ hybridizaton)
접합 보인법 검출 시스템 키트(DF132-60K; BioGenex, San Ramon, 미국) 및 프로브(Biognostik, Gottingen, 독일)를 제공된 프로토콜에 따라 사용하였으며, 배경 신호를 최소화하여 최적화 하였다. 모아진 난소 조직을 냉각포매제(Tissue-Tek OCT compound; Sakura, Torrance, 미국)에 넣고 액화 질소에서 냉동시켰다. 냉동-시료는 10 ㎛ 두께로 절단하고 4% (v/v) 포름알데히드(Sigma-Aldrich, 미국)가 포함된 PBS(Phosphate-buffered saline)에 실온에서 5분간 고정시켰다. 슬라이드를 에탄올 연속적인 농도(70%, 80%, 90%, 95% 및 100%)에서 탈수시킨다. 자연 건조된 시료를 30℃에서 3시간동안 하이브리버퍼-ISH(hybribuffer-ISH)로 전처리 하였다. 혼성화는 Oct-4 및 Nanog 하이브리프로브(hybriprobe)를 포함하는 하이브리버퍼-ISH에서 40℃로 하룻밤 반응시켰다. 슬라이드는 1 x 염화나트륨/구연산나트륨 액(sodium chloride/sodium citrate solution: SSC), 45℃에서 15분간 0.1 x SSC 및 실온에서 3분간 0.1% Tween-20(USB, 클리브랜드, 미국)이 보충된 1 x PBS로 실온에서 5분간 세척하였다. 슬라이드를 실온에서 10분간 파워 블록 리에이젼트(Power Block Reagent)에서 반응시키고 바이오틴화된 항-플루오레세인 항체 로 실온에서 40분 동안 반응시켰다. 0.1% (v/v) Tween-20가 첨가된 1 x PBS로 세척한 후 실온에서 20분 동안 스트렙타비딘-알카라인 포스파타아제 컨쥬게이트에서 인큐베이션을 시키고, 0.1% (v/v) Tween-20가 첨가된 1 x PBS로 세척하였다. 실온에서 1분 동안 활성 완충액으로 반응시켜 알카라인 포스파타아제를 활성화시켰다. 슬라이드를 실온에서 15분간 NBT/BCIP로 발색시키고 커버를 덮은 후 위상차 현미경(BX51TF; Olympus)으로 관찰하였다.
MEFs의 제조
임신한 암컷 마우스의 13.5-dpc 태아(초기 배양을 위한 B6D2F1과 계대배양을 위한 ICR)로부터 배아 섬유아세포를 모았다. 태아의 창자 기관, 머리 및 팔다리를 제거하였고 남은 조직을 작은 조각으로 절단하였다. 조직 조각을 0.04% (v/v) 트립신-EDTA (Invitrogen, 미국)6분 동안 교반하면서 반응시키고, 2분 동안 50 x g에서 원심분리 하였다. 상청액을 10% (v/v) FBS-함유 DMEM 배지(Invitrogen, 미국)로 희석하고 4분 동안 100 x g에서 원심분리 하였다. 수거된 섬유아세포의 펠렛을 부유시키고 단일층 형성을 위하여 DMEM 배지로 교환하였다. 섬유아세포가 컨플루언트 단일층(confluent monolayer)이 형성되었을 때, 10% 디메틸술폭시드dimethylsulfoxide; Invitrogen, 미국)에 냉동시켰다.
난소 세포 제조
난소를 수집하고, 접착성 조직을 제거한 후, 회수된 조직을 수술용 메스를 사용하여 절단하였다. 0.25% (v/w) 트립신-EDTA (Invitrogen, 미국)과 750 U/㎖ 콜라게나아제 타입 I(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 미국) 및 0.03% (v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum: FBS; HyClone)이 첨가된 DMEM (Gibco Invitrogen)이 50:50 (v:v)혼합액으로 구성된 해리 배지에서 절단된 샘플을 37℃에서 초기 30분 동안 배양하였다. 분리된 세포를 40-㎛ 세포 여과기(BD Falcon, 미국)에 여과시켰으며 4분 동안 390 x g에서 원심분리 하였다. 그 다음 60 ㎜ x 10 ㎜ 배양 디쉬에 씨딩(sseding)하였다. 분리된 세포에 혼합되어 있는 기질세포를 처음 씨딩을 한 후 30분간 제거하였으며 바닥 기질세포에 존재하는 부력성 세포(buoyant cell)를 디쉬에 있는 MEF 단일층에 재씨딩하였다. 몇 번을 반복하여 여과된 세포들을 기질 세포가 없는 MEF 단일층에 직접 씨딩하였다. DMEM 배지에는 0.1 mM β-머캅토에탄올(Invitrogen, 미국), 1% (v/v) 비필수 아미노산(Invitrogen, 미국), 2 mM L-글루타민(Sigma-Aldrich, 미국), 페니실린과 스트렙토마이신의 동결 건조된 1% (v/v) 혼합액 (Gibco Invitrogen), 5,000 U/㎖ 마우스 LIF (Chemicon, Temecula, 미국) 및 15% (v/v) FBS (HyClone)을 첨가시켰다.
ESCs를 확립하기 위한 MEFs 및 난소 세포의 공동배양
Fl 혼성(B6D2F1; C57BL/6 x DBA2) MEF 단일층을 젤라틴이 코팅되어 있는 35-mm 조직 배양 접시에서 3시간 동안 10 ㎍/㎖의 마이토마이신 C(Chemicon, Temecula, 미국)로 처리하였으며 그 후에 콜로니-형성 세포를 확립하기 위해 사용하였다. 제조된 난소 세포를 MEF 단일층이 포함된 접시에 접종하고 습한 공기에 서 5% CO2, 37℃ 조건하에서 배양하였다. 배양 4일째에 배아 섬유아세포 및 난소 세포를 혼합한 군이 컨플루언시에 도달하였때 배양 배지를 포함하는 60-mm 조직 배양 접시에서 새로운 단일층에 재플레이팅하였다. 초기 배양에서 LIF 1,000-5,000 U/㎖의 농도를 배양 배지에 첨가하였으며 계대배양을 위하여 LIF 2,000 U/㎖의 농도를 고정시켰다. 초기 배양 후미에(배양 7일째), 콜로니-형성 세포를 모세관 파이펫으로 제거하였으며, 0.25% (v/w) 트립신-EDTA(Invitrogen, 미국)을 이용하여 분리하였고, ICR MEF 단일층과 함께 계대배양 하였다. 계대는 3일 간격으로 LIF 2,000 U/㎖에서 하였으며 배지는 매일 교환하였다.
ESC-유사 세포의 마커 염색
줄기 세포-특이적 마커를 이용하는 특성화에 있어서, 20번째 계대에서 모아진 콜로니-형성 세포는 상온에서 10분 동안 4% (v/v) 포름알데히드(Sigma-Aldrich, 미국)에서 고정시켰다. 알카라인-포스파타아제에 대한 콜로니-형성 세포의 반응성은 Fast Red TR/나프톨 AS-MX 포스테이트(Sigma-Aldrich, 미국)으로 측정하였다. 단계-특이적인 배아 항원 (SSEA)-1 (MC-480), SSEA-3 (MC-631), SSEA-4 (MC-813-70), 인테그린 α6 (P2C62C4) 및 인테그린 β1 (MH-25)에 대한 단일클론항체는 발생 연구 하이브리도마 은행(Developmental Studies Hybridoma Bank (Iowa City, IA))에서 공급받았다. Oct-4 항체는 BD 바이오사이어스사(San Jose, 미국)에서 구입하였다. Alexa Fluor 488-콘쥬게이티드 항-마우스 항체(Molecular Probes, 미국), the Alexa Fluor 568-콘쥬게이티드 항-마우스 항체 (Molecular Probes, 미 국), 및 타코사이토메이션 키트(DakoCytomation, 미국)를 사용하여 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Oct-4, 인테그린 α6, 및 인테그린 β1을 검출하였다.
In Vitro 및 In Vivo 분화
In vitro 자발적 분화를 확인하기 위해, 콜로니-형성 세포에 0.04% (v/v) 트립신-EDTA을 사용하여 처리하였고, 그 다음 상기 분리된 세포들을 15% (v/v) FBS (HyClone)가 첨가된 LIF-부재 DMEM (Invitrogen, 미국)가 포함되어 있는 100-㎜ 플라스틱 패트리 디쉬에 옮겼다. EBs를 96-웰 배양 플레이트에 분리하여 씨딩하였으며 7일 동안 배양하였다. 3배엽에 대하여 다음과 같은 특이적 마커를 사용하여 EBs를 염색하였다:　외배엽 세포: 네스틴(nestin; Santa Cruz Biotechnology, 미국)과 S-IOO (Biodesign International; 미국); 중배엽 세포: 근육 액틴(muscle actin; Biodesign International, 미국)과 데스민(desmin; Santa Cruz Biotechnology, 미국); 및 내배엽 세포: α-페토프로틴(α-fetoprotein; Biodesign International, 미국) 트로마-1(Troma-1; Hybridoma Bank, 미국). 다코싸이토메이션 키트(DakoCytomation)를 이용하여 항체를 측정하였다.
In vivo 분화를 확인하기 위하여, 20번째 계대에서 회수한 1 x 107 개의 콜로니-형성 세포를 성체 NOD-SCID 마우스의 피하로 주입되었다. 이식 후 8주째에 마우스 피하 부위에 형성된 테라토마를 수거하여 4% (v/v) 파라포름알데히드를 이용하여 고정시켰다. 파라핀 블록(paraffin block)에 넣은 후, 조직을 위상차 현 미경(BX51TF; Olympus, Kogaku, 일본)하에서 실험을 위하여 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)을 사용하여 염색하였다.
신경 세포로 분화 유도
신경계 세포로 in vitro 분화를 위해여, 콜로니-형성 세포들을 분리하여, N2 (Invitrogen, 미국) 및 B27 (Gibco Invitrogen, 미국)가 첨가된 DMEM/F12 (Invitrogen, 미국)로 구성된 변형 N2B27 배지에 0.5-1.5 x 104/cm2의 밀도로 0.1% 젤라틴-코팅된 플라스틱 배양 접시위에 깔았다. 배양 기간 내내 형태를 관찰하였으며 배양 배지는 2일 간격으로 교체하였다. 피브로넥틴-코팅된 조직 배양 접시에 다시 리플레이팅하여 분화된 세포를 유지하였다. 그 다음 면역화학적 분석을 하였다. 분화된 세포를 5분 동안 4% (v/w) 파라포름알데히드로 고정시켰으며, 블로킹 솔루션(blocking solution; 5% FBS가 첨가된 PBS)에서 배양하고. 그리고 고정된 세포를 네스틴(Santa Cruz Biotechnology, 미국), β-튜블린 타입 Ⅲ(Chemicon, 미국), 04(Chemicon, 미국), 및 아교섬유산성단백질(glial fibrillary acidic protein: GFAP; Chemicon, 미국)에 대한 1차 항체로 반응시켰다. 항원-항체 결합체는 형광 2차 항체인 Alexa Fluor 488-콘쥬게이티드 항-염소(Molecular Probes, 미국), Alexa Fluor 568-콘쥬게이티드 항-마우스(Molecular Probes, 미국) 및 Alexa Fluor 488-콘쥬게이티드 항-마우스(Molecular Probes, 미국)와 반응시킨 후 관찰하였다. 염색된 세포를 488 nm 또는 568 nm에서 크립톤-아르곤(krypton- argon) 혼합 가스 레이저 여기(excitation)을 이용하는 레이저 스캐닝 공초점 현미경과 플루오레세인 필터 (Bio-Rad, Hemel Hempstead, 영국)를 이용하여 관찰하였다.
프라이머 디자인
본 실험에 사용된 모든 특이적인 프라이머는 프라이머리3 소프트웨어(Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research)를 이용하여 디자인하였다. 모든 PCR 프라이머들은 GenBank로부터 얻은 마무스 cDNA 및 유전적 DNA 서열에 기초하여 디자인되었다. 디자인한 프라이머는 95°C, 30초, 45초 어닐링 온도(표 1), 및 72°C 30초로 40회를 PCR 사이클로 하여 테스트하였다. 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.
Figure 112009015888070-pct00001
RT=역전사효소 중합효소연쇄반응, R-T=실시간 중합효소연쇄반응, gDNA=유전체 DNA 중합효소연쇄반응.
실시간 PCR 분석 (Real-time PCR analysis)
7, 14, 21, 28, 35, 및 42 일에 수거한 EBs의 전체 RNA을 제조사의 실험방법에 따라 RNeasy Plus Mini 키트(Qiagen, Valencia, CA, 미국)를 이용하여 추출하였다. 역전사 시스템(Promega, Madison, WI, 미국)을 이용하여 전체 RNA 중 약 1 ㎍으로부터 cDNA를 합성하였다. 그 다음, DyNAmo HS SYBRGreen qPCR 키트(Finnzymes, Espoo, 필란드)를 이용하여 EBs에서 특이적인 유전자의 발현 수준을 실시간 PCR로 정량하였다. ABI PRISM 7700 시퀀스 검출 시스템(Applied Biosystems, Foster, 미국)으로 최종 볼륨을 25 ㎕로 하여 PCR 증폭을 실시하였으며, 싸이클링 조건은 50℃ 2분, 95℃ 15분을 한 다음 95℃ 15초, 60℃ 30초, 72℃ 30초를 40회로 하였다. PCR 특이도를 체크하기 위해 해리 곡선을 기록하였다.
각 프라이머의 최적의 농도를 300 nM으로 하였으며, 분자 간 및/또는 분자 내부에 중복 형성의 부존재를 주형을 첨가하지 않은 대조군의 실시간 PCR 반응에서 확인하였다.
각 시료에서 각각의 유전자의 mRNA 수준을 β액틴으로 일치시켰다. 상대적인 mRNA 수준을 2-ΔΔCt로 나타냈으며, CT=목표 증폭에 대한 출발점 싸이클인 경우, ΔCt=Ct목표 유전자(3배엽 세포에 대한 특이적인 유전자)-Ct내부대조(internal reference)(β액틴), 그리고 ΔΔCt=Ct시료(0, 21. 또는 33일 동안 배양된 EBs)-ΔCt칼리브레이터(calibrator)(7일 동안 배양된 EBs).
유전체 DNA-PCR 분석의 의한 성별 결정
G-스핀 지노믹 DNA 추출 키트(iNtRON Biotechnology, 대한민국)를 이용하여 각각 확립된 줄기세포로부터 모든 유전체 DNA를 추출하였다. 추출된 유전체 DNA를 Zfy1 (Y 염색체-특이적)과 Xist (X 염색체-특이적)에 대한 프라이로 PCR을 실시하였다. PCT 산물을 2.1% 아가로스젤 전기영동으로 크기를 분류하고 EtBr(ethidium bromide)을 첨가하여 노출시켰다.
FACS에 의한 핵형 분석 및 DNA 성분 분석
핵형 분석을 위하여 5% CO2, 37℃에서 3시간 동안 0.1 ㎍/㎖ 콜세미드(colcemid; Sigma-Aldrich, 미국)가 포함된 배지에서 세포를 배양한다. 처리된 세포를 트립신화하였으며, 75℃에서 0.075 M KCl(Sigma-Aldrich, 미국)로 15분간 재부유시켰다. 그 다음, 저장액에 넣은 다음 3:1 메탄올과 아세트산 혼합액에 고정시켰다. 염색체를 열처리된 슬라이드에 깔고 김자액(Giemsa; Invitrogen, 미국)으로 염색하였다. 그 다음, 염색체를 시토비젼(Cytovision; Applied Imaging Co., ,미국)을 사용하여 분류하였다. DNA 성분을 측정하는 FACS 분석을 위하여, 수거된 세포를 Ca2+- and Mg2+-부재 Dulbecco’s PBS(DPBS; Gibco Invitrogen, 미국)에 세척하고 4℃에서 1시간 동안 70% (v/v) 에탄올(Sigma-Aldrich, 미국)에 부유시켰다. 세포를 4분 도안 390 g에서 원심분리 하였고 0.1 ㎎/㎖ 리보뉴클레아제(Sigma-Aldrich, 미국) 및 0.1 ㎎/㎖ 프로피디움 요오다이드(propidium iodide; Sigma-Aldrich, 미국)가 포함된 Ca2+- and Mg2+-부재 DPBS 0.5 ㎖에서 재부유 시켰다. 암실 실온에서 30분 후에, 두 개의 수냉식 레이져가 장착된 Becton Dickinson FACS-Vantage SE(Becton Dickinson, 미국)를 이용하여 세포 부유물을 분석하였다. 세포 Questver. 3.3 소프트웨어(Becton Dickinson)를 이용하여 데이터를 분석하였다.
텔로머라아제 활성 분석
TRAPEZE 텔로머라아제 검출 키트(Chemicon)을 이용하여 텔로머라아제 활성을 분석하였다. 20번째 계대에서 6 개의 확립된 세포주를 분석하였으며 PCR 증폭을 27 사이클로 실시하였다. 불포화 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동에 의하여 PCR 산물을 분리하였다.
키메라 형성
보다 큰 규모인 전능성을 확인하기 위하여, 다른 계대(7-13 또는 32-39) 수로 유지된 10-15 콜로니-형성 세포가 8-세포 배아와 응집되었으며, 응집 후 20시간에 응집된 배아로부터 유래한 배반포를 슈도-프레그넌트(pseudo-pregnant) ICR 암컷 자궁(S. A. Wood, N. D. Allen, J. Rossant, A. Auerbach, A. Nagy, Nature 365, 87 (1993))에 트랜스퍼하였다.
DNA 미세위성 분석(DNA microsatellite analysis)
E14 ES 세포, B6D2F1 MEFs, B6CBAF1 꼬리, 새롭게 확립한 ESC-유사 세포 및 ESC-유사 세포로부터 유도된 테라토마의 유전체 DNA 시료에 대하여 DNA 미세위성 분석을 실시하였다. 3개의 특이적 마우스 미세위성 프라이머(D03Mit200, D11Mit4, 및 D15Mit159)가 사용되었다(http://www.cidr.jhmi.edu/mouse/mmset.html). 각 시료의 유전체 DNA를 세 개의 미세위성 위치에 대하여 PCR로 증폭시켰다. 5’-말단에 형광 물질(FAM, TET, 또는 HEX)과 함께 정방향 프라이머를 합성하였으며, PC808 프로그램 TEMP 콘트롤 시스템(ASTEC)으로 형광 PCR 증폭을 실시하였다. 그 다음, ABI 프리즘 310 DNA 오토메이티드 시퀀서(ABI Prism 310 DNA automated sequencer; Applied Biosystems, 미국)로 PCR 산물을 분석하였다. 디지털 이미지는 Genescan 데이터 콜렉션 ver. 2.5 소프트웨어(Applied Biosystems)를 이용하여 얻었다. 염기쌍 크기, 피크 높이 및 피크 부위에 대하여 각각의 형광 피크로 나타내었다.
ESC-like 세포, MEFs, 및 유사분열적으로 불활성인 MEFs의 면역염색
마이토마이신 처리 또는 없이 콜로니-형서 ES 세포 및 MEF를 실온에서 10분 동안 4% (v/v) 포름알데이히드에 고정시켰다. 고정된 ESC-유사 세포를 Vasa (Abcam, 영국), Fragilis (Abcam, 영국) 및 AMH (Abcam, 영국)에 대한 항체에 노출시켰다. Alexa Fluor 488-콘쥬게이티드 항-토끼 항체(Molecular Probes)와 DakoCytomation키트를 이용하여 Vasa, Fragilis 및 AMH를 검출하였다. 또한, 고정된 MEFs와 유사분열적으로 불활성인 MEFs를 Oct-4 (BD Biosciences), Nanog (Abcam), Vasa (Abcam), Fragilis (Abcam), CD44 (Chemicon), CD45 (Chemicon) 및 AMH (Abcam) 항체에 노출시켰다. DakoCytomation 키트를 사용하여 항체를 검출하였다.
난소 조직-분리 세포와 ESC-유사 세포의 면역형광염색
분리된 난소 세포를 4℃에서 1시간 동안 70% 에탄올에서 고정시켰다. 고정된 세포를 4분 동안 390 g 에서 원심분리 하였으며, 2% (v/v) FBS (HyClone)가 함유된 Ca2+- and Mg2+-부재 DPBS 0.5 ㎖에 2회 세척하였다.
고정된 난소 조직-분리 세포를 Oct-4 (BD Biosciences), Nanog (Abcam), Vasa (Abcam), CD44 (Chemicon) 및 AMH (Abcam) 1차 항체와 함께 4℃ 1시간동안 반응시켰다. 또한, 1mM EDTA (BIONEER, 대한민국)로 분리된 ESC-유사 세포를 PE-컨쥬게이티드 Sca-1 (BD Biosciences), FITC-컨쥬게이티드 CD44 (BD Biosciences), 바이오틴-컨쥬게이티드 CD34 (BD Biosciences) 및 바이오틴-컨쥬게이티드 CD45 (BD Biosciences) 1차 항체와 함게 실온에서 1시간 반응시켰다.
각가 Sca-1과 CD44는 MSCs에 특이적인 마커이나 CD34와 CD45는 상피줄기세포-특이적 및 조혈모줄기세포-특이적인 마커이다. 2회 세척 후,
항원-항체 복합체를 다음과 같은 형광 2차 항체로 확인하였다: Alexa Fluor 488-콘쥬게이티드 항-마우스(Molecular Probes), Alexa Fluor 488-콘쥬게이티드 항-토끼(Molecular Probes), Alexa Fluor 568-콘쥬게이티드 항-마우스(Molecular Probes), Alexa Fluor 568-콘쥬게이티드 항-렛트(Molecular Probes) 및 스트렙타비딘-피코에리트린(Streptavidin-phycoerythrin; BD Biosciences). 염색된 난소 조직-분리 세포를 레이져 스캐닝 공초점 현미경(Bio-Rad)으로 관찰하였고, 염색된 ESC-유사 세포는 유세포 분석기로 분석하였다(FACSCALIBUR, Becton Dickinson).
각인 유전자 분석(Analysis of Imprinted Genes)
Igf2의 분화적으로 메틸화된 부위 2(DMR2)의 중아황산염 유전체 시퀀싱(Bisulfite genomic sequencing)을 상술한 문헌에 따라 실시하였다(S. Sato, T. Yoshimizu, E. Sato, Y. Matsui, Mol. Reprod. Dev. 65, 41 (2003)).
중아황산염-처리된 유전체 DNAs의 각 DMR2 부위를 다음과 같은 특이적 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하였다: 정방향 프라이머(1088-1107bp) 5’-GTTGGGGATATGTGATATTTA-3’, 역방향 프라이머 (1307-1330bp) 5’-AAACCATAACCTTTAACCTCTCTA-3’. 프라이머의 뉴클레오타이드 부위는 Igf2 DMR2 서열을 의미한다(GenBank accession NO. AY849922). DMR2에서의 4개의 부위(P1, P2, P3 and P4)는 메틸화를 분석하기 위한 부위이다. CpGs의 시토신은 다음의 부위에 위치 한다: 1227, 1229, 1234 and 1240 (GenBank accession no. AY849922).
체세포-유래 ESC-유사 세포의 기탁
상기한 ES 세포의 특성을 모두 가지고 있는 섬유아세포-유래 ESC-유사 세포를 “tScB6CD-SNU-1”라고 명명하고 2006년 5월 16일 국제기탁기관 한국세포주 연구재단에 기탁하였으며, 기탁번호 KCLRF-BP-00135를 부여받았다.
실험결과
본 연구자들은 끊임없이 대안 기술을 찾기 위해 노력하였다. 마우스 섬유아세포(MEFs)를 제조하는 동안, 본 연구자 때때로 콜로니-유사, 상동 세포군을 발견하였다. 그러나, 본 연구자들은 혈관 근처에 있는 연수 조직에서 배아 줄기 세포(ESC)-특이적 Oct-4와 Nanog 발현과 난소 난포의 포막 세포 부위를 확인하였다(도 1). 본 연구자들은 난소로부터 분리된 세포가 ESC-, 중간엽 줄기 세포(ESC)-, 생식 세포- 및/또는 난포 세포-특이적인 마커에 양성 반응을 보이는 세포를 포함하고 있다는 것을 알았다. 우선, 본 연구자들은 B6D2F1 배아 섬유아세포를 단독으로 배양하거나 섬유아세포가 없이 5,000 U/㎖의 백혈병 저해 인자(LIF)를 포함하는 DMEM에서 직경 40 ㎛ 보다 작은 분리된 난소 세포를 배양하였다. 그러나, 모든 배양에서 어느 것도 콜로니를 생산하지 못하였다(표 2).
Figure 112009015888070-pct00002
N/A=분석하기 않은 것.
β-머캅토에탄올, 비-필수 아미노산, L-글루타민, 동결 건조한 페니실린과 스트렙토마이신 혼합물과 우태아혈청이 첨가된 aDMEM를 기본 배지로 이용하였다.
그 다음, 본 연구자들은 DMEM에서 난소 세포와 함께 B6D2F1 섬유아세포를 공동배양 하였으며, LIF 1,000, 2,000 또는 5,000 U/㎖를 추가하였다. 콜로니-유사 세포군이 관찰되었으며(표 3), 그리고, 총 6/24 실험(25%)에서 5,000 U/㎖ LIF-포함한 배지에서 초기 배양 7일째에 콜로니를 생산하였다(도 2). 이 콜로니를 65번의 계대 배양하여 6개월 이상 동안 유지하였으며, -196℃에서 액체 질소에 저장하였다.
Figure 112009015888070-pct00003
a마이토마이신 C를 처리한 배아 섬유아세포 단일층을 세포 배양하였다.
b수컷 DBA2 마우스와 암컷 C57BL/6 마우스를 교미시켜 13.5일된 태아로부터 회수 된 것.
c8주된, 성체 암컷 F1 마우스(B6CBAF1; C57BL/6 x CBA/Ca)로부터 얻은 것
d기본 배지로서 β-머캅토에탄올, 비-필수 아미노산, L-글루타민, 동결 건조한 페니실린과 스트렙토마이신과 우태아혈청이 첨가된 DMEM를 사용하였다.
결론적으로, 본 연구자들은 확립된 콜로니-형성 세포의 전구체를 명확히 하기 위해 노력하였다. 난소 세포 공여자, 섬유아세포 및 대조군 ESCs(129/0Ia 계통)의 유전자형을 구별하기 위해 세 개의 마커를 사용하여 짧은 연쇄 반복(STR) 미세위성 분석을 실시하였다. 확립된 세포의 미세위성 유전자좌는 B6D2F1 섬유아세포 단일 층의 유전자좌와 완벽하게 일치하였으며, 난소 공여자 것과 E14 ES 세포와 완전히 달랐다(표 4a 및 4b).
Figure 112009015888070-pct00004
Figure 112009015888070-pct00005
섬유아세포 단일 층의 세포 중 어느 것도 ESCs, 생식 세포, 난포 세포, MSCs, 및 조혈모줄기세포의 특이적 마커에 대하여 양성 반응을 보이지 않았다(도 3). 이와 같은 결과로부터, 본 연구자들은 MEFs가 확립된 세포의 기원이라는 결론을 내렸다. 난소 니치(niche)는 줄기세포성을 획득하기 위하여 난소 조직-특이적 줄기 세포 및 생식 세포를 포함하며, 최종적으로-분화된 섬유아세포를 재구성한다. 본 연구자들은 연속적으로 다른 계통의 섬유아세포로부터 콜로니-형성 세포를 추가적으로 확립하기 위해 꾸준히 노력하여 두 개 이상의 세포주를 ICR 마우스로부터 유래시켰다.
그 다음, 본 발명자들은 확립된 콜로니-형성 세포를 분리하였다. 6개의 세포주 모두 XX 성 염색체를 가졌다(도 4). 초기(6-7) 또는 후기(30) 계대로부터 모은 콜로니-형성 세포의 핵형은 4배체의 핵형을 갖는 반면, 난소 세포와 MEFs는 에서는 4배체 세포가 발견되지 않았다. 20번째 계대에서 회수된 콜로니-형성 세포는 ESC-특이적인 마커에 대하여 양성 반응을 나타내었으며 ESC-특이적인 유전자를 발현하였다(도 5a 및 5b). 세포는 텔로머라제 활성을 가지며(도 6) 확립된 세포주에서 각인 유전자(imprinted gene) Igf2의 26-47%가 메틸화되었다(표 5).
Figure 112009015888070-pct00006
확립된 세포나 E14 ES 세포 어느 것도 조직-특이적 줄기 세포 마커에 대하여 양성 반응을 보이지 않았다(Sca-1, CD44, AMH, Vasa 및 Fragilis; 도 7-8). LIF-부재 배지에서 콜로니-형성 세포를 배양하는 경우, 배아체(EBs; 도 9)를 형성하였으며 콜로니- 형성세포를 NOD-SCID 마우스로의 피하 이식은 테라토마를 형성하였다. N2B27 용액으로 처리한 후 콜로니-형서 세포는 신경세포로 자발적으로 분화되었다. 전능성을 추가적으로 확인하기 위하여, 초기(7-13 계대) 및 후기(32-39 계대) 계대배양으로부터 모아진 콜로니-형성 세포는 8-세포 배아와 응집되었으며, 응집된 배아로부터 유래된 배반포를 대리모의 자궁에 삽입하였다. 총, 74 자손이 전달되었고, 그 중 9개(12.2%)는 체세포 키메라였다(표 6).
Figure 112009015888070-pct00007
ICR계통의 8-세포 배아와의 응집에 ScB6CD-SUN-1 세포주를 사용하였다.
a어떤 경우에는, 19.5 dpc에서 제왕절개로 태아에게 전달하였으며, 암컷 마우스를 양육하게 위해 삽입하였다.
b전달된 자손수의 백분율.
4개의 키메라가 생존하였다(3마리 암컷 및 1마리 수컷; 도 11). 이러한 결과는 확립된 4배체 세포가 2배체 ES 세포처럼 거의 동일한 특성을 가진 전능성 줄기세포라는 것을 나타낸다(표 7a 및 표 7b).
Figure 112009015888070-pct00008
Figure 112009015888070-pct00009
우리는 4배체 ESC-유사 세포가 분화 후 정상적인 2배체 핵형으로 되돌아가는지를 확인하였다. 확립된 줄기세포에서 2배체 세포가 존재하지 않았지만, 테라토마에서 4배체 세포는 없었다(도 12). EB가 형성되는 것처럼 2배체 세포군이 점진적으로 증가하였으며, 최종적으로 2배체 세포는 21일 후 처리로부터 모은 EBs에서 두드러지게 나타났다. STR 미세위성 분석의 결과는 분화된 세포의 핵형은 피더세포 도너의 것과 일치한다는 것을 보여준다(표 4). 이러한 결과를 토대로, 2배체에서 4배체로 그리고 4배체에서 2배체로의 변환은 재구성(reprogramming)에 의해 줄기세포성을 획득하는 동안, 탈분화 및 체세포로 분화하는 동안 각각 발생하며, 확립된 세포의 핵형에 영향을 주지 않는다.
Ⅱ. 난소 세포로부터 유래된 ESC-유사 세포
재료 및 방법
실험동물
본 실험에 제공된 동물은 대한민국 서울대학교 생식세포 및 줄기 세포 생물공학 실험실에서 빛(14L:10D), 온도(20-22℃), 습도(40-60%)로 조건으로 사육하였다. C57BL/6 암컷 마우스와 DBA2 수컷 마우스를 교미시켜 F1 혼성 암컷 마우스(B6D2F1)를 생산하였으며 8주령 암컷 마우스를 난자 기증자로 이용하였다. 동물 관리, 사육 및 수술에 있어서 모든 과정은 서울대학교의 표준수술 프로토콜을 따랐으며, 서울대학교 실험동물자원 심사위원회는 동물 이용 및 관련 실험과정(승인번호 SNU-050331-2)을 승인하였다. 실험 시료를 적합하게 관리되었으며, 실험 설비 및 장치의 품질 관리를 유지 하였다.
접합보인법(In situ hybridizaton)
접합 보인법 검출 시스템 키트(DF132-60K; BioGenex, San Ramon, 미국) 및 프로브(Biognostik, Gottingen, 독일)을 제공된 프로토콜에 따라 사용하였으며, 배경 신호를 최소화 하여 최적화 하였다. 모아진 C57BL/6 또는 B6D2F1 (C57BL/6 x DBA2)의 난소 조직을 냉각포매제(Tissue-Tek OCT compound; Sakura, Torrance, 미국)에 넣고 액화 질소에서 냉동시켰다. 냉동-시료를 10 ㎛ 두께로 절단하고 4% (v/v) 포름알데히드(Sigma-Aldrich, 미국)가 포함된 PBS(Phosphate-buffered saline)에 실온에서 5분간 고정시켰다. 슬라이드를 에탄올 연속적인 농도(70%, 80%, 90%, 95% 및 100%)에서 탈수시킨다. 자연 건조된 시료를 30℃에서 3시간동안 하이브리버퍼-ISH(hybribuffer-ISH)로 전처리 하였다. 혼성화는 Oct-4 및 Nanog 하이브리프로브(hybriprobe)를 포함하는 하이브리버퍼-ISH에서 40℃로 하룻밤 반응시켰다. 슬라이드를 1 x 염화나트륨/구연산나트륨 액(sodium chloride/sodium citrate solution: SSC), 45℃에서 15분간 0.1 x SSC 및 실온에서 3분간 0.1% Tween-20(USB, 클리브랜드, 미국)가 보충된 1 x PBS로 실온에서 5분간 세척하였다. 슬라이드를 실온에서 10분간 파워 블록 리에이젼트(Power Block Reagent)에서 반응시키고 바이오틴화된 항-플루오레세인 항체로 실온에서 40분 동안 반응시켰다. 0.1% (v/v) Tween-20가 첨가된 1 x PBS로 세척한 후 실온에서 20분 동안 슬라이드를 스트렙타비딘-알카라인 포스파타아제 컨쥬게이트에서 인큐베이션시키고, 0.1% (v/v) Tween-20가 첨가된 1 x PBS로 세척하였다. 실온에서 1분 동안 활성 완충액으로 반응시켜 알카라인 포스파타아제를 활성화시켰다. 슬라이드를 실온에서 15분간 NBT/BCIP로 발색시키고 커버를 덮은 후 위상차 현미경(BX51TF; Olympus)으로 관찰하였다.
MEFs의 제조
교미 후(ICR) 13.5-dpc 태아를 초기 배양과 계대배양 동안 MEFs의 기원으로 사용하기 위하여 안락사 시켰다. 배아 섬유아세포를 태아로부터 수득하고, 태아의 창자 기관, 머리 및 팔다리를 제거하였다. 남아 있는 조직 조각을 0.04% (v/v) 트립신-EDTA (Invitrogen, 미국)6분 동안 교반하면서 반응시키고, 2분 동안 110 x g에서 원심분리 하였다. 상청액을 10% (v/v) FBS-함유 DMEM 배지(Invitrogen, 미국)로 희석하고 4분 동안 390 x g에서 원심분리 하였다. 수거된 섬유아세포의 펠렛을 부유시키고 단일층 형성을 위하여 DMEM 배지로 교환하였다. 섬유아세포가 컨플루언트 단일층(confluent monolayer)이 형성될때, 10% 디메틸술폭시드dimethylsulfoxide; Invitrogen, 미국)에 냉동시켰다.
난소 세포 제조
난소를 수집하고, 접착성 조직을 제거한 후, 회수된 조직을 수술용 메스를 사용하여 절단하였다. 0.25% (v/w) 트립신-EDTA (Invitrogen, 미국)과 750 U/㎖ 콜라게나아제 타입 I(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 미국) 및 0.03% (v/v) 우태아혈청(fetal bovine serum: FBS; HyClone)이 첨가된 DMEM (Gibco Invitrogen)이 50:50 (v:v)혼합액으로 구성된 해리 배지에서 절단된 샘플을 37℃에서 초기 30분 동안 배양하였다. 분리된 세포를 40-㎛ 세포 여과기(BD Falcon, 미국)에 여과시켰으며 4분 동안 390 x g에서 원심분리 하였다. 그 다음 60 ㎜ x 10 ㎜ 배양 디쉬에 씨딩(sseding)하였다. 분리된 세포에 혼합되어 있는 기질세포를 처음 씨딩을 한 후 30분간 제거하였으며 바닥 기질세포에 존재하는 부력성 세포(buoyant cell)를 디쉬에 있는 MEF 단일층에 재씨딩하였다. 몇 번을 반복하여 여과된 세포들을 기질 세포가 없는 MEF 단일층에 직접 씨딩하였다. DMEM 배지에는 0.1 mM β-머캅토에탄올(Invitrogen, 미국), 1% (v/v) 비필수 아미노산(Invitrogen, 미국), 2 mM L-글루타민(Sigma-Aldrich, 미국), 페니실린과 스트렙토마이신의 동결 건조된 1% (v/v) 혼합액 (Gibco Invitrogen), 5,000 U/㎖ 마우스 LIF (Chemicon, Temecula, 미국) 및 15% (v/v) FBS (HyClone)을 첨가시켰다.
콜로니-형성 세포를 확립하기 위한 MEFs 및 난소 세포의 공동배양
MEF 단일층을 젤라틴이 코팅되어 있는 35-mm 조직 배양 접시에서 3시간 동안 10 ㎍/㎖의 마이토마이신 C(Chemicon, Temecula, 미국)로 처리하였으며 그 후에 콜로니-형성 세포를 확립하기 위해 사용하였다. 제조된 난소 세포를 MEF 단일층이 포함된 접시에 접종하고 습한 공기에서 5% CO2, 37℃ 조건하에서 배양하였다. 배양 4일째, 60-70% 컨플루언시에 도달된 난소 세포를 배양 배지가 포함된 같은 크기의 배양 접시에서 새로운 단일층에 리플레이팅 하였다. 초기 배양에서 LIF 1,000-5,000 U/㎖의 농도를 배양 배지에 첨가하였으며 계대배양을 위하여 LIF 1,000 U/㎖의 농도를 고정시켰다. 초기 배양 말미에(배양 7일째), 콜로니-형성 세포를 모세관 파이펫으로 제거하였으며, 3일 간격으로 MEF 단일층과 계대 배양하였고, 배지는 매일 교환하였다.
콜로니-형성 세포의 마커 염색
줄기 세포-특이적 마커를 이용하는 특성화에 있어서, 20번째 계대에서 모아진 콜로니-형성 세포는 상온에서 10분 동안 4% (v/v) 포름알데히드(Sigma-Aldrich, 미국)에서 고정시켰다. 알카라인-포스파타아제에 대한 콜로니-형성 세포의 반응성은 Fast Red TR/나프톨 AS-MX 포스테이트(Sigma-Aldrich, 미국)으로 측정하였다. Oct-4 (Biosciences, 미국), 단계 특이적 배아 항원(SSEA)-I (발생연구 하이브리도마 은행, 미국), SSEA-3 (발생연구 하이브리도마 은행, 미국), SSEA-4 (발생연구 하이브리도마 은행, 미국), 인테그린 α6 (발생연구 하이브리도마 은행, 미국), 인테그린 β1(산타나크루즈 바이오테그놀로지), Vasa (Abeam, Cambridge, 영국), Fragilis (Abeam) 및 AMH (Abeam) 항체를 마커 염색에 사용하였다. Alexa Fluor 488-콘쥬게이티드 항-마우스 항체(Molecular Probes, 미국), the Alexa Fluor 568-콘쥬게이티드 항-마우스 항체 (Molecular Probes, 미국), 및 타코사이토메이션 키트(DakoCytomation, 미국)를 사용하여 SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Oct-4, 인테그린 α6, 인테그린 β1, Vasa, Fragilis 및 AMH를 검출하였다.
In Vitro 및 In Vivo 분화
In vitro 자발적 분화를 확인하기 위해, 콜로니-형성 세포에 0.04% (v/v) 트립신-EDTA을 사용하여 처리하였고, 그 다음 상기 분리된 세포들을 15% (v/v) FBS (HyClone)가 첨가된 LIF-부재 DMEM (Invitrogen, 미국)가 포함되어 있는 100-㎜ 플라스틱 패트리 디쉬에 옮겼다. 세포를 배아체가 형성될 때 까지 성장시켰다. 배아체를 4-웰 배양 플레이트에서 분리하여 씨딩하였고 10-14일 동안 배양하였다. 배아체를 3배엽에 대하여 다음과 같은 특이적 마커를 사용하여 EBs를 염색하였다:　외배엽 세포: 네스틴(nestin; Santa Cruz Biotechnology, 미국)과 S-IOO (Biodesign International; 미국); 중배엽 세포: 근육 액틴(muscle actin; Biodesign International, 미국)과 데스민(desmin; Santa Cruz Biotechnology, 미국); 및 내배엽 세포: α-페토프로틴(α-fetoprotein; Biodesign International, 미국) 트로마-1(Troma-1; Hybridoma Bank, 미국). 다코싸이토메이션 키트(DakoCytomation)를 이용하여 항체를 측정하였다.
In vivo 분화를 확인하기 위하여, 20번째 계대에서 회수한 1 x 107 개의 콜로니-형성 세포를 성체 NOD-SCID 마우스의 피하로 주입되었다. 이식 후 6주째에 마우스 피하 부위에 형성된 테라토마를 수거하여 4% (v/v) 파라포름알데히드를 이용하여 고정시켰다. 파라핀 블록(paraffin block)에 넣은 후, 조직을 위상차 현미경(BX51TF; Olympus, Kogaku, 일본)하에서 실험을 위하여 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)을 사용하여 염색하였다.
신경 세포로 분화 유도
신경계 세포로 in vitro 분화를 위해서, 콜로니-형성 세포들을 분리하여, N2 (Invitrogen, 미국) 및 B27 (Gibco Invitrogen, 미국)가 첨가된 DMEM/F12 (Invitrogen, 미국)로 구성된 변형 N2B27 배지에 0.5-1.5 x 104/cm2의 밀도로 0.1% 젤라틴-코팅된 플라스틱 배양 접시위에 깔았다. 배양 기간 내내 형태를 관찰하였으며 배양 배지는 2일 간격으로 교체하였다. 피브로넥틴-코팅된 조직 배양 접시에 다시 리플레이팅하여 분화된 세포를 유지하였다. 그 다음 면역화학적 분석을 하였다. 분화된 세포를 5분 동안 4% (v/w) 파라포름알데히드로 고정시켰으며, 블로킹 솔루션(blocking solution; 5% FBS가 첨가된 PBS)에서 배양하고. 그리고 고정된 세포를 네스틴(Santa Cruz Biotechnology, 미국), β-튜블린 타입 Ⅲ(Chemicon, 미국), 04(Chemicon, 미국), 및 아교섬유산성단백질(glial fibrillary acidic protein: GFAP; Chemicon, 미국)에 대한 1차 항체로 반응시켰다. 항원-항체 결합체는 형광 2차 항체인 Alexa Fluor 488-콘쥬게이티드 항-염소(Molecular Probes, 미국), Alexa Fluor 568-콘쥬게이티드 항-마우스(Molecular Probes, 미국) 및 Alexa Fluor 488-콘쥬게이티드 항-마우스(Molecular Probes, 미국)와 반응시킨 후 관찰하였다. 염색된 세포를 488 nm 또는 568 nm에서 크립톤-아르곤(krypton-argon) 혼합 가스 레이저 여기(excitation)을 이용하는 레이저 스캐닝 공초점 현미경과 플루오레세인 필터 (Bio-Rad, Hemel Hempstead, 영국)를 이용하여 관찰하였다.
프라이머 디자인
본 실험에 사용된 모든 특이적인 프라이머는 프라이머리3 소프트웨어(Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research)를 이용하여 디자인하였다. 모든 PCR 프라이머들은 GenBank로부터 얻은 마무스 cDNA 및 유전적 DNA 서열에 기초하여 디자인되었다. 디자인한 프라이머는 95°C, 30초, 45초 어닐링 온도(표 1), 및 72°C 30초로 40회를 PCR 사이클로 하여 테스트하였다. 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.
RT-PCR 분석
C57BL/6 or B6D2F1의 난소, 뇌, 심장, 폐, 비장, 및 작은 창자, 방광, 신장 및 피부의 전체 RNA와 콜로니-형성 세포를 제조사의 지침서에 따라, RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 추출하였다. cDNA를 Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI)를 사용하여 전체 RNA의 약 1 ㎍로부터 합성하였으며, 특정 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 하였다. PCR 산물을 1.2% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 크기별-분획하였으며, 에티디움 브로마이드 염색에 의해 확인하였다.
실시간 PCR 분석 (Real-time PCR analysis)
제조사의 실험방법에 따라 RNeasy Plus Mini 키트(Qiagen, Valencia, CA, 미국)를 이용하여 난소 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. cDNA를 역전사중합효소반응과 동일한 방법으로 합성하였다. 그 다음, 상기 난소에서 특저 유전자의 발현 양을 DyNAmo HS SYBRGreen qPCR Kit (Finnzymes, Espoo, Finland)를 사용하여 정량화하였다. ABI PRISM 7700 시퀀스 검출 시스템(Applied Biosystems, Foster, 미국)으로 최종 볼륨을 25 ㎕로 하여 PCR 증폭을 실시하였으며, 싸이클링 조건은 50℃ 2분, 95℃ 15분을 한 다음 95℃ 15초, 60℃ 30초, 72℃ 30초를 40회로 하였다. PCR 특이도를 체크하기 위해 해리 곡선을 기록하였다.
각 프라이머의 최적의 농도를 300 nM으로 하였으며, 분자간 및/또는 분자내부 중복 형성의 부존재를 주형을 첨가하지 않은 대조군 실시간 PCR 반에서 확인하였다. 각 시료에서 각각의 유전자의 mRNA 수준을 β액틴으로 일치시켰다. 상대적인 mRNA 수준을 2-ΔΔCt로 나타냈으며, CT=목표 증폭에 대한 출발점 싸이클인 경우, ΔCt=Ct목표 유전자-Ct내부대조, 그리고 ΔΔCt=Ct시료-ΔCt칼리브레이터.
FACS에 의한 핵형 분석 및 DNA 성분 분석
세포주의 핵형은 7-8주 동안 배양에서 유지한 후 분석하였으며, 이는 16-18 계대에 해당한다. 세포를 1-2시간 동안 0.05 ㎍/㎖ 콜세미드(colcemid; Wako)가 첨가된 배양 배지로 처리하였으며, 그 다음 트립신화하여 수거하였다. 세포를 15분 동안 0.56% KCl 용액으로 처리하고, 30분 동안 아이스에서 냉 메타노-아세트산(3:1) 혼합액으로 혼합하였다. 세포를 30분 간격으로 2회 원심 분리하여 고정액을 두 번 교체하였다. 염색체는 열-처리된 슬라이드에 깔았다. Seabright14의 변형된 방법을 자연 건조된 염색체의 G-밴딩에 사용하였다. 글라스 슬라이드 위에 염색체를 상온에서 약 1주일 동안 두었으며, 10초 동안 0.025% 트립신 용액을 떨어뜨리고, 증류수로 린스 한 다음 10분 동안 인산 버퍼(pH 6.8)에서 Giemsa's 용액으로 염색하였다. 증류수로 세척하고 자연 건조한 후에, 50 개 이상의 스프레드를 염색체 수로 카운트하였으며, 10개의 밴딩 패턴을 300 내지 500개의 밴드 해상도로 측정하였다.
DNA 성분을 측정하는 FACS 분석을 위하여, 수거된 세포를 Ca2+- and Mg2+-부재 Dulbecco’s PBS(DPBS; Gibco Invitrogen, 미국)에 세척하였고 4℃에서 1시간 동안 70% (v/v) 에탄올(Sigma-Aldrich, 미국)에 부유시켰다. 세포를 4분 동안 390 g에서 원심분리 하였고 0.1 ㎎/㎖ 리보뉴클레아제(Sigma-Aldrich, 미국) 및 0.1 ㎎/㎖ 프로피디움 요오다이드(propidium iodide; Sigma-Aldrich, 미국)이 포함된 Ca2+- and Mg2+-부재 DPBS 0.5 ㎖에서 재부유 시켰다. 암실 실온에서 30분 후에, 두 개의 수냉식 레이져가 장착된 Becton Dickinson FACS-Vantage SE(Becton Dickinson, 미국)를 이용하여 세포 부유물을 분석하였다. 세포 Questver. 3.3 소프트웨어(Becton Dickinson)를 이용하여 테이터를 분석하였다.
지노믹 DNA-PCR 분석에 의하여 성별 결정
G-스핀 지노믹 DNA 추출 키트(iNtRON Biotechnology, 대한민국)를 이용하여 각각 확립된 줄기세포로부터 모든 유전체 DNA를 추출하였다. 추출된 유전체 DNA를 Zfy1 (Y 염색체-특이적)과 Xist (X 염색체-특이적)에 대한 프라이머로 PCR을 실시하였다. PCT 산물을 2.1% 아가로스젤에서 전기영동하여 크기를 분류하고 EtBr(ethidium bromide)을 첨가하여 노출시켰다.
텔로머라아제 활성 분석
TRAPEZE 텔로머라아제 검출 키트(Chemicon)을 이용하여 텔로머라아제 활성을 분석하였다. 두 개의 세포주를 20번째 계대에서 분석하였으며 PCR 증폭을 27 사이클로 실시하였다. 불포화 폴리아크릴아마이드젤에서 전기영동하여 PCR 산물을 분리하였다.
DNA 미세위성 분석(DNA microsatellite analysis)
B6D2F1 꼬리, ICR MEFs 및 두 개의 새롭게 확립된 콜로니-형성 세포주로부터 지노믹 DNA 샘플로 DNA 미세위성 분석을 하였다. 공개 데이터베이스(http://www.cidr.jhmi.edu/mouse/mmset.html)로부터 얻은 2개의 특이적 마우스 미세위성 프라이머(D03Mit200 및 D11Mit4)를 사용되었다. 각 시료의 지노믹 DNA를 두 개의 미세위성 위치에 대하여 PCR로 증폭시켰다. 5’-말단에 형광 물질(TET, 또는 HEX)과 함께 정방향 프라이머를 합성하였으며, PC808 프로그램 TEMP 콘트롤 시스템(ASTEC)으로 형광 PCR 증폭을 실시하였다. 그 다음, ABI 프리즘 310 DNA 오토메이티드 시퀀서(ABI Prism 310 DNA automated sequencer; Applied Biosystems, 미국)로 PCR 산물을 분석하였다. 디지털 이미지는 Genescan 데이터 콜렉션 ver. 2.5 소프트웨어(Applied Biosystems)를 이용하여 얻었다. 염기쌍 크기, 피크 높이 및 피크 부위에 대하여 각각의 형광 피크로 나타내었다.
난소 조직-분리 세포 및 콜로니-형성 세포의 면역염색
분리된 난소, 비장 또는 소장 세포를 4℃에서 1시간 동안 70% 에탄올에서 고정시켰다. 고정된 세포를 4분 동안 390 g 에서 원심분리 하였으며, 2% (v/v) FBS (HyClone)가 함유된 Ca2+- and Mg2+-부재 DPBS 0.5 ㎖에 2회 세척하였다.
고정된 난소 조직-분리 세포를 Nanog (Abcam), Vasa (Abcam), CD44 (Chemicon) 또는 AMH (Abcam) 1차 항체와 Oct-4와 반응시킨 2차 항체를 4℃ 1시간동안 반응시켰다. 또한, 1mM EDTA (BIONEER, 대한민국)로 분리된 콜로니-형성 세포를 PE-컨쥬게이티드 Sca-1 (BD Biosciences), FITC-컨쥬게이티드 CD44 (BD Biosciences), 바이오틴-컨쥬게이티드 CD34 (BD Biosciences) 및 바이오틴-컨쥬게이티드 CD45 (BD Biosciences) 1차 항체와 실온에서 1시간 반응시켰다. Sca-1과 CD44는 중간엽줄기세포에 특이적인 마커이나 CD34와 CD45는 각각 상피줄기세포-특이적 및 조혈모줄기세포-특이적인 마커이다. 2회 세척 후, 항원-항체 복합체를 다음과 같은 형광 2차 항체로 확인하였다: Alexa Fluor 488-콘쥬게이티드 항-마우스(Molecular Probes), Alexa Fluor 488-콘쥬게이티드 항-토끼(Molecular Probes), Alexa Fluor 568-콘쥬게이티드 항-마우스(Molecular Probes), Alexa Fluor 568-콘쥬게이티드 항-렛트(Molecular Probes) 및 스트렙타비딘-피코에리트린(Streptavidin-phycoerythrin; BD Biosciences). 염색된 난소 조직-분리 세포를 레이져 스캐닝 공초점 현미경(Bio-Rad)으로 관찰하였고, 염색된 콜로니-형성 세포를 유세포 분석기로 분석하였다(FACSCALIBUR, Becton Dickinson).
체세포-유래 ESC-유사 세포의 기탁
상기한 ES 세포의 특성을 모두 가지고 있는 난소 세포-유래 ESC-유사 세포를 “OSC-B6D2-SNU-1”라고 명명하고 2006년 11월 17일에 국제기탁기관 한국세포주연구재단에 기탁하였으며, 기탁번호 KCLRF-BP-00148를 부여받았다.
실험결과
성체 조직에서 전능성 있는 세포의 다른 하나의 소스를 확인하기 위해, 본 연구자들은 뇌, 심장, 폐, 위, 신장, 난소, 소장, 피부 및 8주령 된 비장, 성체 암컷 마우스에서 줄기 세포 특이적 유전자 발현(Oct-4, Nanog 및 Cripto)을 모니터하였다. 모든 기관이 Nanog mRNA를 발현하였으며, 이를 RT-PCR을 통해 확인하였고(프라이머 서열은 표 8에 나타나 있다), 위와 피부를 제외한 대부분의 기관은 Cripto를 발현하였다(도 15).
Figure 112009015888070-pct00010
RT=역전사효소 중합효소연쇄반응, R-T=실시간 중합효소연쇄반응, gDNA=유전체 DNA 중합효소연쇄반응.
그러나, Oct-4의 발현은 난소, 소장 및 비장에서만 측정되었다. Oct-4, Nanog 및 Cripto 뿐만 아니라, 난소 조직은 Rex-1, Dnmt3b, Tert, 및 Lif Rc가 더욱 발현되었다. 그러나, 실험한 난소들의 발현 수준은 각각 달랐으며, 하나의 난소에서 매우 Nanog 발현이 미미하였다(도 16).
비장 및 소장으로부터 매우 적은 양의 Oct-4-양성 세포를 분리하였으나, 이들은 Nanog에 대하여는 음성반응을 나타내었다(도 17). 이러한 결과들은 이들 조직에서 Nanog mRNA를 번역하지 않는다는 것을 시사한다. 반대로, 난소로부터 분리한 세포는 Oct-4와 Nanog에 대하여 모두 양성을 나타내었다. 그 결과, 본 연구자들은 콜라게네이즈 I과 트립신을 처리하여 소장, 비장(splenal) 및 난소 세포를 분리하였으며 β-머캅토에탄올, 비 필수-아미노산, L-글루타민(glutamine), 우태아혈청 및 항체들을 포함하는 배지를 기초로 Dulbecco's 최소 필수 배지(DMEM)에서 마이토마이신-C(mitomycin-C) 또는 없이 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 단일층 위에 배양하였으며, 1,000, 2,000 또는 5,000 units/㎖의 백혈병 저해 인자(LIF)를 첨가하였다. 비장(Splenal)과 소장 세포는 주로 섬유아세포로 구성되어있으며, LIF의 농도에 관계없이 콜로니-형성이 없는 상동 단일 층을 형성하였다. 대조군으로서, 동일한 배지에서 MEFs만의 배양에서는 콜로니가 생성되지 않았다.
난소 세포 배양의 경우, 직경 40-μm 이상인 성숙한 난모세포와 대부분의 전강 및 강 난포, 미성숙한 것을 제거하기 위해 배양 전에 세포 여과기를 통하여 분리된 세포를 추가적으로 여과하였다. 분리된 세포에 혼합된 기질 세포를 추가적으로 제거하기 위하여, 바닥에 있는 세포 위에 부양성 세포를 씨딩한 후 30분 동안 모아서 MEF 단일층에 재씨딩하였다. 초기 배양하는 동안 콜로니-유사 세포군을 확인하였으나, MEF가 없는 배양에서는 콜로니-형성이 나타나지 않았다. 비장 및 소장 세포를 배양하기 위해 동일한 기술을 적용하였으나, 콜로니를 얻는 데는 실패하였다. 초기 배양 7일까지 14번의 시도 중 두 번만 콜로니를 얻었으며, 고 농도의(5,000 units/ml) LIF를 포함하는 배양에는 모든 콜로니가 관찰되었다. 콜로니-형성 세포는 배아 세포(ES) 또는 배양된 낭배 외피 세포가 형태적으로 정형적이며, 25번 계대하여 세 달 이상 안정적으로 유지되었다.
콜로니-형성 세포의 기원을 추적하기 위해, 두 개의 마커를 이용한 짧은-연쇄 반복 (STR) 미세위성을 분석하였다. 두 개의 확립된 세포주 (OSC-B6D2-SNU-1 및 OSC-B6D2-SNU-2), 난소 세포 도너(B6D2F1; C57BL/6 x DBA2) 및 피더 섬유아세포(ICR)의 핵형을 비교하였다. 확립된 세포의 미세위성 유전자좌를 난소 기증자의 유전자좌가 정확히 일치하였으나, 섬유아세포 기증자의 유전자와는 완전히 달랐다(표 9).
Figure 112009015888070-pct00011
a이용된 미세위성 마커를 난소 기증자(B6D2F1)와 피더 세포(ICR)로서 사용된 마우스 계통인지를 확인하기 위하여 MIT 데이터베이스에서 선택하였다.
그 다음, 난소 조직의 접합보인법(in situ-hybridization)을 실시하였고, 줄기 세포-특이적인 강한 발현, Oct-4 및 Nanog mRNA의 발현은 난소 수질 및 전강 및 강 난포에 있는 말초 부위의 얇은 층에서 주로 확인되었다. 그 다음, 기질 세포를 제거한 후에 분리된 난소 세포를 Nanog, Vasa (생식 세포-특이적), AMH (난포 세포-특이적) 또는 CD44 (중배엽 세포-특이적) 및 Oct-4로 이중 염색하였다. Nanog-, Vasa- 또는 CD44-양성 반응 세포는 동시에 Oct-4에 양성이었으나, AMH-양성 세포는 Oct-4와 반응하지 않았다. 양성 반응을 보이는 세포는 얇거나 조잡한 원형이었다. 그러나, Vasa-양성 세포는 다른 세포 및 콜로니-형성 세포보다 현저하게 더 작았다(도 19).
20번 계대 배양된 콜로니-형성 세포는 알칼린 포스파타네, 항-단계 특이적 배아 항원(SSEA)-I, 항-인테그린 α6, 항-인테그린 β1과 Oct-4 항체 염색에 대하여 양성 반응을 보이는 반면, 항-SSEA-3 또는 항-SSEA-4 항체에 반응하지 않았다.(도 20). 또한, 줄기 세포-특이적인 Oct-4, Nanog, Rex-1, Cripto, Dnmt3b, Tert, Lif Rc, Stat3, Bmp4, Fgf4, Foxd3, Sox2, CD9, 및 Gdf3 유전자가 발현되었으며, 확립된 세포에서 텔로머라제의 활성이 확인되었다(도 21). 이 세포들은 XX 성 염색체를 가진 2배체 핵형을 가졌으며, 이것을 자연-건조된 염색체의 G-밴딩, 유세포 분석기를 이용한 형광-활성 세포 분리(FACS) 및 X 염색체-특이적인 Xist와 Y 염색체-특이적인 Zfy1 유전자 프라이머를 이용하는 PCR 분석으로 결정하였다. 확립된 세포 또는 언급된 E14 ES 세포 모두 조직 특이적 줄기 세포 마커(중간엽 줄기 세포에 대한 Sca-1 및 CD44, 상피 줄기 세포에 대한 CD34와 조혈모세포에 대한 CD45, 생식 줄기 세포에 대한 Fragilis 및 Vasa)와 AMH에 대해서 양성 반응을 나타내지 않았다(도 23 및 도 24).
LIF가 없는 배지에서 배양한 후에, 콜코니-형성 세포는 3배엽(S-IOO, 네스틴, α-평활근 액틴, 데스민, α-페토프로틴 및 트로마-1)의 마커에 대해 양성 반응인 세포로 구성된 배아체(도 25)를 형성하였다. 그 다음, NOD-SCID 마우스로 이식한 후, 콜로니-형성 세포는 3배엽으로부터 유래한 세포로 구성된 테라토마를 형성하였다(OSC-B6D2-SNU-1에 대한 신경상피세포 로제트, 케라틴화된 편평 상피세포, 골질 분화를 나타내는 골섬, 근육, 췌장 조직 및 섬모원형 상피세포를 도 25에 나타내었다). 콜로니-형성 세포를 N2B27 용액으로 처리한 후 추가적으로 신경세포(뉴런, 희소돌기아교세포 및 성상세포)로 분화시켰다(도 26). 이 같은 결과는 ES 세포(ESC)-유사 활성을 갖는 확립된 세포를 나타낸다.
우리는 생식 세포 키메라를 생산에 의해 확립된 세포의 전능성을 확인하기 위해 최종 실험 세트를 실시하였으며, 이는 EGFP로 감염된 세포를 이용하여 큰-규모의 실험으로 추가적으로 확장할 것이다(미발표 데이터). 지금까지, 본 연구자들은 11번째 계대에서 회수한 콜로니-형성 세포(OSC-B6D2-SNU-1)와 응집되는 배아의 이동 후 하나의 전달체를 소유하였으며, 4개의 살아 있는 자손 중 하나는 체세포 키메라였다.
이와 같은 일련의 결과로부터, 확립된 콜로니-형성, ESC-유사 세포를 피더 섬유아세포로부터 유래가 아닌 난소 세포로부터 유래하였다. 면역조직화학적 분석은 생식 세포(생식 세포 및 단위 생식성 난모 세포), 난포 세포 또는 중간엽 세포가 확립된 세포의 전구 세포가 일 것이라는 가능성을 높였다. 본 연구자들은 그러나 전구 세포로서 생식 세포와 난포 세포를 추출하였으며 전구 세포로서 중간엽(줄기) 세포를 조심스럽게 고려하였다. 세포 여과기로 구성된 해리 과정은 단성 생식적으로 활성화 될 수 있는 성숙한 난모 세포와 직경 40 ㎛이상 자란 난포를 완벽히 제거할 수 있다. 씨딩하기 전 기질 세포와 다른 접착성 세포를 제거하는 것은 상피 또는 조혈모세포가 확립되는 것을 최소화 시킨다. 생식 세포-마커 양성 세포(명확히 더 작은)와 콜로니-형성 세포간의 형태적인 차이 및 줄기 세포 마커에 대한 AMH-양성 세포의 무반응은 이러한 예측을 뒷받침한다. 확립된 세포는 콜로니 형성이 시작되고 강한 테로머라아제 발현을 갖는 것만큼 빠르게 생식 줄기 세포에 특이적인 마커에 대하여 음성 반응을 나타내었다. 아마도, 어떤 비일상적인 환경에 노출되는 경우, 난소에 있는 ‘잠복중인’ 중간엽(줄기) 세포는 세포 가소성 또는 자가-재생 활성을 획득한다.
섬유아세포가 난소 ESC-유사 세포를 확립하는 데 중요한 역할을 한다는 것은 명백하다. 이는 ‘잠복중인’ 줄기 세포를 유동화 시키기 위해 니치(예를 들어, 세포 대 세포간의 상호작용을 작동시키거나 또는 전능성을 얻기 위한 결정적인 분자를 분비하는 것)를 만들어 낼 수 있다. 다른 관점에서, 본 연구자들은 궁극적으로 확립된 세포에 고 용량(5,000 units/ml)의 LIF를 사용하였으며, 조직-유래 ESC-유사 세포를 확립하기 위해 미세-환경을 만들거나/조절할 배양 배지의 중요성을 주장하였다. 다른 ESC-유사 세포 주를 사용한 다른 실험에서, 본 연구자들은 Wnt 신호 증가는 글루타티온(glutathione)에 노출함으로서 유도할 수 있고, 줄기 세포 확립과 유지에 자극을 준다는 것을 알았다.
이는 순환하는 혈액에서 전능성 성체 전구 세포(MAPCs)가 난소 ESC-유사 세포의 전구체라는 가능성이 있다. 본 연구자들은 두 개의 중간엽 세포(전능성인 줄기 세포나 MAPCs) 사이에서 ESC-유사 세포의 전구체를 결정하는 실험 전략을 개발하지 못하였다. 그러나, 본 연구자들은 오직 난소로부터 콜로니 형성 세포의 조직 특이적 유도와 난소 수질에서 강한 Oct-4와 Nanog 발현 때문에 전구 세포로서 MAPCs를 고려하지 않는다(도 19). 사실, 난소 세포를 제조하는 동안 난소에 있는 대부분의 순환 혈액을 제거한다. 만약 MAPCs가 콜로니-형성 세포의 전구체라면, 우리는 다양한 기관으로부터 조직-특이적인 ESC-유사 세포를 유도하는 또 다른 기회를 얻을 것이다. 본 연구자들은 배양 환경 또는 배양 첨가물을 변화시킴으로써 조직-특이적인 전능성 세포를 유도할 수 있으나, 전능성 세포는 체세포에 있는 줄기 세포-특이적 유전자의 mRNA 번역을 활성화시킴으로써 확립될 수 있다(도 17).
본 연구결과는 SCNT, 배아 이용뿐만 아니라 생식세포를 이용하지 않고 성체 인간 기관으로부터 자가 전능성 세포 확립의 가능성을 제시하며, ES 세포 연구의 한계를 극복할 수 있는데 기여한다. 면역-특이적 전능성 세포를 유도하기 위한 이러한 새롭게-제시된 대안은 세포/조직 치료를 수행하는 데 있어 윤리적인 논란을 확실히 피할 수 있다.
확립된 세포의 세포적 및 유전적 진화와 배아-유래 전능성 세포성을 갖는 성체 조직-유래 ES 세포간의 비교는 향후 신규한 세포 및 조직 치료법의 개발을 위한 수많은 단서를 제공할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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14. Seabright, M. A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet 2, 971-972 (1971).

Claims (80)

  1. 다음 단계를 포함하는 섬유아세포 유래로서 4배체 핵형을 갖는 배아줄기세포(ESC)-유사 세포 제조방법:
    (a) 마우스의 난소로부터 성체줄기세포를 포함하는 제1세포군을 수득하는 단계로, 상기 제1세포군은 난소 기질세포가 제거된 난소세포를 포함하며;
    (b) 마우스 조직으로부터 상기 제1세포군과 상이한 제2체세포군을 수득하는 단계로, 상기 제2체세포군은 마우스 배아 섬유아세포이고;
    (c) 상기 제2체세포군으로부터 콜로니를 형성하기 위하여 충분한 시간동안 상기 제1세포군 및 상기 제2체세포군을 4,000-6,000 units/㎖의 백혈병 억제 인자가 포함된 배지에서 공동배양 하는 단계; 및
    (d) ESC-유사 세포를 제조하기 위하여 충분한 시간동안 상기 콜로니의 세포를 1,000-2,000 units/㎖의 백혈병 억제 인자가 포함된 배지에서 계대 배양하는 단계로서, 상기 ESC-유사 세포는 4배체 핵형을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
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  4. 제 1 항에 있어서, 상기 제1세포군은 2이상의 세포 타입(types)을 포함하는 이종 군(heterogeneous population)인 것을 특징으로 하는 방법.
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  7. 제 1 항에 있어서, 상기 제2체세포군은 유사 분열적으로 불활성인 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 제2체세포군은 배양 플레이트에 접착성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
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  12. 제 1 항에 있어서, 상기 난소 세포는 난모 세포, 전강 난포(preantral follicles) 및 강 난포(antral follicles)가 제거된 것을 특징으로 하는 방법.
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  22. 다음 단계를 포함하는 섬유아세포 유래로서 4배체 핵형을 갖는 배아줄기세포(ESC)-유사 세포 제조방법:
    (a) 마우스 난소로부터 성체줄기세포를 포함하는 난소 니치(niche)를 수득하는 단계로, 상기 난소 니치는 난모 세포, 전강 난포 및 강 난포가 제거된 난소세포이며;
    (b) 마우스 조직으로부터 상기 난소 니치와 상이한 체세포군을 수득하는 단계로, 상기 체세포는 마우스 배아 섬유아세포이고;
    (c) 상기 체세포군으로부터 콜로니를 형성하기 위하여 충분한 시간동안 상기 난소 니치 및 체세포를 4,000-6,000 units/㎖의 백혈병 억제 인자가 포함된 배지에서 공동배양 하는 단계; 및
    (d) ESC-유사 세포를 제조하기 위하여 충분한 시간동안 상기 콜로니의 세포를 1,000-2,000 units/㎖의 백혈병 억제 인자가 포함된 배지에서 계대배양 하는 단계.
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  26. 제 22 항에 있어서, 상기 난소 니치는 2이상의 세포 타입을 포함하는 이종 군인 것을 특징으로 하는 방법.
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  29. 제 22 항에 있어서, 상기 체세포군은 유사 분열적으로 불활성인 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 22 항에 있어서, 상기 체세포군은 배양 플레이트에 접착성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
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  44. 제 1 항, 제 4 항, 제 7 항, 제 8 항 및 제 12 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 배아줄기세포(ESC)-유사 세포.
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