KR20060089774A - 서로 다른 개체로부터 유래된 체세포와 난자로부터 유래된 인간 배아 줄기세포 및 그 제조방법 - Google Patents
서로 다른 개체로부터 유래된 체세포와 난자로부터 유래된 인간 배아 줄기세포 및 그 제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20060089774A KR20060089774A KR1020050010509A KR20050010509A KR20060089774A KR 20060089774 A KR20060089774 A KR 20060089774A KR 1020050010509 A KR1020050010509 A KR 1020050010509A KR 20050010509 A KR20050010509 A KR 20050010509A KR 20060089774 A KR20060089774 A KR 20060089774A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- cell
- embryonic stem
- egg
- human
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 328
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 138
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 77
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 title description 18
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims abstract description 149
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 86
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims abstract description 73
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 68
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims abstract description 59
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims abstract description 38
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims abstract description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 26
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 62
- BVIAOQMSVZHOJM-UHFFFAOYSA-N N(6),N(6)-dimethyladenine Chemical compound CN(C)C1=NC=NC2=C1N=CN2 BVIAOQMSVZHOJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 44
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 40
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 35
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 32
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 23
- 210000005155 neural progenitor cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 22
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 20
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 20
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 16
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 claims description 16
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 16
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 claims description 14
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 14
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims description 13
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 13
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 13
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 13
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 13
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 13
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims description 13
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 claims description 13
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 12
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 claims description 10
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 10
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 claims description 10
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 claims description 10
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 claims description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 9
- 238000011124 ex vivo culture Methods 0.000 claims description 9
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 claims description 8
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 7
- XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 5-aza-2'-deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)N=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XAUDJQYHKZQPEU-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 6
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims description 6
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 3
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 abstract description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 132
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 62
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 39
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 31
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 24
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 20
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 16
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 16
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 15
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 15
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 15
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 14
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 12
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 12
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 12
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 11
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 11
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 10
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 9
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 9
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 9
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 9
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 8
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 8
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 8
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 7
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 6
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 6
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 6
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 6
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 6
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 6
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 6
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 6
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 5
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 5
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 4
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 4
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 4
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 4
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 4
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 4
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 4
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 4
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 4
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 4
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 4
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 4
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 description 4
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N (2s,4s,5r,6r)-5-acetamido-2-{[(2s,3r,4s,5s,6r)-2-{[(2r,3r,4r,5r)-5-acetamido-1,2-dihydroxy-6-oxo-4-{[(2s,3s,4r,5s,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy}hexan-3-yl]oxy}-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-4-hydroxy-6-[(1r,2r)-1,2,3-trihydrox Chemical group O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@H]([C@@H](NC(C)=O)C=O)[C@@H]([C@H](O)CO)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 LAQPKDLYOBZWBT-NYLDSJSYSA-N 0.000 description 3
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 3
- 229940064804 betadine Drugs 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 3
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 3
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 3
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 3
- 108010086652 phytohemagglutinin-P Proteins 0.000 description 3
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 3
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 3
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 3
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 101710083889 Alpha-fetoprotein Proteins 0.000 description 2
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002723 Atrial Natriuretic Factor Human genes 0.000 description 2
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 2
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 2
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 101100279438 Caenorhabditis elegans egg-3 gene Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 2
- 229920000089 Cyclic olefin copolymer Polymers 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 208000021309 Germ cell tumor Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 101100013973 Mus musculus Gata4 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100031790 Myelin expression factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 101710107751 Myelin expression factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 208000034176 Neoplasms, Germ Cell and Embryonal Diseases 0.000 description 2
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 2
- 102100036859 Troponin I, cardiac muscle Human genes 0.000 description 2
- 101710128251 Troponin I, cardiac muscle Proteins 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108010051583 Ventricular Myosins Proteins 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 2
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 description 2
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 208000013557 cerebral hemisphere cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 2
- 201000008860 cerebrum cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 2
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 2
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 2
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 229940001447 lactate Drugs 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000000276 neural tube Anatomy 0.000 description 2
- 238000010449 nuclear transplantation Methods 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 239000002985 plastic film Substances 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920002714 polyornithine Polymers 0.000 description 2
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 description 2
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 description 2
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 238000010374 somatic cell nuclear transfer Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 1
- 102000010825 Actinin Human genes 0.000 description 1
- 108010063503 Actinin Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 238000011749 CBA mouse Methods 0.000 description 1
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036912 Desmin Human genes 0.000 description 1
- 108010044052 Desmin Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- 102000058058 Glucose Transporter Type 2 Human genes 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010090293 Growth Differentiation Factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100035364 Growth/differentiation factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000270923 Hesperostipa comata Species 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000603702 Homo sapiens Neurogenin-3 Proteins 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 description 1
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 description 1
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100038553 Neurogenin-3 Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 101710183548 Pyridoxal 5'-phosphate synthase subunit PdxS Proteins 0.000 description 1
- 102100035459 Pyruvate dehydrogenase protein X component, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 108091006299 SLC2A2 Proteins 0.000 description 1
- 241001665167 Solter Species 0.000 description 1
- 208000020339 Spinal injury Diseases 0.000 description 1
- 108010057517 Strep-avidin conjugated horseradish peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000005937 Tropomyosin Human genes 0.000 description 1
- 108010030743 Tropomyosin Proteins 0.000 description 1
- 102000004987 Troponin T Human genes 0.000 description 1
- 108090001108 Troponin T Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 239000003710 calcium ionophore Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 210000005045 desmin Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CJAONIOAQZUHPN-KKLWWLSJSA-N ethyl 12-[[2-[(2r,3r)-3-[2-[(12-ethoxy-12-oxododecyl)-methylamino]-2-oxoethoxy]butan-2-yl]oxyacetyl]-methylamino]dodecanoate Chemical compound CCOC(=O)CCCCCCCCCCCN(C)C(=O)CO[C@H](C)[C@@H](C)OCC(=O)N(C)CCCCCCCCCCCC(=O)OCC CJAONIOAQZUHPN-KKLWWLSJSA-N 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- ZEQMQPCXFPCFDI-UHFFFAOYSA-N formaldehyde;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;propan-2-one Chemical compound O=C.CC(C)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O ZEQMQPCXFPCFDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940099552 hyaluronan Drugs 0.000 description 1
- KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N hyaluronan Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)C1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H](C(O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-MNSSHETKSA-N 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 1
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 229960002195 perazine Drugs 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- -1 polyacid Chemical compound 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229940082569 selenite Drugs 0.000 description 1
- MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L selenite(2-) Chemical compound [O-][Se]([O-])=O MCAHWIHFGHIESP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 229940091258 selenium supplement Drugs 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001057 smooth muscle myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000024642 stem cell division Effects 0.000 description 1
- 230000023895 stem cell maintenance Effects 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000001608 teratocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A46—BRUSHWARE
- A46B—BRUSHES
- A46B15/00—Other brushes; Brushes with additional arrangements
- A46B15/0055—Brushes combined with other articles normally separate from the brushing process, e.g. combs, razors, mirrors
- A46B15/0075—Brushes with an additional massage device
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A46—BRUSHWARE
- A46B—BRUSHES
- A46B9/00—Arrangements of the bristles in the brush body
- A46B9/08—Supports or guides for bristles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A46—BRUSHWARE
- A46B—BRUSHES
- A46B2200/00—Brushes characterized by their functions, uses or applications
- A46B2200/10—For human or animal care
- A46B2200/1066—Toothbrush for cleaning the teeth or dentures
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
- C12N2500/14—Calcium; Ca chelators; Calcitonin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
- C12N2500/16—Magnesium; Mg chelators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/46—Amines, e.g. putrescine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/23—Interleukins [IL]
- C12N2501/235—Leukemia inhibitory factor [LIF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
- C12N2517/04—Cells produced using nuclear transfer
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 인간 체세포의 핵을 탈핵된 인간 난자로 이식하여 제조된 핵이식된 난자로부터 유래된 배아 줄기세포로서, 상기 체세포와 상기 난자는 서로 다른 개체로부터 유래된 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포, 그 배아 줄기세포의 제조방법 및 그 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따라 제조된 자가 핵이식란으로부터 유래된 자가 배아 줄기세포는 이식받을 개체의 게놈을 가지고 있기 때문에 면역 거부반응 없이 이식할 수 있을 뿐만 아니라, 체세포와 난자가 서로 다른 개체로부터 유래된 경우, 즉 난자를 생산할 수 없는 남성이나, 가임기가 아닌 여성의 경우에도 자신의 체세포의 핵이 이식된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기세포를 얻을 수 있는 장점이 있다.
자가 핵이식란, 자가 배아 줄기세포, 배반포, 리프로그래밍, 배아체, 분화, 심근 세포, 베타 세포, 신경 전구세포, 척수 손상 치료, 손상된 세포, 조직 또는 기관의 복구, 장기 기능의 회복
Description
도 1a 내지 도 1g는 본 발명에 따른 자가 핵이식란으로부터 유래한 자가 ES 세포의 면역형광염색 사진이다(A;x100, B;x200). 도 1a AP(알칼라인 포스파타제), 도 1b는 SSEA-1, 도 1c는 SSEA-3, 도 1d는 SSEA-4, 도 1e는 TRA-1-60, 도 1f는 TRA-1-81 및 도 1g는 Oct-4에 관한 것이다.
도 2a는 본 발명에 따라 수득된 미분화 콜로니에 ITSF(즉, 인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레나이트 및 피브로넥틴)를 첨가하여 분화된 신경 전구세포의 형광염색 사진이다(x400). 도 2b는 상기 신경 전구세포로부터 더 분화된 뉴로 필라멘트의 형광 염색 사진이다(x400).
도 3은 고정용 피펫(1)과 절개용 피펫(2)으로 난자(3)의 투명대를 절개하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 4는 고정용 피펫(1)과 절개용 피펫(2)으로 난자(3)의 제 1극체와 핵을 제거하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 5는 고정용 피펫(1)과 이식용 피펫(4)으로 탈핵된 수핵 난자(3)에 체세포 를 이식하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 6a는 본 발명에 따라 제조된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기세포주의 핵형과 상기 배아 줄기세포주를 확립하기 위해 사용된 핵을 제공한 남성 환자의 체세포의 핵형을 분석한 결과를 나타낸 사진이다. 도 6b 내지 도 6e는 DNA 지문법 분석결과를 나타낸 사진이다.
도 7a 내지 도 7c는 본 발명에 따른 미분화 콜로니를 면역이 결핍된 마우스의 고환에 주입한 후 형성된 기형종 내에서 확인된 3배엽 세포 사진이다(도 7a: 연골, 도 7b: 장관, 도 7c: 신경관 (모두;x200)).
본 발명은 배아 줄기세포의 제조방법 및 그 제조된 배아 줄기세포로부터 원하는 특정 세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 서로 다른 인간 개체로부터 유래된 체세포 및 난자로부터 배아 줄기세포를 제조하는 방법으로서, 특정 세포 또는 조직을 받을 것으로 예상되는 인간 환자로부터 분리된 체세포 핵을 탈핵된 인간 난자에 이식하여 형성된 핵이식란을 배반포까지 배양하고, 상기 배반포로부터 분리한 내세포괴를 배양하여 자가 배아 줄기세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 제조된 자가 배아 줄기세포로부터 상기 특정 세포로 분화시키는 방법에 관한 것이다.
일반적으로, 줄기세포(stem cell)는 인체를 구성하는 모든 종류의 성숙한 기능성 세포로 발생할 수 있는 미분화 세포를 말한다. 예를 들면, 조혈모세포(hematopoietic stem cell)는 최종적으로 분화된 여러 타입의 혈구 세포들 중 어느 하나로 발생할 수 있다. 배아 줄기(embryonic stem, ES) 세포는 배아로부터 유래된 다능성(pluripotent) 세포이므로 인체를 구성하는 모든 종류의 기관, 조직, 세포로 분화, 발달할 수 있는 능력을 가지고 있다.
1981년에 이루어진 마우스 ES 세포주의 수립은 인간 ES 세포의 발달을 위한 상당한 기술 및 범례(paradigm)를 제공하였다. ES 세포의 발달은 마우스의 기형암종(teratocarcinoma, 일부 동종번식된 계통(strain)의 생식선에서 발생하는 종양)에 대한 연구로부터 전개되었다(Evans and Kaufman et al., Nature, 292:154-156(1981)).
봉소 등(Bongso et al. Human Reproduction, 9:2110-2117(1994))은 생체 외에서 수정된 인간 배아로부터 나온 세포의 단기간 배양 및 유지 방법에 대하여 보고하였다. 봉소 등에 의해서 분리된 세포들은 다능성 줄기세포에서 예상되는 형태(morphology)를 가지고 있었지만, 이러한 초기 연구는 적절한 영양 세포층(feeder cell layer)을 이용하지 못했기 때문에 장기간 배양하는 것은 불가능하였다.
붉은 털 원숭이(rhesus monkey) 또는 비단 원숭이(marmoset monkey)의 배반포로부터 영장류의 ES 세포 제조가 보고되었다. 이러한 영장류의 세포는 이배체(diploid)이고, 이들의 가장 가까운 상대자인 인간의 ES 세포와 매우 유사하였다. 원숭이 및 인간의 ES 세포에 대한 연구로부터 이들의 ES 세포는 마우스 ES 세포와 표현형에서 다소 상이하지만, 다능성 줄기세포가 인간의 배반포로부터 유래될 수 있다는 것을 시사하였다(Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7844-7848(1995)).
1998년 톰슨 등에 의해서 개발된 다능성 인간 줄기세포주의 특성은 다음과 같다(Thomson et al., Science, 282:1145-1147(1998)):
(1) SSEA-3 (stage-specific embryonic antigen-3), SSEA-4 (stage-specific embryonic antigen-4), TRA 1-60(tumor rejection antigen 1-60), GCTM-2(germ cell tumor marker-2), TRA 1-81(tumor rejection antigen 1-81), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), Oct-4 (octamer-4)를 발현함
(2) 높은 텔로머라아제 활성을 나타냄
(3) 마우스에 주입시 3 배엽 세포들로 분화함
(4) 영양 세포에 의존함
(5) 백혈병 억제 인자(hLIF)에 반응하지 않음.
톰슨 등은 불임 치료 중인 커플로부터 기증받은 잉여 배반포로부터 ES 세포를 수득하였다. 구체적으로, ES 세포 확립을 억제하는 것으로 예상되었던 영양외배엽(trophectoderm)을 면역수술(immunosurgery)적 방법으로 제거하였고, 내세포괴(inner cell mass ICM)를 마우스의 배아에서 유래된 섬유아 영양 세포층에 플레이팅(plating)하고, 짧은 부착 및 확장 기간 후, 또 다른 영양 세포 층상에 다시 플레이팅하였다. 마우스 ES 세포 프로토콜과는 배지 또는 배양 시스템에서 커다란 차 이는 없었지만 상대적으로 높은 성공률이 달성되었다.
인간에서의 다능성 ES 세포의 분리 및 포유동물에서의 체세포 핵전달 기술의 발전(SCNT) (Solter, Nat. Rev. Genet., 1, 199-207, 2000)은 인간에서도 체세포 핵전달을 이용하여 조직 복구 및 이식용 의약 연구에 응용될 수 있는 미분화 세포의 무한 원천을 제공할 수 있다는 가능성을 증가시켰다. 이러한 "치료적 복제"의 개념은 체세포의 핵을 탈핵된 난자에 전달하는 것을 의미한다 (Lanza et al., Nat Med., 5, 975-977, 1999). 소에서의 ES-유사 세포 생산 (Cibelli et al., Nat. Biotechnol., 16, 642-646, 1998) 및 복제된 배반포의 내세포괴로부터 마우스 ES 세포의 생산 (Munsie et al., Curr. Biol., 10, 989-992, 2000; Wakayama et al., Science, 292, 740-743, 2001), 그리고 복제된 인간 배아를 8 내지 10 세포기까지 발달 (Cibelli et al., J. Regen. Med., 26, 25-31, 2001)시킨 것에 대한 이전의 보고들은 세포 치료적 복제의 가능성을 제공하였다.
비록 인간이 아닌 포유류의 난자를 이용하여 ES 세포주가 제조될 수 있다는 것이 다수의 논문에 기재되어 있지만, 아직까지 핵이식 기술분야에서 인간 난자로부터 ES 세포주를 제조하였다는 보고는 없다.
ES 세포를 적용할 때, 핵 공여체로서 세포 또는 조직을 이식받을 환자로부터 유래된 체세포를 사용하면, 면역 거부반응 등의 부작용을 피할 수 있다. 만일 환자가 가임기 여성이라면 본인의 난자와 체세포를 사용할 수 있다. 그러나, 환자가 남성, 여자 어린이 또는 폐경기 이후의 여성인 경우에는, 자신의 난자를 사용할 수 없으므로, 타인의 난자를 사용하여야만 한다. 그러나, 난자의 유래와 체세포의 유 래가 다르게 되면, 줄기세포를 성공적으로 얻을 확률이 현저히 낮아지는 문제점이 있다. 따라서, 궁극적으로는 이를 극복하는 것이 중요한 목표가 되어 왔다.
본 발명자들은 예의 연구한 결과, 특정하게 선택된 조건 하에서 핵이식된 인간 난자를 성공적으로 배양할 수 있고, 이로부터 배아 줄기세포주를 확립할 수 있다는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간의 체세포 핵을 탈핵된 인간 난자에 이식하여 형성된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기세포를 제공하는 것이다.
더 나아가서는, 본 발명의 목적은, 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화된 세포 또는 조직을 이식받을 환자로부터 유래된 체세포의 핵을 타인의 탈핵 난자에 이식하여 배양함으로써 배아 줄기세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 체세포와 난자가 서로 다른 개체에서 유래된 경우, 즉 난자를 생산할 수 없는 남성이나, 가임기가 아닌 여성의 경우에도 자신의 체세포의 핵이 이식된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기세포를 제공하는 것이다.
본 발명은 또 다른 목적은 본 발명에 따라 제조된 핵이식란의 생체외 배양에 적합한 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간의 체세포 핵을 탈핵된 인간 난자에 이식하여 형성된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기세포주에서 분화된 신경 전구세포, 베타 세포, 심근 세포 등의 특정 세포 또는 조직을 제공하는 것이다.
더 나아가, 본 발명의 또 다른 목적은, 자가 배아 줄기세포로부터 분화된 신경 전구세포, 베타 세포, 심근 세포 등의 세포 또는 조직을 자가 핵이식란의 핵을 공여한 환자에 이식하여, 손상된 조직이나 장기를 회복시키는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위한, 본 발명에 의한 배아 줄기세포는, 인간 체세포의 핵을 탈핵된 인간 난자로 이식하여 제조된 핵이식된 난자로부터 유래된 배아 줄기세포로서, 상기 체세포와 상기 난자는 서로 다른 개체로부터 유래된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 또 다른 배아 줄기세포는, 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포 또는 조직을 이식받을 인간 환자의 체세포의 핵을 탈핵된 인간 난자로 이식하여 제조된 핵이식된 난자로부터 유래된 인간 자가 배아 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 배아 줄기세포를 제조하는 방법은,
(1) 한 개체로부터 유래된 인간 체세포를 배양하여 공여핵 세포를 준비하는 단계;
(2) 상기 개체와는 다른 개체로부터 유래된, 인간 난자를 탈핵하여 수핵 난자를 준비하는 단계
(3) 상기 공여핵 세포의 핵을 상기 수핵 난자에 이식하고, 상기 공여핵 세포의 핵과 상기 수핵 난자를 융합시킴으로써 자가 핵이식란을 제조하는 단계
(4) 상기 자가 핵이식란을 리프로그래밍, 활성화 및 생체외 배양시켜 배반포를 형성하는 단계 및
(5) 상기 배반포로부터 내세포괴를 분리하고, 상기 내세포괴를 미분화상태로 배양하여 자가 배아 줄기세포주를 확립하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 배아 줄기세포를 제조하는 또 다른 방법은,
(1) 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포 또는 조직을 이식받을 인간 환자의 체세포를 배양하여 공여핵 세포를 준비하는 단계;
(2) 인간 난자를 탈핵하여 수핵 난자를 준비하는 단계;
(3) 상기 공여핵 세포의 핵을 상기 수핵 난자에 이식하고, 상기 공여핵 세포의 핵과 상기 수핵 난자를 융합시킴으로써 자가 핵이식란을 제조하는 단계;
(4) 상기 자가 핵이식란을 리프로그래밍, 활성화 및 생체외 배양시켜 배반포를 형성하는 단계; 및
(5) 상기 배반포로부터 내세포괴를 분리하고, 상기 내세포괴를 미분화상태로 배양하여 자가 배아 줄기세포주를 확립하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명에 의한 배아 줄기세포로부터 분화된 세포는, 인간 체세포의 핵을 탈핵된 인간 난자로 이식하여 제조된 핵이식된 난자로부터 유래된 배아 줄기세포로부터 분화된 세포로서, 상기 체세포와 상기 난자는 서로 다른 개체로부터 유래된 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 또 다른 배아 줄기세포로부터 분화된 세포는, 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포 또는 조직을 이식받을 인간 환자의 체세포의 핵을 탈핵된 인 간 난자로 이식하여 제조된 핵이식된 난자로부터 유래된 자가 배아 줄기세포인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 의한 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법은,
(1) 인간 체세포의 핵을 탈핵된 인간 난자로 이식하여 제조된 핵이식된 난자로부터 유래된 배아 줄기세포로서, 상기 체세포와 상기 난자는 서로 다른 개체로부터 유래된 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포를 배양하여 배아체를(embryoid body)를 형성하는 단계
(2) 상기 배아체를, 상기 배아체의 세포를 특정 세포로 분화시키기에 적합한 제제의 존재 하에 배양하는 단계 및
(3) 상기 특정 세포를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 인간 배아 줄기세포로부터 특정 세포를 분화시키는 또 다른 방법으로서,
(1) 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포 또는 조직을 이식받을 인간 환자의 체세포의 핵을 탈핵된 인간 난자로 이식하여 제조된 핵이식된 난자로부터 유래된 자가 배아 줄기세포를 배양하여 배아체를(embryoid body)를 형성하는 단계 및
(2) 상기 배아체를, 상기 배아체의 세포를 특정 세포로 분화시키기에 적합한 제제의 존재 하에 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기한 배아 줄기세포, 그 제조방법, 배아 줄기세포로부터 분화된 세포, 그 제조방법에 있어서, 상기 체세포는 남성 또는 가임기가 아닌 여성으로부터 유래된 것임을 특징으로 한다.
상기한 본 발명에 의한 배아 줄기세포의 제조방법에 있어서, 상기 (3) 단계는, 상기 공여핵 세포와 상기 수핵 난자와의 세포 융합에 의해 수행되는 것이 바람직하다.
상기한 본 발명에 의한 배아 줄기세포의 제조방법에 있어서, 상기 (4) 단계의 리프로그래밍은 바람직하게는 20시간 이하, 더 바람직하게는 6시간 이하, 더 바람직하게는 3시간 이하, 가장 바람직하게는 2시간 이하의 시간동안 수행된다.
상기한 본 발명에 의한 배아 줄기세포의 제조방법에 있어서, 상기 (4)단계의 활성화는 상기 핵이식된 난자를 칼슘 이온 운반체로 처리한 다음 6-디메틸아미노퓨린으로 처리하여 수행되는 것이 바람직하다.
상기한 본 발명에 의한 배아 줄기세포의 제조방법에 있어서, 상기 칼슘 이온 운반체의 농도는 바람직하게는, 5μM 내지 15μM, 더 바람직하게는 약 10μM이다.
상기한 본 발명에 의한 배아 줄기세포의 제조방법에 있어서, 상기 6-디메틸아미노퓨린의 농도는 바람직하게는, 1.5mM 내지 2.5mM, 더 바람직하게는 약 2.0mM이다.
상기한 본 발명에 의한 배아 줄기세포의 제조방법에 있어서, 상기 (4)단계의 생체외 배양은 적어도 둘 이상의 배지를 이용하여 연속적으로 수행되며, 상기 각 배지는 서로 다른 조성을 갖는 것이 바람직하다.
상기한 본 발명에 의한 배아 줄기세포의 제조방법에 있어서, 상기 생체외 배양은 서로 다른 조성을 갖는 두 종류의 배지를 연속적으로 사용하여 수행되는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는, G1 ver.3 배지에서 일차배양을 하고, HSA가 포함된 mSOFaa 배지 즉, SNUnt-2' 배지에서 이차배양을 하는 것이다. 여기서 HSA가 포함된 mSOFaa 배지는 10%의 HSA가 포함된 mSOFaa 배지인 것이 바람직하다.
상기한 본 발명에 의한 배아 줄기세포의 제조방법에 있어서, 상기 (5)단계에서 내세포괴는 인간 유래의 섬유아세포 및 마우스 유래의 섬유아세포가 혼합된 영양 세포층 상에서 배양되는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포 또는 조직을 이식받을 인간 환자로부터 유래된 체세포, 바람직하게는 섬유아세포를 포함하는 영양 세포층 상에서 배양된다. 가장 바람직하게는, 자가 배아 줄기세포로부터 분화된 세포, 바람직하게는 섬유아세포를 포함하는 영양 세포층 상에서 배양된다.
상기한 본 발명에 의한 배아 줄기세포로부터 분화된 세포 또는 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법에 있어서, 상기 세포는 조혈모 세포, 신경 전구세포, 신경 세포, 베타 세포, 근육 세포, 간 세포, 연골 세포, 상피 세포 및 심근 세포 중 어느 하나 이상일 수 있다.
상기한 본 발명에 의한 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법에 있어서, 상기 특정 세포가 신경 전구세포인 경우, 상기 (2)단계 이후에,신경 전구세포의 마커를 발현하는 세포를 선별하는 단계를 더 포함하는 것이 바람직하다. 여기서 상기 (2)단계의 제제는, 인슐린, 트랜스페린, 소디움 셀레나이트 및 피브로넥틴의 혼합물, 레티노산(Retinoic Acid), 아스코르브산(Ascorbic acid), 니코틴아마이드, N-2 보충제 및 B-27 보충제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이 사용될 수 있 다.
상기한 본 발명에 의한 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법에 있어서, 상기 특정 세포가 베타 세포인 경우, 상기 (2)단계의 제제는, 인슐린, 트랜스페린, 소디움 셀레나이트 및 피브로넥틴의 혼합물, 니코틴아마이드, N-2 보충제 및 B-27 보충제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다.
상기한 본 발명에 의한 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법에 있어서, 상기 특정 세포가 베타세포인 경우, 상기 (2)단계는, (i) 배아체를, 인슐린, 트랜스페린, 소디움 셀레나이트 및 피브로넥틴의 혼합물을 포함하는 배지에 깔고, N-2 보충제, B-27 보충제 및 bFGF를 상기 배지에 보충하고 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 (i) 단계의 배지에서 bFGF를 제거하고 니코틴아마이드를 첨가하고 글루코오스의 농도를 500mg/l 내지 1500mg/l로 낮춘 후 상기 배아체를 배양하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 양태로서 상기 글루코오스의 농도를 901mg/l까지 낮추는 것을 들 수 있다. 상기와 같은 글루코오스의 농도 범위는 베타 세포의 분화를 촉진한다.
상기한 본 발명에 의한 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법에 있어서, 상기 특정 세포가 심근 세포인 경우, 상기 (2)단계의 제제는, 디메틸 술폭시드(DMSO), 레티노산 및 5-아자-2'-데옥시시티딘 (5-aza-dC)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하다.
한편, 본 발명에 따른 손상된 세포, 조직 또는 기관의 복구용 조성물은, 손상된 세포, 조직 또는 기관의 복구를 위해 개체에 투여되는 조성물로서, 상기한 본 발명에 따른 인간 배아 줄기세포, 상기한 본 발명에 따른 분화된 세포, 상기 세포들로부터 유래된 조직 및 상기 조직으로부터 유래된 기관으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 세포, 조직 또는 기관 이식용 키트는, 손상된 세포, 조직 또는 기관의 복구를 위해 개체에 세포, 조직 또는 기관을 이식하기 위한 세포, 조직 또는 기관 이식용 키트로서, 상기한 본 발명에 따른 인간 배아 줄기세포, 상기한 본 발명에 따른 분화된 세포, 상기 세포들로부터 유래된 조직 및 상기 조직으로부터 유래된 기관으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 개체의 손상된 세포, 조직 또는 기관을 복구하는 방법은, 상기한 본 발명에 따른 인간 배아 줄기세포, 상기한 본 발명에 따른 분화된 세포, 상기 세포들로부터 유래된 조직 및 상기 조직으로부터 유래된 기관으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을, 상기 배아 줄기세포의 제조를 위해 체세포를 공여한 개체에 이식하여, 상기 개체의 손상된 세포, 조직 또는 기관을 복구하는 것임을 특징으로 한다.
상기한 본 발명에 따른, 조성물, 이식용 키트 및 방법에 있어서, 상기 인간 배아 줄기세포 또는 상기 분화된 세포는 환자의 질환의 치료에 적합하도록 유전자가 변형될 수 있다.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 살펴본다.
본원 명세서에서 사용된 용어 "핵 이식"은 체세포 (또는 "공여핵 세포"로 표기함)의 핵을 탈핵된 난자 (또는 "수핵 난자"로 표기함)에 이식하는 과정을 의미하며, 이러한 과정에 의해서 수득된 세포를 "핵이식란"이라고 한다. 본 명세서에 사용된 용어 "체세포"는 단일의 염색체(n)를 갖는 생식세포를 제외하고 2배체(diploid)의 염색체(2n)를 갖는, 인체를 구성하는 모든 세포를 의미한다.
본원 명세서에서 사용된 용어 "자가 핵이식란"이란, 체세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 수득한 핵이식란으로서, 상기 핵이식란으로부터 유래된 줄기세포 또는 상기 줄기세포로부터 분화된 특정 세포 또는 조직을 받을 것으로 예상되는 남성 또는 여성 환자로부터 분리된 체세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 수득한 핵이식란을 의미한다.
자가 핵이식란으로부터 유래된 특정 세포 또는 조직을 받는 환자는 그러한 세포 또는 조직이 환자 자신의 유전자형을 가지기 때문에 면역거부반응을 나타내지 않을 것으로 예상된다.
본원 명세서에서 사용된 용어 "배아 줄기세포(ES cell)"는 배아(embryo)로부터 유래되어 다양한 세포 타입으로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있는 미분화 세포를 말한다. 일반적으로 "배아"는 수정 후 약 8주 까지의 수정란 또는 그에 상응하는 발생단계에 있는 핵이식란을 말한다. 배아는 수정란 또는 핵이식란의 반복적인 분할(division)에 의해 발생하며, 일반적으로 내세포괴(inner cell mass, ICM) 및 외부 영양막 세포(outer trophectoderm)를 함유하는 배반포(blastocyst) 단계를 포함한다.
따라서, 본원 명세서에 사용된 용어 "자가 배아 줄기세포(또는 "hntES 세포주"로 표기함)"란, 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포 또는 조직을 이식받을 환자로부터 분리된 체세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 수득된 자가 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기세포를 의미한다.
본원 명세서에서 사용된 용어 "자가 영양 세포층(auto feeder layer)은 이식을 받을 환자의 자가 핵 이식란으로부터 유래한 자가 배아 줄기세포로부터 분화된 세포를 포함하는 세포층으로서, 줄기세포의 확립을 위해 사용되는 영양 세포층(feeder)을 의미한다.
본원 명세서에서 사용된 용어 "신경 전구세포(neuro progenitors)"는 뉴론과 성상교세포(astrocytes), 희돌기교세포(oligodendrocytes), 슈완세포(schwann cells), 위선 세포(satellite cells), 상의 세포(ependymal cells) 및 마이크로글리아(microglia)의 글리아 등의 신경세포로 분화되는 세포를 말한다.
이하에서는, 본 발명에 따른 자가 배아 줄기세포주의 제조방법을 각 단계별로 구체적으로 기술한다.
제1 단계 : 공여핵 세포의 준비
본 발명에서는 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포 또는 조직을 이식받을 환자의 체세포를 배양하여 공여핵 세포로 준비한다. 여성 또는 남성의 체세포가 모 두 공여핵 세포로 이용될 수 있으며, 이들 체세포는 탈핵된 인간 난자에 핵을 공여하게 된다.
인간으로부터 얻을 수 있는 체세포라면 모두 공여핵 세포로 이용될 수 있다. 또한, 상업적 목적으로 인간의 세포를 저장하는 기관으로부터 얻은 체세포를 사용할 수도 있다. 예를 들어, 인간의 피부 세포, 신경세포, 난관상피세포 또는 난구 세포 등이 공여핵 세포로 이용될 수 있다.
이들 공여핵 세포는 예를 들면, 마더(Marther) 및 바네스(Barnes) 방법(참조 : Animal Cell Culture Methods, Vol.57 of Methods in Cell Biology, Marther & Barnes, eds., Academic Press, 1998)을 응용하여 배양함으로써 세포주로 작제할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 배양의 한 양태는 수득한 체세포에 자궁관류액 및 P/S 항생제(페니실린 10,000IU, 스트렙토마이신 10mg)가 함유된 인산염 완충 식염수(PBS)를 첨가하고, 원심 분리하여 세척한 다음, 인간 혈청(HS, human serum), 비필수 아미노산(NEAA, non-essential amino acid) 및 P/S 항생제가 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium)에서 39℃에서 5%, CO2의 조건으로 배양하는 것이다.
특히, 핵 공여 세포로서 난구세포를 이용하는 경우에는, 난구세포-난모세포 복합체를 히알루로니다제로 처리하여 난모세포를 둘러싸고 있는 난구세포를 분리한 후 트립신-EDTA 용액을 난구세포 층에 첨가하고 그 용액을 포화 습도, 5% CO2 대기, 39℃에 위치시켜 얻을 수 있다. 원심분리 및 세척을 한 후 수거된 난구세포들은 상기 기재된 것과 동일한 조건 하에서 배양할 수 있다.
제2 단계 : 수핵 난자의 준비
본 발명에서 수핵 난자라 함은 난자 자신의 핵을 결여하고, 외부로부터 체세포의 핵을 수여받는 난자를 말한다.
본 발명에서는 당업계에 공지된 방법(Yuzpe et al, J Reprod Med, 34: 937-942, 1989)에 따라 인간의 난소에서 과배란 난자를 채취 및 배양하거나 상업적 목적으로 인간 난자를 저장하는 기관으로부터 난자를 얻고 성숙시켜 성숙한 난자를 준비할 수 있다. 예를 들어, 5% 인간혈청알부민(HSA)이 첨가된 G1 ver.3배지(Vitro Life, Goteborg, Sweden)에서 5% CO2의 조건 하에 약 4 시간 동안 배양함으로써 난자를 성숙시킬 수 있다.
다음으로, 상기 성숙한 난자의 난구 세포(cumulus cell)를 제거한 다음, 난자의 투명대의 일부를 제거하고 제 1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 탈핵된 수핵 난자를 작제할 수 있다.
본 발명에서는 한 양태로서 다음과 같이 탈핵이 수행될 수 있다. 성숙한 난자를 하이알루로니다제가 용해된 세정용 배양액에 넣고, 난구 세포를 물리적으로 제거한 후, 상기 G1 ver.3배지로 세정한다. 그 다음, 난구 세포가 제거된 난자의 투명대를 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 이를 통하여 난자의 전체 세포질의 10 내지 15%에 해당하는 양의 제 1 극체를 포함한 세포질을 제거하여 탈핵시킨다. 이어, 탈핵된 난자를 상기 G1 ver.3배지로 세정하고, 상기 G1 ver.3배지에 정치시킨다.
탈핵 후, 예를 들면 자외선 하에서 Hoechst 33342(Sigma Co., Louis, MO, U.S.A.)로 염색된 세포질체를 관찰함으로써 탈핵 여부를 재확인하는 것이 바람직하다.
제3 단계 : 핵이식란의 제조 및 전기 융합
상기 제1 단계에서와 같이 준비된 공여핵 세포를 제2 단계에서 준비된 수핵 난자에 이식하고, 곧 이어 전기융합시켜 핵이식란을 작제한다.
체세포 핵을 수핵 난자로 이식하기 위하여, 체세포의 핵만을 수핵 난자로 이식할 수도 있고, 체세포 전체를 수핵 난자로 이식할 수도 있다.
본 발명에서 핵 이식 및 전기 융합은 다음의 양태로 수행될 수 있다.
먼저, 상기 제 2단계에서 수득한 G1 ver.3배지에 정치된 탈핵된 난자를 G1 ver.3배지로 세정하고, 이식용 피펫을 사용하여 공여핵 세포를 PHA-P (phytohemagglutin-P)용액에 있는 난자의 투명대에 형성된 절개창으로 주입시켜서 핵이식란을 작제한다. 이어, G1 ver.3배지로 세정하고 정치시킨다.
이어서, 상기 정치된 핵이식란을 세포 조작기를 이용하여 전기 융합시킨다. 핵이식란이 있는 G1 ver.3배지에 만니톨 용액을 첨가한 후, 핵이식란을 함유하는 만니톨 용액을 세포 조작기에 연결시킨 2개 전극 사이에 넣은 다음, 체세포가 (+)전극을 향하도록 핵이식란을 위치시킨다. 그런 다음, 전압은 0.75 내지2.00kV/cm, 시간은 10 내지 20μs, 횟수는 약 1초 간격으로 1 내지 5회의 조건으로 직류전류를 통전하여 핵이식란을 전기 융합시킨다.
마지막으로, 융합된 핵이식란을 만니톨 용액과 G1 ver.3배지로 세정한다. 이때 사용하는 만니톨 용액은 HEPES(4-(2-hydroxyl)-1-perazine ethanesulfonic acid) 완충용액에 BSA 및 만니톨이 용해된 pH 7.2 내지 7.4의 용액이다.
제4 단계 : 핵이식란의 활성화 및 생체 외 배양
본 발명에 따른 핵이식란이 정자와 난자가 합쳐져서 형성된 통상적인 수정란과 같은 발달 과정을 거치기 위해서는 리프로그래밍 시간, 활성화 방법 및 생체외 배양 조건을 적합하게 설정해야 한다.
본 발명에서는 체세포의 핵이 이식된 상기 핵이식란을 활성화시키고 배양함으로써 정상적인 수정 및 발달 과정과 유사한 환경을 제공한다. 즉, 상기 제 3단계에서 전기 융합시킨 핵이식란을 리프로그래밍 시간을 거친 다음 활성화시키고 배반포 단계까지 생체외 배양한다.
리프로그래밍 시간은 수핵 난자와 공여핵 세포를 전기 융합시킨 후 활성화시 키기 전까지 핵이식란을 정치해 놓는 시간을 말하는 것으로, 이 시간은 핵이식란의 발달 능력(특히, 배반포 형성률)에 영향을 미칠 수 있다. 상기 리프로그래밍 시간은 체세포의 유전자 발현 패턴을 핵이식란의 발달에 적합하고 필요한 패턴으로 되돌리는데 필요하다. 이러한 시간은 크로마틴 리모델링 (chromatin remodeling)에 중요한 역할을 하며, 생체내(in vivo) 와 생체외(in vitro)에서 핵이식란의 발달 능력을 결정하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 리프로그래밍 시간은 20시간 이하, 바람직하게는 6 시간 이하, 보다 바람직하게는 3 시간 이하, 가장 바람직하게는 약 2시간이다.
상기의 리프로그래밍 시간이 경과한 후 핵이식란을 활성화시키는데, 본 발명에서 이용 가능한 활성화 방법은 칼슘 이온 운반체(calcium ionophore), 이오노마이신(ionomycin), 에탄올, 타이로드 용액(Tyrode's solution)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.) 및 퓨로마이신(puromycin)과 같은 화학물질(chemical)에 의한 화학적 자극 또는 물리적인 자극 등을 포함한다. 본 발명에서는 리프로그래밍 시간이 경과된 핵이식란에 칼슘 이온 운반체를 처리하는 활성화 방법이 적합하며, 칼슘 이온 운반체를 처리한 다음 6-디메틸아미노퓨린(6-DMAP)을 처리하는 활성화 방법이 바람직하다. 여기서, 상기 칼슘 이온 운반체의 농도는 5μM 내지 15 μM인 것이 바람직하고, 약 10μM인 것이 보다 바람직하다. 또한, 6-DMAP의 농도는 1.5 mM 내지 2.5 mM인 것이 바람직하며, 2.0 mM인 것이 보다 바람직하다.
이때, 칼슘 이온 운반체 및 6-DMAP는 체외 배양용 배지에 용해시켜 사용한다. 체외 배양용 배지로는 알라닌, 알라닐-글루타민, 아스파라진, 아스파테이트, 염화칼슘, EDTA, 글루코오스, 글루타메이트, 히알루로난(hyaluronan), 황산마그네슘, 페니실린G, 염화칼륨, 프롤린, 세린, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 이수소인산나트륨, 소디움 락테이트, 소디움 파이루베이트, 타우린 및 WFI(Water for injection)를 포함하는 G1 ver.3 배지(Vitro Life, Goteborg, Sweden)가 바람직하다.
추가로, 핵이식란의 효율적인 생체 외 배양을 위해서 당업계에 공지된 바와 같이 다양한 에너지 기질(substrate)로 배양 배지를 보충하거나 배아 발달의 단계별로 효과적인 성분들을 함유한 순차적인(sequential) 배양 시스템을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용 가능한 상업적으로 입수할 수 있는 순차적인 배양 시스템에는 예를 들면, G1 ver.3 / mSOFaa (Choi et al, Theriogenology, 58: 1187-1197, (2002)) 배지가 있다. 바람직한 생체외 배양 배지에는 본 발명자들에 의해서 확립된 "인간변형합성난관액 (human modified synthetic oviductal fluid; hmSOFaa) 배지"가 포함되는데, 이 배지를 "SNUnt-2' 배지"라 명명하였다. 상기 hmSOFaa 배지는 mSOFaa 배지 (Choi et al, Theriogenology, 58: 1187-1197, (2002))에 소 혈청 알부민 대신 인간 혈청 알부민(human serum albumin; HSA)을 첨가함으로써 제조된 것이다. 여기서, mSOFaa 배지는 소 배아 배양에 광범위하게 이용되고 있다.
구체적으로, 상기 "SNUnt-2' 배지"는 (1) 95 내지 110mM NaCl, (2) 7.0 내지 7.5mM KCl, (3) 20 내지 30mM NaHCO3, (4) 1.0 내지 1.5mM NaH2PO4, (5) 3 내지 8mM Na-락테이트, (6) 1.5 내지 2.0mM CaCl2·2H2O, (7) 0.3 내지 0.8mM MgCl2·6H
2O, (8) 0.2 내지 0.4mM Na-피루베이트, (9) 1.2 내지 1.7mM 글루코오스, (10) 12 내지 20㎎/㎖ HSA, (11) 0.7 내지 0.8㎍/㎖ 카나마이신, (12) 1.5 내지 3% 필수아미노산, (13) 0.5 내지 1.5% 비필수아미노산, (14) 0.7 내지 1.2mM L-글루타민 및, (15) 0.3 내지 0.7%의 인슐린, 트랜스페린 및 소듐 셀레나이트의 혼합물로 이루어져 있다. 바람직하게 "SNUnt-2' 배지"는 표 1에 정리된 바와 같은 함량의 성분들로 이루어져 있다.
| 성 분 | 농 도 |
| NaCl | 99.1~106mM |
| KCl | 7.2mM |
| NaHCO3 | 25mM |
| NaH2PO4 | 1.2mM |
| Na-락테이트 | 5mM |
| CaCl2·2H2O | 1.7mM |
| MgCl2·6H2O | 0.5mM |
| Na-피루베이트 | 0.3mM |
| 글루코오스 | 1.5mM |
| HSA | 16㎎/㎖ |
| 카나마이신 | 0.75㎍/㎖ |
| 필수아미노산 | 2% |
| 비필수아미노산 | 1% |
| L-글루타민 | 1mM |
| ITS* | 0.5% |
* ITS: 인슐린 1.0 g/L, 트랜스페린 0.55 g/L 및 소듐 셀레나이트 0.67 mg/L의 혼합물
한편, 본 발명에 따른 핵이식란의 생체 외 배양은 서로 다른 배지에서 배양되는 1차 배양 및 2차 배양으로 이루어지는 것이 바람직하며, 1차 배양은 G1 ver 3. 배지에서, 2차 배양은 HSA가 포함된 mSOFaa 배지 또는 SNUnt-2' 배지에서 배양하는 것이 바람직하다. 가장 바람직한 것은, 1차 배양은 G1 ver 3. 배지에서, 2차 배양은 10%의 HSA가 포함된 mSOFaa 배지, 즉 SNUnt-2' 배지에서 배양하는 것이다.
제5 단계 : 투명대 또는 이의 일부분의 제거
상기 제4 단계에서 얻은 배반포로부터 유래된 배아 줄기세포를 수득하기 위해서는 전술한 과정으로 배양된 배반포의 투명대 또는 이의 일부분을 제거해야 한다.
배반포를 먼저 효소 처리하여 투명대(zona pellucida) 또는 이의 일부분을 제거한다. 본 발명에서 배반포로부터 투명대 또는 이의 일부분을 제거하는 방법은 통상적으로 이용되는 방법을 모두 사용할 수 있다. 이러한 예에는 프로나아제(pronase), 산성 타이로드 용액(acid Tyrodes solution) 및 레이저 절개(dissection)와 같은 물리적인 방법 등을 포함한다.
바람직하게는 프로나아제를 이용하는 것이다. 프로나아제는 PBS 및 G2 배지(Vitro Life, Goteborg, Sweden) 또는 S2 배지(Scandinavian IVF Sciences, Goteborg, Sweden)에 용해하여 이용한다. 한 양태로 PBS와 S2 배지를 1:1로 혼합한 배지에 용해하여 이용할 수 있다. 배반포로부터 투명대를 제거하기 위해서 약 0.1% 프로나아제를 투명대가 제거되기에 충분한 시간 동안 적용시킨다. 바람직하게는 약 1-2분, 더욱 바람직하게는 1-1.5분 동안 적용시킨다.
제6 단계 : 영양막 세포의 제거 및 ICMs의 분리
상기에서와 같이, 투명대가 일단 제거되면, 영양막 세포가 노출된다. 이 영양막 세포는 ICMs로부터 완전히 분리되는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 영양막 세포를 ICMs로부터 분리하는데 통상적으로 이용되는 방법이 모두 도입될 수 있다.
본 발명에서는 영양막 세포의 표면에 있는 에피토프에 반응하는 항체 또는 항혈청을 처리하여 영양막 세포를 분리하는 면역수술(immuno-surgery)적 방법 또는 피펫을 사용하는 물리적 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 항체 및 보체 처리를 병행하는 것이다. 이러한 경우에, 항체 및/또는 항혈청 및 보체 처리는 개별적으로 또는 동시에 실시할 수 있다. 바람직한 항체 및/또는 항혈청 및 보체의 조합(combination)은 항-태반 알칼라인 포스파타제 항체(anti-placental alkaline phosphatase antibody, anti-AP) 및 베이비 래빗 보체 (Baby Rabbit complement) 또는 항-인간 혈청 항체(anti-human serum antibody) 및 기니아 피그 보체(Guinea Pig complement) 등을 포함한다.
항체 및 보체는 SNUnt-2', G2.2(Vitro Life, Goteborg, Sweden) 또는 S2 배지에 희석하여 이용한다. G2.2 배지는 알라닌, 알라닐-글루타민, 아르기닌, 아스파라진, 아스파르트산, 염화칼슘, 판토텐산칼슘, 염화콜린, 시스테인, 폴릭산, 글루 코오스, 글루타민산, 글라이신, 히스티딘, 인간 혈청 알부민, 이노시톨, 이소루신, 루신, 라이신, 황산마그네슘, 메티오닌, 니코틴아마이드, 페니실린G, 페닐알라닌, 염화칼륨, 프롤린, 피리독살 HCL, 리보플라빈, 세린, 중탄산나트륨, 염화나트륨, 이수소인산나트륨, 소디움 락테이트, 소디움 파이루베이트, 티아민, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 물을 포함한다. 항-태반 알칼라인 포스파타제 항체(anti-AP)는 S2 배지로 1:20으로 희석하여 사용하고, 다른 항체 및 보체는 1:1로 희석하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 투명대가 제거된 배반포에 항체를 처리한 다음 보체를 처리하는 것이 바람직하다. 배반포는 항체로 약 30분 동안 처리하는 것이 바람직하다. 항체에 노출시킨 후, 배반포는 SNUnt-2', G2.2 또는 S2 배지로 세정한 다음 보체에 적용시키는 것이 바람직하며, 적용 시간은 약 30분 정도가 적합하다.
상기 배반포를 SNUnt-2', G2.2 또는 S2 배지로 세정하여 영양막 세포 또는 이의 일부분을 배반포로부터 분리해낼 수 있다. 이 때, 영양막 세포의 분리는 물리적인 수단에 의해 달성될 수 있으며, 바람직하게는 이러한 분리는 작은 보어(bore)를 가진 피펫을 통한 배반포의 피페팅(pipetting)에 의해서 실시될 수 있다.
이러한 과정을 통하여 투명대 및 영양막 세포를 제거하고 ICMs를 수득한다.
제7 단계 : 섬유아 영양 세포층에서의 ICMs 세포의 배양
상기 제6 단계에서 분리된 ICMs 세포들은 그들의 미분화 상태를 유지하도록 섬유아 영양 세포층(fibroblast feeder cell)에서 배양한다. 몇몇 경우에 백혈병 억제인자(leukemia inhibitory factor, hLIF)는 영양 세포층을 대신하여 세포들을 미분화 상태로 유지하는데 이용되기도 하지만, 인간 세포의 경우에, 고농도 LIF도 섬유아 영양 세포층이 없는 경우에는 세포를 미분화 상태로 유지할 수 없다. 따라서 통상적으로 배아 줄기세포와 관련된 배외(extraembryonic) 분화 및 세포 사멸을 유도하지 않는 조건은 섬유아 영양 세포층 상에서 배양하는 것을 말한다.
영양 세포층으로서 마우스 및/또는 인간의 섬유아세포를 이용하는 것이 바람직하다. 이들은 단독으로 또는 혼합하여 이용할 수 있다. 더 바람직한 것은 환자의 자신의 체세포, 예를 들면 피부 섬유아세포를 영양 세포층(feeder)으로 이용할 수 있다. 더욱 바람직한 것은 환자의 자가 핵 이식란으로부터 유래한 배아 줄기세포로부터 분화된 세포를 영양 세포층(feeder layer)으로 이용하는 것이다. 본 발명자는 이를 자가 영양 세포층(auto feeder layer)이라 명명하고자 한다. 가장 바람직하게는 자가 핵 이식 배아 줄기세포로부터 섬유아세포로 분화된 세포를 영양 세포층으로 이용하는 것이다. 이러한 세포의 이용을 통하여 궁극적으로 수득하고자 하는 자가 핵 이식된 배아 줄기세포가 다른 세포 즉, 유래가 다른 섬유아 영양 세포층을 구성하는 세포들에 의하여 오염되는 것을 방지할 수 있다.
인간 유래의 섬유아세포는 마우스 섬유아세포와 적합하게 혼합하여 최적의 줄기세포 생장 및 분화 억제를 달성할 수 있다.
섬유아세포 층의 세포 밀도가 그들의 안정성 및 성능에 영향을 미친다. 세포 밀도는 cm2당 약 2.5 x 104 개의 인간 세포와 7.0 x 104 개의 마우스 세포가 가장 바람직하다. 마우스 섬유아세포 단독으로 이용될 때에는 3.0 x 104 ~ 1.0 x 105 세포/cm2 밀도가 적합하다. 이러한 영양 세포층은 ES 세포의 첨가 6-48시간 이전에 확립되는 것이 바람직하다.
바람직하게는 마우스 또는 인간의 섬유아세포들은 계대수가 적은(low passage number) 세포들이다. 섬유아세포의 질(quality)은 줄기세포를 지지하는 능력에 영향을 미친다. 배아의 섬유아세포가 특히 바람직한데, 마우스 세포의 경우에 이들은 13.5일 된 태아(fetus)로부터, 인간의 섬유아세포는 배아 또는 태아 조직으로부터 수득할 수 있으며, 통상적인 세포 배양 프로토콜을 이용해서 배양할 수 있다.
마우스 배아의 섬유아세포를 취급하는데 있어서, 기본적인 가이드라인은 트립신의 이용을 최소화하고 과밀화(overcrowding)를 억제하는 것을 포함한다. 이렇게 취급되지 않은 마우스 배아의 섬유아세포들은 미분화된 ES 세포의 생장을 지지할 수 없다. 새로이 제조된 마우스 배아의 섬유아세포의 각 배치(batch)는 이들이 줄기세포의 지지 및 유지에 적합한지를 확인하기 위해서 먼저 테스트되어야 한다.
새로운 일차(primary) 배아 섬유아세포가 냉동-해동된 섬유아세포와 비교했을 때 줄기세포 소생(renewal)을 지지하는데 더욱 적합하다. 그러나, 그 때마다 새로운 일차 배아 섬유아세포를 준비하는 것은 매우 번거롭다. 몇몇 배치들은 반복적 냉동 및 해동 후에도 그들의 지지 잠재력을 보유하게 되기도 한다. ES 세포 소생을 지지하는데 효과적인 것으로 입증된 각 새로운 배치들은 냉동 및 해동 후에 다시 테스트하는 것이 바람직하다. 냉동 및 해동 후에 그들의 잠재력을 보유하게 되는 배치를 이용하는 것이 시간 및 비용의 측면에서는 더욱 바람직하다.
일부 마우스 계통(strain)은 다른 계통 보다 줄기세포의 유지에 더욱 적합한 배아 섬유아세포를 생산할 수 있다. 예를 들면, 동종번식된 129/Sv 또는 CBA 마우스, 또는 129/Sv 와 C57/B16 계통의 교잡으로 생산된 마우스에서 유래된 섬유아세포가 줄기세포 유지에 가장 적합한 것으로 입증되어 왔다.
한편, 영양 세포들은 이들의 성장은 저지되도록 처리되는 것이 바람직하다. 당업계에 공지된 몇 가지 방법이 이용될 수 있는데 예를 들면, 방사선 조사 또는 미토마이신 C와 같은 화학물질을 처리하는 것이다. 가장 바람직한 것은 영양 세포들을 미토마이신 C로 처리하는 것이다.
이러한 섬유아 영양 세포층은 일반적으로 젤라틴으로 코팅된 페트리 디쉬 상에서 배양하며 바람직하게는 0.1% 젤라틴으로 코팅된 것이다.
섬유아 영양 세포층은 ES 배지에서 유지될 수 있다. 적합한 ES 배지는 DMEM/F12 배지에 20% 혈청 대체물(serum replacement)(Gibco, Grand Island, NY. U.S.A.), 0.1mM 베타-메르캅토에탄올, 1% 비필수 아미노산(NEAA), 2mM 글루타민 및 페니실린(100 units/ml), 스트렙토마이신(100g/ml), 스트렙토마이신, 인간의 재조합 섬유아세포 성장 인자(4 ng/ml, basic fibroblast growth factor, bFGF)가 보충된 배지이다.
ES 배지는 추가적으로 줄기세포의 성장 또는 생존을 촉진하거나 줄기세포 분 화를 억제할 수 있는 수용성 생장인자를 보충할 수 있다. 이러한 인자들에는 예를 들면 인간의 다능성 줄기세포 인자 또는 배아 줄기세포 소생 인자 등을 포함한다.
분리된 ICMs는 적어도 6일 이상 배양될 수 있으며, 이 단계에서 세포의 콜로니가 발생한다. 이 콜로니는 원칙적으로는 미분화된 줄기세포로 이루어져 있다. 미분화된 세포의 분리(isolation)는 화학적 또는 물리적 수단 또는 둘 모두에 의해서 달성될 수 있다. 마이크로 피펫을 이용하는 것이 바람직하다. 이러한 물리적인 분리는 Ca2+/Mg2+ 없는 PBS 배지 또는 디스파제(dispase)와 같은 세포의 분리(dissociation)에 도움이 되는 효소 처리와 병행해서 실시할 수도 있다.
제8 단계 : 배아 줄기세포의 계대 배양
본 발명은 이렇게 배양된 줄기세포를 영양 세포층에서 떼어내서 새로운 영양 세포층으로 옮긴 다음 이를 형태학적으로 미분화된 상태로 증식하기에 충분한 시간동안 배양할 수 있다.
이 때에, 세포들은 5-7일 동안 배양하는 것이 바람직하다. 대략 배양 2일 후까지 미분화된 줄기세포 콜로니가 관찰되었다. 줄기세포는 높은 핵/세포질 비율, 현저한 인(nucleoli), 응축된 콜로니 형성 및 뚜렷한 세포 경계에 의하여 형태학적으로 확인될 수 있다.
미분화된 줄기세포의 증식 방법은 줄기세포 콜로니로부터 미분화된 줄기세포 응집체(clump)를 분리하는 것에서 시작된다. 이러한 분리는 화학적 또는 물리적인 수단 또는 둘 모두에 의해서 수행될 수 있다. 보다 바람직하게는 세포들은 Ca2+/Mg2+ 없는 PBS 배지로 세정하거나 물리적인 방법 또는 두 방법을 조합하여 콜로니로부터 분리할 수 있다. 보다 바람직하게는 물리적 방법으로 조각내어 계대하는 것이다.
첫 번째 방법에서, Ca2+/Mg2+ 없는 PBS 배지가 세포간의 부착력을 감소시키는데 이용될 수 있다. 상기 배지로 약 15-20분 적용한 이후에 세포들은 점진적으로 단층으로부터 서로 분리되기 시작하여 목적한 크기의 응집체(clump)로 분리될 수 있다. 세포 분리가 부분적일 때에는, 피펫의 예리한 가장자리를 이용하는 물리적인 분리가 응집체의 분리 및 절단에 유용할 수 있다.
선택적인 화학적 방법은 효소의 이용을 포함한다. 효소는 단독으로 또는 물리적인 방법과 함께 사용될 수 있으며, 효소는 디스파제를 이용하는 것이 바람직하다.
또 다른 방식은 콜로니의 물리적인 절단 이후에 디스파제를 이용하여 응집체를 분리하는 혼합된 방식이다. 콜로니의 절단은 Ca2+/Mg2+를 함유하는 PBS 배지에서 실시한다. 마이크로 피펫의 예리한 가장자리는 콜로니들을 약 100개 세포를 포함하는 응집체로 절단하는데 이용될 수 있다. 응집체가 분리되자마자, 이들을 넓은 구멍 마이크로-피펫으로 집어서 Ca2+/Mg2+ 함유 PBS 배지로 세정한 다음 새로운 섬유아 영양 세포층으로 옮긴다.
이러한 배양 과정에서 줄기세포가 미분화 상태를 유지하고 있는지 여부를 확인할 필요가 있다. 미분화된 배아 줄기세포는 앞서 기재된 바와 같이 특징적인 형태학적 특성을 가지고 있다. 줄기세포를 확인할 수 있는 또다른 방법은 세포 마커를 검출하거나 또는 다능성 세포의 특징적인 유전자의 발현을 측정함으로써 가능하다.
다능성 세포의 특징적인 유전자 또는 특유의 계통(lineage)의 예에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 줄기세포의 마커로서 AP(알칼라인 포스파타제), Oct-4(Octamer-4), SSEA-3, SSEA-4를 포함한다. 줄기세포에 특징적인 다른 유전자들은 제네시스(genesis), GDF-3 및 크립토(Cripto)를 포함한다. 그러한 유전자 발현 프로필은 RT-PCR, 분화 유전자 발현 방법 및 마이크로 어레이 분석 등에 의해서 달성될 수 있다
바람직하게는 줄기세포는 SSEA-4, GCTM-2(germ cell tumor marker-2) 항원, TRA 1-60을 포함한 인간 다능성 줄기세포 마커와의 면역반응 여부에 의해서 확인될 수 있다. 바람직하게는 이러한 세포들은 전사 인자로 Oct-4를 발현하며 또한 정상 이배체 핵형(normal diploid karyotype)을 유지하고 있다.
줄기세포의 진행(progress) 및 이들의 분화 또는 미분화 상태 유지는 배양 배지에 분비되는 줄기세포 특이적인 물질들의 정량 측정 또는 ELISA 또는 관련된 기술을 이용하여 세포의 고정된 현미표본(preparation)에서 모니터될 수 있다. 이러한 줄기세포 특이적인 물질들은 CD 항원의 가용성 형태 또는 GCTM-2 항원을 포함하며 또한 이들은 세포 마커의 검출 또는 유전자 발현의 측정을 이용하여 상기 기 재된 바와 같이 모니터할 수 있다.
배아줄기세포 세포를 어떤 타입의 세포로도 분화시킬 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서 본 발명에 의한 배아줄기세포는 다양한 유형의 세포를 제공하는 좋은 공급원이 될 수 있다. 예컨대, 배아줄기 세포는, 세포 분화에 적합한 배지 및 조건 하에서 배양함으로써, 조혈모세포, 신경 세포, 베타 세포, 근육 세포, 간 세포, 연골 세포, 상피 세포 등으로 분화 유도될 수 있다. 그러한 배지 및 조건은 당업계에 잘 알려져 있다.
따라서 본 발명에 의한 배아줄기 세포는 수많은 치료적 및 진단적 응용을 가질 수 있다. 특히, ES 세포는 당뇨병, 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 대뇌 마비 및 암과 같은 수많은 질환의 치료를 위한 세포 이식 치료법에 이용될 수 있다. 더 나아가, 자가 핵이식란으로부터 유래된 자가 배아줄기 세포는 치료 도중이나 그 이후에 면역 거부 반응의 부작용이 없으므로, 세포 이식 치료법에서 더욱 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 환자의 체세포 핵을 타인의 탈핵 난자에 이식한 핵이식란으로부터 유래한 자가 배아줄기 세포를 신경세포로 분화시켜 이들의 생체 내에서 손상된 조직이나 장기의 기능을 회복시킬 수 있음을 동물실험을 통해 확인하였으며, 그 이외에도 자가 배아줄기 세포를 베타 세포 및 심근세포로 분화시키고 이들의 기능을 확인하였다.
이하에서는 본 발명에 따른 자가 배아 줄기세포를 특정 세포로 분화시키는 방법을 구체적으로 기술하고자 한다.
1. 신경 전구세포로의 분화
제1 단계 : 배아체(embryonic body)의 생성
앞서 수득한 자가 배아 줄기 세포(hntES 세포)를 신경 전구세포로 분화하기 위한 첫 단계는 ntES 세포를 배아체로 생성시키는 것이다. 줄기세포주로부터 배아체를 형성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(Zhang et al, Nat. Biotechnol., 19: 1129-1133, 2001).
구체적으로, 본 발명은 한 양태로서 배양된 ntES 세포 콜로니를 비접착성의 배양 디쉬로 옮겨서 3일 내지 5일 동안 20% 혈청 대체물(serum replacement)(Gibco, Grand Island, NY. U.S.A.)이 첨가된 DMEM/F12 배지에서 배양함으로써 배아체를 생성할 수 있다. 상기 배양시 통상 하루가 경과한 후에 부유하는 배아체(약 40 내지 60개의 배아체/디쉬)가 자라나기 시작한다. 이 때에, 상기 배아체를 새로운 디쉬로 옮기면서 잔류하는 영양 세포들을 제거하는 것이 바람직하다. 그 다음 이렇게 생성된 배아체는 (폴리오르니틴/라미닌으로 코팅된) 접착성의 디쉬에 플레이트한다.
제2 단계 : 제제에 의한 신경 전구세포로의 분화 유도
본 발명에 있어서, 제1 단계에서 수득한 배아체들을 신경 전구세포로 분화할 수 있는 화학물질에는 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들면, ITSF(Insulin, Transferrin, Sodium selenite, Fibronectin의 혼합물), 레티노산(Retinoic Acid), 아스코르브산(Ascorbic acid), 니코틴아마이드, N-2 보충제(N-2 supplement 100X; 17502-048, Gibco, Grand Island, NY, U.S.A.) 및 B-27 보충제(B-27 supplement, 50X; 17504-044, Gibco, Grand Island, NY, U.S.A.) 등이 있다. 이들을 배지에 첨가하여 계속 배양하여 확장(expansion) 및 분화함으로써 ntES로부터 분화된 신경 전구세포를 수득할 수 있다.
본 발명에서는 한 양태로 상기 제 1단계에서 생성된 배아체를 하루 더 배양한 후에, ITSF 즉, 인슐린 (약 25μg/ml), 트랜스페린 (약 100μg/ml), 소듐 셀레나이트 (약 30nM) 및 피브로넥틴 (약 5μg/ml)으로 보충된 DMEM/F12 배지에서 5일 내지 10일 동안 배양하여 ntES 세포의 신경 전구세포로의 분화를 유도할 수 있다.
제3 단계 : 신경 전구세포 마커를 발현하는 세포의 선별 및 배양
상기 제2 단계에서 분화된 세포들 중에서 신경 전구세포 마커, 예를 들면, 네스틴(nestin)을 발현하는 세포를 선별한 다음 이들을 배양함으로써 자가 배아 줄기세포로부터 분화된 신경 전구세포를 수득할 수 있다. 또한, 수득된 신경 전구세포로부터 특정의 원하는 신경세포 타입으로 분화유도될 수 있으며, 이 분화유도는 화학물질을 사용한 유도 등의 통상의 방법으로 수행될 수 있다.
신경 전구세포로의 분화 과정의 바람직한 양태는 마커 양성인 세포를 선별하고, N-2 보충제, 라미닌(laminin), bFGF로 보충된 DMEM/F12 배지에서 5 내지 7일 배양하여 세포의 확장을 개시하고, 그런 다음 이들을 bFGF가 제외된 N-2 보충제 및 라미닌으로 보충된 DMEM/F12 배지로 8일 내지 14일 동안 배양하는 것이다.
2. 베타 세포로의 분화
본 발명의 자가 배아 줄기 세포로부터 인슐린을 분비하는 베타 세포로의 분화는 통상의 방법으로 수행될 수 있다 (Hanna Esgev et al. Stem Cells, 22: 265-274, 2004)
제1 단계 : 배아체(embryonic body)의 생성
상기 1. 신경전구세포로의 분화에서 사용된 방법과 유사한 방법으로 생성시킬 수 있다(Zhang et al, Nat. Biotechnol., 19: 1129-1133, 2001).
제2 단계 : 제제에 의한 베타 세포로의 분화 유도
본 발명에 있어서, 제1 단계에서 수득한 배아체들을 베타 세포로 분화할 수 있는 제제에는 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들면, ITSF(Insulin, Transferrin, Sodium selenite, Fibronectin의 혼합물), 니코틴아마이드, N-2 보충제(N-2 supplement 100X; 17502-048, Gibco, Grand Island, NY, U.S.A.) 및 B-27 보충제(B-27 supplement 50X; 17504-044, Gibco, Grand Island, NY, U.S.A.) 등이 있다. 이들을 배지에 첨가하여 계속 배양하여 확장(expansion) 및 분화함으로써 hntES로부터 분화된 베타 세포를 수득할 수 있다.
또한, 베타-세포로의 분화를 유도하는 배지의 바람직한 한 양태는 20% 혈청 대체물(serum replacement)(Gibco, Grand Island, NY. U.S.A.), 1% 비-필수아미노산(Gibco Invitrogen), 0.1 mmol/L 2-멀캅토에탄올(mercaptoethanol)(Gibco Invitrogen), 1mmol/L 글루타민(Biological Industries, Bet-Haemak, Israel), 4 ng/ml 인간 재조합 bFGF(Pepro Tech, Rocky Hill, Nj)이 보충된 knockout DMEM이다.
바람직하게는, 제1 단계에서 얻어진 배아체들을 ITSF 배지에 깔고, N-2 보충제, B-27 보충제 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)로 보충한 다음, 글루코오스의 농도를 낮추고 bFGF를 제거하며 니코틴아마이드를 첨가함으로써 베타 세포로의 분화를 유도할 수 있다.
베타 세포로의 분화단계는 제1단계에서 형성시킨 배아체를 ITSF배지에 플레이트하는(plating) 과정, N-2, B-27 및 bFGF을 첨가하여 배양하는 과정, 배지 내 글로코스 농도를 줄이고 bFGF를 제거한 다음 니코틴아미드(nicotinamide)를 첨가하는 과정 및 형성된 세포괴를 트립신(trypsin)-EDTA 등으로 분해하고 현탁액에서 부유배양하는 과정을 포함한다.
상기 과정으로 분화 유도된 세포들은 인슐린을 분비하며 이의 확인은 베타 세포로 분화를 표지할 수 있는 인슐린(Insuline), PDX1, ngn3, 글루코카이네이즈(Glucokinase), GLUT2 등을 확인할 수 있는 RT-PCR 방법, 배지 내 인슐린 농도의 측정, 인슐린을 확인할 수 있는 면역형광염색법(Immunofluorescence), 인슐린 유전자의 발현을 확인하는 인시츄 혼성화 분석(In Situ Hybridization Analysis) 방법 등으로 가능하다.
3. 심근 세포(cardiomyocyte)로의 분화
본 발명에 있어서 배아 줄기세포로부터 심근 세포로의 분화는 이 기술분야에서 공지된 통상의 방법 (Chunhui Xu et al. Circ Res. 91: 501-508, 2002)을 포함하며, 구체적으로 배아 줄기 세포로부터 배아체를 형성시킨 후 이를 심근 세포로 분화유도할 수 있는 제제를 포함하는 배지 상에서 배양함으로써 유도할 수 있다. 본 발명에 있어서, 배아체들을 심근 세포로 분화할 수 있는 제제에는 이에 제한되는 것은 아니지만 예를 들면, DMSO (dimethyl sulfoxide), RA (retinoic acid), 5- aza-dC(5-aza-2'-deoxycytidine ) 등이 있다. 이들을 배지에 첨가하여 계속 배양하여 확장(expansion) 및 분화함으로써 hntES로부터 분화된 심근 세포를 수득할 수 있다.
구체적으로, 본 발명 명세서 상의 신경 전구세포나 베타 세포로의 분화방법과 동일하게 수행될 수 있다. 예를 들면 배아체의 형성은 증식이 억제된 지지세포 위에서 배양된 자가 배아 줄기세포를 37℃에서 5-10분 정도 200U/mL 콜라게나아제(collagenase) Ⅳ를 이용하여 몇몇 덩어리 형태로 분리하여 원형의 배아체(embryonic body)를 형성시킬 수 있다. 상기 배아체를 심근 세포로의 분화를 유도할 수 있는 배지 상에서 배양하여 수행될 수 있으며, 예를 들면, 분화 유도 배지는 80% knock-out DMEM, 1 mmol/L L-글루타민, 0.1 mmol/L 베타-메르캅토에탄올, 1% 인간의 비필수 아미노산, 20% FBS를 포함한다.
상기 배양을 통해 형성된 세포괴를 trypsin-EDTA 등으로 분해하고 현탁액에서 추가로 부유 배양한 후 젤라틴이나 폴리-L-라이신으로 코팅처리된 플레이트에 옮긴 후 배양을 함으로써 맥박성을 띠는 세포로의 분화를 유도할 수 있다.
본 발명에 있어서, 자가 배아 줄기세포의 심근세포로의 분화는 심근세포의 마커, 예를 들면, 카디악 알파-미오신 헤비 체인(cardiac α-myosin heavy chain), 카디악 트로포닌 I(cardiac troponin I), 심방성 나트륨배설증가 인자(atrial natriuretic factor) 및 심장 전사 인자(cardiac transcription factors) GATA-4, Nkz2.5 및 MEF-2를 통해 확인할 수 있다. 또한, sMHC, 트로포미오신(tropomyosin), 알파-액티닌( α-actinin), 데스민(desmin) 및 카디악 트로포닌 T(cardiac troponin T) 단백질과 같은 근육 마커를 통해 확인 할 수 있으며, 이 외에도 크레아틴 카이네이즈-MB(CK-MB)(creatin kinase-MB(CK-MB)) 및 미오글로빈(myoglobin)을 확인할 수 있다. 본 발명에 있어서, 자가 배아 줄기세포로부터 유래된 심근세포의 확인은 상기 마커들의 존재를 확인함으로써 가능하며, 상기 마커들은 면역염색, RT-PCR 또는 생체외(in-vitro) 약리학적 제제를 이용함으로써 확인할 수 있다.
본 발명에 의한 손상된 세포, 조직 또는 기관 복구용 조성물은, 본 발명에 의한 배아 줄기세포, 그로부터 분화된 세포, 그로부터 유래된 조직 또는 그로부터 유래된 기관을 유효성분으로 포함한다. 상기 조성물은, 상기 세포 또는 조직 또는 기관 이외에 상기 조성물을 유지하고 개체에 투여하기에 적합한 제제의 형태로 제조될 수 있다. 가장 바람직한 제제는 수용성 주사제이다. 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 생리식염주사액, 링겔액 또는 다른 적당한 수성용제를 이용한 주사제제를 들 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포 또는 조직을, 이온교환수지를 통과시키고 2차 증류한 증류수에 투입하여 제조된 주사액의 형태로 제조될 수 있다. 상기 증류수 이외에도 초여과, 역삼투장치를 이용하여 제조한 물 역시 주사제의 용제로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 상기 세포를 배양하기 위한 배지인 G1. ver 3 배지를 일부 포함할 수도 있다.
본 발명에 의한 조성물은, 개체에 따라 투여량이 달라질 수 있다. 예컨대, 척추 손상의 정도에 따라, 개체에 투여될 조성물의 투여량이 결정될 것이다.
본 발명에 의한 조성물은, 여러 경로로 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로 는 정맥주사, 근육주사, 피하주사, 피내주사, 척수강 주사, 점적주사 등이다. 상기 투여 경로는 환자의 손상 부위에 따라 달라질 수 있음은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
본 발명에 의한 세포, 조직 또는 기관 이식용 키트는, 본 발명에 따른 인간 배아 줄기세포, 그로부터 분화된 세포, 그로부터 유래된 조직 또는 그로부터 유래된 기관을 포함하며, 통상의 이식에 필요한 기구들, 재료들, 시약들 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 인간 배아 줄기세포 또는 그로부터 유래된 분화된 세포는, 환자의 세포, 조직 또는 기관의 손상이 유전적 원인에 기인한 경우, 이를 유전자 치료법으로 치료하기 위해, 상기 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포는 유전자 재조합 등을 통해 유전자가 변형된 것일 수 있다. 예컨대, 유전적 원인에 의해 발병되는 것으로 보고 되고 있는 알츠하이머병이나 파킨슨씨병의 경우, 체세포 공여자인 환자로부터 유래된 줄기세포 또는 그로부터 유래된 분화세포에서, 그 질병을 유발시키는 유전자를 정상 유전자로 교체한 후 이를 상기 환자에게 다시 이식하면, 상기 환자는 이미 손상된 세포, 조직, 기관의 복원은 물론이고, 복원된 세포, 조직, 기관이 다시 유전적 원인으로 손상되는 것을 예방할 수 있다. 이로써 완벽한 유전자 치료가 가능하게 된다.
또 다른 측면에서, 해당 질병의 치료 효과를 증강시키고 손상의 재발을 막기 위하여, 해당 질병을 치료하는 인자를 발현하는 유전자를, 본 발명에 의한 인간 배아 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포에 도입할 수 있다. 예컨대, 파킨슨씨병을 치료하기 위해 뇌성장 인자를 코딩하는 유전자를 인간 배아 줄기세포 또는 그로부터 유래된 분화된 세포에 도입시킨 후 이를 환자에게 이식한다면, 이미 손상된 세포, 조직, 기관의 복원은 물론이고, 도입된 유전자의 발현으로 생산되는 뇌성장 인자를 통해 손상이 재발되는 것을 미리 예방할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
아래 실시예에서 사용된 G1 ver.3 배지는 달리 언급이 없는 한 5% HSA가 첨가된 배지이다.
<실시예 1>
(1-1) 난자의 준비
난자 기증자들을 신체 및 정신 검사를 통해서 자세하게 스크리닝한 후 여포자극 호르몬(follicle stimulation hormone, FSH)을 주입하여 과배란(superovulation)을 유도하였다.
인간의 융모성생식선자극호르몬(human chorionic gonadotropin, hCG)을 난 자 기증자에게 주입한 후 36시간째에, 난구-난모세포 복합체(cumulus-oocyte complex, COCs)를 회수하여 G1 ver.3 배지(Vitro Life, Goteborg, Sweden)에서, 37℃, 5% CO2의 포화습도 배양기에서 40분 동안 배양하였다. COC는 히알루로니다제(0.1% (w/v), hyaluronidase; Sigma Co., Saint Louis, MO, U.S.A.)로 1시간 동안 처리해서 난구세포(cumulus cell)를 분산시켰다. 이후 마우스 피펫을 이용하여 난구세포를 벗겨낸 후, G1 ver.3 배지(Vitro life, Goteborg, Sweden)로 세정하였다. 이로써, 난구세포가 제거된 난자를 얻었다.
(1-2) 공여핵 세포의 준비
남성의 배꼽주변에 1cm 정도의 상처를 낸 뒤, 0.5 x 0.5 x 0.5 ㎤ 정도 크기의 조직을 떼어내었다. 상기 조직을 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지에 넣고, PBS로 3회 세정한 후, 수술용 가위를 이용해서 잘게 분쇄하였다. 분쇄된 조직을 4.5ml의 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지와 2000unit/ml 콜라게나제 타입 II를 갖는 0.5ml의 용액을 함유하는 배지에서 24시간동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 이후, 피펫팅을 반복하여 분쇄된 조직으로부터 체세포를 분리하였다. 상기 분리된 체세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지로 세정하고 2일간 인큐베이션하였다. 체세포의 부착이 확인되면 10% FBS가 첨가된 새로운 DMEM 배지로 교환하였다.
이렇게 하여 얻은 남성의 체세포를 트립신-EDTA(0.25% (w/v), Trypsin- EDTA(1X) ; Life technologies, Rockville, MD, U.S.A.)으로 3분간 실온에서 처리한 후, 형태 지름(modal diameter)이 직경 18-20㎛인 세포를 공여핵 세포로 선택하였다.
<실시예 2>
난자의 탈핵 및 융합
실시예 1에서 수득한 난자를 G1 ver.3 배지에서 배양해서 탈핵하기 앞서 1 내지 2시간 동안 핵의 성숙을 유도하였다. 이어지는 탈핵, 핵 이식 및 전기 융합을 다음과 같이 실시하였다.
(2-1) 난자의 탈핵 및 체세포의 핵 이식
난자를 G1 ver.3 배지로 1회 세정하고, 5ml의 G1 ver.3 배지에 하이알루로니다제 0.05g을 용해시킨 용액 111ul와 G1 ver.3 배지 1ml을 혼합하여 최종 농도를 0.1%(w/v)로 적정한 하이알루로니다제 용액 내에 난자를 옮긴 다음, 난구 세포를 제거하고 G1 ver.3 배지로 3회 세정하고 정치시켰다. 이어, 7.5㎍/ml의 농도가 되도록 DMSO에 사이토칼라신 B(cytochalasin B)를 용해시킨 용액 1㎕와 10% 소 태아 혈청이 첨가된 G1 ver.3 배지 1ml을 혼합한 사이토칼라신 B 용액으로 난자를 옮기 로, 정치된 난자의 투명대를 미세조작기로 절개하여 절개창을 형성시킨 후, 이를 통하여 전체 세포질의 10 내지15%에 해당하는 양의 난자의 세포질을 제거함으로써 난자를 탈핵시켰다.
도 3은 고정용 피펫(1)과 절개용 피펫(2)으로 난자(3)의 투명대를 절개하는 과정을 나타낸다. 도 4는 난자의 제 1극체와 핵을 제거하는 탈핵과정을 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 난자(3)를 회전시켜 절개창을 수직으로 위치시키고, 고정용 피펫(1)을 난자의 밑 부위에 위치시켜 난자가 아래쪽으로 움직이지 못하도록 지지한 다음, 절개용 피펫을 난자의 위에서 가볍게 눌러 난자를 탈핵시켰다. 이처럼 탈핵된 난자를 G1 ver.3 배지로 3회 세정하고, G1 ver.3 배지에 정치시켰다.
그런 다음, 1% 소태아혈청이 첨가된 PBS로 만든 4 ㎕ 미소적에 존재하는 공여핵 세포를 400 ㎕의 G1 ver.3 배지와 100 ㎕의 PHA-P 용액 (10 ml의 G1 ver.3 배지에 5mg의 PHA-P를 용해시킨 용액)을 혼합하여 제조한 용액으로 만든 4 ㎕ 미소적에 존재하는 탈핵 난자에 고정용 피펫과 이식용 피펫을 사용하여 이식하였다. 공여핵 세포와 탈핵 난자를 함유하는 상기 미소적을 증발 방지를 위하여 미네랄 오일로 도포하였다.
도 5는 탈핵된 난자에 체세포를 이식하는 과정을 나타낸다. 도 5에서 보듯이, 탈핵된 난자(3)가 고정용 피펫(1)으로 고정되고, 이식용 피펫(4)이 난자의 절개창으로 주입된 후, 유압으로 체세포를 주입하여 핵이식란을 작제하였다. 이처럼, 작제된 핵이식란을 G1 ver.3 배지로 3회 세정한 후, 동일한 배지에 정치시켰다.
(2-2) 전기 융합에 의한 핵이식란의 작제
BTX- 세포 조작기(BTX Inc., San Diego, CA, U.S.A.)를 사용하여 핵이식란을 전기 융합시켰다.
0.5mM HEPES 완충용액(pH 7.2)에 0.1mM MgSO4, 0.05% BSA 및 0.28mM 만니톨을 용해시킨 만니톨 용액 20㎕의 미소적, G1 ver.3 배지 10㎕와 상기 만니톨 용액 10㎕를 혼합한 20㎕의 미소적, 그리고 G1 ver.3 배지 20㎕의 미소적을 준비하였다. 상기 (2-1)에서 제조한 핵이식란을 먼저 G1 ver.3 배지 10㎕와 상기 만니톨 용액 10㎕를 혼합한 20㎕의 미소적에서 1분간 정치시킨 후, 마우스 피펫을 이용하여 상기 핵이식란을 상기 만니톨 용액 20㎕의 미소적으로 옮기고 1분간 정치시켰다. 이어, 핵이식란을 BTX-세포 조작기에 연결시킨 2개 전극(3.2mm chamber No. 453) 사이에 분주된 만니톨 용액에 넣고, 공여세포가 (+) 전극을 향하도록 핵이식란을 위치시켰다. 전압은 1kV/cm, 시간은 15μs, 횟수는 1초 간격으로 2회의 조건에서 직류전류를 통전하여 핵이식란을 전기융합시켰다. 융합된 핵이식란을 G1 ver.3 배지 10㎕와 상기 만니톨 용액 10㎕를 혼합한 20㎕의 미소적에서 1분간 정치시킨 후, G1 ver.3 배지 20㎕의 미소적으로 옮긴 후, G1 ver.3 배지로 3회 세정하였다.
<실시예 3>
핵이식란의 리프로그래밍, 활성화 및 생체 외 배양
실시예 2에서 수득한 핵이식란은 정상적인 배 발생을 유도하는데 있어 주요인자 중의 하나인 정자에 의한 활성화를 받지 못하기 때문에 인공적인 자극이 필요하다. 인위적 배발생을 위한 최적의 조건을 설정하기 위해서, 표 2 내지 4에 기재된 바와 같이, 핵이식란을 리프로그래밍 시간이 경과한 이후에 여러 방법으로 활성화시키고 또한 생체 외 배양하였다.
먼저, 리프로그래밍 시간이 배반포 형성률에 미치는 영향을 확인하고자 리프로그래밍 시간을 각각 2, 4, 6, 20시간으로 변화시키고 활성화 방법 및 생체외 배양 조건을 표 2와 같이 동일하게 설정하였다. 이를 통하여 리프로그래밍 시간이 약 2시간일 때 최고의 배반포 형성률이 나타남을 알 수 있었다.
| 재프로 그래밍 시간(h) | 활성화 조건 | 1차 배지 | 2차 배지 | 난모 세포 개수 | 하기 발달된 클로닝 배아의 개수(%) | |||
| 2-세포 | 상실배 | 배반포 | ||||||
| 2 | 10μM 이온 운반체* | 2.0mM 6-DMAPa | G1 ver.3 | SNUnt-2' 배지 | 16 | 16(100) | 4(25) | 4(25) |
| 4 | 10μM 이온 운반체 | 2.0mM 6-DMAP | G1 ver.3 | SNUnt-2' 배지 | 16 | 15(94) | 1(6) | 0 |
| 6 | 10μM 이온 운반체 | 2.0mM 6-DMAP | G1 ver.3 | SNUnt-2' 배지 | 16 | 15(94) | 1(6) | 1(6) |
| 20 | 10μM 이온 운반체 | 2.0mM 6-DMAP | G1 ver.3 | SNUnt-2' 배지 | 16 | 9(56) | 1(6) | 0 |
* 칼슘 이온 운반체 A23187
또한, 활성화 방법이 배반포 형성률에 미치는 영향을 확인하고자 고정된(2시간) 리프로그래밍 시간이 경과된 핵이식란을 G1 ver.3 배지에서 37℃, 5분 동안 칼 슘 이온운반체 A23187 (5 또는 10μM; Sigma, Co., St Louis, MO, U.S.A.) 또는 이오노마이신(5 또는 10μM; Sigma, Co., St Louis, MO, U.S.A.) 중 어느 하나로 처리한 다음 G1 ver.3 배지로 수차례 세정하고, 2.0mM 6-디메틸아미노퓨린(6-dimethylaminopurine, 6-DMAP; Sigma)을 포함하는 G1 ver.3 배지에 옮겨서 37℃, 5% CO2, 5% O2, 90% N2에서 4시간 동안 활성화시켰다. 그런 다음 표 3과 같이 이들을 동일한 배양 조건에서 배양하였다. 이를 통하여 10μM 이온운반체를 처리하고 2.0mM 6-DMAP를 처리하는 활성화 방법이 최고의 배반포 형성률을 나타냄을 확인할 수 있었다.
| 재프로 그래밍 시간(h) | 활성화 조건 | 1차 배지 | 2차 배지 | 난모 세포 개수 | 하기 발달된 클로닝 배아의 개수(%) | |||
| 2-세포 | 상실배 | 배반포 | ||||||
| 2 | 5μM 이온 운반체* | 2.0mM 6-DMAP | G1 ver.3 | SNUnt-2' 배지 | 16 | 11(69) | 0 | 0 |
| 2 | 10μM 이온 운반체* | 2.0mM 6-DMAP | G1 ver.3 | SNUnt-2' 배지 | 16 | 16(100) | 5(31) | 3(19) |
| 2 | 5μM 이오노마이신 | 2.0mM 6-DMAP | G1 ver.3 | SNUnt-2' 배지 | 16 | 9(56) | 0 | 0 |
| 2 | 10μM 이오노마이신 | 2.0mM 6-DMAP | G1 ver.3 | SNUnt-2' 배지 | 16 | 12(75) | 0 | 0 |
* 칼슘 이온 운반체 A23187
아울러, 생체 외 배양 조건이 배반포 형성률에 미치는 영향을 확인하고자 상기 최적의 리프로그래밍 시간 및 활성화 후에 핵이식란을 G1 ver.3 배지로 세차게 세정하고 10㎕ G1 ver.3 배지 드롭(drop) 또는 mSOFaa에서 37℃, 5% CO2, 5% O2, 90% N2 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 분리한 배아를 새로운 G2.2 배지 또는 5% HSA가 포함된 mSOFaa 배지로 옮겨서 또 다시 6일 동안 배양하였다. 이를 통하여 G1 ver.3 배지에서 일차 배양하고 mSOFaa 배지에서 이차 배양함으로써 최고의 배반포 형성률을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
| 재프로 그래밍 시간(h) | 활성화 조건 | 1차 배지 | 2차 배지 | 난모 세포 개수 | 하기 발달된 클로닝 배아의 개수(%) | |||
| 2-세포 | 상실배 | 배반포 | ||||||
| 2 | 10μM 이온 운반체* | 2.0mM 6-DMAP | G1 ver.3 | SNUnt-2' 배지 | 16 | 16(100) | 4(25) | 3(19) |
| 2 | 10μM 이온 운반체* | 2.0mM 6-DMAP | G1 ver.3 | G2.2 | 16 | 16(100) | 0 | 0 |
| 2 | 10μM 이온 운반체* | 2.0mM 6-DMAP | SNUnt-2' 배지 | 16 | 16(100) | 0 | 0 | |
* 칼슘 이온 운반체 A23187
결국, 핵이식란은 2시간의 리프로그래밍 시간을 거친 다음 10μM 이온 운반체를 처리하고 2.0mM 6-DMAP를 처리하여 활성화한 다음 G1 ver.3 배지에서 일차 배양하고 SNUnt-2' 배지(10% HSA가 추가된 mSOFaa 배지)에서 이차 배양함으로써 정상적인 배반포를 달성할 수 있었다.
<실시예 4>
투명대의 제거 및 영양막 세포의 제거와 ICM의 분리
상기 실시예 3으로부터 수득한 배반포를 0.1% 프로나제(pronase; Sigma Co., St. Louis, MO, U.S.A.)를 1분 동안 적용하여 투명대를 제거한 다음, 100% 항-인간 혈청 항체(anti-human serum antibody; Sigma)를 20분 동안 처리하고, 37℃, 5% CO2에서 10㎕ 기니아 피그 보체(Life Technologies, Rockville, MD, U.S.A.)에 추가로 30분 동안 노출시킴으로써 영양막 세포를 제거하고 ICMs를 분리하였다.
<실시예 5>
ICMs의 배양
(1) 마우스 태아의 섬유아세포층
이렇게 분리된 ICMs는 0.1% 젤라틴으로 코팅된 조직 배양 디쉬에서 미토마이신 C로 비활성화된 일차 마우스 (C57BL breed) 태아의 섬유아세포 층상 (3.75 x 104 세포/㎠) 에서 배양하였다. 배양 배지는 DMEM/F12 배지(Life Technologies, Rockvile, MD, U.S.A.)에 20% 혈청 대체물(serum replacement)(Gibco, Grand Island, NY. U.S.A.), 0.1mM 베타-메르캅토에탄올(Sigma), 1% 비필수 아미노산, 2 mM 글루타민, 페니실린(100 units/ml), 스트렙토마이신(100 ㎍/ml), 섬유아세포 성 장 인자(4 ng/ml, basic fibroblast growth factor, bFGF; Life Technologies, Rockvile, MD, U.S.A.)가 보충된 배지를 이용하였다. 초기 ES 세포 배양 동안에, 배지는 인간 재조합 백혈병 억제 인자 (leukemia inhibitory factor, hLIF; Chemicon, Temecula, CA, U.S.A.) (100 units/ml)로 보충하였다. 상기 배양은 미분화된 ntES 세포 콜로니가 나타날 때까지 6일 이상 수행되었다. ntES 세포 콜로니 형성 이후, 5일 또는 7일에 한번씩 마이크로 피펫을 이용하여 기계적으로 ntES 세포를 분리하였다.
(2) 마우스 태아의 섬유아세포와 인간 유래의 섬유아세포가 혼합된 층
영양 세포층으로서 마우스 태아의 섬유아세포를 단독 사용하는 대신, 미토마이신 C로 비활성화된 일차 마우스 (C57BL breed) 태아의 섬유아세포 7.0 x 104 세포/㎠와 인간 섬유아세포, 구체적으로 자가 배아 줄기세포 제작에 사용된 체세포 제공 환자의 피부 섬유아세포 2.5 x 104 세포/cm2이 혼합된 영양 세포층을 이용한 것을 제외하고는 상기 (1)과 동일하게 하여, 줄기세포를 얻을 수 있었다.
(3) 자가 섬유아세포 층 또는 자가 배아 줄기세포로부터 분화된 섬유아세포층
본 발명의 체세포를 제공한 환자의 섬유아세포, 바람직하게는 피부의 섬유아세포 3.75 x 104 세포/㎠ 를 영양세포층으로 이용하거나 상기 (1)과 같이 하여 얻어진 자가 배아 줄기세포로부터 분화시킨 섬유아세포를 3.75 x 104 세포/㎠ 의 양으로 영양 세포층으로 이용한 것을 제외하고는 상기 (1)과 동일하게 하여, 각각 줄기세포를 얻을 수 있었다.
<실험예 1>
핵형 분석에 의한 인간 ntES 세포주의 확인
상기 실시예5의 (1)에서 수득한 콜로니들을 0.1 mM Ca2+ 및 0.1 mM Mg2+를 함유하는 PBS로 세정한 후, 시트레이트-아세톤-포름알데히드로(혼합비: 25:65:8 (v/v/v)) 4℃에서, 1시간 동안 고정하고 0.1mM Ca2+ 및 0.1mM Mg2+를 포함하는 PBS로 한차례 세정하였다. ntES 세포의 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 활성도를 검증하기 위해서 AP 키트(Sigma Co., St. Louis, MO, U.S.A.)를 사용하였다. 이때 사용된 단일클론 항체는 다음과 같다: Oct-4(SC-5279; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,CA); SSEA-1(MC480), SSEA-3(MC631) 및 SSEA-4(MC-813-70; Developmental Studies Hybridoma Bank, lowa City, IA); TRA-1-60 및 TRA-1-81(Chemicon, Temecula, CA, U.S.A.). ntES 세포의 특정 표면 항원을 확인하기 위 하여 상기 단일클론 항체를 일차 항체로 사용하여 면역조직화학 분석 (immunohistochemical assay)을 수행하였다. 상기 일차 항체를 바이오티닐래이티드 이차 항체 및 아비딘-호스라디쉬 퍼옥시다제 접합체를 함유하는 Vectastatin ABC 키트 (Vector laboratory, Burlingame, CA)로 탐지하였다. 그 결과 도 1a 내지 도 1g에서 보는 바와 같이 인간 줄기 세포의 특징적인 표지인, AP(알칼라인 포스파타제)(도 1a), SSEA-1(도 1b), SSEA-3(도 1c), SSEA-4(도 1d), Tra-1-60(도 1e), Tra-1-81(도 1f) 및 Oct-4(도 1g)를 확인할 수 있었다.
게놈 DNA 및 인간의 STR (short tanderm repeat) 마커에 대하여 자동화된 ABI 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems, Foster city, CA, U.S.A.)상에서 STR AMP FLSTR PROFILER 키트(Applied Biosystems, Foster city, CA, U.S.A.)를 이용해서 DNA 지문법(finger printing) 분석을 실시하였다. 이의 분석 결과를 도 6a 내지 도 6e에 나타내었다.
도 6a에 따르면, 상기 실시예 1-5에서 수득한 핵이식란으로부터 유래한 배아 줄기세포주의 핵형 분석 결과 남성의 유전자임을 확인하였고, 도 6b 내지 도 6e에 따르면, 더 나아가 DNA 지문분석을 통하여 상기 배아 줄기세포주에 핵을 제공한 남성의 체세포 핵형 분석 결과가 동일한 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 수득한 배아 줄기세포주는 자가 핵이식란으로부터 유래된 것임을 알 수 있다.
<실험예 2>
기형종(teratoma) 분석을 통한 줄기세포주의 확인
실시예 5의 (1)에서 얻은 미분화 줄기세포 100개 콜로니를 배양 디쉬에서 분리하여 1 ml 주사기에 넣어 SCID mouse (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Korea)의 고환(testis)에 주입한 후 8주간 배양하였다. 형성된 기형종(teratoma)을 파라핀 고정하여 면역 조직화학검사를 시행하여 3배엽의 세포가 생성되었는지 확인하였다. 이의 분석 결과를 도 7a 내지 도 7c에 나타내었다.
도 7a 내지 도 7c에 따르면, 실시예 5의 (1)에서 수득한 배아 줄기세포주는 고환(testis)에 3배엽 (연골(도 7a): 중배엽, 장관(도 7b): 내배엽, 및 신경관(도 7c): 외배엽)을 형성하는 것을 볼 수 있다. 따라서, 본 발명에서 수득한 세포는 다양한 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 다능성 배아 줄기세포주임을 알 수 있다.
<실험예 3>
면역 조직 화학염색에 의한 배아체 형성 확인
상기 실시예5의 1(1)에서 얻은 인간 ntES 세포 콜로니를 0.1% 트립신/1mM EDTA로 처리하여 분리한 다음 플라스틱 페트리 디쉬로 옮겼다. 인간 ntES 세포는 hLIF 및 bFGF 없이 DMEM/DMEM F12에서 14일 동안 배양하였다. 파라핀 고정을 위해서, ntES 세포는 PBS에 용해된 1% 저용융 아가로스에 옮기고 42℃까지 냉각시켰다. ntES 세포를 포함하는 고체화된 아가로스를 PBS에 용해된 4% 파라포름알데히드에 고정시키고 파라핀에 심어넣었다. 개개의 6-mm 섹션을 슬라이드에 배치하고 면역조직화학 분석을 수행하였다. 사용된 항체는 다음과 같다: Zemed 사(South San Francisco, CA, U.S.A.)로부터 구입한 알파-1-페토단백질(18-0003), 사이토케라틴(18-0234), 데스민(18-0016), 뉴로필라멘트(18-0171) 및 S-100(18-0046); Santa Cruz Biotechnology사로부터 구입한 HNF-2-알파(SC-6556), BMP-4(SC-6896), Myo D(SC-760) 및 NCAM(SC-7326). 상기 항체를 일차 항체로 사용하고, 바이오티닐래이티드 항-래빗, 항-마우스 또는 항-고오트 항체를 이차 항체로 사용하였다. 상기 면역반응을 스트렙타비딘-접합 호스라디쉬 퍼옥시다제 및 디아미노벤지딘 크로마겐으로 탐지하였다.
그 결과, 실시예 5의 (1)에서 수득한 배아 줄기세포주에서 내배엽 마커 단백질인 알파-1-페토단백질, 사이토케라틴 및 HNF-2-알파와, 중배엽 마커 단백질인 BMP-4, 미오 D 및 데스민, 그리고, 외배엽 마커 단백질인 뉴로필라멘트, S-100 및 NCAM가 발현됨을 확인할 수 있었으며, 이로써 상기 배아 줄기세포주가 배아체를 형성할 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에서 수득한 세포는 배아 줄기세포주임을 알 수 있었다.
<실시예 6>
신경 전구세포로의 분화
(6-1) 미분화된 ES 세포의 확장
상기 실시예 5의 (1)에서 얻어진 줄기세포를 37℃, 5% CO2에서 2% 젤라틴으로 코팅된 배양 플레이트에 충진된, 세포분열이 불활성화된 마우스 배아의 섬유아세포 영양 세포층에서 배양하였다. 상기 배양 시에 DMEM/F12(1:1), 20% 넉아웃 혈청 대체물(knock-out serum replacement)(Gibco, Grand Island, NY. U.S.A.), 0.1mM 인간의 비필수 아미노산, 0.1mM 베타-메르캅토에탄올, 1mM L-글루타민, 항생제(100 U/ml 페니실린 G, 100μg/ml 스트렙토마이신 및 4ng/ml bFGF로 이루어진 배지를 이용하며, 매일 교환해주었다.
(6-2) 배아체(embryonic body)의 생성
배양된 ES 세포 콜로니를 피펫 팁으로 가볍게 긁어서 벽으로부터 수집하여 비접착성의 배양 디쉬로 옮겨서 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 배양 배지는 4 ng/ml bFGF가 없는 것을 제외하고는 상기 (6-1)에서 사용한 배지와 동일한 배지를 이용하였다. 하루가 경과한 후에, ES 세포 콜로니들은 부유하는 배아체(~50/디쉬)로 자라나기 시작하였다. 이 때, 배아체를 새로운 디쉬로 옮기면서 잔류하는 영양 세포들은 모두 제거하였다. 추가로 4일 동안 배양한 후에, 생성된 배아체는 (폴리오르니틴/라미닌으로 코팅된)접착성의 디쉬에 플레이트하였다.
(6-3) 네스틴-양성인 세포의 선별
접착성 디쉬에서 1일 동안 배양한 후에, 분화하는 배아체를 ITSF(인슐린:25 μg/ml, 트랜스페린:100μg/ml, 소듐 셀레나이트:30nM 및 피브로넥틴:5μg/ml)로 보충된 DMEM/F12에 옮겨서 37℃에서 6일 동안 배양하였다. 이렇게 배양된 세포는 항-네스틴 항체(Chemicon, Temecula, CA, U.S.A.)를 0.01M PBS, 1% BSA, 5mM EDTA 함유 용액으로 1/1000로 희석한 용액으로 40분 동안 37℃에서 배양하였다. 새로운 상기 DMEM/F12 배지로 세정한 다음 세포들을 피코에리스린(phycoerythrine, PE)-접합된 이차 항체(Chemicon, Temecula, CA, U.S.A.)로 추가로 30분 동안 처리하고 새로운 상기 DMEM/F12 배지로 3차례 세정하여 네스틴-양성 세포를 선별하였다.
(6-4) 네스틴-양성 세포의 확장(expansion)
선별된 네스틴-양성 세포를 N-2 보충제, 라미닌(1ng/ml), bFGF(10ng/ml)로 보충된 DMEM/F12 배지에서 6일 동안 배양함으로써, 확장하였다.
(6-5) 신경 전구세포로의 분화
그런 다음 네스틴-양성인 세포들을 bFGF를 제거하고 라미닌(1ng/ml) 및 N-2 보충제로 보충된 DMEM/F12 배지로 10일 동안 37℃에서 배양하여 분화를 유도하였다.
본 발명에 따른 자가 핵이식란으로부터 유래한 줄기세포주에서 분화된 신경 전구세포를 도 2a에, 그 신경 전구세포로부터 더 분화된 뉴로 필라멘트를 도 2b에 나타내었다.
<실시예 7>
줄기세포로부터 분화된 신경 전구세포의 척수 손상 치료
성체 스프래그 다우리(Sprague Dawley) (250-350g, female)를 케타민(60mg/kg)와 자일라진(Xylazine)(5mg/kg)의 혼합용액을 300ul 복강 주사하여 마취시켰다. 스프래그 다우리의 등 아래 부분 털을 면도기로 자른 후 베타딘을 도포하였다. 흉곽의 늑골(Thoracic rib)과 척추골(vertebra)의 13번째 위치에 중앙선으로 2cm을 절개한 후, 늑골 위의 근육과 조직을 조심스럽게 잘라내었다. 스프래그 다우리의 L1-L2 왼쪽 부위를 11번 수술용 칼과 1ml 주사기 바늘을 이용해 일직선으로 잘라내었다(hemicordotomy). L1-L2 척추골(vertebra) 왼쪽 부위의 윗부분 뼈를 제거한 후, 척수의 중앙혈관을 기준으로 11번 칼날로 한번 선을 긋듯이 절개하였다. 이어서 1ml 실린저의 바늘 끝을 "ㄱ" 자 모양으로, 구부려서 11번 수술용 칼에 의해서 절개된 부위를 일직선으로 연속적으로 절개하여 척수의 왼쪽신경이 잘려나가도록 하였다. 이때에 중앙혈관이 절개되지 않아야 하며, 중앙혈관을 기준으로 오른쪽 부위는 손상이 없도록 해야 한다. 이후 슬라스틱 쉬트를 뼈가 제거된 부위만큼 적당히 오려서 그 위에 덮어주어, 근육과 조직들이 척수에 붙어서 뭉쳐지지 않도록 하였다. 이후 수술용 실과 바늘로 절개 된 부위를 봉합하고 수술부위에 베타딘을 도포하였다.
상기와 같이 척수가 손상된 스프래그 다우리 실험 그룹을 총 4그룹으로 나누었다. 그 중 제 1그룹에는 손상 후에 아무런 처치도 하지 아니하였다. 제 2그룹은 손상 후 8일 후에 손상이 가해진 쥐의 등 L1-L2 부위를 수술용 칼로 다시 절개하여 연 후, 헤미코도토미(hemicordotomy)가 가해진 L1-L2 부위에서 머리방향으로 5mm 정도 위치에 헤밀턴 실린저용 바늘로 찌른 후 5ul/10min의 속도로 줄기세포 배양용 배지인 G1 ver.3 배지를 주입하였다. 제3그룹 및 제 4그룹은 손상 후 8일 후에 손상이 가해진 쥐의 등 L1-L2 부위를 수술용 칼로 다시 절개하여 연 후, 헤미코도토미가 가해진 L1-L2 부위에서 머리방향으로 5mm 정도 위치에 헤밀턴 실린저용 바늘로 찌른 후 5ul/10min의 속도로 상기 실시예5의 (1)에서 제조된 줄기세포를 주입하였다. 주입이 끝난 후에는 손상이 가해진 부위에 슬라스틱 쉬트를 적당한 크기로 오려서 덮어놓고, 수술용 바늘과 실로 수술부위를 봉합하고 베타딘을 도포하였다.
줄기세포에 의한 효과를 알아보기 위하여, 행동 실험과 부검 실험을 수행하였다.
Journal of Neurotrauma Vol. 12 1~21p, Number 1, 1995, Michele Basso et al을 참고하여 변형된 행동 실험(Modified Behavioral Test)를 수행하였다. 수술 후 다음날부터 2주 동안 매일 행동 실험을 수행하였고, 3~4주 동안은 3일에 1번 그리고 5주~6주 동안은 7일에 1번 수행하였다. 그 결과, 제 3그룹 및 제 4그룹의 스프래그 다우리는 처음 1~2주까지는 전혀 움직이지 못하다가, 2주 후부터는 조금씩 움직이기 시작하였고, 4주 후에는 정상 상태의 움직임을 나타내었다. 반면에, 제 1그룹 및 제 2 그룹의 스프래그 다우리는 6주가 지나도록 전혀 움직이지 못하였다.
한편, 6주 후에는 쥐를 부검하여 척수의 회복과 각 장기의 이상 유무를 확인하였다. 그 결과, 제 3그룹 및 제 4그룹의 스프래그 다우리는 손상된 척수가 거의 회복된 것을 확인할 수 있었다. 그러나 제 1그룹 및 제 2그룹의 스프래그 다우리는 척수가 전혀 회복되지 않았음을 확인하였다.
<실시예 8>
베타 세포로의 분화
상기 실시예5의 (1)에서 제조된 줄기세포를, 불활성화시킨 생쥐 배아 섬유아세포 위에서, 80% DMEM(Dulbeco's modified Eagles) 배지, 20% 넉아웃 혈청 대체물(knockout serum replacement)(Gibco, Grand Island, NY. U.S.A.), 1 mM 글루타민, 1% 비필수 아미노산, 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (GIBCO Invitrogen; Paisley, UK), 4 ng/ml bFGF (GIBCO Invitrogen; Paisley, UK)와 함께 배양하였다.
1 mg/ml type IV 콜라게나아제 (GIBCO Invitrogen)으로 세포를 분리한 다음 30분 후에 세포들을 5-ml 피펫으로 긁어서 플라스틱 페트리접시 (Miniplast; Ein-Shemer, Israel)에 옮겨 집합체(배아체)를 형성케 하였다. 형성된 배아체를 80% 넉아웃 DMEM (GIBCO Invitrogen), 20% defined FBS (Hyclone; Logan, UT), 1 mM 글루타민 (GIBCO Invitrogen) 및 1 % 비필수 아미노산(GIBCO Invitrogen)으로 7일 동안 배양하고 매3일 마다 배지를 교환하였다. 7일 된 배아체 (평균 10000 세포 정도로 이루어짐)를 6-웰 플라스틱 배양 접시에(Nunc; Roskide, Denmark) 웰당 각각 300개 정도의 배아체를 깔고, 1주일 동안 ITS [DMEM/F12 1:1, insulin (10 mg/L)- transferrin (6.7 ng/L)-selenium (5.5 mg/L)] (GIBCO Invitrogen) 및 1 mM 글루타민 (GIBCO Invitrogen)에 5㎍/ml 피브로넥틴(fibronectin) (Roche Diagnostics GmbH; Mannheim, Germany)를 첨가하여 배양하였다.
1주 후, ITSF 배지 (ITS와 피브로넥틴)에서 세포들을 트립신-EDTA (Biological Industries; Beit Haemek, Israel)으로 단세포들로 분해하고 플라스틱 조직배양 접시에 2 X 105 /ml의 농도로 깔았다. 이 때, 하기 조성의 배지와 함께 깔았다: DMEM/F12 1:1 에 N-2 보충제 (500 ㎍/ml 프로게스트론, 1,611 ㎍/ml 푸트라신(putrascine) 및 0.52 ㎍/ml 셀레나이트) (GIBCO Invitrogen), B-27 보충제 배지(GIBCO Invitrogen), 1 mM 글루타민(GIBCO Invitrogen) 그리고 10 ng/ml bFGF (GIBCO Invitrogen)를 첨가하여 제조된 배지. 접시에 깔기 전에, 조직배양접시는 0.1% 젤라틴이나 폴리-L-오르니틴(ornithine) (15 ng/ml) (Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO)으로 코팅하였다. 접시에 깐 후 세포괴들은 1주일 동안 배양하고, 배지교환은 이틀에 한 번씩 하였다. 그 후, bFGF를 제거하고, 10 mM의 니코틴아마이드(nicotinamide) (Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO)를 첨가하였다. 또한, 글루코오스가 포함되지 않은 DMEM을 사용하여, 배지 내 총 글루코오스의 농도를 901 mg/L로 감소시켰다. 이어서, DMEM/F12 1:1에 901 mg/L의 글루코오스가 들어있고, N-2와 B-27배지, 1 mM 글루타민, 그리고 10 mM 니코틴아마이드가 보충된 배지에서 4일 동안 배양시 형성된 세포괴는 트립신-EDTA로 분해하고 페트리 접시에서 상기 배지와 함께 부유배양하였다.
상기에서 형성된 세포괴를 미세입자 효소 면역분석법(microparticle enzyme immunoassay) (AXSYM System Insulin Kit code B2D010; Abbott Laboratories; Chicago, IL)으로 측정한 결과 인슐린을 분비함을 확인할 수 있었다.
<실시예 9>
심근 세포로의 분화
상기 실시예5의 (1)에서 제조된 줄기세포를, 37℃, 5% CO2에서 2% 젤라틴으로 코팅된 배양 플레이트에 충진된, 세포분열이 불활성화된 인간 피부 섬유아세포 영양 세포층에서 배양하였다. 상기 배양 시에 80% 넉아웃 DMEM, 1 mmol/L L-글루타민, 0.1 mmol/L 베타-메르캅토에탄올, 1% 인간의 비필수 아미노산, 20% FBS를 포함하는 배지를 이용하며, 매일 교환해주었다.
상기 배양된 ES 세포 콜로니를 피펫 팁으로 가볍게 긁어서 벽으로부터 수집하여 비접착성의 배양 디쉬로 옮겨서 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 배양 배지는 상기에서 사용한 배지와 동일한 배지를 이용하였다. 하루가 경과한 후에, ES 세포 콜로니들은 부유하는 배아체(~50/디쉬)로 자라나기 시작하였다. 이 때, 배아체를 새로운 디쉬로 옮기면서 잔류하는 영양 세포들은 모두 제거하였다. 추가로 4일 동안 배양한 후에, 생성된 배아체는 젤라틴이나 폴리-L-라이신으로 코팅처리된 접착성의 디쉬에 1-3EBs/cm2 정도의 비율로 플레이트하고 배양하였다.
접착성 디쉬에서 1일 동안 배양한 후에, 80% 넉아웃-DMEM, 1 mmol/L L-글라타민, 0.1 mmol/L 베타-멀캅토에탄올, 1% 인간 비필수 아미노산, 20% FBS (Hyclone)를 포함한 배지 내에 세포를 부유시켜 4일 동안 배양하였다. 배양 후 생성된 세포괴를 젤라틴이나 폴리-L-라이신으로 코팅된 플레이트에 약 0.5-4 EBs/㎠ 정도의 비율로 옮긴 후 세포의 변화를 관찰하면서 계속 배양하였다.
분화하는 배아체를 각각 DMSO (dimethyl sulfoxide), RA (retinoic acid), 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine, 5-aza-dC)로 보충된 배지(80% 넉아웃 DMEM, 1 mmol/L L-글루타민, 0.1 mmol/L 베타-메르캅토에탄올, 1% 인간의 비필수 아미노산, 20% FBS를 포함하는 배지)에 옮겨서 37℃에서 6일 동안 배양하였다.
상기 배양으로 얻어진 맥박성을 띈 세포를 포함하고 있는 분화된 배양세포를 PBS나 120mM NaCl, 5.4mM KCl, 5mM MgSO4, 5mM Na-파이루베이트, 20mM 글루코오스, 20mM 타우린, 10mM HEPES이 포함된 pH 6.9 상태의 저칼슘 용액으로 세척하였다. 배양세포는 37℃에서 한두 시간 정도 30uM CaCl2이 첨가된 저칼슘용액에 1mg/ml 콜라게나제(collagenase) B를 투여한 후 배양하였다. 그러고 나서 배양세포는 85mM KCl, 30mM K2HPO4, 5mM MgSO4, 1mM EGTA, 2mM Na2ATP, 5mM Na-피루베이트, 5mM 크레아틴, 20mM 타우린, 20mM 글루코오스가 첨가된 pH 7.2상태의 용액에서 재부유되어 완벽한 분리를 위해 약 15분간 37℃에서 배양하였다. 분리 후에는 배양세포는 퍼콜 그레디언트(Percoll gradient)에 적용하였고, 또한 37℃에서 약 30분간 0.56 units/ml Blendzyme Ⅳ에 의해 분리하였다.
맥박치는 세포를 포함하는 분화된 인간 배아 줄기세포만 분리하여 분화용 배지에 재부유시키고 중지된 퍼콜 그레디언트에 옮겼다. 퍼콜은 20mmol/L HEPES, 150mmol/L NaCl을 포함하는 완충액으로 희석하고, 1500g에서 30분간 원심분리한 후 세포층을 구분하였다. 그 외의 층에 있는 세포를 수집하여 세척하고, 80% 넉아웃 DMEM, 1 mmol/L L-글루타민, 0.1 mmol/L 베타-메르캅토에탄올, 1% 인간의 비필수 아미노산, 20% FBS를 포함하는 배지에 재부유시킨 후 면역염색을 위해서 조각된 세포들을 챔버 슬라이드 위에 뿌리고 배양한 후 면역염색을 실시하였다. 그 결과, 심근세포의 마커인 카디악 알파-미오신 헤비 체인(cardiac α-myosin heavy chain), 카디악 트로포닌 I(cardiac troponin I), 심방성 나트륨배설증가 인자(atrial natriuretic factor) 및 심장 전사 인자(cardiac transcription factors) GATA-4, Nkz2.5 및 MEF-2를 통해 확인할 수 있었다.
본 발명에 따라 제조된 인간 자가 핵이식란으로부터 유래된 인간 자가 배아 줄기세포는 이식받을 개체의 게놈을 가지고 있기 때문에 면역 거부반응 없이 이식할 수 있을 뿐만 아니라, 체세포와 난자의 유래가 서로 다른 경우, 즉 난자를 생산할 수 없는 남성이나, 가임기가 아닌 여성의 경우에도 자신의 체세포의 핵이 이식된 핵이식란으로부터 유래된 배아 줄기세포를 얻을 수 있는 장점이 있다.
더 나아가 이와 같이 하여 얻어진 배아 줄기세포를 세포 분화에 적합한 배지 및 조건 하에서 배양함으로써, 조혈모세포, 신경 세포, 베타 세포, 근육 세포, 간 세포, 연골 세포, 상피 세포 등의 특정 세포로 분화 유도될 수 있다. 이렇게 분화된 세포 또는 조직은 손상된 세포, 조직을 복구함으로써 손상된 장기 기능의 회복을 가능하게 한다. 예컨대, 세포 손상 당뇨병, 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 대뇌 마비 및 암과 같은 수많은 질환의 치료를 위한 세포 이식 치료법에 이용될 수 있다.
Claims (41)
- 인간 체세포의 핵을 탈핵된 인간 난자로 이식하여 제조된 핵이식된 난자로부터 유래된 배아 줄기세포로서, 상기 체세포와 상기 난자는 서로 다른 개체로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 인간 배아 줄기세포.
- 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포 또는 조직을 이식받을 인간 환자의 체세포의 핵을 탈핵된 인간 난자로 이식하여 제조된 핵이식된 난자로부터 유래된 인간 자가 배아 줄기세포.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 체세포는 남성 또는 가임기가 아닌 여성으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 배아 줄기세포.
- 제 3항에 있어서, 상기 체세포는 남성으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 배아 줄기세포.
- 인간 배아 줄기세포를 제조하는 방법으로서,(1) 한 개체로부터 유래된 인간 체세포를 배양하여 공여핵 세포를 준비하는 단계;(2) 상기 개체와는 다른 개체로부터 유래된, 인간 난자를 탈핵하여 수핵 난 자를 준비하는 단계;(3) 상기 공여핵 세포의 핵을 상기 수핵 난자에 이식하고, 상기 공여핵 세포의 핵과 상기 수핵 난자를 융합시킴으로써 자가 핵이식란을 제조하는 단계;(4) 상기 자가 핵이식란을 리프로그래밍, 활성화 및 생체외 배양시켜 배반포를 형성하는 단계; 및(5) 상기 배반포로부터 내세포괴를 분리하고, 상기 내세포괴를 미분화상태로 배양하여 자가 배아 줄기세포주를 확립하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 배아 줄기세포의 제조방법.
- 인간 배아 줄기세포를 제조하는 방법으로서,(1) 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포 또는 조직을 이식받을 인간 환자의 체세포를 배양하여 공여핵 세포를 준비하는 단계;(2) 인간 난자를 탈핵하여 수핵 난자를 준비하는 단계;(3) 상기 공여핵 세포의 핵을 상기 수핵 난자에 이식하고, 상기 공여핵 세포의 핵과 상기 수핵 난자를 융합시킴으로써 자가 핵이식란을 제조하는 단계;(4) 상기 자가 핵이식란을 리프로그래밍, 활성화 및 생체외 배양시켜 배반포를 형성하는 단계; 및(5) 상기 배반포로부터 내세포괴를 분리하고, 상기 내세포괴를 미분화상태로 배양하여 자가 배아 줄기세포주를 확립하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 자가 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 체세포는 남성 또는 가임기가 아닌 여성으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 체세포는 남성으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 (3) 단계는, 상기 공여핵 세포와 상기 수핵 난자와의 세포 융합에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 (4) 단계의 리프로그래밍은 20시간 이하의 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 (4)단계의 리프로그래밍은 6시간 이하의 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 11항에 있어서, 상기 (4)단계의 리프로그래밍은 3시간 이하의 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제12항에 있어서, 상기 (4)단계의 리프로그래밍은 2시간 이하의 시간동안 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 (4)단계의 활성화는 상기 핵이식된 난자를 칼슘 이온 운반체로 처리한 다음 6-디메틸아미노퓨린으로 처리하여 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 칼슘 이온 운반체의 농도는 5μM 내지 15μM인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 15항에 있어서, 상기 칼슘 이온 운반체의 농도는 약 10μM인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 14항에 있어서, 상기 6-디메틸아미노퓨린의 농도는 1.5mM 내지 2.5mM인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 6-디메틸아미노퓨린의 농도는 약 2.0mM인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 (4)단계의 생체외 배양은 적어도 둘 이 상의 배지를 이용하여 연속적으로 수행되며, 상기 각 배지는 서로 다른 조성을 갖는 것임을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 19항에 있어서, 상기 생체외 배양은 서로 다른 조성을 갖는 두 종류의 배지를 연속적으로 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 20항에 있어서, 상기 생체외 배양은 G1 ver.3 배지에서 일차배양을 하고 SNUnt-2' 배지에서 이차배양을 하는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 5항 또는 제 6항에 있어서, 상기 (5)단계에서 내세포괴는, 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포 또는 조직을 이식받을 인간 환자로부터 유래된 섬유아세포를 포함하는 영양 세포층 상에서 배양되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제 22항에 있어서, 상기 영양 세포층은, 제1항 또는 제2항에 따른 줄기세포로부터 분화된 섬유아세포를 포함하는 영양 세포층 상에서 배양되는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 제22항에 있어서, 상기 영양 세포층은, 마우스 유래의 섬유아세포가 더 포함된 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포의 제조방법.
- 인간 체세포의 핵을 탈핵된 인간 난자로 이식하여 제조된 핵이식된 난자로부터 유래된 배아 줄기세포로부터 분화된 세포로서, 상기 체세포와 상기 난자는 서로 다른 개체로부터 유래된 것을 특징으로 하는 분화된 세포.
- 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포 또는 조직을 이식받을 인간 환자의 체세포의 핵을 탈핵된 인간 난자로 이식하여 제조된 핵이식된 난자로부터 유래된 자가 배아 줄기세포로부터 분화된 세포.
- 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 상기 분화된 세포는, 조혈모 세포, 신경 전구세포, 신경 세포, 베타 세포, 근육 세포, 간 세포, 연골 세포, 상피 세포 및 심근 세포 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포.
- 인간 배아 줄기세포로부터 특정 세포를 분화시키는 방법으로서,(1) 인간 체세포의 핵을 탈핵된 인간 난자로 이식하여 제조된 핵이식된 난자로부터 유래된 배아 줄기세포로서, 상기 체세포와 상기 난자는 서로 다른 개체로부터 유래된 것을 특징으로 하는 인간 배아 줄기세포를 배양하여 배아체를(embryoid body)를 형성하는 단계 및(2) 상기 배아체를, 상기 배아체의 세포를 특정 세포로 분화시키기에 적합한 제제의 존재 하에 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법.
- 인간 배아 줄기세포로부터 특정 세포를 분화시키는 방법으로서,(1) 줄기세포 또는 그로부터 분화된 세포 또는 조직을 이식받을 인간 환자의 체세포의 핵을 탈핵된 인간 난자로 이식하여 제조된 핵이식된 난자로부터 유래된 자가 배아 줄기세포를 배양하여 배아체를(embryoid body)를 형성하는 단계 및(2) 상기 배아체를, 상기 배아체의 세포를 특정 세포로 분화시키기에 적합한 제제의 존재 하에 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 자가 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법.
- 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 상기 특정 세포는, 조혈모 세포, 신경 전구세포, 신경 세포, 베타 세포, 근육 세포, 간 세포, 연골 세포, 상피 세포 및 심근 세포 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법.
- 제 30항에 있어서, 상기 특정 세포는 신경 전구세포이며,상기 (2)단계 이후에,신경 전구세포의 마커를 발현하는 세포를 선별하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법.
- 제 31항에 있어서, 상기 (2)단계의 제제는, 인슐린, 트랜스페린, 소디움 셀레나이트 및 피브로넥틴의 혼합물, 레티노산(Retinoic Acid), 아스코르브산(Ascorbic acid), 니코틴아마이드, N-2 보충제 및 B-27 보충제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법.
- 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 상기 특정 세포는 베타 세포이며,상기 (2)단계의 제제는, 인슐린, 트랜스페린, 소디움 셀레나이트 및 피브로넥틴의 혼합물, 니코틴아마이드, N-2 보충제 및 B-27 보충제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법.
- 제 33항에 있어서,상기 (2)단계는,(i) 배아체를, 인슐린, 트랜스페린, 소디움 셀레나이트 및 피브로넥틴의 혼합물을 포함하는 배지에 깔고, N-2 보충제, B-27 보충제 및 bFGF를 상기 배지에 보충하고 배양하는 단계; 및(ii) 상기 (i) 단계의 배지에서 bFGF를 제거하고 니코틴아마이드를 첨가하고 글루코오스의 농도를 500mg/l 내지 1500mg/l로 낮춘 후 상기 배아체를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법.
- 제 28항 또는 제 29항에 있어서, 상기 특정 세포는 심근 세포이며,상기 (2)단계의 제제는,디메틸 술폭시드(DMSO), 레티노산 및 5-아자-2'-데옥시시티딘 (5-aza-dC)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 배아 줄기세포로부터 특정 세포로의 분화방법.
- 손상된 세포, 조직 또는 기관의 복구를 위해 개체에 투여되는 조성물로서, 제 1항 또는 제 2항에 따른 인간 배아 줄기세포, 제 25항 또는 제 26항에 따른 분화된 세포, 상기 세포들로부터 유래된 조직 및 상기 조직으로부터 유래된 기관으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 손상된 세포, 조직 또는 기관의 복구용 조성물.
- 제 36항에 있어서, 상기 인간 배아줄기세포 또는 상기 분화된 세포는 환자의 질환의 치료에 적합하도록 유전자가 변형된 것을 특징으로 하는 손상된 세포, 조직 또는 기관의 복구용 조성물.
- 손상된 세포, 조직 또는 기관의 복구를 위해 개체에 세포, 조직 또는 기관을 이식하기 위한 세포, 조직 또는 기관 이식용 키트로서, 제 1항 또는 제 2항에 따른 인간 배아 줄기세포, 제 25항 또는 제 26항에 따른 분화된 세포, 상기 세포들로부터 유래된 조직 및 상기 조직으로부터 유래된 기관으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포, 조직 또는 기관 이식용 키트.
- 제 38항에 있어서, 상기 인간 배아줄기세포 또는 상기 분화된 세포는 환자의 질환의 치료에 적합하도록 유전자가 변형된 것을 특징으로 하는 세포, 조직 또는 기관 이식용 키트.
- 제 1항 또는 제 2항에 따른 인간 배아 줄기세포, 제 25항 또는 제 26항에 따른 분화된 세포, 상기 세포들로부터 유래된 조직 및 상기 조직으로부터 유래된 기관으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을, 상기 배아 줄기세포의 제조를 위해 체세포를 공여한 개체에 이식하여, 상기 개체의 손상된 세포, 조직 또는 기관을 복구하는 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 인간 배아줄기세포 또는 상기 분화된 세포는 환자의 질환의 치료에 적합하도록 유전자가 변형된 것을 특징으로 하는 손상된 세포, 조직 또는 기관을 복구하는 방법.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020050010509A KR20060089774A (ko) | 2005-02-04 | 2005-02-04 | 서로 다른 개체로부터 유래된 체세포와 난자로부터 유래된 인간 배아 줄기세포 및 그 제조방법 |
| PCT/KR2006/000403 WO2006083133A2 (en) | 2005-02-04 | 2006-02-03 | Human embryonic stem cell created from an oocyte and a somatic cell derived from non-identical individuals and a method for preparing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020050010509A KR20060089774A (ko) | 2005-02-04 | 2005-02-04 | 서로 다른 개체로부터 유래된 체세포와 난자로부터 유래된 인간 배아 줄기세포 및 그 제조방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20060089774A true KR20060089774A (ko) | 2006-08-09 |
Family
ID=36777629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020050010509A KR20060089774A (ko) | 2005-02-04 | 2005-02-04 | 서로 다른 개체로부터 유래된 체세포와 난자로부터 유래된 인간 배아 줄기세포 및 그 제조방법 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20060089774A (ko) |
| WO (1) | WO2006083133A2 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014200161A1 (ko) * | 2013-06-10 | 2014-12-18 | 단국대학교 산학협력단 | 효소적 생물연료전지 기반 전기자극에 의한 세포 거동 조절 방법 |
| KR20210031210A (ko) * | 2019-09-11 | 2021-03-19 | 재단법인 아산사회복지재단 | 포유동물의 이수체 체세포 유래 반수체 염색체를 포함하는 생식세포의 제조방법 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2023516484A (ja) | 2020-03-11 | 2023-04-19 | ビット バイオ リミテッド | 肝細胞作製方法 |
-
2005
- 2005-02-04 KR KR1020050010509A patent/KR20060089774A/ko not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-02-03 WO PCT/KR2006/000403 patent/WO2006083133A2/en active Application Filing
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014200161A1 (ko) * | 2013-06-10 | 2014-12-18 | 단국대학교 산학협력단 | 효소적 생물연료전지 기반 전기자극에 의한 세포 거동 조절 방법 |
| KR20210031210A (ko) * | 2019-09-11 | 2021-03-19 | 재단법인 아산사회복지재단 | 포유동물의 이수체 체세포 유래 반수체 염색체를 포함하는 생식세포의 제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2006083133A2 (en) | 2006-08-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9476064B2 (en) | Neuro-progenitor produced from an SCNT-derived ES cell | |
| JP4889902B2 (ja) | ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞からヒト神経前駆細胞を作製する方法、並びに、該方法を利用したニューロンの作製方法、稀突起膠細胞又は星状細胞の作製方法 | |
| US20080076176A1 (en) | De-differentiation and re-differentiation of somatic cells and production of cells for cell therapies | |
| US7011828B2 (en) | Implanting neural progenitor cells derived for human embryonic stem cells | |
| KR100973453B1 (ko) | 인간 배아 줄기 세포에서 유래되는 연골세포 전구체 | |
| US20020136709A1 (en) | In vitro-derived adult pluripotent stem cells and uses therefor | |
| US20070298453A1 (en) | Stem Cells | |
| US20070020759A1 (en) | Therapeutic reprogramming of germ line stem cells | |
| JP2005503822A (ja) | 無フィーダーマトリックス上での未分化ヒト胚性幹（ｈｅｓ）細胞の導出および増殖方法ならびにヒトフィーダー層 | |
| AU2006269884A1 (en) | Therapeutic reprogramming of germ line stem cells | |
| Muzaffar et al. | Equivalency of buffalo (Bubalus bubalis) embryonic stem cells derived from fertilized, parthenogenetic, and hand-made cloned embryos | |
| KR20060089774A (ko) | 서로 다른 개체로부터 유래된 체세포와 난자로부터 유래된 인간 배아 줄기세포 및 그 제조방법 | |
| JP2005523685A (ja) | 体細胞由来胚幹細胞及びそれらの分化子孫 | |
| JP2010507373A (ja) | 動物血清を含まない培地中で着床前胚から多能性細胞を単離するための方法 | |
| WO2008018684A1 (en) | Culture medium for co-culturing of human stem cells and their feeder cells | |
| Procópio et al. | Development of Artificial gametes | |
| NZ583003A (en) | Embryonic stem cell line and method for preparing the same | |
| Bui et al. | Female Germline Stem Cells: Potential Applications in Reproductive Technology | |
| Muhammad Alahdal | Deriving bovine embryonic stem-like cells in defined conditions | |
| JP2008528059A (ja) | 分化細胞を治療用に再プログラム化するための核の材料の使用 | |
| US20090305404A1 (en) | Methods and compositions relating to blastomere-derived human embryonic stem cells | |
| AU2005202687A1 (en) | Methods of generating germ cells from stem cells and uses thereof | |
| AU1976701A (en) | Long-term cell culture compositions and genetically modified animals derived therefrom |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E601 | Decision to refuse application |