JP2010507373A - 動物血清を含まない培地中で着床前胚から多能性細胞を単離するための方法 - Google Patents

動物血清を含まない培地中で着床前胚から多能性細胞を単離するための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚から前記多能性細胞を単離する方法であって、フィーダー細胞層に包埋され、実質的に血清のない培地で培養される、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、及び、前記1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法を提供する。本発明は、前記方法により作製される多能性細胞及びその使用も提供する。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明
本出願は、2006年10月24日出願のオーストラリア特許仮出願第2006905889号からの優先権を主張するものであり、その内容はこの参照により本明細書に組み込まれているものと解釈すべきである。
[発明の分野]
本発明は、胚から多能性細胞を単離する方法、及び該方法により単離される多能性細胞に関する。
[発明の背景]
胚性幹(ES)細胞は、胚に由来する多能性細胞であり、3種類の胚葉すべてに分化する能力を有する。胚では、そのような細胞は、生殖細胞も含めて、生物の全組織及び器官の形成に寄与する。
ES細胞は、Oct4、Nanog、Sox2、Rex1及びアルカリホスファターゼなどのいくつかの特異的な分子マーカーを発現する。ES細胞は、SSEA−1、SSEA−2、TRA1−60、及びTRA1−81などのいくつかの特異的な細胞表面マーカーも発現する。未分化ES細胞の追加のさらなる特徴は、関連する非筋ミオシンを伴うF−アクチンの細胞質組織化である。未分化ES細胞では、F−アクチンは末梢組織化皮質環に組織化され、そこでは細胞が相互に直接接触している。
ES細胞の主供給源は、胚結節、即ち着床前胚の内部多能性成分である。マウスや他のげっ歯類、霊長類及びヒトなどの哺乳動物では、この多能性成分は、その細胞が初期胚内部で多能性細胞の凝集塊として組織化されているために、内部細胞塊(ICM)と呼ばれている。有蹄動物では、この成分は、この成分の細胞が平板的な、大部分が一層構造として組織化されているために、胚性円板(ED)と呼ばれている。
ES細胞の研究及び医学的応用はよく認識されている。しかし、これらの応用は、ほぼすべての種からのES細胞の単離方法が不可能であり、及び/又は効率的でないことにより妨げられてきた。
例えば、ES細胞の単離及びES系統の樹立の効率は低い。ES系統を樹立するために常用されているマウス株でも、単離の効率は、通常、使用される胚の2〜3%を超えることはない。
ES細胞を単離する方法は、一般に、栄養外胚葉及び胚外内胚葉などの他の非多能性細胞の過剰増殖を減少させるために、これらの細胞から多能性成分を分離するステップも必要である。多能性成分を他の細胞から分離するこれらの方法は、通常、免疫外科的ステップ、又は内部細胞塊からの栄養外胚葉細胞の機械的除去を含むステップのいずれかを含む。
この点に関して、胚中の他の細胞からの多能性成分のある種の分離を行わずに、胚全体から多能性細胞を単離することもこれまで可能ではなかった。
さらに、大半の哺乳動物では、キメラ動物のすべての器官及び組織(生殖系列の系統を含む)の形成に関与するその能力という点で、真のES細胞株の樹立はまだ報告されてはいない。
ES細胞の単離ができないこと及び/又は効率が悪いことに対する理由はいくつかあるが、胚中の多能性である細胞の数が少ない、及び胚から単離される多能性細胞を未分化状態で維持することができないことが、この単離ができないこと及び/又は効率が悪いことの一因である可能性がある。
本発明は、胚から多能性細胞を単離する方法であって、他の細胞型から多能性成分の分離を必要とせず、胚全体から多能性細胞を直接単離することにも使うことができる方法に関する。
先行技術として与えられる特許文書又は他の物への本明細書における参照は、前記文書若しくは物が公知であったこと、又はそれに含まれる情報が特許請求の範囲のすべての優先日の時点でありふれた一般知識であったことを承認したこととして解釈すべきではない。
[発明の概要]
本発明は、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)(a)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、胚由来の1つ又は複数の多能性細胞を増殖させること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
本発明は、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)(a)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、着床前胚全体を増殖させること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
本発明は、他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)(a)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で着床前胚由来の1つ又は複数の多能性細胞を増殖させること、及び、1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法も提供する。
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、及び、1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法も提供する。
本発明は、他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、及び、1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法も提供する。
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)胚から、1つ又は複数の多能性細胞を含む、初代培養を樹立すること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)胚由来の1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)胚から、1つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
本発明は、実質的に血清を含まない、1つ又は複数の多能性細胞を増殖させるのに使用するときの培養培地も提供する。
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)胚全体をフィーダー細胞の層に押圧することにより、着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離するためのキットであって、実質的に血清を含まない、1つ又は複数の多能性細胞を増殖させるための培地を含み、胚から多能性細胞を単離するための使用説明書をさらに随意に含むキットも提供する。
本発明は、着床前胚から単離された多能性細胞であって、胚由来の他の細胞から多能性細胞を単離せずに、胚全体由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる、多能性細胞も提供する。
本発明は、着床前胚から単離された複数の多能性細胞であって、胚由来の他の細胞から1つ又は複数の多能性細胞を単離せずに、胚全体由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる、複数の多能性細胞も提供する。
本発明は、着床前胚から単離された多能性細胞であって、実質的に血清のない培地中で胚由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる、多能性細胞も提供する。
本発明は、着床前胚から単離された複数の多能性細胞であって、実質的に血清のない培地中で胚由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる複数の多能性細胞も提供する。
本発明は、哺乳動物着床前胚からのES細胞の単離に向けての研究から生まれている。特に、血清を欠く培地中で胚由来の多能性細胞を増殖させると、胚外及び他の分化細胞の過剰増殖が減少し、また、多能性細胞の未分化状態での維持も支持されることが実証されている。
このような形で多能性細胞を単離すると、他の細胞から多能性成分を人為的に単離する必要がなくなり、多能性細胞を胚全体から単離することも可能になる。このような形で多能性細胞を単離すると、血清に付随する1つ又は複数の病原体による汚染の可能性を一緒にもたらす血清の供給源の存在下で細胞を増殖させる必要もなくなる。
図1は、使用する代表的なブタ胚盤胞を示す。 図2は、透明帯の除去及びマウス胚線維芽細胞(MEF)フィーダー細胞層への押圧後の胚盤胞を示す。 図3は、フィーダー層への押圧前(パネルA)及び押圧後(パネルB)のブタ胚盤胞の細胞数を示す。細胞数は、胚盤胞全体のフィーダー層への押圧後に減少してはいないこと、及びフィーダー層への押圧によっても胚性円板と栄養膜細胞の機械的分離が生じていないことに注目すべきである。 図4は、対照(FCS)グループと実験(血清代替物、SR)グループにおける初代胚性増殖の形成を示す。両グループで、胚性増殖は栄養外胚葉細胞と推定ES細胞からなっていた。 図5は、培養7日後のFCSグループにおける初代胚性増殖の発生を示す。胚性増殖は、分化細胞からなり、推定ES細胞が存在する徴候は何もなかった。 図6は、培養7日後のFCSグループにおける初代胚性増殖の発生を示す。この胚性増殖では、推定ES細胞の小コロニーが分化細胞に取り囲まれている。 図7は、培養7日後のSRグループにおける初代胚性増殖を示す。胚性増殖は、ES細胞に特徴的な形態(小さな細胞質/核比、複数の核小体のある核、及び細胞質における複数の脂質封入体)を有し、少量のアポトーシス栄養外胚葉細胞を有する推定ブタES細胞からなる。 図8は、培養7日後のSRグループにおける初代胚性増殖を示す。増殖は、特徴的な形態を有する均質な推定ブタES細胞のみからなる。 図9は、培養14日後のSRグループにおける初代胚性増殖を示す。初代胚性増殖は著しく拡大し、均質な推定ESコロニーからなり、栄養外胚葉又は他の分化細胞の徴候は何もない。 図10は、栄養膜細胞の残り及び多能性細胞として同定された細胞(黄色矢印)からなる(パネルA)初代2日目初代増殖におけるOCT−4の発現を示す。パネルBは、多能性細胞(黄色矢印)のみがOct−4(緑色)を発現していることを示している。 図11は、単一ブタES細胞における高い細胞質/核比を示す。これらの細胞は直径が小さく(パネルA)、その細胞質に脂質封入体を有している。これらの細胞の核(パネルB、核は赤色に染色されている)が細胞のほとんど全容積を占めている。 図12は、ブタ胚盤胞へのブタES細胞の注入の結果を示す。赤色蛍光染色剤で標識した単一ブタES細胞のセット(パネルA及びパネルB)を宿主ブタ胚盤胞に注入した。注入の次の日、宿主胚盤胞はその形状を回復し(パネルC)、注入されたブタES細胞は胚盤胞のICMに組み込むことができた(パネルD)。 図13は、ブタ栄養膜細胞(パネルA)、マウス胚線維芽細胞及びブタES細胞(パネルB)におけるF−アクチン組織化(緑色)を示す。ブタES細胞は、ES細胞に特徴的なF−アクチン分布パターンを有している。 図14は、ブタES細胞におけるSSEA−1発現(赤色)を示す。 図15は、ブタES細胞におけるOct−4発現(緑色)を示す。 図16は、ブタ胚盤胞(パネルA)のICM細胞(黄色矢印)における、及びブタES細胞(赤色矢印)を注入したブタ胚盤胞(パネルB)におけるOct−4発現(緑色)を示す。
[発明の全般的な説明]
上記のように、一実施形態では、本発明は、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)(a)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、胚由来の1つ又は複数の多能性細胞を増殖させること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
本発明は、胚から多能性細胞を単離するための改良された方法を対象とする。本発明は、多能性細胞株の樹立のために使用してもよい。
この点に関して、本明細書のいたるところで使用される用語「多能性細胞」とは、以下の特徴、(i)外胚葉、中胚葉、及び内胚葉派生物を含むいかなる細胞型にも分化することができる、(ii)生殖系列の系統を含むキメラ生物におけるいかなる器官及び組織にも寄与することができる、(iii)その多能性状態を示す特異的分子マーカー(例えば、Oct4、Nanog、Sox2、Rex1、アルカリホスファターゼ)及び細胞表面マーカー(例えば、SSEA−1、SSEA−4、TRA1−60、TRA1−81)を発現する、並びに(iv)細胞質にF−アクチンの特徴的な分布を有する、のうち1つ又は複数を有する細胞を意味すると理解されている。
本明細書のいたるところで使用される用語「胚由来の1つ又は複数の多能性細胞」とは、胚に存在する多能性細胞などの胚起源の1つ若しくは複数の多能性細胞、又は胚に本来存在する多能性細胞由来の1つ若しくは複数の多能性細胞を意味すると理解されるべきである。
細胞が多能性細胞かどうかを評価するための方法は、本技術分野では公知である。
例えば、多能性細胞は、形態上の特徴により同定することができる(例えば、E.Robertson、「Embryo−derived stem lines」、In:Teratocarcinomas and embryonic stem cells−a practical approach、EJ Robertson編、IRL Press、Oxford、1987、pp71〜112;及びStice SL and Golueke PJ、Cultured inner cell mass cell lines derived from bovine or porcine embryos、米国特許第5905042号を参照されたい)。
例えば、マウスES細胞は典型的には小さく、大きな核及び最小の細胞質を有し、核には1つ又は複数の顕著な濃い核小体構造物が含有されるが、ウシ及びブタ多能性細胞は、以下の特性、即ち、a)小さな細胞質/核容積比;b)細胞質小胞;及びc)小さな個々の細胞、を示している。ある種のマーカー(Oct4、Nanog、Sox2、Rex1、アルカリホスファターゼ、SSEA−1、SSEA−4、TRA1−60、TRA1−81などの)の発現及び/又は種々の細胞型、即ち外胚葉、中胚葉及び内胚葉胚葉の派生物に分化する細胞の能力も、多能性細胞の同定の判定基準である。
ES細胞の同定のもう1つの判定基準は、F−アクチン分布である。マウスES細胞では、F−アクチンは、末梢組織化皮質環に組織化されており、そこでは細胞は相互に直接接触している(例えば、Slager HGら、Organization of non−muscle myosin during early murine embryonic differentiation、Differentiation.1992.v.50.pp.47〜56;Flechon,J.−E.What are ES Cells? In:Transgenic animals−Generation and use(Houndebine LM 編)、Harwood Academic Publishers、1997、pp157〜166を参照されたい)。
本明細書のいたるところで使用される用語「胚由来の非多能性細胞」とは、多能性能がない胚起源の細胞を意味すると理解されるべきである。そのような細胞には、例えば、栄養膜細胞などの分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞、及び胚外内胚葉細胞が挙げられる。非多能性細胞は胚に存在することもあれば、胚に本来存在する多能性又は非多能性細胞から増殖した細胞などの、胚に本来存在する細胞由来であることもある。多能性及び非多能性として細胞を特徴付けるための方法は本技術分野では公知である。
胚は適切な種由来でよい。哺乳動物胚の例には、ヒト、霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ若しくはヤギを含む家畜動物、イヌ、ネコを含むコンパニオンアニマル、又はマウス、ラット、モルモット、若しくはウサギを含む臨床検査動物由来の胚が挙げられる。
本発明の種々の実施形態での着床前胚は、例えば、卵母細胞の精子による受精から生じる胚でも、核移植により産生される胚でも、単為生殖活性化により産生される胚でもよい。本発明の範囲には、インビトロ産生胚又はインビボ産生胚由来の多能性細胞の単離が含まれることが認識されるであろう。
胚を単離する又は産生するための方法は本技術分野では公知である。例えば、胚は適切なメス哺乳動物から単離することができる。或いは、胚は、補助生殖医療技術の使用などによりインビトロで生じさせることができる。適切な補助生殖医療技術の例は、体外受精である。
本発明の種々の実施形態での着床前胚は、着床に先立って1つ又は複数の多能性細胞を含有する胚である。
胚は、接合期からのすべての適切な胚形成期を含む適切な着床前胚である。
一実施形態では、着床前胚は、桑実胚又は、拡張胚盤胞若しくは孵化胚盤胞を含む胚盤胞である。
この点に関して、受精により産生される胚の場合には、胚は受精後一連の卵割を受け、2細胞、4細胞、8細胞及び16細胞期と進行することは理解されるであろう。8細胞又は16細胞胚(種に依存)の発生後、卵割球は相互に緊密な接合部を形成し始め、その円い形は変形し、桑実胚と呼ばれる球形の細胞塊を形成する。
卵割球間の接合複合体の形成に続いて、体液が胚内部に蓄積して、胚盤胞形成のシグナルを送る。胚盤胞は栄養膜細胞の中空球から構成されており、その内部には、一般に内部細胞塊/胚結節と呼ばれる細胞の小さなクラスターがある。栄養膜は続けて胎膜系に寄与し、内部細胞塊細胞の一部は胎児になるよう運命付けられている。一般に、着床前の胚の最終発生段階は孵化胚盤胞である。
ヒトでは及び他の哺乳動物では、内部細胞塊での細胞の発生及びそれに引き続き胚性胚葉及び分化細胞を形成する分化を含む胚盤胞の形成は、すべて類似の発生過程をたどる。
典型的には、本発明の種々の実施形態における適切な着床前胚は、多能性細胞の単離のために選択される。この点に関して、当業者ならば、胚は異なる発生能を有していることがあり、大きく明瞭な内部細胞塊を有する胚が一般に、多能性細胞の単離にもっとも適切な胚を提供することを認識するであろう。例えば、大きく明瞭な内部細胞塊のある拡張胚盤胞を使用してもよい。胚を類別するための方法は本技術分野では公知であり、例えば、胚盤胞類別方式は、Veekら(2003)「Human blastocysts in vitro」、Veek L.L.及びZaninovic N.編、An Atlas of Human Blastocysts.New York pp99〜137;The Parthenon Publishing Group、2003に記載されている。
本明細書において先述したように、本発明は、胚から多能性細胞を単離するための改良された方法を対象とする。
この点に関して、用語「単離する」とは、多能性細胞を、胚において存在するその天然の環境から取り出すことを意味すると理解されるであろう。
したがって、本発明は、着床前胚由来の1つ又は複数の多能性細胞を増殖させるステップと、そのようにして増殖させた細胞から多能性細胞を単離するステップとを含む。
この点に関して、胚由来の1つ又は複数の多能性細胞には、胚に存在する1つ若しくは複数の多能性細胞、又は胚に本来存在する多能性細胞から生じる1つ若しくは複数の多能性細胞が含まれることは理解されるであろう。同様に、胚由来の非多能性細胞には、胚に存在する非多能性細胞、又は胚に存在する多能性若しくは非多能性細胞から生じる非多能性細胞が挙げられる。
一実施形態では、本発明を使用して、他の非多能性細胞と比較して胚由来の1つ又は複数の多能性細胞を濃縮することができる。
別の実施形態では、本発明を使用して、胚由来の多能性細胞の数を増やすことができる。
例えば、多能性細胞は、栄養膜細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞、及び胚外内胚葉細胞などの胚由来の非多能性細胞が実質的にない1つ又は複数の多能性細胞でよい。
この点に関して、特に栄養外胚葉細胞のせいで、培養期間中ICMの増殖は妨げられ、多能性細胞及び多能性細胞株の樹立は厄介になることがある。
一実施形態では、そのようにして単離される多能性細胞は、栄養膜細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞、及び胚外内胚葉細胞などの胚由来の1つ又は複数の非アポトーシス非多能性細胞が実質的にない。細胞のアポトーシス状態を判定するための方法は本技術分野では公知である。
本明細書において先述するように、本発明を使用して、例えば、胚に存在する多能性細胞に由来する多能性細胞株を樹立することもできる。
一実施形態では、本発明を使用して、胚外細胞及び/又は分化細胞(分化するよう方向付けられた細胞を含む)が実質的にない複数個のインビトロ多能性細胞を得ることができる。例えば、本発明を使用して、多能性細胞の均質なコロニーなどの多能性細胞の均質な集団を得ることができる。
例えば、一実施形態では、本発明の1つ又は複数の多能性細胞を、細胞が細胞のコロニーを形成するまで増殖させることができる。
一実施形態では、このようにして形成されるコロニーは、栄養膜細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞、及び胚外内胚葉細胞などの1つ又は複数の非アポトーシス非多能性細胞が実質的に存在しない。
特定の一実施形態では、本発明を使用して、胚の一部から多能性細胞を単離することができるだけではなく、本発明を使用して、胚全体から多能性細胞を直接単離することもできることが認識されている。
したがって、本発明の種々の実施形態での1つ又は複数の多能性細胞の増殖は、1つ又は複数の多能性細胞を含有する胚全体の増殖でよい。
したがって、別の実施形態では、本発明は、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)(a)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、着床前胚全体を増殖させること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
先述するように、本発明を使用して、栄養外胚葉細胞などの他の細胞から前記多能性細胞を単離する1つ又は複数のステップを用いずに、着床前胚から多能性細胞を単離することもできる。
したがって、一実施形態では、本発明は、他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)(a)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚を増殖させること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
先述のように、一実施形態では、胚は胚全体である。
したがって、本発明を使用して、他の細胞から多能性細胞を単離せずに、胚全体から多能性細胞を単離することもできる。
したがって、別の実施形態では、本発明は、他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚全体から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)(a)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
他の細胞(栄養膜細胞などの)から多能性細胞を単離するのに使われるそのような方法の例には、機械的、免疫外科的、非酵素的又は酵素的単離方法が挙げられる。
本発明は、本発明に従って単離された多能性細胞も提供する。本発明は、多能性細胞に由来する多分化能性又は分化細胞も提供する。特定の発生系列に沿って多能性細胞を分化させ、細胞を特徴付けるための方法は本技術分野では公知である。
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から単離された多能性細胞であって、胚由来の他の細胞から多能性細胞を単離せずに、胚全体由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる多能性細胞を提供する。
本発明は、細胞の均質な集団などの複数の多能性細胞も提供する。例えば、細胞の集団は多能性細胞のコロニーでもよい。
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から単離された複数個の多能性細胞であって、胚由来の他の細胞から多能性細胞を単離せずに、胚全体由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる複数の多能性細胞を提供する。
本明細書において先述するように、本発明の種々の実施形態における1つ又は複数の多能性細胞の増殖は、多能性細胞の未分化増殖を可能にするが胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下での細胞の増殖である。培養条件がこれらの基準を満たしているかどうかを判定するための方法は本技術分野では公知である。
一実施形態では、1つ又は複数の多能性細胞の増殖は、実質的に血清の不在下での増殖である。
一実施形態では、胚由来の前記1つ又は複数の多能性細胞を、実質的に血清のない培養培地中で増殖させる。
したがって、本発明は、血清を含有しない培地などの実質的に血清のない適切な培地中で細胞を増殖させることを含む。
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で胚由来の1つ又は複数の多能性細胞を増殖させることを含む方法を提供する。
この点に関して、培養培地に血清が存在すると、多能性細胞の単離及び維持の低効率の一因となることがあることは認識されている。理論に縛られることなく、培養培地中の血清の存在は、胚外細胞の過剰増殖だけではなく、多能性細胞の分化を促進することの原因にもなると考えられている。したがって、血清は、増殖している細胞に栄養分を提供するだけではなく、血清は、多能性細胞の分化を促進し及び/又は細胞の分化を支援することができる不確定因子も含有することがある。
したがって、このような形での胚由来の多能性細胞の増殖は、胚外細胞(栄養外胚葉及び胚外内胚葉などの)の除去、並びに、分化している及び/又は分化するよう方向付けられた細胞の除去を可能にする。
一実施形態では、胚の透明帯は、1つ又は複数の多能性細胞の増殖前に除去される。例えば、透明帯は、酵素的な又は機械的な除去によって除去してよい。哺乳動物胚の透明帯を除去するための方法は本技術分野では公知である。
本発明は、この方法により単離される多能性細胞又は複数の細胞も提供する。
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から単離された多能性細胞であって、実質的に血清のない培地において胚由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる多能性細胞を提供する。
別の実施形態では、本発明は、着床前胚から単離された複数の多能性細胞であって、実質的に血清のない培地において胚由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖した複数の多能性細胞を提供する。
この点に関して、実質的な無血清培地とは、血清のない培地又は、胚外細胞の除去、並びに、すでに分化した及び/若しくは分化するよう方向付けられた細胞の除去をそれでも可能にするレベルの血清タンパク質(複数可)若しくは他の成分を含む培地のことである。
一実施形態では、培地は無血清である。
この点に関して、血清は種々の成分の混合物であるので、実質的に血清のない培地は、通常は血清に存在するが、非多能性細胞の分化及び増殖を促進しない1つ又は複数の成分をそれでも含有することがあることは認識されるであろう。
非多能性細胞の分化及び増殖を促進する特定の因子の能力を判定するための方法は本技術分野では公知である。
一実施形態では、1つ又は複数の多能性細胞の増殖は、血清代替物を含む培地中である。適切な血清代替物は、例えば、インビトロジェン社(Invitrogen)(カタログ番号10828−028)から入手可能である、又はUltroserG(ポール社(Pall))などの血清代替物がある。血清代替物は、血清アルブミン、インスリン及びトランスフェリンなどの高純度動物(一般にウシ)タンパク質を含有する血清代替物と定義される。血清代替物は、増殖因子、ステロイドホルモン、グルココルチコイド及び細胞接着因子を通常は含有しないが、これらを含有することもある。
血清代替物の適切な濃度は5〜25%の範囲にある。
別の実施形態では、1つ又は複数の多能性細胞の増殖は、アルブミンを含む培地においてである。
アルブミンの適切な濃度は0.1〜10%の範囲にある。
胚由来の1つ又は複数の多能性細胞の増殖のための適切な培地は、L−グルタミンをモル当量単位で置換したGlutaMax−I(ジペプチドL−アラニル−L−グルタミン)、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含有し、0.1mM〜10mMピルビン酸ナトリウム、1〜100ng/mL bFGF、1〜100ng/mL hrEGF、1×ITS、55μM β−メルカプトエタノール、1×非必須アミノ酸(すべてインビトロジェン社製)及び1〜100ng/mL hrLIF(ミリポア社(Millipore))を補充したα−MEM培地(インビトロジェン社、カタログ番号32571−036)である。
この点に関して、例えば、E.Robertson、「Embryo−derived stem lines」、In:Teratocarcinomas and embryonic stem cells−a practical approach、EJ Robertson編、IRL Press、Oxford、1987、pp71〜112に記載の多種多様な種由来の胚の培養条件は本技術分野では公知である。
適切な基礎培地には、例えば、DMEM培地、DMEM/F12培地、アルファ−MEM培地及びHEScGRO培地が含まれる。他の適切な基礎培地は当業者が決定してよい。
一実施形態では、着床前胚は胚全体である。
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚由来の多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させることを含む方法を提供する。
本発明は、実質的に血清を含まない、1つ又は複数の多能性細胞を増殖させるのに使用するときの培養培地も提供する。一実施形態では、培地は血清代替物を含む。
適切な培養培地は本明細書で前述している通りである。
本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離するためのキットも提供する。キットは、実質的に血清を含まない、胚を増殖させるための培地を含み、多能性細胞を単離するための使用説明書をさらに含んでもよい。
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離するためのキットであって、実質的に血清を含まない、1つ又は複数の多能性細胞を増殖するための培地を含み、胚から多能性細胞を単離するための使用説明書をさらに随意に含むキットを提供する。
一実施形態では、キット中の培地は血清代替物も含む。
或いは、キットは別々に血清代替物も含有し、この血清代替物は使用のために培地に添加される。
一実施形態では、1つ又は複数の多能性細胞の増殖は、1つ又は複数の多能性細胞を含有する胚の全部又は一部からの細胞の初代培養の樹立を含む。
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)胚から、1つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
一実施形態では、初代培養は、フィーダー細胞の存在下で胚の全部又は一部を増殖させることにより樹立される。
この場合、胚の全部又は一部は、例えば、フィーダー細胞の層に押圧されていてもよく、包埋されていてもよく、又は平板化されていてもよい。
一般に、フィーダー層は、フィーダー細胞の増殖を阻害するように処理された不活化フィーダー層でなる。増殖を阻害するようフィーダー層を処理する方法には、照射(例えば、γ−照射)又はマイトマイシンCなどの化学薬品による処理が含まれる。フィーダー層として使用するのに適切な細胞には、マウス胚線維芽細胞などの細胞が含まれる。適切なフィーダー層を調製するための方法は本技術分野では公知である。
一実施形態では、初代培養は、フィーダー細胞の存在下で胚全体を直接増殖させることにより樹立される。
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)胚由来の1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
或いは、初代培養は、胚の全部又は一部を適切な細胞増殖基質上で増殖させることにより樹立することができる。
本明細書において先述するように、一実施形態では、初代培養の増殖は実質的に血清のない培地中で行う。
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)胚から、1つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
一実施形態では、初代培養は、着床前胚全体から直接樹立される。
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
一実施形態では、胚の透明帯は、1つ又は複数の多能性細胞の増殖前に除去される。例えば、透明帯は、酵素的又は機械的除去により除去してもよい。哺乳動物胚の透明帯を取り除くための方法は本技術分野では公知である。
本明細書において先述するように、初代培養は、胚の全部又は一部をフィーダー層に押圧することにより樹立することができる。
したがって、別の実施形態では、本発明は、着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)胚全体をフィーダー細胞の層に押圧することにより着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
初代培養の増殖は、例えば、必要な細胞の富化及び/又は拡張に応じて、1つ又は複数の多能性細胞の増殖又は維持を可能にするのに適切な時間の間であってよい。
一実施形態では、胚の透明帯は、1つ又は複数の多能性細胞の増殖前に取り除かれる。例えば、透明帯は、酵素的又は機械的除去により除去することができる。哺乳動物胚の透明帯を除去するための方法は本技術分野では公知である。
例えば、初代培養は、実質的に胚外細胞のない、又は栄養外胚葉細胞などの少量のアポトーシス胚外細胞を含有する多能性細胞の均質な集団の作製を可能にする7〜14日の期間培養することができる。
一実施形態では、初代培養は、均質な多能性細胞のコロニーの形成を可能にするのに十分な期間培養される。したがって、コロニーは、栄養外胚葉及び他の分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞並びに胚外内胚葉細胞などの非多能性細胞が実質的にないことがある。
そのようにして単離された多能性細胞は、未分化細胞の形態上の判定基準及び多能性をまったく喪失することなく何度も継代することができる。
本発明は、本発明に従って作製される多能性細胞、又は多能性細胞株も提供する。
本発明は、本発明に従って作製される多能性細胞由来のさらに限定された能力の細胞(例えば、多分化能性細胞)又は分化細胞、及び多能性細胞由来の遺伝子操作された細胞も提供する。多能性細胞を分化させる方法及び遺伝子操作する方法は本技術分野では公知である。
本発明は、本発明に従って作製される多能性細胞由来の1つ又は複数の細胞を含む非ヒト動物も提供する。そのような動物を作製するための方法は本技術分野では公知である。
例えば、キメラ動物などの動物は、本発明に従って作製される多能性細胞由来のいくつかの細胞を含有することができる。
本発明は、本発明に従って作製される1つ又は複数の多能性細胞を含む組成物も提供する。組成物はインビトロでもインビボでも使用することができる。
この点に関して、本発明は、細胞を組織又は被検体に導入することにより組織中又は被検体中で細胞を再生するために、本発明に従って作製される多能性細胞(並びにその分化した及び遺伝子操作された形)の使用も企図している。
したがって、別の実施形態では、本発明は、本発明に従って作製される細胞を含む医薬組成物、並びに/又は多能性細胞由来の分化細胞及び/若しくは多能性細胞由来の遺伝子操作された細胞を含む医薬組成物を企図している。
細胞療法のための医薬組成物を処方するための方法は本技術分野では公知であり、例えば、「Stem Cell Transplantation−Biology,Processing and Therapy」、(2006)、Anthony D.H.Ronald−Hoffman及びEsmail P.Zanjani編、Wiley−VCH Verlag GmbH&co kGaA;「Cell Therapy,Stem Cellss and Brain Therapy」、(2006)、Paul R.Sunberg及びCyndy D.Davis編、Humana Pressに記載されている。
一般に、そのような医薬組成物は、細胞及び医薬的に許容可能なキャリアを含んでいる。
細胞療法が標的組織において細胞を再生させる必要性は、細胞消失、損傷又は機能障害に付随するいくつかの疾患又は状態に関連することがある。
したがって、本発明を使用して、細胞消失、細胞損傷又は細胞機能障害に付随する被検体の疾患又は状態を予防及び/又は治療することもでき、その方法は本発明に従って細胞を被検体に導入するステップを含む。
被検体は、本明細書において先述する哺乳動物を含む、任意の適切なレシピエントでよい。レシピエント哺乳動物及びヒトに細胞を導入するための方法は、本技術分野では公知である。
[特定の実施形態の説明]
ここで、本発明の上記の一般的原理を具体化する実験に言及する。しかし、以下の説明は、上記説明の一般性を限定するためのものではないことは理解されるべきである。
実施例1
(ブタ胚盤胞のインビトロ作製)
ブタ卵巣は地元の屠殺場から入手した。卵母細胞は吸引して、39℃で5%二酸化炭素の加湿環境の下、TCM−199培地で成熟させた。42〜44時間の成熟後、卵母細胞は、TALP−PVA培地において濃度5×10精子/mLで使う成熟オスの精子で6時間受精させた。受精後、受精卵母細胞はNCSU−23培地で7日間培養した。受精日は0日目である。インビトロ培養の7日目に発生した孵化又は拡張胚盤胞(図1)を、推定多能性ブタES細胞の単離のために使った。
実施例2
(ブタ胚盤胞のインビボ作製)
発情期のメス豚を成熟オスの精子で人為的に授精させた。授精後4.5日目に、インビボ作製した新しい胚を後期桑実胚−初期胚盤胞期に子宮角から流し出し、実施例1に記載するようにNCSU−23培地で一晩培養した。人為的授精後6日目に発生した拡張胚盤胞を、推定多能性ES細胞の単離のために使った。
実施例3
(一次マウス胚線維芽細胞からのフィーダー層の調製)
一次マウス胚線維芽細胞からのフィーダー層の調製のための方法は、E.Robertson、「Embryo−derived stem lines」、In:Teratocarcinomas and embryonic stem cells−a practical approach、EJ Robertson編、IRL Press、Oxford、1987、pp71〜112に記載の通りである。手短に言えば、129/Sv妊娠メスマウスを妊娠14日目に屠殺した。胎児を取り出し、肝臓、心臓及び他の内臓器官は処分した。残った胎児は、トリプシン及びEDTAの存在下で細かく切り刻み、37℃で10〜15分間インキュベートした。次に、トリプシンは中和し、細胞はFalcon組織フラスコ上に蒔いて、細胞がコンフルエントになるまで5%二酸化炭素の加湿環境の下37℃でインキュベートした。細胞がコンフルエントに到達したところで、細胞をトリプシン処理により回収し、トリプシンを不活化し、細胞は、血清中10%DMSOで、濃度2〜5×10細胞/mL/チューブでクライオチューブ(cryotube)中で凍結し、−80℃以下で保存した。フィーダー層の調製のために、チューブを解凍し、細胞は洗浄してDMSOを取り除き、コンフルエントに到達するまで培養フラスコで増殖させた。コンフルエントになると、細胞はトリプシン処理し、トリプシンを不活化し、洗浄した細胞はガンマ照射にかけ、使用までの2日間、1.2〜1.5×10細胞/cmでFalcon器官培養皿に蒔いた。
実施例4
(透明帯のないブタ胚盤胞のフィーダー層への押圧)
ブタ孵化又は拡張胚盤胞は、実施例1及び実施例2に記載の通りに得られた。代表的な胚盤胞を図1に示す。拡張胚盤胞から透明帯を機械的に取り除くために、先端部分の内径が胚盤胞の直径よりもわずかに小さい口で調節するガラスピペットで透明帯を慎重に取り除いた。2〜3回のピペット操作の後、胚盤胞を損傷することなく透明帯は容易に除かれた。次に、透明帯のないブタ胚を、フィーダー層を含有するFalcon器官培養皿に移し、30G針の付いたインスリン用注射筒を使用してフィーダー層に慎重に押圧した。胚をフィーダー層に押圧しても、細胞が消失したり、又は、多能性細胞が栄養膜細胞から機械的に分離することはない。これは、図2及び図3に示している。胚は、濃度50nMの生体DNA染色剤Hoechst33342で染色し、押圧の前と後で細胞数を計数した。この研究の結果(図3Aと図3Bに示す)により、押圧手順の間、細胞消失も胚の多能性成分と非多能性成分の分離も起こらないことが実証された。
実施例5
(多能性細胞の単離)
ブタ6日目〜7日目孵化又は拡張胚盤胞は、実施例1及び実施例2に記載した通りに得られた。代表的な胚盤胞は図1に示している。
透明帯の除去後、胚は、実施例3に記載し図2に示す通りに、マウス胚線維芽細胞フィーダー層に押圧し、L−グルタミンをモル当量単位で置換したGlutaMax−I(ジペプチドL−アラニル−L−グルタミン)、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含有し、1mMピルビン酸ナトリウム、10ng/mL bFGF、10ng/mL nrEGF、1×ITS、55μM β−メルカプトエタノール、1×非必須アミノ酸(すべてインビトロジェン社製)及び10ng/mL hrLIF(ミリポア社)を補充したα−MEM培地(インビトロジェン社、カタログ番号32571−036)で12〜15日間培養した。
培養培地に、20%のHyclone ES screened FCS(対照FCSグループ)又は10%のInvitrogen SR(実験SRグループ)を添加した。
各グループでフィーダー層に押圧された胚の発生は、日単位でモニターし、各グループの培地は3日ごとに取り換えた。
培養2日目、両グループの押圧した胚は、栄養外胚葉細胞と推定ES細胞からなる胚性増殖物を形成した(図4)。
長期間の胚性増殖物の追加の培養により、対照(FCSグループ)と実験グループ(SRグループ)に発生形態学的に識別可能な構造体が生じた。
7日間培養した後、FCSグループの胚性増殖物は、分化細胞(図5)又は分化細胞に取り囲まれた非常に小さな推定ES細胞成分(図6)からなっていた。このグループの最良の場合では、培養2週間後の一次胚性増殖形成により、分化細胞で取り囲まれたほとんど継代できない(直径0.5mm未満)PCからなるコロニーが形成された。
SRグループでは、培養7日後、胚性増殖物は、ES細胞の形態的特徴(小さな細胞質/核比、複数の核小体のある核、及び細胞質中の複数の脂質封入体)のある推定ブタES細胞とわずかな量のアポトーシス栄養外胚葉細胞からなり(図7)、又は胚性増殖物は、特徴的な形態を有する均質な推定ブタES細胞のみからなっていた(図8)。
次の7日間のSR胚性増殖物の追加の培養により、栄養外胚葉又は他の分化細胞の徴候がまったくない均質な推定ES細胞株コロニーが形成された(図9)。
これらのブタES細胞株コロニーは、その時点で直径約3mmに到達していたので、簡単に機械的継代が可能である。ブタES細胞株は、記載する上記の方法を使用して作製すれば、解凍後95%近くの生存率で大きな塊又は集団のコロニーとして凍結状態で液体窒素中に保存することが可能であろう。本明細書に記載する条件の下で増殖させた凍結解凍ブタESコロニーは、樹立コロニーとして同一判定基準の未分化状態を有する。これらのブタES細胞株は、形態学的基準又は未分化細胞及び多能性を喪失せずに複数回の継代の間培養下で維持することができる。
実施例6
(ブタ胚盤胞の2日目初代増殖物におけるOct4発現)
ブタ6日目〜7日目孵化又は拡張胚盤胞は、実施例1及び実施例2に記載の通りに得られ、実施例5に記載の通りにフィーダー層上に蒔いた。培養下2日後、胚性増殖物は4%パラホルムアルデヒド中に固定し、一次ヤギ抗−Oct−4ポリクローナル(IgG)抗体で染色した。二次抗体は、FITCで標識したロバ抗−ヤギIgG抗体であった。試料は、落射蛍光顕微鏡下で解析した。図10Aに示すように、ブタ胚性増殖物は、形態によって推定ES細胞(黄色矢印)と同定される細胞のグループと残りの栄養膜細胞からなっていた。図10Bに示すように、形態によって推定ES細胞と同定される細胞のみがOct−4を発現した(黄色矢印)。
実施例7
(ブタES細胞における細胞質/核比)
ブタ胚幹細胞(ES細胞)は、実施例5に記載の通りに単離した。インビトロで数回継代した後、ブタES細胞を、TrypLE Express(インビトロジェン社)で酵素的に分離させて、ブタES細胞の単一細胞懸濁液を作製した。作製した単一細胞の核は、濃度50nMのCyto−64Red Fluorescent Nucleic Acid Stain(インビトロジェン社)で染色した。図11Aに示すように、ブタES細胞は、直径約11〜13μmの小型細胞である。図11Bに示すように、ブタES細胞の核は、細胞のほぼ全容積を占めており、即ち、これらの細胞は、ES細胞に特徴的な低細胞質/核比(又は高核/細胞質比)を有する。
実施例8
(ブタ胚盤胞のICM細胞に対するブタES細胞の高親和性)
図12Aと図12Bで示すように、単一細胞懸濁液として調製し(実施例7に記載したように)Cyto64で染色した、数回継代した後のブタES細胞を、5日目インビトロ作製レシピエントブタ胚盤胞に注入した。レシピエントブタ胚盤胞は、実施例1に記載の通りに作製した。注入後、胚盤胞は、実施例1に記載した培養培地で一晩培養した。注入直後、胚盤胞は崩壊した(図12A及び図12B)が、一晩培養後その形状は回復した(図12C)。図12Dに示すように、注入したブタES細胞は、レシピエント胚盤胞のICMに組み込むことができ、それによって、ブタ胚盤胞のICM細胞に対するブタES細胞の高親和性が実証された。
実施例9
(ブタ栄養膜細胞及びブタES細胞におけるF−アクチンパターン)
ブタ7日目インビトロ胚盤胞は、実施例1に記載の通りに作製した。ブタES細胞は、実施例5に記載の通りに、単離され数回の継代の間培養を維持された。ブタ胚盤胞とブタES細胞のコロニーを4%パラホルムアルデヒド中で固定し、Alexa Fluor488(インビトロジェン社)で標識したファロイジン(二環式ヘプタペプチド、F−アクチンフィラメントに結合する)で染色した。図13Aで示すように、ブタ胚における最初の分化細胞である栄養膜細胞(赤色矢印)は、細胞質全体にF−アクチンの拡散分布(緑色)を有する。図13Bで示すように、マウス胚線維芽細胞は、その細胞質全体に広範なF−アクチン(緑色)微小線維束(黄色矢印)を含有し、一方ブタESコロニーの細胞中のF−アクチン(緑色)は細胞の周辺に組織化されていて(赤色矢印)、そこでは細胞は相互に直接接触している。F−アクチン組織化のこのパターンはES細胞に特徴的である。
実施例10
(ブタES細胞におけるSSEA−1発現)
実施例5に記載の通りに、単離され数回の継代の間培養を維持されたブタES細胞は、4%パラホルムアルデヒドで固定し、一次マウス抗−SSEA−1抗体(IgM)で染色した。二次抗体は、ローダミンで標識したヤギ抗−マウス(IgM)抗体であった。染色後、ブタES細胞コロニーは、DAPI付きSlowFade antifage reagent(インビトロジェン社)に包埋した。図14に示すように、ブタES細胞は、多能性のマーカーであるSSEA−1(赤色)を集中的に発現している。
実施例11
(ブタES細胞におけるOct−4発現)
実施例5に記載の通りに、単離され数回の継代の間培養を維持されたブタES細胞は、4%パラホルムアルデヒドで固定し、一次ヤギ抗−Oct−4ポリクローナル(IgG)抗体で染色した。二次抗体は、FITCで標識したロバ抗−ヤギIgG抗体であった。試料は落射蛍光顕微鏡下で解析した。図15に示すように、ブタES細胞は、多能性のマーカーであるOct−4を発現している。
実施例12
(マウス胚盤胞に注入されたブタES細胞におけるOct4の発現)
実施例5に記載の通りに、単離され数回の継代の間培養を維持されたブタES細胞を、実施例8に記載の通りに、5日目インビトロ作製レシピエントブタ胚盤胞に注入した。注入後次の日に、形状が回復した胚盤胞は実施例11に記載の通りに、Oct4発現を調べた。図16Aで示すように、ブタ6日目非注入胚盤胞では、胚盤胞の多くの細胞がOct−4を発現するが、ICM細胞は核のサイズにより容易に識別できるであろう。Oct−4を発現し、円板として組織化されているICM細胞(黄色矢印)はほとんど存在しない。図16Bは、ブタES細胞を注入した孵化6日目ブタ胚盤胞を表している。ブタICM細胞(黄色矢印)はより拡散した形で組織化され、注入されたブタES細胞(赤色矢印)は、それが注入された方法に従って条片として組織化されている(図12Aと12Bを参照されたい)。ブタES細胞は高レベルのOct−4発現を有している(又はICM細胞は減少レベルを有する)ようにみえるが、両種類の細胞がOct−4を発現する。
したがって、本明細書に記載する多能性細胞を単離する方法は、胚外細胞の増殖を除去し多能性幹細胞を未分化状態で維持することにより、多能性幹細胞の単離の容易さと効率の改良をもたらす。さらに、血清の使用を回避することにより、血清に付随する病原体による細胞汚染の危険性が減少される。
最後に、本明細書に記載する発明の種々の改変及び変更は、本発明の範囲と精神から逸脱しない限りにおいて、当業者には自明であることが理解されるであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、請求の範囲に記載される本発明をそのような特定の実施形態に過度に限定するべきではないことを理解されたい。実際、当業者には明らかな、本発明の実施について記載された形態の種々の改変は、本発明の範囲内にあるものとする。

Claims (98)

  1. 1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
    (i)(a)前記1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)前記胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない、条件の下で、前記胚由来の前記1つ又は複数の多能性細胞を増殖させること、
    (ii)前記1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
    を含む方法。
  2. 前記条件が実質的に血清のない培地中での増殖を含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記条件が血清代替物及び/又はアルブミンを含む培地中での増殖を含む、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 前記培地が5〜25%血清代替物を含む、請求項3に記載の方法。
  5. 前記胚由来の非多能性細胞が、栄養外胚葉細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞及び胚外内胚葉細胞を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記1つ又は複数の多能性細胞の増殖が、前記1つ又は複数の多能性細胞を含有する胚全体の増殖を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記方法が、他の細胞からの前記多能性細胞の単離を含まない、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記方法が、前記1つ又は複数の多能性細胞を含む、前記胚由来の細胞の初代培養を樹立することを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記初代培養が、フィーダー細胞の存在下で前記胚の全部又は一部を増殖させることによって樹立される、請求項8に記載の方法。
  10. 前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように処理されたものである請求項8に記載の方法。
  11. 前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように照射されたものである請求項10に記載の方法。
  12. 前記初代培養が、前記フィーダー細胞の存在下で胚全体を増殖させることにより樹立される、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を前記フィーダー細胞に押圧することにより樹立される、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を適切な細胞増殖基質上で増殖させることにより樹立される、請求項8に記載の方法。
  15. 前記胚の透明帯が、前記1つ又は複数の多能性細胞の増殖前に除去される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記1つ又は複数の多能性細胞を、前記1つ又は複数の多能性細胞が細胞のコロニーを形成するまで増殖させる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記コロニーが実質的に栄養外胚葉細胞を含まない、請求項16に記載の方法。
  18. 前記コロニーが実質的に分化細胞及び分化するよう方向付けられた細胞を含まない、請求項16又は17に記載の方法。
  19. 前記着床前胚が胚盤胞である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記胚盤胞が孵化又は拡張胚盤胞である、請求項19に記載の方法。
  21. 前記着床前胚が、卵母細胞の体外受精により生じる、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法に従って作製される多能性細胞。
  23. 請求項22に記載の多能性細胞に由来する多分化能性又は分化細胞。
  24. 請求項22に記載の多能性細胞の均質な集団。
  25. 請求項22に記載の多能性細胞に由来する1つ又は複数の細胞を含む非ヒト動物。
  26. 請求項22に記載の1つ又は複数の多能性細胞を含む組成物。
  27. 1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
    (i)(a)前記1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)前記胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、着床前胚全体を増殖させること、
    (ii)前記1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
    を含む方法。
  28. 他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚から前記多能性細胞を単離する方法であって、
    (i)(a)前記1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)前記胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、
    (ii)前記1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
    を含む方法。
  29. 前記単離が、機械的、免疫外科的又は酵素的単離のうち1つ又は複数である、請求項28に記載の方法。
  30. 着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で前記胚由来の1つ又は複数の多能性細胞を増殖させること、及び、前記1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法。
  31. 前記培地が血清代替物及び/又はアルブミンを含む、請求項30に記載の方法。
  32. 前記培地が5〜25%血清代替物を含む、請求項31に記載の方法。
  33. 前記胚由来の非多能性細胞が、栄養外胚葉細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞及び胚外内胚葉細胞を含む、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記1つ又は複数の多能性細胞の増殖が、前記1つ又は複数の多能性細胞を含有する胚全体の増殖である、請求項30〜33のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記方法が、他の細胞からの前記多能性細胞の単離を含まない、請求項30〜34のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記単離が、機械的、免疫外科的又は酵素的単離のうち1つ又は複数である、請求項35に記載の方法。
  37. 前記方法が、前記胚から、前記1つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立することを含む、請求項30〜36のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記初代培養が、フィーダー細胞の存在下で前記胚の全部又は一部を増殖させることによって樹立される、請求項37に記載の方法。
  39. 前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように処理されたものである請求項38に記載の方法。
  40. 前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように照射されたものである請求項39に記載の方法。
  41. 前記初代培養が、前記フィーダー細胞の存在下で胚全体を増殖させることにより樹立される、請求項38〜40のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を前記フィーダー細胞に押圧することにより樹立される、請求項38〜41のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を適切な細胞増殖基質上で増殖させることにより樹立される、請求項37に記載の方法。
  44. 前記胚の透明帯が、前記1つ又は複数の多能性細胞の増殖前に除去される、請求項30〜43のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記1つ又は複数の多能性細胞を、前記細胞が細胞のコロニーを形成するまで増殖させる、請求項30〜44のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記コロニーが実質的に栄養外胚葉細胞を含まない、請求項45に記載の方法。
  47. 前記コロニーが実質的に分化細胞及び分化するよう方向付けられた細胞を含まない、請求項45又は46に記載の方法。
  48. 前記着床前胚が胚盤胞である、請求項30〜47のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記胚盤胞が孵化又は拡張胚盤胞である、請求項48に記載の方法。
  50. 前記着床前が卵母細胞の体外受精により生じる、請求項30〜49のいずれか一項に記載の方法。
  51. 請求項30〜50のいずれか一項に記載の方法に従って作製される多能性細胞。
  52. 請求項51に記載の多能性細胞に由来する多分化能性又は分化細胞。
  53. 請求項51に記載の多能性細胞の均質な集団。
  54. 請求項51に記載の多能性細胞に由来する1つ又は複数の細胞を含む非ヒト動物。
  55. 請求項51に記載の1つ又は複数の多能性細胞を含む組成物。
  56. 着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で1つ又は複数の多能性細胞を含む胚全体を増殖させること、及び、前記1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法。
  57. 他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚から前記多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で着床前胚全体を増殖させること、及び、前記1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法。
  58. 前記単離が、機械的、免疫外科的又は酵素的単離のうち1つ又は複数である、請求項57に記載の方法。
  59. 着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
    (i)前記胚から、1つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
    (ii)前記1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、前記胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で前記初代培養を増殖させること、
    (iii)前記増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
    を含む方法。
  60. 前記培地が実質的に血清のない、請求項59に記載の方法。
  61. 前記培地が血清代替物及び/又はアルブミンを含む、請求項59又は60に記載の方法。
  62. 前記培地が5〜25%血清代替物を含む、請求項61に記載の方法。
  63. 前記胚由来の非多能性細胞が、栄養外胚葉細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞及び胚外内胚葉細胞を含む、請求項59〜62のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記初代培養が胚全体から樹立される、請求項59〜63のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記方法が、他の細胞からの前記多能性細胞の単離を含まない、請求項59〜64のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記単離が、機械的、免疫外科的又は酵素的単離のうち1つ又は複数である、請求項65に記載の方法。
  67. 前記初代培養が、フィーダー細胞の存在下で前記胚の全部又は一部を増殖させることにより樹立される、請求項59〜66のいずれか一項に記載の方法。
  68. 前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように処理されたものである請求項67に記載の方法。
  69. 前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように照射されたものである請求項68に記載の方法。
  70. 前記初代培養が、フィーダー細胞の存在下で胚全体を増殖させることにより樹立される、請求項59〜69のいずれか一項に記載の方法。
  71. 前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を前記フィーダー細胞に押圧することにより樹立される、請求項68〜70のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を適切な細胞増殖基質上で増殖させることにより樹立される、請求項59〜66のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記胚の透明帯が、前記1つ又は複数の多能性細胞の増殖前に除去される、請求項59〜72のいずれか一項に記載の方法。
  74. 前記1つ又は複数の多能性細胞を、前記1つ又は複数の多能性細胞が細胞のコロニーを形成するまで増殖させる、請求項59〜73のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記コロニーが実質的に栄養外胚葉細胞を含まない、請求項74に記載の方法。
  76. 前記コロニーが実質的に分化細胞及び分化するよう方向付けられた細胞を含まない、請求項74又は75に記載の方法。
  77. 前記着床前胚が胚盤胞である、請求項59〜76のいずれか一項に記載の方法。
  78. 前記胚盤胞が孵化又は拡張胚盤胞である、請求項77に記載の方法。
  79. 前記着床前が、卵母細胞の体外受精により生じる、請求項59〜78のいずれか一項に記載の方法。
  80. 請求項56〜79のいずれか一項に記載の方法に従って作製される多能性細胞。
  81. 請求項80に記載の多能性細胞に由来する多分化能性又は分化細胞。
  82. 請求項79に記載の多能性細胞の均質な集団。
  83. 請求項80に記載の多能性細胞由来の1つ又は複数の細胞を含む非ヒト動物。
  84. 請求項80に記載の1つ又は複数の多能性細胞を含む組成物。
  85. 着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
    (i)前記胚から、1つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
    (ii)実質的に血清のない培地中で前記初代培養を増殖させること、
    (iii)前記増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
    を含む方法。
  86. 着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
    (i)着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
    (ii)実質的に血清のない培地中で前記初代培養を増殖させること、
    (iii)前記増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
    を含む方法。
  87. 着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
    (i)前記胚全体をフィーダー細胞の層に押圧することにより着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
    (ii)実質的に血清のない培地中で前記初代培養を増殖させること、
    (iii)前記増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
    を含む方法。
  88. 実質的に血清を含まない、1つ又は複数の多能性細胞を増殖させるのに使用するときの培養培地。
  89. 前記培地が、血清代替物及び/又はアルブミンを含む、請求項88に記載の培地。
  90. 前記培地が、5〜25%血清代替物を含む、請求項89に記載の培地。
  91. 着床前胚から多能性細胞を単離するためのキットであって、実質的に血清を含まない、1つ又は複数の多能性細胞を増殖させるための培地を含み、前記胚から多能性細胞を単離するための使用説明書をさらに随意に含むキット。
  92. 前記培地が血清代替物及び/又はアルブミンを含む、請求項91に記載のキット。
  93. 着床前胚から単離された多能性細胞であって、前記胚由来の他の細胞から前記多能性細胞を単離せずに、胚全体由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる多能性細胞。
  94. 着床前胚から単離された複数の多能性細胞であって、前記胚由来の他の細胞から前記多能性細胞を単離せずに、胚全体由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる複数の多能性細胞。
  95. 実質的に非多能性細胞を含まない、請求項94に記載の複数の細胞。
  96. 着床前胚から単離された多能性細胞であって、実質的に血清のない培地中で前記胚由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる多能性細胞。
  97. 着床前胚から単離された複数の多能性細胞であって、実質的に血清のない培地中で前記胚由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる複数の多能性細胞。
  98. 実質的に非多能性細胞を含まない、請求項97に記載の複数の細胞。
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