JP2010507373A - 動物血清を含まない培地中で着床前胚から多能性細胞を単離するための方法 - Google Patents
動物血清を含まない培地中で着床前胚から多能性細胞を単離するための方法 Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】なし
Description
本発明は、胚から多能性細胞を単離する方法、及び該方法により単離される多能性細胞に関する。
胚性幹(ES)細胞は、胚に由来する多能性細胞であり、3種類の胚葉すべてに分化する能力を有する。胚では、そのような細胞は、生殖細胞も含めて、生物の全組織及び器官の形成に寄与する。
本発明は、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)(a)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、胚由来の1つ又は複数の多能性細胞を増殖させること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
(i)(a)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、着床前胚全体を増殖させること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
(i)(a)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
(i)胚から、1つ又は複数の多能性細胞を含む、初代培養を樹立すること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
(i)着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)胚由来の1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
(i)胚から、1つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
(i)着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
(i)胚全体をフィーダー細胞の層に押圧することにより、着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法も提供する。
上記のように、一実施形態では、本発明は、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)(a)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、胚由来の1つ又は複数の多能性細胞を増殖させること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
(i)(a)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、着床前胚全体を増殖させること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
(i)(a)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚を増殖させること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
(i)(a)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
(i)胚から、1つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
(i)着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)胚由来の1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
(i)胚から、1つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
(i)着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
(i)胚全体をフィーダー細胞の層に押圧することにより着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で初代培養を増殖させること、
(iii)増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法を提供する。
ここで、本発明の上記の一般的原理を具体化する実験に言及する。しかし、以下の説明は、上記説明の一般性を限定するためのものではないことは理解されるべきである。
(ブタ胚盤胞のインビトロ作製)
ブタ卵巣は地元の屠殺場から入手した。卵母細胞は吸引して、39℃で5%二酸化炭素の加湿環境の下、TCM−199培地で成熟させた。42〜44時間の成熟後、卵母細胞は、TALP−PVA培地において濃度5×106精子/mLで使う成熟オスの精子で6時間受精させた。受精後、受精卵母細胞はNCSU−23培地で7日間培養した。受精日は0日目である。インビトロ培養の7日目に発生した孵化又は拡張胚盤胞(図1)を、推定多能性ブタES細胞の単離のために使った。
(ブタ胚盤胞のインビボ作製)
発情期のメス豚を成熟オスの精子で人為的に授精させた。授精後4.5日目に、インビボ作製した新しい胚を後期桑実胚−初期胚盤胞期に子宮角から流し出し、実施例1に記載するようにNCSU−23培地で一晩培養した。人為的授精後6日目に発生した拡張胚盤胞を、推定多能性ES細胞の単離のために使った。
(一次マウス胚線維芽細胞からのフィーダー層の調製)
一次マウス胚線維芽細胞からのフィーダー層の調製のための方法は、E.Robertson、「Embryo−derived stem lines」、In:Teratocarcinomas and embryonic stem cells−a practical approach、EJ Robertson編、IRL Press、Oxford、1987、pp71〜112に記載の通りである。手短に言えば、129/Sv妊娠メスマウスを妊娠14日目に屠殺した。胎児を取り出し、肝臓、心臓及び他の内臓器官は処分した。残った胎児は、トリプシン及びEDTAの存在下で細かく切り刻み、37℃で10〜15分間インキュベートした。次に、トリプシンは中和し、細胞はFalcon組織フラスコ上に蒔いて、細胞がコンフルエントになるまで5%二酸化炭素の加湿環境の下37℃でインキュベートした。細胞がコンフルエントに到達したところで、細胞をトリプシン処理により回収し、トリプシンを不活化し、細胞は、血清中10%DMSOで、濃度2〜5×106細胞/mL/チューブでクライオチューブ(cryotube)中で凍結し、−80℃以下で保存した。フィーダー層の調製のために、チューブを解凍し、細胞は洗浄してDMSOを取り除き、コンフルエントに到達するまで培養フラスコで増殖させた。コンフルエントになると、細胞はトリプシン処理し、トリプシンを不活化し、洗浄した細胞はガンマ照射にかけ、使用までの2日間、1.2〜1.5×105細胞/cm2でFalcon器官培養皿に蒔いた。
(透明帯のないブタ胚盤胞のフィーダー層への押圧)
ブタ孵化又は拡張胚盤胞は、実施例1及び実施例2に記載の通りに得られた。代表的な胚盤胞を図1に示す。拡張胚盤胞から透明帯を機械的に取り除くために、先端部分の内径が胚盤胞の直径よりもわずかに小さい口で調節するガラスピペットで透明帯を慎重に取り除いた。2〜3回のピペット操作の後、胚盤胞を損傷することなく透明帯は容易に除かれた。次に、透明帯のないブタ胚を、フィーダー層を含有するFalcon器官培養皿に移し、30G針の付いたインスリン用注射筒を使用してフィーダー層に慎重に押圧した。胚をフィーダー層に押圧しても、細胞が消失したり、又は、多能性細胞が栄養膜細胞から機械的に分離することはない。これは、図2及び図3に示している。胚は、濃度50nMの生体DNA染色剤Hoechst33342で染色し、押圧の前と後で細胞数を計数した。この研究の結果(図3Aと図3Bに示す)により、押圧手順の間、細胞消失も胚の多能性成分と非多能性成分の分離も起こらないことが実証された。
(多能性細胞の単離)
ブタ6日目〜7日目孵化又は拡張胚盤胞は、実施例1及び実施例2に記載した通りに得られた。代表的な胚盤胞は図1に示している。
(ブタ胚盤胞の2日目初代増殖物におけるOct4発現)
ブタ6日目〜7日目孵化又は拡張胚盤胞は、実施例1及び実施例2に記載の通りに得られ、実施例5に記載の通りにフィーダー層上に蒔いた。培養下2日後、胚性増殖物は4%パラホルムアルデヒド中に固定し、一次ヤギ抗−Oct−4ポリクローナル(IgG)抗体で染色した。二次抗体は、FITCで標識したロバ抗−ヤギIgG抗体であった。試料は、落射蛍光顕微鏡下で解析した。図10Aに示すように、ブタ胚性増殖物は、形態によって推定ES細胞(黄色矢印)と同定される細胞のグループと残りの栄養膜細胞からなっていた。図10Bに示すように、形態によって推定ES細胞と同定される細胞のみがOct−4を発現した(黄色矢印)。
(ブタES細胞における細胞質/核比)
ブタ胚幹細胞(ES細胞)は、実施例5に記載の通りに単離した。インビトロで数回継代した後、ブタES細胞を、TrypLE Express(インビトロジェン社)で酵素的に分離させて、ブタES細胞の単一細胞懸濁液を作製した。作製した単一細胞の核は、濃度50nMのCyto−64Red Fluorescent Nucleic Acid Stain(インビトロジェン社)で染色した。図11Aに示すように、ブタES細胞は、直径約11〜13μmの小型細胞である。図11Bに示すように、ブタES細胞の核は、細胞のほぼ全容積を占めており、即ち、これらの細胞は、ES細胞に特徴的な低細胞質/核比(又は高核/細胞質比)を有する。
(ブタ胚盤胞のICM細胞に対するブタES細胞の高親和性)
図12Aと図12Bで示すように、単一細胞懸濁液として調製し(実施例7に記載したように)Cyto64で染色した、数回継代した後のブタES細胞を、5日目インビトロ作製レシピエントブタ胚盤胞に注入した。レシピエントブタ胚盤胞は、実施例1に記載の通りに作製した。注入後、胚盤胞は、実施例1に記載した培養培地で一晩培養した。注入直後、胚盤胞は崩壊した(図12A及び図12B)が、一晩培養後その形状は回復した(図12C)。図12Dに示すように、注入したブタES細胞は、レシピエント胚盤胞のICMに組み込むことができ、それによって、ブタ胚盤胞のICM細胞に対するブタES細胞の高親和性が実証された。
(ブタ栄養膜細胞及びブタES細胞におけるF−アクチンパターン)
ブタ7日目インビトロ胚盤胞は、実施例1に記載の通りに作製した。ブタES細胞は、実施例5に記載の通りに、単離され数回の継代の間培養を維持された。ブタ胚盤胞とブタES細胞のコロニーを4%パラホルムアルデヒド中で固定し、Alexa Fluor488(インビトロジェン社)で標識したファロイジン(二環式ヘプタペプチド、F−アクチンフィラメントに結合する)で染色した。図13Aで示すように、ブタ胚における最初の分化細胞である栄養膜細胞(赤色矢印)は、細胞質全体にF−アクチンの拡散分布(緑色)を有する。図13Bで示すように、マウス胚線維芽細胞は、その細胞質全体に広範なF−アクチン(緑色)微小線維束(黄色矢印)を含有し、一方ブタESコロニーの細胞中のF−アクチン(緑色)は細胞の周辺に組織化されていて(赤色矢印)、そこでは細胞は相互に直接接触している。F−アクチン組織化のこのパターンはES細胞に特徴的である。
(ブタES細胞におけるSSEA−1発現)
実施例5に記載の通りに、単離され数回の継代の間培養を維持されたブタES細胞は、4%パラホルムアルデヒドで固定し、一次マウス抗−SSEA−1抗体(IgM)で染色した。二次抗体は、ローダミンで標識したヤギ抗−マウス(IgM)抗体であった。染色後、ブタES細胞コロニーは、DAPI付きSlowFade antifage reagent(インビトロジェン社)に包埋した。図14に示すように、ブタES細胞は、多能性のマーカーであるSSEA−1(赤色)を集中的に発現している。
(ブタES細胞におけるOct−4発現)
実施例5に記載の通りに、単離され数回の継代の間培養を維持されたブタES細胞は、4%パラホルムアルデヒドで固定し、一次ヤギ抗−Oct−4ポリクローナル(IgG)抗体で染色した。二次抗体は、FITCで標識したロバ抗−ヤギIgG抗体であった。試料は落射蛍光顕微鏡下で解析した。図15に示すように、ブタES細胞は、多能性のマーカーであるOct−4を発現している。
(マウス胚盤胞に注入されたブタES細胞におけるOct4の発現)
実施例5に記載の通りに、単離され数回の継代の間培養を維持されたブタES細胞を、実施例8に記載の通りに、5日目インビトロ作製レシピエントブタ胚盤胞に注入した。注入後次の日に、形状が回復した胚盤胞は実施例11に記載の通りに、Oct4発現を調べた。図16Aで示すように、ブタ6日目非注入胚盤胞では、胚盤胞の多くの細胞がOct−4を発現するが、ICM細胞は核のサイズにより容易に識別できるであろう。Oct−4を発現し、円板として組織化されているICM細胞(黄色矢印)はほとんど存在しない。図16Bは、ブタES細胞を注入した孵化6日目ブタ胚盤胞を表している。ブタICM細胞(黄色矢印)はより拡散した形で組織化され、注入されたブタES細胞(赤色矢印)は、それが注入された方法に従って条片として組織化されている(図12Aと12Bを参照されたい)。ブタES細胞は高レベルのOct−4発現を有している(又はICM細胞は減少レベルを有する)ようにみえるが、両種類の細胞がOct−4を発現する。
Claims (98)
- 1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)(a)前記1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)前記胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない、条件の下で、前記胚由来の前記1つ又は複数の多能性細胞を増殖させること、
(ii)前記1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法。 - 前記条件が実質的に血清のない培地中での増殖を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記条件が血清代替物及び/又はアルブミンを含む培地中での増殖を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記培地が5〜25%血清代替物を含む、請求項3に記載の方法。
- 前記胚由来の非多能性細胞が、栄養外胚葉細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞及び胚外内胚葉細胞を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の多能性細胞の増殖が、前記1つ又は複数の多能性細胞を含有する胚全体の増殖を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、他の細胞からの前記多能性細胞の単離を含まない、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、前記1つ又は複数の多能性細胞を含む、前記胚由来の細胞の初代培養を樹立することを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記初代培養が、フィーダー細胞の存在下で前記胚の全部又は一部を増殖させることによって樹立される、請求項8に記載の方法。
- 前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように処理されたものである請求項8に記載の方法。
- 前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように照射されたものである請求項10に記載の方法。
- 前記初代培養が、前記フィーダー細胞の存在下で胚全体を増殖させることにより樹立される、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を前記フィーダー細胞に押圧することにより樹立される、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を適切な細胞増殖基質上で増殖させることにより樹立される、請求項8に記載の方法。
- 前記胚の透明帯が、前記1つ又は複数の多能性細胞の増殖前に除去される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の多能性細胞を、前記1つ又は複数の多能性細胞が細胞のコロニーを形成するまで増殖させる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記コロニーが実質的に栄養外胚葉細胞を含まない、請求項16に記載の方法。
- 前記コロニーが実質的に分化細胞及び分化するよう方向付けられた細胞を含まない、請求項16又は17に記載の方法。
- 前記着床前胚が胚盤胞である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記胚盤胞が孵化又は拡張胚盤胞である、請求項19に記載の方法。
- 前記着床前胚が、卵母細胞の体外受精により生じる、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法に従って作製される多能性細胞。
- 請求項22に記載の多能性細胞に由来する多分化能性又は分化細胞。
- 請求項22に記載の多能性細胞の均質な集団。
- 請求項22に記載の多能性細胞に由来する1つ又は複数の細胞を含む非ヒト動物。
- 請求項22に記載の1つ又は複数の多能性細胞を含む組成物。
- 1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)(a)前記1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)前記胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、着床前胚全体を増殖させること、
(ii)前記1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法。 - 他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚から前記多能性細胞を単離する方法であって、
(i)(a)前記1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、(b)前記胚由来の非多能性細胞の増殖を許容しない条件の下で、1つ又は複数の多能性細胞を含む着床前胚全体を増殖させること、
(ii)前記1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離すること
を含む方法。 - 前記単離が、機械的、免疫外科的又は酵素的単離のうち1つ又は複数である、請求項28に記載の方法。
- 着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で前記胚由来の1つ又は複数の多能性細胞を増殖させること、及び、前記1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法。
- 前記培地が血清代替物及び/又はアルブミンを含む、請求項30に記載の方法。
- 前記培地が5〜25%血清代替物を含む、請求項31に記載の方法。
- 前記胚由来の非多能性細胞が、栄養外胚葉細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞及び胚外内胚葉細胞を含む、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の多能性細胞の増殖が、前記1つ又は複数の多能性細胞を含有する胚全体の増殖である、請求項30〜33のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、他の細胞からの前記多能性細胞の単離を含まない、請求項30〜34のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離が、機械的、免疫外科的又は酵素的単離のうち1つ又は複数である、請求項35に記載の方法。
- 前記方法が、前記胚から、前記1つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立することを含む、請求項30〜36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記初代培養が、フィーダー細胞の存在下で前記胚の全部又は一部を増殖させることによって樹立される、請求項37に記載の方法。
- 前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように処理されたものである請求項38に記載の方法。
- 前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように照射されたものである請求項39に記載の方法。
- 前記初代培養が、前記フィーダー細胞の存在下で胚全体を増殖させることにより樹立される、請求項38〜40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を前記フィーダー細胞に押圧することにより樹立される、請求項38〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を適切な細胞増殖基質上で増殖させることにより樹立される、請求項37に記載の方法。
- 前記胚の透明帯が、前記1つ又は複数の多能性細胞の増殖前に除去される、請求項30〜43のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の多能性細胞を、前記細胞が細胞のコロニーを形成するまで増殖させる、請求項30〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記コロニーが実質的に栄養外胚葉細胞を含まない、請求項45に記載の方法。
- 前記コロニーが実質的に分化細胞及び分化するよう方向付けられた細胞を含まない、請求項45又は46に記載の方法。
- 前記着床前胚が胚盤胞である、請求項30〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 前記胚盤胞が孵化又は拡張胚盤胞である、請求項48に記載の方法。
- 前記着床前が卵母細胞の体外受精により生じる、請求項30〜49のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項30〜50のいずれか一項に記載の方法に従って作製される多能性細胞。
- 請求項51に記載の多能性細胞に由来する多分化能性又は分化細胞。
- 請求項51に記載の多能性細胞の均質な集団。
- 請求項51に記載の多能性細胞に由来する1つ又は複数の細胞を含む非ヒト動物。
- 請求項51に記載の1つ又は複数の多能性細胞を含む組成物。
- 着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で1つ又は複数の多能性細胞を含む胚全体を増殖させること、及び、前記1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法。
- 他の細胞から多能性細胞を単離せずに、着床前胚から前記多能性細胞を単離する方法であって、実質的に血清のない培地中で着床前胚全体を増殖させること、及び、前記1つ又は複数の多能性細胞から多能性細胞を単離することを含む方法。
- 前記単離が、機械的、免疫外科的又は酵素的単離のうち1つ又は複数である、請求項57に記載の方法。
- 着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)前記胚から、1つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)前記1つ又は複数の多能性細胞の未分化増殖を可能にし、前記胚由来の非多能性細胞の増殖は許容しない培地中で前記初代培養を増殖させること、
(iii)前記増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法。 - 前記培地が実質的に血清のない、請求項59に記載の方法。
- 前記培地が血清代替物及び/又はアルブミンを含む、請求項59又は60に記載の方法。
- 前記培地が5〜25%血清代替物を含む、請求項61に記載の方法。
- 前記胚由来の非多能性細胞が、栄養外胚葉細胞、分化細胞、分化するよう方向付けられた細胞及び胚外内胚葉細胞を含む、請求項59〜62のいずれか一項に記載の方法。
- 前記初代培養が胚全体から樹立される、請求項59〜63のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、他の細胞からの前記多能性細胞の単離を含まない、請求項59〜64のいずれか一項に記載の方法。
- 前記単離が、機械的、免疫外科的又は酵素的単離のうち1つ又は複数である、請求項65に記載の方法。
- 前記初代培養が、フィーダー細胞の存在下で前記胚の全部又は一部を増殖させることにより樹立される、請求項59〜66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように処理されたものである請求項67に記載の方法。
- 前記フィーダー細胞が、前記フィーダー細胞の増殖を阻害するように照射されたものである請求項68に記載の方法。
- 前記初代培養が、フィーダー細胞の存在下で胚全体を増殖させることにより樹立される、請求項59〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を前記フィーダー細胞に押圧することにより樹立される、請求項68〜70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記初代培養が、前記胚の全部又は一部を適切な細胞増殖基質上で増殖させることにより樹立される、請求項59〜66のいずれか一項に記載の方法。
- 前記胚の透明帯が、前記1つ又は複数の多能性細胞の増殖前に除去される、請求項59〜72のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ又は複数の多能性細胞を、前記1つ又は複数の多能性細胞が細胞のコロニーを形成するまで増殖させる、請求項59〜73のいずれか一項に記載の方法。
- 前記コロニーが実質的に栄養外胚葉細胞を含まない、請求項74に記載の方法。
- 前記コロニーが実質的に分化細胞及び分化するよう方向付けられた細胞を含まない、請求項74又は75に記載の方法。
- 前記着床前胚が胚盤胞である、請求項59〜76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記胚盤胞が孵化又は拡張胚盤胞である、請求項77に記載の方法。
- 前記着床前が、卵母細胞の体外受精により生じる、請求項59〜78のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項56〜79のいずれか一項に記載の方法に従って作製される多能性細胞。
- 請求項80に記載の多能性細胞に由来する多分化能性又は分化細胞。
- 請求項79に記載の多能性細胞の均質な集団。
- 請求項80に記載の多能性細胞由来の1つ又は複数の細胞を含む非ヒト動物。
- 請求項80に記載の1つ又は複数の多能性細胞を含む組成物。
- 着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)前記胚から、1つ又は複数の多能性細胞を含む、細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で前記初代培養を増殖させること、
(iii)前記増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法。 - 着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で前記初代培養を増殖させること、
(iii)前記増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法。 - 着床前胚から多能性細胞を単離する方法であって、
(i)前記胚全体をフィーダー細胞の層に押圧することにより着床前胚全体から細胞の初代培養を樹立すること、
(ii)実質的に血清のない培地中で前記初代培養を増殖させること、
(iii)前記増殖した初代培養から多能性細胞を単離すること
を含む方法。 - 実質的に血清を含まない、1つ又は複数の多能性細胞を増殖させるのに使用するときの培養培地。
- 前記培地が、血清代替物及び/又はアルブミンを含む、請求項88に記載の培地。
- 前記培地が、5〜25%血清代替物を含む、請求項89に記載の培地。
- 着床前胚から多能性細胞を単離するためのキットであって、実質的に血清を含まない、1つ又は複数の多能性細胞を増殖させるための培地を含み、前記胚から多能性細胞を単離するための使用説明書をさらに随意に含むキット。
- 前記培地が血清代替物及び/又はアルブミンを含む、請求項91に記載のキット。
- 着床前胚から単離された多能性細胞であって、前記胚由来の他の細胞から前記多能性細胞を単離せずに、胚全体由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる多能性細胞。
- 着床前胚から単離された複数の多能性細胞であって、前記胚由来の他の細胞から前記多能性細胞を単離せずに、胚全体由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる複数の多能性細胞。
- 実質的に非多能性細胞を含まない、請求項94に記載の複数の細胞。
- 着床前胚から単離された多能性細胞であって、実質的に血清のない培地中で前記胚由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる多能性細胞。
- 着床前胚から単離された複数の多能性細胞であって、実質的に血清のない培地中で前記胚由来の1つ又は複数の多能性細胞から増殖させる複数の多能性細胞。
- 実質的に非多能性細胞を含まない、請求項97に記載の複数の細胞。
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