JP2005523685A - 体細胞由来胚幹細胞及びそれらの分化子孫 - Google Patents
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Abstract
Description
(i) 核ドナーである細胞又は細胞核を除核卵母細胞に移植してnt株を形成するステップ、
(ii) 得られた核移植株を活性化するステップ、
(iii) 前記核移植株を様々な着床前段階にまで培養するステップ、
(iv) 2細胞期よりも成長した発育段階にあるnt株からのドナー核によってエンコードされている核移植胚幹細胞、肺幹様細胞、その他の種類の胚由来幹細胞を得るステップ、
を包含する。
(i) 核移植によって、再プログラムされた体細胞から、胚幹細胞、胚幹様細胞、その他の種類の胚由来幹細胞を作製するステップ、
(ii) 適切な条件下で、分化細胞へと分化するよう上記細胞を誘導するステップ、
が包含される。
(i) ntES細胞株は、体細胞の核移植によって、ヒトの体細胞核から得ることができる。
(ii) ntES細胞株は、受精した接合体から得た従来のヒトES細胞と同様、in vivoで長時間増殖することができる。
(iii) nt細胞は、外胚葉、中胚葉、内胚葉を含む、3種全ての胚葉細胞に分化する可能性を有する。これらの発見により、治療クローニングが、事実上実現可能だということが実証された。本発明の発明者はさらに、ヒトの体細胞は、ヒト以外の哺乳類の卵母細胞、望ましくはウサギの卵母細胞により、効果的に再プログラムされることを見出した。
核移植(nuclear transfer)法又は核移植(nuclear transplantation)法は、発明の背景技術にて引用した文献(特に、Wilmutらによる、"Nature," 第385号、p. 810−813、1997年;Campbellらによる、"Biology of Reproduction," 第49(5)号、p. 933−942、1993年;Collasらによる、"Mol. Reprod. Dev.," 第38号、p. 264−267、1994年;Kefferらによる、"Biology of Reproduction," 第50号、p. 935−939、1994年;Simsらによる、"PNAS," 第90号、p. 6155−6159、1993年;国際公開第94/26884号、国際公開第94/24274号、国際公開90/03432号を参照。参照することで、本明細書にこれらの全てを取り入れることとする。)などの多くの文献において説明されている。
本発明では、核移植のドナーとして用いる細胞は、ヒトの細胞、望ましくはヒトの線維芽細胞から得られる。
核移植に使用される卵母細胞は、哺乳類や両生類をはじめとする様々な動物から得ることができる。適切な哺乳類の卵母細胞源として、ヒツジ、牛、豚、馬、ウサギ、モルモット、ハツカネズミ、ハムスター、ネズミ、霊長類などが挙げられる。好ましい実施形態では、卵母細胞は、ウサギ科源から、最適にはウサギから得られる。
本発明では、ニュージーランドウサギから得た成熟した卵母細胞は、hCG注射後15〜23時間の間に除核すべきことを見出した。除核前に、卵母細胞を、ヒアルロニダーゼを含有するM2培地(シグマ社)に配置する。極小内径のピペットによる繰り返し吸入により、又はしばらくの間渦動させることにより、卵丘細胞を除去する。次いで、裸にされた卵母細胞を、極体を含むものに選別し、極体の存在が確認された、選ばれた第2分裂中期の卵母細胞を、核移植と除核に使用する。
nt株は、当分野で本質的に周知の方法、例えば透明帯への注射や細胞質への注射などによって、調製することができる。
典型的に除核卵母細胞のものとは異なる種のものである、動物あるいはヒトの、単一の細胞又は細胞核を、除核卵母細胞の囲卵腔内へ移入させる。好適には、ヒトあるいは動物の細胞とウサギの卵母細胞とからなるnt株は、hCG注射後約16〜20時間の間に、電気融合培地(マンニトール、スクロース、又はソルビトール融合培地)内で毎回60マイクロ秒又はより頻繁に90〜120Vの電気パルスを1〜2度適用することによって、0.5mmの容器内で電気融合される。融合後、融合したnt株の各々を、孵卵まで適切な組織培地、例えばRD{DEME(ギブコ社)、RPMI-1640(ギブコ社)}、M199(ギブコ社)、DMEM(ギブコ社)に配置する。
(i) 卵母細胞内の二価カチオン濃度の上昇、
(ii) 卵母細胞内における細胞タンパク質のリン酸化反応の減少。
核移植には、エレクトロポレーション法を用いるのではなく、卵母細胞の細胞質に直に細胞核を注射することをはじめとする、他の方法を用いることができる。これらの手法は、ドナーの体細胞が卵母細胞によって再プログラムされることが可能な場合にのみ適用することができ、即ち、ウサギの卵母細胞細胞質内でヒト体細胞が再プログラムされるよう誘導され得なければならない(CollasとBarnesによる、"Lol. Reprod. Dev," 第38号、p. 264−267、1994年)。
活性化したnt株は、さらなる発育のために適切な培地内で培養することができる。例えば、活性化したnt株は、培地RD、M199、DMEM50、パラフィン層で被覆されている50マイクロリットルの培地、に移し、例えば38℃、5%CO2にて、培養することができる。好適な一例においては、培地RD内で培養した場合に最高の割合で胚盤胞が得られた。
培養システムは、ntES細胞株の形成において最も重要な因子である。当該システムには、培地と栄養支持細胞層が含まれる。培地とは、DMEM(ギブコ社)、FBS(ハイクローン(Hyclone)社)、非必須アミノ酸ストック(ギブコ社)、β−メルカプトエタノール、ノックアウト培地(ギブコ社)、SR(ギブコ社)、その他様々な要素を含有物質として含む、ntES細胞の培養に適する液体、を意味する。
(i) in vitroにて未分化状態での成長を維持する、
(ii) 長期培養の間、正常な核型を維持する、
(iii) 外胚葉、中胚葉、内胚葉を含む、3つの胚葉のうちの特定の種類の細胞に発達し得る。
Thomsonら("Science," 第282(6)号、11月号、p. 1145−1147、1998年)は、体外受精(IVF)後残った胚盤胞を用いて、ヒトES細胞株をうまく形成することができたと報告した。彼らはまた、ヒトES細胞とそこから取出した細胞が、胚様体(EB)、並びに外胚葉、中胚葉、内胚葉を含む3つ全ての胚葉の誘導体を形成する能力を有することも実証した。
本発明においてnt株から得られたヒトntES細胞、胚幹様細胞又はその他の胚由来幹細胞は、多くの病気治療/多くの治療用途に使用できる。
インフォームド・コンセントの上で、手術により得た包皮の組織を細分化し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、毎分1000回転で5分間遠心分離機にかけ、0.05%トリプシンと0.02%EDTA(Gibco)からなる溶液を用いて、37℃にて30分間消化させた。チューブから過剰溶液を除去し、該チューブを毎分1000回転で5分間遠心分離した。上清を捨て、細胞の沈殿物を、90%DMEM(ギブコ社)+10%FBS(ハイクローン社)+50IU/mlペニシリン‐ストレプトマイシン(ギブコ社)内で培養した。再度プレート内に懸濁させ、そして37℃、5%CO2にて培養し、3日ごとに培地を変えた。細胞が密集成長した後に継代させ、第7〜第20継代の細胞を核ドナー細胞(図1)として使用した。
成熟した2.5〜3kgほどのメスのニュージーランドウサギを、100IUの妊馬血清ゴナドトロピン(PMSG)(筋肉注射)(第一生物医薬品社、上海)を1回注射して過剰排卵させ、72時間後に100IUのhCG(HuaFu High バイオテクノロジー社、天津)(静脈注射)を1回注射した。成熟した卵母細胞は、予熱したM2溶液(シグマ社)を用いて、hCG注射から14〜16時間後に卵管から洗い流した。当該卵母細胞を、300IU/mlのヒアルロニダーゼを含む溶液に入れ、卵丘細胞を取り除いた。該卵母細胞(図2)を、その後、M2溶液を用いて3度洗浄した。
透明帯への注射
卵母細胞を、7.5μg/mlのサイトカラシンB(シグマ社)を含むM2培地内で処理し、培養し、室温で10分間保持した後、斜端針で除核した。その後、単一のドナー線維芽細胞を、除核したウサギの卵母細胞の囲卵腔に移植し、nt株を形成した。当該nt株を、0.3Mグルコース(シグマ社)、0.1mM塩化マグネシウム(シグマ社)、0.05mM塩化カルシウム(シグマ社)を含有する融合緩衝液内で平衡状態におき、HV120Vの直流パルスで1回、60μ秒間刺激した。刺激後、nt株を、42.5%DMEM(ギブコ社)、42.5%RPMI-1640(ギブコ社)、15%FBS(ハイクローン社)からなるRD培地内で培養し、胚盤胞を得た(図3〜6、11)。
卵母細胞を、7.5μg/mlのサイトカラシンB(Sigma)入りのM2溶液内で培養し、室温で10分間保持した後、斜端針で除核した。次いで、単一のドナー線維芽細胞を、除核したウサギの卵母細胞の細胞質へ移入し、nt株を形成した。多くのnt株を、42.5%DMEM(ギブコ社)、42.5%RPMI‐1640(ギブコ社)、15%FBS(ハイクローン社)からなるRD培地内で培養した。6〜7日後、胚盤胞が得られた(図7〜10)。
上述のようにして胚盤胞期のnt株を得、そして、透明帯を剥ぎ取るために胚盤胞より直径の小さいガラス針(直径3mmのガラス管から伸びている)を用いて優しくピペットで上下させた。それから胚盤胞の内細胞塊を単離し、栄養支持細胞層上にのばし、79%DMEM(ギブコ社)、20%FBS(ハイクローン社)、1%非必須アミノ酸ストック(ギブコ社)、0.1mMベータ‐メルカプトエタノール(ギブコ社)、10ng/ml のLIF(R&D社)、10ng/ml のbHGH(R&D社)、10μM Forskolin(シグマ社)内で、5%CO2、37℃にて培養し、2日毎に培地を半分変えた。
栄養支持細胞は、14〜16日のハツカネズミの胎児から得た。胎児の頭、肝臓、心臓、食道を無菌状態で除去した後、胎児の残留物を細分化し、0.05%トリプシンと0.02%EDTA(ギブコ社)を含む予熱した溶液内で消化させ、37℃にて30分間培養し、毎分1000回転で5分間遠心分離を行った。細胞の沈殿物を、90%DMEM(ギブコ社)、10%FBS(ハイクローン社)、50IUペニシリン‐ストレプトマイシン(ギブコ社)からなる溶液内に再度懸濁させ、培地にのばして、5%CO2、37℃にて培養した。3継代後に栄養支持細胞層を10mMマイトマイシンC(Sigma)により3〜4時間処理し、4ウェル又は96ウェルプレートに移した。栄養支持細胞層は、5%のCO2を含む加湿器付き培養器内で、37℃にて成長した。均質の栄養支持細胞層を有するプレートを用いて、S-ES株(Culture)を調製した。
霊長類のES細胞は、アルカリホスファターゼ活性を発現し、一連の特徴的な表面抗原を発現することができ、それ故、これらは、アルカリホスファターゼ活性と、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-10、TRA-1-81抗体の免疫組織化学特性を検知することにより同定することができる。
10μg/mlのコルヒチンを、細胞培養液に添加した。37℃にて4時間放置した後、該細胞をプレートから除去し、毎分1000回転で8分間遠心分離した。上清を捨て、細胞残留物を、予熱した0.05M塩化カリウムを用いて再度懸濁させ、37℃にて30分間培養した。毎分1000回転で8分間遠心分離し、上清を捨て、細胞固定液(メタノール:氷酢酸=3:1)に細胞残留物を再度懸濁させ、室温にて15分間放置した。毎分1000回転で8分間遠心分離し、上清を捨て、細胞残留物を室温下の細胞固定液内で15分間再度懸濁させた。毎分1000回転で8分間遠心分離した後、細胞残留物をガラスプレートに入れ、GIMEMSA染色液を用いて染色し、核型を調べた。結果の一例を図20に示す。
DMEM(ギブコ社)、0.5μmのレチノイン酸(シグマ社)、10%FBS(ハイクローン社)を含有するRA培地内で、EB細胞塊又はEB様細胞塊を5日間培養した。前記培地を、79%DMEM(ギブコ社)、10%FBS(ハイクローン社)、ウマ血清(シグマ社)、鶏胚抽出物(ギブコ社)を含有する筋肉細胞培養培地と取り替えた後、さらに7〜10日間培養すると、筋肉様細胞とすることができた。当該細胞は、平行に配列しており、そのうちのいくつかは数個の核を有していた(図15)。
DMEM(ギブコ社)、0.5μmのレチノイン酸(シグマ社)、10%FBS(ハイクローン社)を含有するRA培地内で、EB細胞塊又はEB様細胞塊を5日間培養した。前記培地を、DMEM-F12(ギブコ社)、1%ITS(ギブコ社)を含有するニューロン培養培地と取り替えた後、さらに7〜10日間培養すると、前記EB細胞塊又はEB様細胞は、細胞体から伸びるいくつかの繊維状突起を有するニューロン細胞となることができた(図16)。
90%DMEM(ギブコ社)、0.5μmのレチノイン酸(シグマ社)、10%FBS(ハイクローン社)を含有するRA培地、又はDMEM-F12(ギブコ社)、1%ITS(ギブコ社)を含有するニューロン培養培地、又は79%DMEM(ギブコ社)、10%FBS(ハイクローン社)、10%ウマ血清(シグマ社)、1%鶏胚抽出物(ギブコ社)を含有する筋肉細胞培養培地内で、EB細胞塊又はEB様細胞塊を培養すると、該EB細胞又はEB様細胞は、線維芽細胞様細胞となることができた。当該細胞は、平坦で多形性で、大きい核とはっきりとした核小体、豊富な細胞質を備えている(図17)。
90%DMEM(ギブコ社)、0.5μmのレチノイン酸(シグマ社)、10%FBS(ハイクローン社)を含有するRA培地内で、EB細胞塊又はEB様細胞塊を数日間培養すると、該EB細胞又はEB様細胞は、含脂肪細胞(図18)となることができた。Oil Red Oという含脂肪細胞特異性染料により染色された前記細胞は、細胞質内に脂肪滴を含有する含脂肪細胞であることが確認された。
ntES細胞を、79%DMEM(ギブコ社)、20%FBS(ハイクローン社)、1%非必須アミノ酸ストック(ギブコ社)、0.1mMベータ‐メルカプトエタノール、10ng/ml のLIF(R&D社)、10ng/mlのbFGF(R&D社)、10μMのForskolin(シグマ社)を含有する培地内で、37℃、5%CO2にて、7〜14日以上培養したところ、ntES細胞の一部が自然分化し、EBを形成した(図14)。
EB細胞塊又はEB様細胞塊は、免疫組織化学法により同定した。
外胚葉マーカ抗体:ネスチン(ケミコン(Chemicon)社)に対し陽性。
中胚葉マーカ:ミオグロビン(ダコ(Dako)社)及びKDR(シグマ社)に対し陽性。
内胚葉マーカ:α−フェトプロテイン(バイオジェネックス(BioGenex)社)、α−抗トリプシン(ダコ社)に対し陽性。
Claims (27)
- 体細胞の核移植により、胚幹細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞を調製する方法であって、
I. 哺乳類の細胞又は細胞核を除核卵母細胞に移植してnt株を得るステップ、
II. 得られた前記nt株を活性化するステップ、
III. 前記活性化されたnt株を培養し、様々な着床前段階のnt株を得るステップ、
IV. 2細胞期よりも成長した発育段階のnt株から、胚幹細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞を単離するステップ、
を包含する方法。 - 前記ドナー細胞が、ヒトの体細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記卵母細胞が、哺乳類又は両生類由来のものである、請求項1に記載の方法。
- 前記卵母細胞が、分裂期の中期、望ましくは第2分裂中期にある、請求項3に記載の方法。
- 前記卵母細胞が、ヒト絨毛性ゴナドトロピンの注射後24時間以内に除核される、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記得られたnt株が、室温培養によって又は活性化剤の使用によって活性化される、請求項1に記載の方法。
- 前記活性化剤が、マンニトール電気融合溶液、スクロース電気融合溶液、ソルビトール電気融合溶液、リン酸緩衝液からなる群から選択され、より好ましくはスクロース電気融合溶液である、請求項6に記載の方法。
- 前記活性化された核移植株が、RD培地、M199培地、DMEM培地からなる群から選択される培地、より望ましくはRD培地内で培養され、例えば2〜4細胞期、8細胞期、桑実胚期、胚盤胞期、孵化胚盤胞期をはじめとする様々な着床前段階のnt株が得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記活性化された核移植株が、RD培地、M199培地、DMEM培地からなる群から選択される培地で培養され、多数の種類の細胞、例えば顆粒細胞、卵管細胞、子宮細胞及びSTO(ネズミ線維芽細胞)細胞と共培養系を形成し、例えば2〜4細胞期、8細胞期、桑実胚期、胚盤胞期、孵化胚盤胞期をはじめとする様々な着床前段階のnt株が得られる、請求項1に記載の方法。
- 2細胞成長期よりも成長したnt株を培養し、適切な条件下でntES細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞を単離する、請求項1に記載の方法。
- 前記ntES細胞、前記胚幹様細胞、又は前記その他の種類の胚由来幹細胞を培養するために使用される培地が、限定はしないが、DMEM培地あるいはノックアウト培地、好ましくはDMEM培地である、請求項1に記載の方法。
- 前記培地が、1つ又は複数の他の要素を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記他の要素が、白血病阻害因子(LIF)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、及びForskolinから選択される、請求項12に記載の方法。
- 請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法による、体細胞の核移植によって得られた核移植胚幹細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞。
- 核移植胚幹細胞、又は胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞由来の分化細胞を生産する方法であって、
I. 体細胞核移植により胚幹細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞を得るステップ、
II. ステップIで得られた細胞を適切な条件下で特定の種類の細胞に分化するよう誘導するステップ、
を包含する方法。 - 前記ntES細胞、前記胚幹様細胞、又は前記その他の種類の胚由来幹細胞が、RA、DMSO、H2O2、β−メルカプトエタノールからなる群から選択される試薬を含有する培地内で誘導することができる、請求項15に記載の方法。
- 前記胚幹細胞、又は前記胚幹様細胞、又は前記その他の種類の胚由来幹細胞(誘導していない前記細胞、又は自然誘導もしくは生化学的誘導後の前記細胞を含む)が、種々の特定の細胞に応じて様々な培地にて培養される、請求項15に記載の方法。
- 個々に様々な成長因子を含有する又はこれらの組み合わせを含有する全ての培地が、胚幹細胞又は胚幹様細胞又はその他の種類の胚由来幹細胞を誘導する、請求項15に記載の方法。
- 前記ntES細胞、前記胚幹様細胞、又は前記その他の種類の幹細胞が、動物又はヒトの特定部分に移植され、体環境において種々の種類の細胞に分化するよう誘導される、請求項15に記載の方法。
- 請求項15〜19のいずれか1項に記載の方法により得られた核移植胚幹細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞。
- ヒトの分化細胞であり、且つ核DNAが移植されたヒトの体細胞によりエンコードされている、請求項20の分化細胞。
- 2細胞期以上のnt株、及びその核移植胚幹細胞、胚幹様細胞、又はその他の種類の胚由来幹細胞から誘導を介して得られる、請求項21に記載の分化細胞。
- 任意の部分、例えば核DNA、ミトコンドリア、RNA、細胞器官、細胞膜などを、人工的に変性又は変化させることができる、請求項20〜22のいずれか1項に記載の分化細胞。
- 人工的に付加された分子を体内へ運ぶ担体として使用される、請求項20〜23のいずれか1項に記載の細胞。
- 薬物の検定及び評価に使用される、請求項20〜23のいずれか1項に記載の細胞。
- 請求項20に従って調製されたヒトの分化細胞を患者に投与することからなる治療法。
- 前記細胞移植療法が、限定はしないが、例えばパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脊髄異常又は損傷、多発性硬化症、筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、肝臓疾患、糖尿病、心臓疾患、軟骨異常又は損傷、火傷、足の壊疽、血管疾患、尿路疾患、AIDS、癌をはじめとする病気からなる群から選択される疾病又は症状を治療するのに効果がある、請求項26に記載の方法。
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