MXPA99001706A - Lineas celulares embrionicas o similares a las desoporte producidas por transplante nuclear de especies cruzadas - Google Patents

Abstract

Se provee un método mejorado de transferencia nuclear que implica el transplante de núcleos de células donadoras en ocitos enucleados de una especie diferente de la célula donadora. Las unidades de transferencia nuclear resultantes sonútiles para la producción de células de soporte embriónicas isogénicas, en particular células embriónicas o de soporte isogénicas humanas. Estas células embriónicas o similares a las de soporte sonútiles para producir las células diferenciadas deseadas y para la introducción, remoción o modificación de genes deseados, v.gr., en sitios específicos del genoma tales como células por recombinación homóloga. Estas células, que pueden contener un gen heterólogo son especialmenteútiles en terapias de transplante de células y para el estudioín vivo de la diferenciación celular.

Description

LINEAS CELULARES EMBRIONIC AS O SIMILARES A LAS DE SOPORTE PRODUCIDAS POR TRANSPLANTE NUCLEAR DE ESPECIES CRUZADAS 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la producción de células embriónicas o similares a las de soporte por transplante de núcleos de células derivadas de células animales o humanas en oocitos animales enucleados de una especie diferente de los núcleos donadores. La presente invención se refiere más específicamente a la producción de células embriónicas o similares a las de soporte por transplante del núcleo de una célula humana en un oocito animal enucleado, preferiblemente un oocito ungulado y más preferiblemente un oocito enucleado de bovinos. La presente invención se refiere además al uso de las células embriónicas o similares a las de soporte resultantes, preferiblemente células embriónicas o similares a las de soporte humanas para terapia para aplicaciones de diagnóstico, para la producción de células diferenciadas que también se pueden utilizar para terapia o diagnóstico y para la producción de células diferenciadas embriónicas o transgénicas, líneas celulares, tejidos y órganos. También, las células embriónicas o similares a las de soporte obtenidas de acuerdo con la presente invención pueden utilizarse por sí mismas como donadores nucleares en métodos de transplante nuclear o transferencia nuclear. 2. ANTECEDENTE de la INVENCIÓN Los métodos para derivar las líneas de células de soporte embriónicas (SE) in vitro de embriones de ratones de pre-implante temprano son bien conocidos. (Ver, por ejemplo, Evans y otros, Nature, 29:154-156 (1981); Martin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 78:7634-7638 (1981)). Las células SE se pueden pasar en un estado no diferenciado, siempre y cuando una capa alimentadora de células de fibroblastos (Evans y otros, Id.) o una fuente de inhibición de diferenciación (Smith y otros, Dev. Biol., 121:1-9 (1987)) estén presentes. Peviamente se ha reportado que las células SE tienen numerosas aplicaciones. Por ejemplo, se ha reportado que las células de SE se pueden utilizar como un modelo in vitro para diferenciación, especialmente por el estudio de genes que están implicados en la regulación de desarrollo temprano. Las células de SE de ratones pueden dar origen a quimeras de líneas germinales cuando se introducen en embriones de ratones para pre-implantes, demostrando así su pluripotencia (Bradley y otros, Nature, 309:255-256 (1984)). En vista de su capacidad para transferir su genoma a la siguiente generación, las células SE tienen utilidad potencial para manipulación de la línea germinal de animales de ganado utilizando células SE con o sin una modificación genética deseada. Además, en el caso de animales de ganado, v.gr., ungulados, los núcleos de embriones de ganado de pre-implante similares soportan el desarrollo de oocitos enucleados hasta término (Smith y otros, Bioi.

Reprod. , 40: 1027- 1035 (1989) ; y Keefer y otros, Biol. Reprod.. 50: 935-939 (1994)) . Esto es en contraste a los núcleos de embriones de ratones que más allá de la etapa de ocho células después de la transferencia, no soportan a manera de reporte el desarrollo de oocitos enucleados (Cheong y otros, Biol. Reprod., 48: 958 (1993)) . Por lo tanto, las células SE de animales de ganado son altamente convenientes debido a que pueden proveer una fuente potencial de núcleos donadores totipotentes, manipulados genéticamente o de alguna manera, para procedimientos de transferencia nuclear. Algunos grupos de investigación han reportado el aislamiento de líneas celulares embriónicas pluripotentes significativamente. Por ejemplo, Notarianni y otros, J. Reprod. Fert. S?ppl. , 43:255-260 (1991 ) , reportaron el establecimiento de líneas celulares pluripotentes significativamente estables a través de blastocitos de cerdos y ovejas que exhiben algunas características morfológicas y de crecimiento similares a las células en cultivos primarios de masas celulares internas aisladas inmunoquirúrgicamente de blastocitos de ovejas. (Id) También , Notarianni y otros, J. Reprod. Fert. Suppl. , 41 : 51 -56 (1990) describen el mantenimiento y diferenciación en cultivo de líneas celulares embriónicas pluripotenciales putativas de blastocitos de cerdos . Además, Gerfen y otros, Anim. Biotech, 6( 1 ): 1 -14 ( 1995) describe el aislamiento de líneas celulares embriónicas de blastocitos de porcinos. Estas células se mantienen de manera estable en capas alimentadoras de fibroblastos embriónicos de ratones sin el uso de medio acondicionado . Estas células se diferencian a manera de reporte en varios tipos de células diferentes durante el cultivo (Gerfen y otros, Id.). Además, Saito y otros, Roux's Arch. Dev. Biol., 201:134-141 (1992) reportan las líneas celulares similares a células de soporte embriónicas de bovinos cultivadas, las cuales sobreviven los pasajes para tres, pero se pierden después del cuarto pasaje. Aún además, Handyside y otros, Roux's Arch. Dev. Biol., 196: 185-190 (1987) describen el cultivo de masas de células internas inmunoquirúrgicamente aisladas de embriones de ovejas bajo condiciones que permiten el aislamiento de líneas de células SE de ratones derivadas de ICM de ratones. Handyside y otros (1987) (Id), reporta que bajo dichas condiciones, los ICM de ovejas se unen, se difunden y desarrollan áreas de células similares a células de SE y células similares a las endodérmicas, pero que después del cultivo prolongado únicamente son evidentes las células similares a las endodérmicas. (Id.). Recientemente, Cherny y otros, Theriogenology, 41:175 (1994) reportaron que las líneas celulares derivadas de células germinales primordiales de bovinos pluripotentes significativamente se mantuvieron en cultivo a largo plazo. Estas células, después de aproximadamente siete días en cultivo, produjeron colonias similares a SE que tiñen positivas para fosfatasa alcalina (AP), exhibieron la capacidad de formar cuerpos de embrioides y se diferenciaron espontáneamente en por lo menos dos tipos diferentes de células. Estas células también expresaron a manera de reporte ARNm para los factores de transcripción OCT4, OCT6 y H ES 1 , un patrón de genes homeoencasillados que se piensa que se expresan por las células de SE exclusivamente . También recientemente, Campbell y otros, Nature, 380:64-68 (1996) reportaron la producción de corderos vivos después de la transferencia nuclear de células de disco (DE) embriónicas cultivadas de embriones de ovinos de nueve días cultivados bajo condiciones que promueven el aislamiento de líneas celulares de SE en el ratón . Los autores concluyeron basados en sus resultados que las células DE de embriones de ovinos de nueve días son totipotentes por transferencia nuclear y esa totipotencia se mantiene en el cultivo. Van Stekelenburg-Hamers y otros, Mol. Reprod. Dev., 40:444-454 (1 995) , reportaron el aislamiento y caracterización de l íneas celulares permanentes significativamente de células de masa de células internas de blastocitos de bovinos. Los autores aislaron y cultivaron ICM de blastocitos de bovinos de 8 ó 9 d ías bajo diferentes condiciones para determinar cuales células alimentadoras y medios de cultivos son más eficientes con el fin de soportar la unión y crecimiento de células de ICM de bovinos. Concluyeron , basado en sus resultados, que la unión y crecimiento de las células ICM cultivadas se mejora por el uso de células alimentadoras de STO (fibroblastos de ratones) (en lugar de células epiteliales del útero de bovinos) y mediante el uso de suero separado con carbón (en lugar de suero normal) para suplementar el medio de cultivo. Van Stekelenburg y otros reportaron , sin embargo, que sus líneas celulares se asemejaron a células epiteliales más que las células ICM pluripotentes. (Id. ) . Aún además, Smith y otros, WO 94/24274; publicada el 27 de Octubre de 1994, Evans y otros, WO 90/03432 , publicada el 5 de Abril de 1990, y Wheeler y otros, WO 94/26889, publicada el 24 de Noviembre de 1994, reportaron el aislamiento, selección y propagación de células de soporte de animales que significativamente pueden utilizarse para obtener animales transgénicos. También, Evans y otros, WO 90/03432, publicada el 5 de Abril de 1990, reportaron la derivación de células de soporte embriónicas pluripotentes significativamente derivadas de especies de porcinos y bovinos que seguramente son útiles para la producción de animales transgénicos. Además, Wheeler y otros, WO 94/26884, publicada el 24 de Noviembre de 1994, describieron células de soporte embriónicas que con seguridad son útiles para la manufactura de ungu lados quiméricos y transgénicos. Por lo tanto, basado en lo anterior, es evidente que muchos grupos han intentado producir l íneas celulares de SE, v.gr. , debido a su aplicación potencial en la producción de embriones clonados o transgénicos y en transplante nuclear. El uso de células ICM para transplante nuclear también ha sido reportado. Por ejemplo, Collas y otros , Mol. Reprod. Dev. , 38:264-267 (1 994) describen el transplante nuclear de ICM de bovinos por microinyección de las células donadoras usadas en oocitos maduros enucleados. La referencia describió el cultivo de embriones in vitro durante siete días para producir quince blastocitos los cuales, al transferirse en receptores bovinos, dieron como resultado cuatro embarazos y dos nacimientos. También, Keefer y otros, Biol. Reprod., 50:935-939 (1994), describen el uso de células de ICM de bovinos como núcleos donadores en procedimientos de transferencia nuclear, para producir blastocitos los cuales, al transplantarse en receptores bovinos, dieron como resultado varios descendientes vivos. Además, Sims y otros, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 90:6143-6147 (1993) describieron la producción de becerros por transferencia de núcleos de células de ICM de bovinos cultivadas in vitro a corto plazo en oocitos maduros enucleados. También, la producción de corderos vivos después de la transferencia nuclear de células embriónicas cultivadas de discos, han sido reportadas (Campbell y otros, Nature, 380:64-68 (1996)). Aún además, el uso de células embriónicas pluripotentes de bovinos en transferencia nuclear y la producción de fetos quiméricos también se ha reportado (Stice y otros, Biol. Reprod., 54:100-110 (1996)); Collas y otros, Mol. Reprod. Dev., 38:264-267 (1994). También, han habido intentos previos para producir unidades de TN de especies cruzadas (Wolfe y otros, Theriogenology, 33:350 (1990). Específicamente, las células embriónicas de bovinos se fusionaron con oocitos de visón para producir algunas unidades de TN de especies cruzadas posiblemente teniendo una masa de célula interna. Sin embargo, las células embriónicas, células no adultas fueron utilizadas como núcleos donadores en el procedimiento de transferencia nuclear. El dogma ha sido que las células embriónicas se reprograman más fácilmente que las células adultas. Estos datos se remontan a estudios de TN anteriores en la rama (revisión por DiBerardino, Differentiation, 17: 17-30 (1980)) . También, este estudio implicó animales filogenéticamente muy similares (núcleos de ganado y oocitos de visón) . En contraste, previamente cuando más especies diversas se fusionaron durante TN (núcleos de ganado en oocitos de hámster) , no se obtuvieron estructuras de masa celular interna. Además, nunca se ha reportado previamente que las células de masa celular interna de unidades de TN podrían utilizarse para formar una colonia simi lar a células de SE que podrían propagarse. También , Collas y otros (Id.) , enseñaron el uso de células de granulosa (células somáticas adultas) para producir embriones de transferencia nuclear de bovinos. Sin embargo, a diferencia de la presente invención , estos experimentos no implicaron transferencia nuclear de especies cruzadas. También, a diferencia de la presente invención las colonias de células sim ilares a SE no fueron obtenidas.

Por lo tanto, sin importar lo que se ha reportado previamente en la literatura, existe una necesidad para métodos mejorados de prod ucir células embrión icas o sim ilares a las de soporte. En particular, existe una necesidad para producir células embriónicas o similares a las de soporte humanas dado su potencial significantivo terapéutico y de diagnóstico .

A este respecto, numerosas enfermedades humanas se han identificado las cuales pueden tratarse por transplante de células. Por ejemplo, la enfermedad de Parkinson se ocasiona por la degeneración de neuronas dopaminérgicas en la substancia negra. El tratamiento normal para el Parkinson implica la administración de L-DOPA, la cual disminuye temporalmente la pérdida de dopamina, pero ocasiona severos efectos laterales y finalmente no invierte el progreso de la enfermedad. Un enfoque diferente para tratar el Parkinson, el cual promete tener una amplia aplicabilidad para el tratamiento de muchas enfermedades del cerebro y daño del sistema nervioso central, implica el transplante de células o tejidos de animales fetales o neonatales en el cerebro de adultos. Las neuronas fetales de una variedad de regiones del cerebro se pueden incorporar en el cerebro de adultos. Dichos injertos han mostrado que alivian experimentalmente las deficiencias del comportamiento inducidas, incluyendo funciones cognoscitivas complejas en animales de laboratorio. Los resultados de pruebas iniciales de ensayos clínicos en humanos han sido prometedores. Sin embargo, los suministros de células fetales de humanos o tejidos obtenidos de portadores erróneos, es muy limitada. Sin embargo, la obtención de células o tejidos de fetos abortados es altamente controversial. Actualmente no hay un procedimiento disponible para producir células "fetales" del paciente. Además, el tejido de aloinjerto no está fácilmente disponible y el tejido de aloinjerto y xenoinjerto se somete a rechazo de injerto. Además, en algunos casos, podría ser benéfico hacer modificaciones genéticas en células o tejidos antes de! transplante. Sin embargo, muchas células o tejidos en donde la modificación sería conveniente no se dividen bien el cultivo y la mayoría de los tipos de transformación genética requieren células de división rápida. Por lo tanto, hay una clara necesidad en la técnica de un suministro de células no diferenciadas embriónicas o de soporte humanas para usarse en transplantes y terapias de células y gentes. OBJETIVOS de la INVENCIÓN Es un objetivo de la invención proveer métodos novedosos y mejorados para producir células embriónicas o células si milares a las de soporte. Es un objetivo más específico de la invención proveer un método novedoso para producir células embriónicas o similares a las de soporte que implican transplante del núcleo de un mam ífero o célula humana a un oocito enucleado de una especie diferente. Es otro objetivo específico de la invención proveer un método novedoso para producir células embriónicas o similares a las de soporte humanas que implica el transplante del núcleo de una célula en un oocito animal enucleado , preferiblemente un oocito enucleado ungulado. Es otro objetivo de la invención proveer un método novedoso para producir células embriónicas o sim ilares a las de soporte humanas que implica el transplante de núcleos de una célula humana, v.gr. , una célula adulta humana en un oocito humano enucleado. Es otro objetivo de la invención proveer células embriónicas o similares a las de soporte producidas por transplante de núcleos de una célula de animal o de humano en un oocito enucleado de una especie diferente. Es un objetivo más especifico de la presente invención proveer células embriónicas o si milares a las de soporte humanas producidas por transplante de núcleos de una célula humana en un oocito de animal enucleado , preferiblemente un oocito enucleado ungulado. Es otro objetivo de la invención usar dichas células embriónicas o similares a las de soporte para la terapia o diagnóstico. Es otro objetivo específico de la invención usar dichas células embriónicas o similares a las de soporte humanas para el tratamiento o diagnóstico de cualq uier enfermedad , en donde la célula, tejido o transplante de órgano es terapéutica o diagnósticamente benéfico. Es otro objetivo específico de la invención utilizar células embriónicas o similares a las de soporte producidas de acuerdo con la invención para la producción de células diferenciadas, tejidos u órganos . Es un objetivo más específico de la invención usar las células embriónicas humanas o similares a las de soporte producidas de acuerdo con la invención para la producción de células humanas diferenciadas , tejidos u órganos .

Es otro objetivo específico de la invención utilizar las células embriónicas o similares a las de soporte producidas de acuerdo con la invención para la producción de células embriónicas o similares a las de soporte tratadas genéticamente, cuyas células se pueden utilizar para producir células humanas diferenciadas tratadas genéticamente o transgénicas, tejidos u órganos, v.gr., que tienen uso en terapias de genes. Es otro objetivo específico de la invención usar células embriónicas o similares a las de soporte producidas de acuerdo con la invención in vitro, v.gr., para el estudio de diferenciación de células con fines de análisis, v.gr. para estudios de fármacos. Es otro objetivo de la invención proveer métodos mejorados para terapia de transplante, que comprende el uso de células isogénicas singénicas, tejidos u órganos producidos de células embriónicas o similares a las de soporte producidas de acuerdo con la invención. Dichas terapias incluyen, a manera de ejemplo, el tratamiento de enfermedades y daños incluyendo enfermedad de Parkinson, Huntington, Alzheimer, ALS, daño de la medula espinal, esclerosis múltiple, distrofia muscular, diabetes, enfermedades del hígado, enfermedad del corazón, reemplazo de cartílagos, quemaduras, enfermedades vasculares, enfermedades del tracto urinario, así como para el tratamiento de defectos inmunes, transplante de medula ósea, cáncer, entre otras enfermedades. Es otro objetivo de la invención usar células embriónicas o similares a las de soporte transgénicas o tratadas genéticamente producidas de acuerdo con la invención para terapia de genes, en particular para el tratam iento y/o prevención de las enfermedades y daños identificados, supra. Es otro objetivo de la invención usar células embriónicas o simi lares a las de soporte producidas de acuerdo con la invención o células embriónicas o si milares a las de soporte transgénicas o tratadas genéticamente producidas de acuerdo con la invención como donadores nucleares para el transplante nuclear. Con los anteriores y otros objetivos, ventajas y aspectos de la invención que serán evidentes más adelante, la naturaleza de la invención será entendida de manera más clara por referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y en las reivindicaciones anexas. BREVE DESCRIPCIÓ N DE LAS FIG URAS La Figura 1 , es una fotografía de una unidad de transferencia nuclear (TN) prod ucida por la transferencia de una célula de humano adulto en un oocito de bovinos enucleados. Las Figuras 2 a 5, son fotografías de células similares a las de soporte embriónicas derivadas de una unidad de TN tal como la descrita en la Figura 1 . DESCRIPCIÓN DETALLADA de la INVENCIÓN La presente invención provee un método para producir células embriónicas o similares a las de soporte y más específicamente células embriónicas o si milares a las de soporte por transferencia nuclear o transplante nuclear. En la presente solicitud, la transferencia nuclear o transplante nuclear o TN se utilizan intercambiablemente. Como se describió antes, el aislamiento de células embriónicas o similares a las de soporte por transferencia nuclear o transplante nuclear nunca se ha reportado. En su lugar, el aislamiento reportado previamente de células similares a ES ha sido de embriones fertilizados. También la transferencia nuclear exitosa que implica las células o ADN de especies genéticamente diferentes o más específicamente de células adultas o ADN de una especie y oocitos de otra especie nunca ha sido reportado. También, a saber de los Solicitantes, nunca se ha reportado un método para producir células embriónicas o similares a las de soporte humanas en cultivo de tejido. En su lugar, las células fetales humanas limitadas y tejidos que han estado actualmente disponibles se deben obtener de tejidos de abortos espontáneos y de fetos abortados. También, antes de la presente invención, no se han obtenido células embriónicas o similares a las de soporte por transplante nuclear de especies cruzadas. Muy inesperadamente, los inventores de la presente descubrieron que las células embriónicas o similares a las de soporte humanas y las colonias celulares se pueden obtener por transplante del núcleo de una célula humana, v.gr., una célula humana adulta diferenciada en un oocito animal enucleado, el cual se usa para producir unidades de transferencia nuclear (TN), las células de las cuales al cultivarse originan células y colonias de células embriónicas o similares a las de soporte humanas. Este resultado es altamente sorprendente dado a que es la primera demostración del transplante nuclear de especies cruzadas efectivo, es decir el transplante de núcleos de células de una célula de animal o de humano, v.gr., célula adulta, en el huevo enucleado de diferentes especies animales, para producir las unidades de transferencia nuclear que contienen células la cuales cuando se cultivan bajo condiciones apropiadas, originan células y colonias celulares embriónicas o similares a las de soporte. Preferiblemente, las unidades de TN usadas para producir células similares a las de SE serán cultivadas a un tamaño de por lo menos 2 a 400 células, preferiblemente de 4 a 128 células, y más preferiblemente a un tamaño de por lo menos aproximadamente 50 células. En la presente invención, las células embriónicas o similares a las de soporte se refieren a células producidas de acuerdo con la presente invención. La presente invención se refiere a dichas células como similares a las de soporte en lugar de células de soporte debido a la forma en que se producen, es decir, por transferencia nuclear de especies cruzadas. Mientras que estas células se espera que tengan capacidad de diferenciación similar a las células de soporte normales tienen algunas diferencias insignificantes debido a la forma en que se producen. Por ejemplo, estas células similares a las de soporte pueden tener la mitocondria de los oocitos utilizados para transferencia nuclear.

El presente descubrimiento se ha hecho basado en la observación de que el transplante nuclear de los núcleos de una célula humana adulta, específicamente una célula epitelial humana obtenida de la cavidad oral de un donador humano, cuando se transfieren en un oocito de bovinos enucleado, da como resultado la formación de unidades de transferencia nuclear, las células de las cuales al cultivarse originan células similares a las de soporte embriónicas humanas y colonias de células embriónicas o similares a las de soporte humanas. Se hipotetiza por los presentes inventores que los oocitos de bovinos y oocitos humanos pueden sufrir procesos de maduración que son suficientemente similares para permitir que el oocito de bovino funcione como un substituto efectivo o subrogarse por un oocito humano. Basado en el hecho de que los núcleos de células humanas pueden transplantarse efectivamente en oocitos de bovinos, es razonable esperar que las células humanas se pueden transplantar en oocitos de otras especies, v.gr. , otros ungulados así como otros animales. En particular, otros oocitos ungulados deben ser adecuados, v.gr. , cerdos, ovejas, caballos, cabras, etc. También, los oocitos de otras fuentes deben ser adecuados, v. gr. , oocitos derivados de otros primates, anfibios, roedores, conejos, etc. Además , el uso de métodos similares debe ser posible para transferir células humanas o núcleos de células en oocitos humanos. Por lo tanto, en su modalidad más amplia, la presente invención implica el transplante de un núcleo de células animales o humanas o célula de animal o humana en el oocito enucleado de una especie animal diferente de los núcleos de donadores, por inyección o fusión, para producir una unidad de TN, conteniendo células que se pueden utilizar para obtener células embriónicas o similares a las del soporte y/o cultivos de células. Por ejemplo, la invención puede implicar el transplante de un núcleo celular ungulado o célula ungulada en oocito de otras especies, v.gr., otro ungulado o no ungulado, por inyección o fusión, cuyas células y/o núcleo se combinan para producir unidades de TN y que se cultivan bajo condiciones adecuadas para obtener unidades de TN multicelulares, preferiblemente comprendiendo por lo menos alrededor de 2 a 400 células, más preferiblemente de 4 a 128 células, y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 50 células. Las células de dichas unidades de TN se pueden utilizar para producir células embriónicas o similares a las de soporte o colonias celulares al cultivarse. Sin embargo, la modalidad preferida de la invención comprende la producción de células embriónicas o similares a las de soporte humanas por transplante del núcleo de una célula humana donadora o una célula humana en un oocito animal enucleado, preferiblemente un oocito ungulado y aún más preferiblemente un oocito enucleado. En general, las células embriónicas o similares a las de soporte serán producidas por un proceso de transferencia nuclear que comprende los siguientes pasos: (i) obtener células humanas o animales deseadas para ser usadas como una fuente de núcleos donadores; (ii) obtener oocitos de una fuente adecuada, v.gr., un mamífero y más preferiblemente un ungulado, v.gr., bovino; (iii) enuclear dichos oocitos; (iv) transferir la célula humana o animal o núcleo en el oocito enucleado de una especie animal diferente a la célula o núcleo donador, v.gr., por fusión o inyección; (v) cultivar el producto de TN resultante o unidad de TN para producir estructuras celulares múltiples; y (vi) cultivar células obtenidas de dichos embriones para obtener células embriónicas o similares a las de soporte y colonias de células similares a las de soporte. Las técnicas de transferencia nuclear o transplante nuclear son conocidas en la literatura y se describen en muchas de las referencias citadas en el Antecedente de la Invención. Ver, en particular, Campbell y otros, Theriogenology, 43:181 (1995); Collas y otros, Mol. Report Dev., 38:264-267 (1994); Keefer y otros, Biol. Reprod., 50:935-939 (1994); Sims y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6143-6147 (1993); WO 94/26884; WO 94/24274 y WO 90/03432, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. También, Patentes de E.U.A. Nos. 4,944,384 y 5,057,420 describen procedimientos para transplante nuclear de bovinos. Las células humanas o animales se pueden obtener por métodos bien conocidos. Las células humanas o animales útiles en la presente invención, incluyen a manera de ejemplo, células epiteliales, neutrales, células epidérmicas, queratinocitos, células hematopoyéticas, melanocitos, condrocitos, linfocitos (linfocitos B y T), eritrocitos, macrofagos, monocitos, células mononucleares, fibroblastos, células de músculo cardíaco y otras células de músculo, etc. Además, las células humanas utilizadas para transferencia nuclear se pueden obtener de diferentes órganos, v.gr., piel, pulmones, páncreas, hígado, estómago, intestino, corazón, órganos reproductivos, vejiga, riñon, uretra y otros órganos urinarios, etc. Estos solo son ejemplos de células donadoras adecuadas. Las células donadoras, es decir, células útiles en la presente invención, se pueden obtener de cualquier célula u órgano del cuerpo, estos incluyen cualesquiera células somáticas o germinadas. En el ejemplo siguiente las células utilizadas como donadores para transferencia nuclear fueron células epiteliales derivadas de la cavidad oral de un donador humano. Sin embargo, como se trató, el método descrito se puede aplicar a otras células o núcleos humanos. Además, los núcleos celulares se pueden obtener de células somáticas humanas. Los oocitos utilizados para transferencia nuclear se pueden obtener de animales incluyendo mamíferos y anfibios. Las fuentes de mamíferos adecuadas para oocitos incluyen ovejas, bovinos, ovinos, cerdos, caballos, conejos, conejillos de la india, ratones, hámster, ratas, primates, etc. En las modalidades preferidas, los oocitos se obtendrán de ungulados y más preferiblemente de bovinos.

Los métodos para el aislamiento de oocitos son bien conocidos en la materia. Esencialmente, estos comprenden aislar oocitos de los ovarios o del tracto reproductivo de un mamífero o anfibio, v. gr. , un bovino. Una fuente fácilmente disponibles de oocitos de bovinos son materiales de matadero. Para el uso exitoso de técnicas tales como ingeniería genética, transferencia nuclear y clonación , los oocitos generalmente se pueden madurar in vitro antes de que se puedan utilizar estas células como células receptores para transferencia nuclear y antes de que se puedan fertilizar por la célula de esperma para desarrollarse en un embrión. Este proceso generalmente requiere recuperar oocitos inmaduros (profase I) de ovarios de animales, v. gr. , ovarios de bovinos obtenidos en un matadero y madurando los oocitos en un medio de maduración antes de la fertilización o enucleación hasta que el oocito obtiene la etapa de metafase I I , la cual en el caso de oocitos de bovinos generalmente se presenta a alrededor de 18-24 horas de después de la aspiración . Con fines de la presente invención , este período es conocido como el "período de maduración". Como se usa en la presente, para calcular los períodos, "aspiración" se refiere a la aspi ración del oocito inmaduro de folículos de ovarios. Adicionalmente, los oocitos en la etapa de metafase I I , que se han madurado in vivo se han utilizado exitosamente en técnicas de transferencia nuclear. Esencialmente, los oocitos maduros en la metafase I I se recuperan quirúrgicamente de vacas no superovuladas o superovuladas o vaquillas de 35 a 48 horas después del inicio del estro o después de la inyección de gonadotropina corionica humana (hCG) u hormona sim ilar. La etapa de maduración del oocito en la enucleación y transferencia nuclear se ha reportado por ser significativo para el éxito de los métodos de TN . (Ver por ejemplo, Prather y otros, Differentiation, 48, 1 -8, 1991 ). En general, las prácticas de clonación de embriones de mamíferos exitosas usan el oocito en la etapa de metafase I I como el oocito receptor debido a que se piensa que en esta etapa el oocito puede ser o es suficientemente "activado" para tratar el núcleo introducido como lo hace un esperma de fertilización. En animales domésticos y especialmente ganado, el período de activación de oocitos generalmente varía de aproximadamente 16-52 horas, preferiblemente de aproximadamente 28-42 horas después de la aspiración. Por ejemplo, los oocitos inmaduros se pueden lavar en medios de cultivos de embriones de hámster regulados por H EPES (H ECM) como se describió en Seshagine y otros, Biol. Reprod., 40, 544-606, 1989 y después se coloca en gotas de medio de maduración que consiste de 50 microlitros de medio de cultivo de tejido (MCT) 199 conteniendo 10% de suero de becerro fetal que contienen gonadotropinas apropiadas tales como hormona luteinizante (H L) y hormona de estimulación de fol ículo (H EF) y estradiol bajo una capa de parafina de peso ligero o silicón a 39°C.

Después de un período de maduración en tiempo fijo, que varía de aproximadamente 10 a 40 horas y preferiblemente de alrededor 16-18 horas, los oocitos serán enucleados. Antes de la enucleación los oocitos preferiblemente serán removidos y colocados en H ECM que contiene 1 miligramo por m il il itro de hialuronidasa antes de la remoción de células acumuladas. Esto se puede efectuar por pipeteo repetido a través de pipetas de orificio muy fino o revolviendo durante poco tiempo. Los oocitos separados después tamizan por cuerpos polares y los oocitos en metafase I I seleccionados, como se determina por la presencia de cuerpos polares, después se utilizan para transferencia nuclear. Después viene la enucleación. La enucleación se puede efectuar por métodos conocidos, tales como los descritos en la Patente de E. U .A. No. 4,994,384 que se incorpora aquí por referencia. Por ejemplo, los oocitos de metafase I I se colocan en H ECM , conteniendo opcionalmente 7.5 microgramos por mil il itro de citocalasina B, para enucleación inmediata o se pueden colocar en un medio adecuado, por ejemplo CR 1 aa, más 10% de suero de vaca en estro y después se somete a enucleación , preferiblemente no más de 24 horas después y más preferiblemente 16- 18 horas después . La enucleación se puede devorar microquirúrgicamente utilizando una micropipeta para remover el cuerpo polar y el citoplasma adyacente. Los oocitos entonces se pueden tamizar para identificar aquellos de los cuales se han enucleado exitosamente. Este tamiz se puede efectuar tiñendo los oocitos con 1 microgramo por milil itro de colorante 33342 Hoechst en H ECM y después observar los oocitos bajo irradiación ultravioleta durante menos de 10 segundos. Los oocitos que se han enucleado exitosamente se pueden colocar en un medio de cultivo adecuado. V.gr. , CR 1 aa más 10% de suero. En la presente invención, los oocitos receptores preferiblemente serán enucleado en un tiempo que varía de aproximadamente 10 horas a alrededor de 40 horas después de la irradiación de la maduración in vitro, más preferiblemente de aproximadamente 16 horas a alrededor de 24 horas después del inicio de la maduración in vitro y más preferiblemente aproximadamente 16- 18 horas después de la iniciación de la maduración in vitro. U na sola célula animal o humana que es heterológa para el oocito enucleado entonces se transferirá en el espacio perivitil ino del oocito enucleado utilizado para producir la unidad de TN . La célula animal o humana y el oocito enucleado se utilizará para producir unidades de TN de acuerdo con los métodos conocidos en la materia. Por ejemplo, las célu las se pueden fusionar por electrofusión . La electrofusión se logra proveyendo un impulso de electricidad que es suficiente para ocasionar una ruptura temporal de la membrana de plasma. Esta ruptura de la membrana de plasma es muy corta debido a que la membrana se reforma rápidamente. Esencialmente, si se inducen dos membranas adyacentes a la ruptura y por la reformación de las bicapas de l ípidos intermezcladas, se abrirán pequeñas cantidades entre las dos células. Debido a la inestabilidad termodinámica de dicha abertura pequeña, se alarga hasta que las dos células se vuelven una. Se hace referencia a la Patente de E. U .A. No. 4, 997, 384 por Prather y otros (incorporada aquí por referencia en su totalidad) para una discusión adicional de este proceso. Una variedad de medios de electrofusión se pueden utilizar incluyendo v.gr. , sacarosa, manitol , sorbitol y solución reguladora de fosfato. La fusión se puede lograr usando virus Sendai como un agente fusogénico (Graham, Wister Inot. Symp. Monogr., 9, 1 9 , 1 969) . También, en algunos casos (v.gr. , con pequeños núcleos donadores) puede ser preferible inyectar el núcleo directamente en el oocito en lugar de utilizar fusión por electroporación . Dichas técnicas se describen en Collas and Barnes, Mol. Reprod. Dev. , 38:264-267 ( 1994) y se incorporan aquí en su totalidad por referencia. Preferiblemente, la célula humana o animal y el oocito se electrofusionan en una cámara de 500 µm por aplicación de un im pulso eléctrico de 90- 120v durante aproximadamente 15 µseg . , alrededor de 24 horas después del inicio de la maduración del oocito. Después de la fusión , las unidades de TN fusionadas resultantes se colocan en un medio adecuado hasta la activación, v.gr. , medio de CRI aa . La activación normal se efectuará en corto tiem po después, normalmente menos de 24 horas después y preferiblemente aproximadamente 4-9 horas después.

La unidad de TN se puede activar por métodos conocidos , Dichos métodos incluyen, v. gr. , cultivar la unidad de TN a una temperatura sub-fisiológica, en ausencia aplicando un choque de temperatura fría, realmente fría a la unidad de TN . Esto puede hacerse más convenientemente cultivando la unidad de TN a temperatura ambiente, que es relativamente fría para las condiciones de temperatura fisiológicas a las cuales se pueden exponer normalmente. Alternativamente, se puede lograr la activación por la aplicación de agentes de activación conocidos. Por ejemplo, la penetración de oocitos por esperma durante la fertilización se ha mostrado que activa los oocitos de prefusión para dar mayores números de embarazos viables y becerros genéticamente idénticos múltiples después de la transferencia nuclear. También , los tratamientos tales como choque eléctrico y químico se pueden util izar para activar embriones de TN después de la fusión. Los métodos de activación de oocitos adecuados son el tema de la Patente de E. U .A. No . 5,496,720, para Susko-Parrish y otros. Adicionalmente, la activación se puede efectuar simultáneamente o secuencialmente: (i) incrementand o niveles de cationes divalentes en el oocito, y (ii) reduciendo la fosforilación de proteínas celulares en el oocito. Esto general mente será efectuar introduciendo cationes divalentes en el citoplasma de oocitos, v. gr. , magnesio, estroncio, bario o calcio , v. gr. , en forma de un ionofero. Otros métodos para incrementar los niveles de cationes divalentes incluyen el uso de choque eléctrico, tratamiento con etanol y tratamiento con quelantes encasillados. La fosforilación puede reducirse por métodos conocidos, v.gr. , por la adición de inhibidores de cinasa, v. gr. , inhibidores de cinasa de serina-treonina, tales como 6-dimetil-amino-purina, estauroesporina, 2-aminopurina y esfingosina. Alternativamente, la fosforilación de proteínas celulares puede inhibirse por la introducción de una fosfatasa en el oocito, v. gr. , fosfatasa 2A y fosfatasa 2 B. En la modalidad preferida, la activación de TN se efectuará exponiendo brevemente ia unidad de TN fusionada a un medio de TL-H EP ES conteniendo 5µM de ionomicina y 1 mg/m l de BSA, seguido por el lavado en TL-H EP ES conteniendo 30 mg/ml de BSA dentro de aproximadamente 24 horas después de la fusión y preferiblemente aproximadamente 4 a 9 horas después de la fusión. Las unidades de TN activadas entonces se pueden cultivar en un medio de cultivo in vitro adecuado hasta la generación de células embriónicas o similares de las de soporte y colonias celulares. Los medios de cultivo adecuados para cultivación y maduración de em briones son bien conocidos en la materia. Ejemplos de medios conocidos, que se pueden utilizar para cultivo y mantenimiento de embriones de bovinos i ncluyen H am's F- 10 + 10% de suero de becerro fetal (SBF) , Medio de Cultivo de Tejido - 199 (TCM-199) + 1 0% de suero de becerro fetal , Tyrodes-Albumin Lactate-Pyruvato (TALP), Dulbecco's Solución Salina Regulada de Fosfato (PBS), medio de Eagle's y Whitten's. Uno de los medios más comunes usados para la recuperación y maduración de los oocitos es TCM-199 y de 1 a 20% de suplemento de suero incluyendo suero de becerro fetal, suero de recién nacidos, suero de vaca estrual, suero de cordero o suero de novillos. Un medio de mantenimiento preferido incluye TCM-199 con sales Earl, 10% de suero de becerro fetal, 0.2 MM de piruvato de Ma y 50 µg/ml de sulfato de gentamicina. Cualquiera de los anteriores también puede implicar el co-cultivo con una variedad de tipos celulares tales como células de granulosa, células de oviducto, células BRL y células de uterino y células de STO. Otro medio de mantenimiento se describe en la Patente de E.U.A. No. 5,096,822 to Rosenkrans, Jr. y otros, que se incorpora aquí por referencia. Este medio embriónico nombrando CR1, contienen las substancias nutricionales necesarias para soportar un embrión. CR1 contiene L-lactato de hemicalcio en cantidades que varían de 1.0 mM a 10 mM, preferiblemente de 1.0 mM a 5.0 mM. El L-lactato de hemicalcio es L-lactato con una sal de hemicalcio incorporada en el mismo. El L-lactato de hemicalcio es significativo en que un solo componente satisface dos requerimientos principales en el medio de cultivo: (i) el requerimiento de calcio necesario para compactar y la disposición del citoesqueleto; y (ii) el requerimiento de lactato necesario para el metabolismo y transporte de electrones.

El L-lactato de hemicalcio también sirve como mineral valioso y fuente de energía para el medio necesario para viabilidad de los embriones. Ventajosamente, el medio CR1 no contiene suero, tal como suero de becerro fetal y no requiere el uso de un co-cultivo de células animales u otros medios biológicos, es decir, medios que comprenden células animales tales como células oviductales. Los medios biológicos algunas veces pueden ser desventajosos en cuanto a que pueden contener microorganismos o factores traza que pueden ser dañinos para los embriones y que son difíciles de detectar, caracterizar y eliminar. Los ejemplos de los componentes principales en medio CR1 incluyen L-lactato de hemicalcio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, bicarbonato de sodio y una cantidad menor de albúmina de suero de bovinos libres de ácidos grasos (Sigma a-6003). Adicionalmente, una cantidad definida de aminoácidos esenciales y no esenciales se puede agregar al medio. CR1 con aminoácidos se conoce por la abreviatura "CR1aa". El medio CR1 preferiblemente contiene los siguientes componentes en las siguientes cantidades: cloruro de sodio -114.7 mM cloruro de potasio -3.1 mM bicarbonato de sodio -26.2 mM L-lactato de hemicalcio -5 mM BASA libre de ácidos grasos -3 mg/ml En la modalidad preferida, la unidad de embriones de TN activados se colocará en el medio CR1aa conteniendo 1.9 mM DMAP durante aproximadamente 4 horas después de un lavado en HECM y después cultivados en BSA que contienen CR1aa. Por ejemplo, las unidades de TN activadas se pueden transferir al medio de cultivo CRIaa conteniendo 2.0 mM DMAP (Sigma) y cultivadas bajo condiciones ambiente, v.gr., aproximadamente 38.5°C, 5% de CO2 durante un tiempo adecuado, v.gr., aproximadamente 4 a 5 horas. Después de eso, la unidad o unidades de TN cultivadas se lavan preferiblemente y después se colocan en un medio adecuado, v.gr., medio de CR1aa conteniendo 10% de SBF y 6 mg/ml contenido en placas de pozos que preferiblemente contienen una capa alimentadora confluente adecuada. Las capas alimentadoras adecuadas incluyen, a manera de ejemplo, fibroblastos y células epiteliales, v.gr., fibroblastos y células epiteliales uterinas derivadas de ungulados, fibroblastos de pollo, fibroblastos de murinos (v.gr., ratones o ratas), líneas de células alimentadoras STO, y Sl-m220 y células de BRL. En la modalidad preferida, las células alimentadoras comprenderán fibroblastos embriónicos de ratas. Los medios para la preparación de una capa alimentadora de fibroblastos adecuada se describe en el ejemplo siguiente y está dentro de la experiencia del artesano experto.

Las unidades de TN se cultivaron en la capa alimentadora hasta que las unidades de TN alcancen un tamaño adecuado para obtener células que se pueden utilizar para producir células similares a las de soporte embriónicas o colonias celulares. Preferiblemente, estas unidades de TN serán cultivadas hasta por lo menos aproximadamente 2 a 400 células, más preferiblemente aproximadamente 4 a 128 células y más preferiblemente por lo menos alrededor de 50 células. El cultivo será efectuado bajo condiciones adecuadas, es decir, aproximadamente 38.5°C y 5% de CO2, con medio de cultivo cambiado con el fin de optimizar el crecimiento normal de aproximadamente cada 2-5 días, preferiblemente aproximadamente cada 3 d ías. En el caso de unidades de TN derivadas de oocitos de células humanas/bovinos enucleados, suficientes células para producir una colonia de células de SE, normalmente en orden de aproximadamente 50 células. Serán obtenidas alrededor de 12 días después de iniciar la activación de oocitos. Sin embargo, esto puede variar dependiendo de la célula particular usada como el donador nuclear, la especie del oocito particular y las condiciones de cultivo. Alguien experto en la materia puede asegurarlo visualmente de manera fácil cuando un número suficiente deseado de células se ha obtenido basado en la morfolog ía de las unidades de TN cultivadas. Después que las unidades de TN del tamaño deseado son obtenidas, las células se remueven mecánicamente de la zona y se utilizan para prod uci r células y l íneas celulares embriónicas o similares a las de soporte. Esto se efectúa preferiblemente tomando el grupo de células que comprende la unidad de TN, que normalmente contendrá por lo menos aproximadamente 50 células, lavando dichas células y sembrándolas en placas en una capa alimentadora, v.gr., células de fibroblastos irradiadas. Normalmente, las células utilizadas para obtener las células similares a las de soporte o colonias celulares se obtendrán de la porción más interna de la unidad de TN cultivada que preferiblemente es por lo menos de 50 células de tamaño. Sin embargo, las unidades de TN de números de células más pequeños o mayores así como células de otras porciones de la unidad de TN también se pueden utilizar para obtener células similares a SE y colonias celulares. Las células se mantienen en la capa alimentadora en un medio de crecimiento adecuado, v.gr., MEM alfa suplementado con 10% de SBF y 0.1 mM de beta-mercaptoetanol (Sigma) y L-glutamina. El medio de crecimiento se cambia con frecuencia según sea necesario para optimizar el crecimiento, v.gr., aproximadamente cada 2-3 días. Este proceso de cultivo da como resultado la formación de células o líneas celulares embriónicas o similares a las de soporte. En el caso de embriones de TN derivados de oocitos de células humanas/bovinos se observan colonias aproximadamente al segundo día cultivando en el medio de MEM alfa. Sin embargo, este tiempo puede variar dependiendo de la célula donadora nuclear particular, el oocito específico y las condiciones de cultivo. Alguien experto en la materia puede variar las condiciones de cultivo según se desea para optimizar el crecimiento de las células embriónicas o similares a las de soporte particulares. Las células y colonias celulares embriónicas o similares a las de soporte obtenidas normalmente exhibirán una apariencia similar a las células embriónicas o similares a las de soporte de las especies usadas como el donador de células nucleares en lugar de las especies que con frecuencia son donadoras de oocitos. Por ejemplo, en el caso de las células embriónicas o similares a las de soporte obtenidas por las de transferencia de una célula donadora nuclear humana en un oocito de bovinos enucleado, las células exhiben una morfología más similar a las células de soporte embriónicas de ratones que las células similares a SE de bovinos. Más específicamente, las células individuales de la colonia celular de la línea SE humana son no definidos y el perímetro de la colonia es refractiva y de apariencia uniforme. Además, la colonia de las células tiene un tiempo de doblaje de células más largo, alrededor del doble de las células SE de ratones. También, a diferencia de las células de SE derivadas de bovinos y porcinos, la colonia no tiene una apariencia similar al epitelio. Las células y líneas celulares embriónicas o similares a las de soporte resultantes preferiblemente células y líneas celulares embriónicas o similares a las de soporte humanas, tienen numerosas aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Más especialmente, las células embriónicas o similares a las de soporte se pueden utilizar para terapias de transplante de células. Las células embriónicas o similares a las de soporte humanas tienen aplicación en e! tratamiento de diferentes condiciones de enfermedad . A este respecto, se sabe que las células de soporte embriónicas (SE) de ratones son capaces de diferenciarse en casi todos los tipos celulares, v. gr. , células de soporte hematopoyéticas. Por lo tanto, las células embriónicas o similares a las de soporte humanas producidas de acuerdo con la invención deberán tener capacidad de diferenciación simi lar. Las células embriónicas o similares a las de soporte de acuerdo con la invención serán inducidas para diferenciarse con el fin de obtener los tipos de células deseadas de acuerdo con los métodos conocidos. Por ejemplo , las células embriónicas o similares a las de soporte humanas presentes se pueden inducir para diferenciarse en células de soporte hematopoyéticas, células de músculo, células de músculo cardiaco, células de hígado, células de cartílagos, células epiteliales, células del tracto urinario, etc. , cultivado dichas células en el medio de diferenciación y bajo condiciones que proveen diferenciación celular. El medio y métodos que dan como resultado la diferenciación de células de soporte embriónicas son conocidas en la materia dado que son condiciones de cultivo adecuadas. Por ejemplo , Palacios y otros, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 92:7530-7537 ( 1995) enseña la producción de células de soporte hematopoyéticas de una l ínea celular embriónica sometiendo las células de soporte a un procedimiento de inducción comprendiendo agregados de cultivo i nicial de dichas células en un medio de cultivo de suspensión que carece de ácido retinoico seguido por el cultivo en el mismo medio conteniendo ácido retinoico, seguido por la transferencia de agregados celulares a un substrato que provee la unión de células. Además, Pedersen, J. Reprod. Fértil. Dev., 6:543-552 (1994) es un artículo de revisión que hace referencia a numerosos artículos que describen métodos para la diferenciación in vitro de células de soporte embriónicas para producir varios tipos de células diferenciados incluyendo células hematopoyéticas, músculo, músculo cardiaco, células de nervios, entre otros. Además, Bain y otros, Dev. Biol., 168-342-357 (1995) enseña la diferenciación in vitro de células de soporte embriónicas para producir células neurales que tiene propiedades neuronales. Estas referencias son ilustrativas de métodos reportados para obtener células diferenciadas de células embriónicas o similares a las de soporte. Estas referencia y en particular las descripciones de la presente que se refieren a métodos para diferenciar células de soporte embriónicas se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Por io tanto, utilizando métodos y medios de cultivo conocidos, alguien experto en la materia puede cultivar las células embriónicas o similares a las de soporte presentes para obtener los tipos de células diferenciadas deseadas, v.gr., células neurales, células del músculo, células hematopoyéticas, etc.

Las células embriónicas o sim ilares a las de soporte presentes se pueden utilizar para obtener cualquier tipo de células diferenciadas deseadas. Los usos terapéuticos de dichas células humanas diferenciadas no son en paralelo. Por ejemplo, las células de soporte hematopoyéticas humanas se pueden utilizar en tratamientos médicos que requieren transplante de médula ósea. Dichos procedimientos se utilizan para tratar muchas enfermedades, v. gr. , cánceres en etapa tardía tales como cáncer de ovario y leucemia, así como enfermedades que comprenden el sistema inmune, tal como SI DA. Las células de soporte hematopoyéticas se pueden obtener, v.gr. , fusionando células somáticas adultas de un paciente con cáncer o SI DA, v.gr. , células epiteliales o linfocitos con un oocito enucleado , v.gr. , oocito de bovinos, obteniendo células embriónicas o similares a las de soporte como se describe antes y cultivando las células bajo condiciones que favorecen la diferenciación , hasta que se obtienen células de soporte hematopoyéticas. Dichas células hematopoyéticas se pueden utilizar en el tratamiento de enfermedades que incluyen cáncer y SI DA. Alternativamente, las células somáticas adultas de un paciente con un trastorno neurológico se pueden fusionar con un oocito animal enucleado, v. gr. , un oocito de bovinos, células embriónicas o similares a las de soporte humanas obtenidas de los mismo y dichas células cultivadas bajo condiciones de diferenciación para producir líneas celulares neutrales. Las enfermedades específicas que se pueden tratar por transplante de dichas células neurales humanas incluyen, a manera de ejemplo la enfermedad de Parkinson , enfermedad de Alzheimer, ALS y parálisis cerebral entre otras. En el caso específico de la enfermedad de Parkinson, se ha demostrado que las células neurales y cerebros fetal transplantadas hacen las condiciones apropiadas con las células circundantes y producen dopamina. Esto puede dar como resultado la inversión a largo plazo de los síntomas de la enfermedad de Parkinson . La gran ventaja de la presente invención es que provee un suministro esencialmente sin l ímite de células humanas isogénicas o singénicas adecuadas para el transplante. Por lo tanto, será obvio el problema significativo asociado con los métodos de transplante actuales, es decir el rechazo del tejido transplantado que puede ocurrir debido al rechazo de huésped contra injerto o injerto contra huésped. Convencionalmente, el rechazo se evita o reduce por la administración de fármacos ante el rechazo tal como ciclosporina. Sin embargo, dichos fármacos efectos laterales significativos adversos, v. gr. , inmunosupresión , propiedades carcinogénicas, así como que son muy costosos . La presente invención deberá eliminar, o por lo menos reducir en gran parte la necesidad de fármacos anti-rechazo. Otras enfermedades y condiciones que se tratan por terapia de cél ulas isogénicas incluyen , a manera de ejemplo, daños de la médula espinal, esclerosis múltiple, distrofia muscular, diabetes , enfermedades del h ígado, es decir, hipercolesterolem ía , enfermedades del corazón , reemplazo de cartílago, quemaduras, úlceras de pies, enfermedades gastrointestinales, enfermedades vasculares, enfermedades del pulmón , enfermedades del tracto urinario y enfermedades y condiciones relacionadas con la edad. También , las células embriónicas o similares a las de soporte humanas producidas de acuerdo con la invención se pueden utilizar para producir células diferenciadas humanas tratadas genéticamente o transgénicas. Esencialmente, se efectuará introduciendo un gen o genes deseados que pueden ser heterológos o removiendo todo o parte de un gen o genes endógenos de células embriónicas o similares a las de soporte humanas producidas de acuerdo con la invención y permitiendo que dichas células se diferencien en el tipo de células deseado. U n método preferido para lograr dicha modificación es por recombinación homologa debido a que dicha técnica se puede utilizar para insertar, suprimir o modificar un gen o genes a un sitio o sitios específicos en el genoma de células similares a las de soporte. Esta metodolog ía se puede utilizar para reemplazar genes defectuosos, v.gr. , genes del sistema inmune defectuosos, genes de fibrosis cística o para introducir genes que dan como resultado la expresión de proteínas terapéuticamente benéficas tales como factores de crecimiento , linfocinas , citoquinas, enzimas, etc. Por ejemplo, el factor de crecimiento derivado de cerebro que codifica genes se puede introducir en las células embriónicas o similares a las de soporte hu manas, las células diferenciadas en células neurales y las célu las transplantadas en un paciente con Parkinson para retardar la perdida de las células neurales durante dicha enfermedad. Previamente, los tipos de células transfectadas con BDN F varió de células primarias a l íneas celulares inmortalizadas, aya sea células derivadas neutrales o no neutrales (mioblastos y fibroblastos) . Por ejemplo, los astrocitos pueden transfectarse con el gen de BDN F utilizando vectores retrovirales y las células injertadas en un modelo de ratón de la enfermedad de Parkinson (Yoshimoto y otros, Brain Research, 691 -25-36, (1995)). Esta terapia ex vivo redujo los síntomas similares a los de Parkinson en las ratas de hasta 45% 32 d ías después de la transferencia. También , el gen de hidroxilasa de tirosina se ha colocado en los astrocitos con resultados similares (Lundberg y otros, Develop. Neurol., 139: 39-53 (1996) y referencias citadas en la presente) . Sin embargo , d ichos sistemas ex vivo tienen problemas. En particular, los vectores retrovirales actualmente utilizados se regulan descendentemente in vivo y el transgen únicamente es expresado temporalmente (revisión por Mull igan, Science, 260:926-932 (1993)) . También , dichos estudios utilizaron células primarias, astrocitos, que tienen una extensión de vida fi nito y se replican lentamente. Dichas propiedades afectan adversamente el régimen de transfección e impiden la selección de células establemente transfectadas. Además, es casi imposible propagar una gran población de células primarias dirigidas a genes que serán utilizadas en las técnicas de recombinación. En contraste, las dificultades asociadas con sistemas retrovirales deberán eliminarse por el uso de células embriónicas o similares a las de soporte. Se ha demostrado previamente por el presente destinatario que las líneas celulares embriónicas de ganado y de cerdos se pueden transfectar y seleccionar para la integración estable de ADN heterólogo. Dichos métodos se describen en la Patente de E.U.A. asignada comúnmente Serie No. 08/626,054, presentada el 01 de Abril de 1996, incorporada aquí por referencia en su totalidad. Por lo tanto, mediante el uso de dichos métodos u otros métodos conocidos, los genes convenientes se pueden introducir en las células embriónicas o similares a las de soporte humanas presentes y las células se pueden diferenciar en tipos de células deseados, v.gr., células hematopoyéticas, células neurales, células pancreáticas, células de cartílagos, etc. Los genes que se pueden introducir en las células embriónicas o similares a las de soporte presentes incluyen, a manera de ejemplo, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento neurotrófico derivado de la giia, factor de crecimiento similar a insulina (I y II), neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, factor neurotrófico ciliar, AFT-1, genes de citoquina (interleucina, interferones, factores de estimulación de colonias, factores de necrosis tumoral (alfa y beta), etc.), genes que codifican enzimas terapéuticas, etc.

También, las células embriónicas o similares a las de soporte presentes, preferiblemente células humanas, se pueden utilizar como un modelo in vitro de diferenciación en particular para el estudio de genes que están implicados en la regulación de desarrollo temprano. También , los tejidos y órganos de células diferenciadas que utilizan las células embriónicas o similares a las de soporte presentes se pueden utilizar en estudios de fármacos. Además, las células embriónicas o similares a las de soporte presentes se pueden utilizar como donadores nucleares para la producción de otras células embriónicas sim ilares a las de soporte y colonias celulares. Con el fin de describir más claramente la presente invención , se proveen los siguientes ejemplos. EJEMPLO 1 MATERIALES Y MÉTODOS Células Donadores para Transferencia Nuclear Las células epiteliales se rasparon ligeramente desde la parte interna de la boca de un adulto que dio su consentimiento con una placa de vidrio normal . Las células se lavaron de la placa en una caja petri conteniendo solución salina regulada de fosfato sin Ca o Mg. La células se pipetearon a través de una pipeta de orificio pequeño para romper los grupos de células en una sola suspensión celular. Las células después se transfirieron en un microgotero de medio de TL-H E PES conteniendo 10% de suero de becerro fetal (SBF) bajo aceite para transferencia nuclear en oocitos de ganado nuclear. Procedimientos de Transferencia Nuclear Se han descrito previamente los procedimientos de transferencia nuclear básicos. En resumen, después de que los oocitos de matadero se maduraron in vitro los oocitos se separaron de las células en grupos y se enuclearon con una micropipeta nivelada a aproximadamente 18 horas después de la maduración (hpm). La enucleación se confirmó en medio TL-H EPES más bisbecimida (Hoechst 33342, 3µg/ml ; Sigma). Las células individuales donadores se colocaron entonces en espacio de perivitelina de oocito receptor. El citoplasma de oocitos de bovinos y el núcleo donador (unidad TN) se fusionaron utilizando técnicas de electrofusión . U n impulso de fusión que consiste de 90 V durante 15 µseg . se aplicó a ia unidad de TN . Esto corrió 24 horas después de iniciar la maduración (hpm) de los oocitos. Las unidades de TN se colocaron en medio CR 1 aa hasta 28 hpm . Este procedimiento utilizado para activar artificialmente los oocitos se ha descrito en otras partes. La activación de la unidad de TN fue de 28 hpm . U na breve descripción del procedimiento de activación es el sig uiente: las unidades de TN se expusieron durante cuatro minutos a ionomicina (5 µM , Cal Biochem , La Jolla, CA) en TL-H EPES suplementado con 1 mg/ml de BSA y después se lavaron durante cinco minutos en TL-H EPES suplementado con 30 mg/m l de BSA. Las unidades de TN se transfirieron entonces en un microgotero de medio de cultivo CR1aa conteniendo 0.2 mM de DMAP (Sigma) y cultivadas a 38.5°C, 5% de CO2 durante cuatro a cinco horas. Las unidades de TN se lavaron y se colocaron en un medio CR1aa más 10% de SBF y 6 mg/ml BASA en cuatro placas de pozos conteniendo una capa alimentadora confluente de fibroblastos embriónicos de ratón (descritos antes). Las unidades de TN se cultivaron durante tres días más a 38.5°C y 5% de CO2. El medio de cultivo se cambió cada tres días hasta el día 12 después del tiempo de activación. En este tiempo las unidades de TN que alcancen el número de células deseadas, es decir, aproximadamente un número de 50 células se removieron mecánicamente de la zona y se utilizaron para producir líneas de células embriónicas. Una fotografía de una unidad de TN obtenida como se describió antes está contenida en al Figura 1. Capa Alimentadora de Fibroblastos Los cultivos primarios de fibroblastos embriónicos se obtuvieron de fetos de murinos de 14-16 días de edad. Después de que se removieron asépticamente la cabeza, el hígado, el corazón y el tracto alimentario, los embriones se cortaron y se incubaron durante 30 minutos a 37°C en solución de EDTA de tripsina (0.05% de tripsina/0.02% de EDTA; GIBCO, Grand Island, NY). Las células de fibroblastos se sembraron en placas de matraces de cultivos y tejidos y se cultivaron en medio alfa-MEM (BioWhittaker, Walkersville, MD) suplementado con 10% de suero de becerro fetal (SBF) (Hyclone, Logen, UT), penicilina (100 lU/ml) y estreptomicina (50µl/ml). De tres a cuatro días después del paso los fibroblastos embriónicos en placas de cultivo de 35 x 10 Nunc (Baxter Scientific, McGaw Park, IL), fueron irradiadas. Los fibroblastos irradiados se desarrollaron y se mantuvieron en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 en aire a 37°C. Las placas de cultivo que tuvieron una monocapa uniforme de células se usaron para líneas de células embriónicas. Producción de líneas celulares embriónicas Las células de la unidad de TN obtenidas como se describió antes se lavaron y se sembraron en placas directamente en células de fibroblastos alimentadoras irradiadas. Estas células incluyen aquellas de la porción interna de la unidad de TN. Las células se mantuvieron en un medio de crecimiento consistiendo de MEM alfa suplementado con 10% de SBF y 0.1 mM de beta-mercaptoetanol (Sigma). El medio de crecimiento se intercambió cada dos a tres días. La colonia inicial se observó por el segundo día de cultivo. La colonia se propagó y exhibió una morfología similar a las células de soporte embriónicas (SE) de ratón descritas previamente. Las células individuales dentro de la colonia no están bien definidas y el perímetro de la colonia es refractiva y de apariencia uniforme. La colonia de células parece tener un tiempo de doblado de células inferior que las células SE de ratones. También, ia diferencia de las células de SE derivadas de bovinos y porcinos, la colonia no tiene una apariencia epitelial. Las Figuras 2 a 5 son fotografías de colonias de células similares a SE obtenidos como se describió antes. Producción de Células Humanas Diferenciadas Las células embriónicas humanas obtenidas se transfirieron a un medio de diferenciación y se cultivaron hasta que se obtuvieron tipos de células humanas diferenciadas. RESULTADOS Tabla 1. Las células humanas como núcleos donadores en la producción y desarrollo de la unidad de TN TABLA 1 La unidad de TN que desarrollo una estructura teniendo más de 16 células se sembró en placas en una capa alimentadora de fibroblastos. Esta estructura se unió a la capa alimentadora y se inició para propagar la formación de una colonia con una morfología similar a células de SE (Ver, por ejemplo, Figura 2). Además, aunque las estructuras de la etapa de 4 a 16 células no se utilizaron para intentar y producir una colonia de células SE, se ha mostrado previamente que esta etapa es capaz de producir l íneas celulares de SE o similares a SE (ratones, Eistetter y otros, Devel. Growth and Differ, 31 :275-282 (1989); Bovino, Stice y otros, 1996)) . Por lo tanto, se espera que las unidades de TN en la etapa de 4 - 16 células también deben originar y colonias celulares embriónicas y similares a las de soporte. M ientras que la presente invención se ha descrito e ilustrado en la presente por referencia a varios materiales, procedimientos y ejemplos específicos, se entiende que la invención no se restringe al material particular, combinaciones de materiales y procedimientos seleccionados para ese propósito. Numerosas variaciones de dichos detalles serán implicadas y serán apreciadas por los expertos en la materia.

Claims (35)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para producir células embriónicas o similares a las de soporte comprendiendo los siguientes pasos: (i) insertar una célula o núcleo de célula de humano o mamífero deseada en un oocíto de animal enucleado, en donde dicho oocito se deriva de una especie diferente de animal que la célula humana o de mamífero bajo condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (TN); (ii) activar las unidades de transferencia nuclear resultantes; (iii) cultivar las unidades de transferencia nuclear activada hasta que es mayor a la etapa de desarrollo de 2 células; y (iv) cultivar células obtenidas de las unidades de TN cultivadas para obtener células embriónicas o similares a las de soporte.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde la célula insertada en el oocito animal enucleado es una célula humana.
3. 3. El método de la reivindicación 2, en donde la célula humana es una célula adulta.
4. 4. El método de la reivindicación 2, en donde la célula humana es una célula epitelial o linfocito.
5. 5. El método de la reivindicación 2, en donde los oocitos se obtienen de un mamífero.
6. 6. El método de la reivindicación 5, en donde el oocito animal se obtienen de un ungulado.
7. 7. El método de la reivindicación 6, en donde el ungulado se selecciona del grupo que consiste de bovinos, ovinos, porcinos, equinos, caprinos y búfalos.
8. 8. El método de la reivindicación 1, en donde el oocito enucleado se madura antes de la enucleación.
9. 9. El método de la reivindicación 1, en donde las unidades de transferencia nuclear fusionadas se activa por exposición a ionomicina y DMAP.
10. 10. El método de la reivindicación 1, en donde las unidades de transferencia nuclear activadas se cultivan en un cultivo de capa alimentadora.
11. 11. El método de la reivindicación 10, en donde la capa alimentadora comprende fibroblastos.
12. 12. El método de la reivindicación 1, en donde en el paso (iv) las células de una unidad de TN que tiene 16 células o más se cultivan en una capa de células alimentadoras.
13. 13. El método de la reivindicación 12, en donde la capa de células alimentadoras comprende fibroblastos.
14. 14. El método de la reivindicación 12, en donde los fibroblastos comprenden fibroblastos embriónicos de ratón.
15. 15. El método de la reivindicación 1, en donde las células embriónicas o las similares a soporte resultantes se inducen para diferenciarse.
16. 16. El método de la reivindicación 2, en donde las células embriónicas o similares a las de soporte resultantes se inducen para diferenciarse.
17. 17. El método de la reivindicación 1, en donde la fusión se efectúa por electrofusión.
18. 18. Células embriónicas o similares a las de soporte obtenidas de acuerdo con el método de la reivindicación 1.
19. 19. Células embriónicas o similares a las de soporte humanas se obtienen de acuerdo con el método de la reivindicación 2.
20. 20. Células embriónicas o similares a las de soporte humanas se obtienen de acuerdo con el método de la reivindicación 3.
21. 21. Células embriónicas o similares a las de soporte humanas se obtienen de acuerdo con el método de la reivindicación 4.
22. 22. Células embriónicas o similares a las de soporte humanas se obtienen de acuerdo con el método de la reivindicación 6.
23. 23. Células embriónicas o similares a las de soporte humanas se obtienen de acuerdo con el método de la reivindicación 7.
24. 24. Células humanas diferenciadas obtenidas por el método de la reivindicación 16.
25. 25. Las células humanas diferenciadas de la reivindicación 24, que se seleccionan del grupo que consiste de células neurales, células hematopoyéticas, células pancreáticas, células de músculo, células de cartílago, células urinarias, células del hígado, células del bazo, células reproductoras, células de la piel, células intestinales y células estomacales.
26. 26. Un método de terapia que comprende administrar a un paciente que necesita terapia de transplante celular células humanas diferencias isogénicas de acuerdo con la reivindicación 24.
27. 27. El método de la reivindicación 26, en donde la terapia de transplante de células se efectúa para tratar una enfermedad o condición seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, ALS, defectos o daños de médula espinal, esclerosis múltiple, distrofia muscular, fibrosis cística, enfermedad del hígado, diabetes, enfermedad del corazón, defectos o daños en cartílagos, quemaduras, ulceras en los pies, enfermedad vascular, enfermedad del tracto urinario, SIDA y cáncer.
28. 28. El método de la reivindicación 26, en donde las células humanas diferenciadas son células hematopoyéticas o células neurales.
29. 29. El método de la reivindicación 26, en donde la terapia es para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y las células diferenciadas son células neurales.
30. 30. El método de la reivindicación 26, en donde la terapia es para el tratamiento de cáncer y las células diferenciadas son células hematopoyéticas.
31. 31. Las células humanas diferenciadas de la reivindicación 24, que contienen y expresan un gen insertado.
32. 32. El método de la reivindicación 1 , en donde el gen deseado se inserta, remueve o modifica en las células embriónicas o similares a las de soporte.
33. 33. El método de la reivindicación 32, en donde el gen deseado codifica una enzima terapéutica, un factor de crecimiento o una citoquina.
34. 34. El método de la reivindicación 32, en donde las células embriónicas o similares a las de soporte son células embriónicas o similares a las de soporte.
35. 35. El método de la reivindicación 32 , en donde el gen deseado se remueve, modifica o se suprime por recombinación homologa.