CN111019886B - 新的干性因子和其用于培养胚胎干细胞的方法或培养体系 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了培养胚胎干细胞的方法，所述方法包括使胚胎干细胞与SF1670在细胞培养液中接触，使得所述胚胎干细胞保持干性。本发明还提供了培养胚胎干细胞的细胞培养体系(培养基或培养液)，其中含有SF1670，所述细胞培养体系可使得胚胎干细胞保持干性。本发明提供的胚胎干细胞培养方法和培养体系能够有效地维持干细胞的增殖能力、发育潜能以及干性的稳定性。

Description

新的干性因子和其用于培养胚胎干细胞的方法或培养体系
技术领域
本发明涉及细胞培养方法和细胞培养基领域。具体的，本发明提供了一种维持胚胎干细胞的干性的细胞培养方法和细胞培养基。
背景技术
胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)起源于早期哺乳动物胚胎的内细胞团[1,2]，其具有自我更新的能力，并且能够分化成为三个胚层的典型细胞类型[3]。哺乳动物的胚胎干细胞具有独特分子和细胞特性的干性，如多能性状态[4]。1981年，英国科学家马丁·埃文斯首次建立了小鼠胚胎干细胞系，开启了胚胎干细胞领域的研究工作(Evans andKaufman，1981)。随着研究的愈发深入，科学家们对ESCs的多能性调控机制的研究也越来越透彻，推进了ESCs培养体系的跟进和发展：从最初的胎牛血清培养基，到Invitrogen公司推出KoSR替代胎牛血清，再到应用最为广泛的“代胎体系”，ESCs培养基的发展实现了从有血清到无血清、从成分不明确到确定化学成分的过程。而且通过培养基的不断更新和发展，在体外成功地得到了各种动物的ESC细胞系。ESC细胞系被广泛用于人类发育生物学、药物发现、药物测试和移植药物。例如，目前对着床后人胚胎的了解主要是基于数量有限的静态组织切片。但是，早期胚胎干细胞干性的根本机制还有待深入研究和充实。
小分子抑制剂被广泛用来维持小鼠和灵长类ESCs的干性[5,6]。MAP 激酶/ERK激酶(MEK)抑制剂和GSK3抑制剂(2i，PD0325901和CHIR99021) 被用来维持小鼠ESCs的原生(naive)干性状态，也能够促进多能性因子的表达，包括Nanog、Oct4和Klf4[7]。白血病抑制因子通过激活转录因子STAT3来驱动小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖[8,9]。小分子化合物 CHIR99021抑制GSK3活性，从而调控Wnt/β-catenin信号通路来维持小鼠胚胎干细胞的干性状态[5,7]。BIO(6-bromoindirubin-3’-oxime)也是特异性识别GSK3的小分子抑制剂,参与抑制胚胎干细胞的分化和激活Wnt 信号通路，从而维持多能性因子(Rex、Oct4和Nanog)的表达[5]。
SF1670是第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源蛋白 (Phosphatase andtensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN)的特异性抑制剂。SF1670特应性结合到PTEN的活性位点，从而抑制PTEN活性。PTEN参与抑制PI3K/AKT信号通路，抑制PIP2向PIP3转换，调控多种细胞生物学现象。SF1670可增强fMLP引起的PIP3信号转导，增强AKT 磷酸化和活性。已有报道SF1670可以增加中性粒细胞中活性氧的产生，增强PIP3信号，激活中性粒细胞活性，从而增强中性粒细胞减少小鼠的炎症反应和杀菌能力[13]。
本领域还需要对胚胎干细胞的干性的机理有更多的了解，以及需要各种能够有效地维持胚胎干细胞的干性的体外培养方法和培养基。
发明内容
发明人首次和意外发现和证明了SF1670在维持胚胎干细胞的干性包括其多能性中的作用。由此，发明人提供了新的和更有效的体外培养胚胎干细胞的方法和培养体系(培养基或培养液)。
具体的，在本发明的其中一个方面，本发明提供了体外培养胚胎干细胞的方法，所述方法包括使胚胎干细胞与SF1670在细胞培养液中接触。在本发明的方法中，SF1670可使得所述胚胎干细胞保持干性。在本发明的其中又一个方面，本发明的方法使得培养的所述胚胎干细胞保持多能性，特别是原始态多能性。
在本发明的其中另一个方面，本发明还提供了培养胚胎干细胞的细胞培养体系(培养基或培养液)，其中含有SF1670。所述细胞培养体系可使得胚胎干细胞保持干性。在本发明的其中又一个方面，本发明的细胞培养体系使得培养的所述胚胎干细胞保持多能性，特别是原始态多能性。
在本发明的其中又一个方面，所述胚胎干细胞为来自哺乳动物的胚胎干细胞。在本发明中，所述哺乳动物可以为任何哺乳动物，包括和不限于啮齿动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、绵羊科动物、牛科动物、猪科动物及灵长类动物。所述哺乳动物典型地包括啮齿动物，如小鼠、大鼠，几内亚猪和兔等，以及灵长类动物如人和猴等。
在本发明中，术语干细胞是指在单细胞水平上具有自我更新和分化产生子代细胞的能力的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注入胚泡后基本上有助于所有或大部分组织形成的能力。
在本发明中，术语干细胞的干性(stemness)指干细胞的基础活性，包括干细胞的生长、发育和增殖能力，以及分化为一种或者多种细胞的能力。术语干细胞的多能性是指干细胞具备的分化为各种细胞的潜力。干细胞根据其发育潜能分为：(1)全能，指能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类型；(2)多能，指能够产生所有的胚胎细胞类型；(3)专能，指能够产生细胞谱系的亚群，但所有细胞谱系都只分布于特定组织、器官或生理系统内；(4)寡能，指能够产生比专能干细胞更有限的细胞谱系亚群；以及(5)单能，指能够产生单一细胞谱系(如生精干细胞)。胚胎干细胞的多能性还可以被分为原始态多能性(nalivepluripotency)和始发态多能性 (primed pluripotency)两种状态。这两种状态的细胞在发育上相互联系，具有不同的形态、信号依赖、发育性质、基因表达及表观遗传学性质，并且在特定的条件下可以相互转化。
在本发明的其中一个方面，本发明提供的胚胎干细胞的体外培养方法或培养体系中包括SF1670。在本发明的其中又一个方面，本发明提供的胚胎干细胞的体外培养方法和培养体系中SF1670的工作浓度为约0.1～约5μM，优选为约0.2～约4μM，最优选为约0.5～约2μM。
SF1670的分子结构式如下式所示：
Figure BDA0002324822810000031
SF1670是一种特异性的第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源蛋白(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN) 抑制剂。SF1670特应性结合到PTEN的活性位点，从而抑制PTEN活性。 PTEN参与抑制PI3K/AKT信号通路，抑制PIP2向PIP3转换，增强AKT磷酸化和活性。
在本发明的其中又一个方面，胚胎干细胞的体外培养方法和培养体系中包括适合胚胎干细胞的营养物质和细胞因子等。胚胎干细胞的体外培养方法和培养体系(培养基或培养液)的关键作用目的包括维持干细胞的增殖能力、长期培养后的发育潜能以及干性的稳定性。在本发明中，所述胚胎干细胞的体外培养方法中的培养液，以及所述胚胎干细胞的培养体系可含有白蛋白或白蛋白替代物、一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种运铁蛋白或运铁蛋白替代物、一种或多种抗氧化剂、一种或多种胰岛素或胰岛素替代物、一种或多种胶原前体以及一种或多种痕量元素。所述培养方法中的培养液和所述胚胎干细胞的培养体系还可补充对维持干细胞的增殖能力、长期培养后的发育潜能以及干性的稳定性的细胞因子，例如白血病抑制因子、青灰因子或睫状节神经细胞营养因子。可用于维持胚胎干细胞的增殖能力、长期培养后的发育潜能以及干性的稳定性的细胞因子还包括Activin A，以及Wnt/β-catenin信号通路的多种小分子抑制剂(IWR1，XAV939,JW55和53AH)等。胚胎干细胞的培养体系(尤其是在成纤维细胞饲养层上的)通常补充有动物血清(尤其是胎牛血清)以使得胚胎干细胞在培养期间进行增殖。
在本发明的其中又一个方面，所述胚胎干细胞的体外培养方法和所述培养体系可通过将SF1670与前述营养物质和细胞因子一起配置成培养液或培养体系。在本发明的其中另一个方面，所述胚胎干细胞的体外培养方法和所述培养体系可通过将SF1670加入到配置好的培养液或培养体系中。在本领域已经存在各种现成的(ready)培养体系(包括培养基或培养液)，例如各种基础培养基或营养培养基。这些现成的培养体系以可商购的形式提供和获得。营养培养基含有促进增殖的营养物的细胞培养介质，一般含有等渗盐水、缓冲液、蛋白质来源(一种或多种添加的蛋白质或氨基酸的形式)和其它外部添加的营养物和生长因子。现成的体外培养胚胎干细胞的方法和培养体系(培养基或培养液)还包括成纤维细胞饲养细胞层，这种饲养细胞层能够使胚胎干细胞增殖同时保持未分化状态。体外培养胚胎干细胞的方法和培养体系(培养基或培养液)采用条件培养基(conditioned medium)。条件培养基具有与直接使用饲养细胞具有相同的特性。
在本发明的其中又一个方面，本发明提供的细胞培养方法和细胞培养体系中不含有GSK3抑制剂，例如不含有CHIR99021。本申请的发明人意外地发现，小分子化合物SF1670可以作为培养胚胎干细胞的新的细胞因子，替代在现有胚胎干细胞培养体系中采用的GSK3的抑制剂，例如CHIR99021，用于维持干细胞的干性。
在本发明的其中又一个方面，本发明提供的细胞培养方法和细胞培养体系中含有GSK3抑制剂，例如含有CHIR99021。本申请的发明人意外地发现，小分子化合物SF1670作为培养胚胎干细胞的新的细胞因子，与GSK3抑制剂例如CHIR99021联合使用，对维持干细胞的干性产生了协同增效作用。其机理可能是SF1670通过在PI3K/Akt通路中增强了 mTOR等因子的活性，与GSK3抑制剂一起影响胚胎干细胞的干性维持。
在本发明的其中一个方面，提供了SF1670用于体外培养胚胎干细胞的方法，所述方法包括使胚胎干细胞与SF1670在细胞培养液中接触。在本发明的方法中，SF1670可使得所述胚胎干细胞保持干性。在本发明的其中又一个方面，本发明的方法使得培养的所述胚胎干细胞保持多能性，特别是原始态多能性。
在本发明的其中一个方面，提供了SF1670用于维持胚胎干细胞的干性的方法。所述方法包括将SF1670施与胚胎干细胞。在本发明的方法中，SF1670可使得所述胚胎干细胞保持干性。在本发明的其中又一个方面，本发明的方法使得培养的所述胚胎干细胞保持多能性，特别是原始态多能性。
在本文中，蛋白符号不用斜体，并全部大写；基因符号使用斜体。例如PTEN为蛋白质，编码该蛋白质的基因写为Pten。有时在本文中蛋白质符号也不使用大写。例如有时本文中“Pten”表示PTEN蛋白质。有时在本文中基因符号也不使用斜体。例如有时本文中“PTEN”或“PTEN基因”表示编码PTEN蛋白质的基因Pten。
附图说明
图1显示SF1670可维持培养的胚胎干细胞的原始态
a.在完全培养基中培养，分别用DMSO或不同浓度的SF1670处理的胚胎干细胞图片。比例尺，100μm。
b.分别用DMSO或不同浓度的SF1670处理的细胞，经过碱性磷酸酶染色。DMSO处理组包含更高比例的“扁平态”细胞克隆(左侧图箭头所指)， SF1670处理的细胞包含更多“原始态圆顶”克隆(右侧图箭头所指)。
c.统计分析DMSO和SF1670处理的胚胎干细胞中含有的“扁平态”和“原始态圆顶”克隆比例。
图2显示bpV(HOpic)或bpV(pic)对维持胚胎干细胞的原始态作用不明显。
a.完全培养基中，分别用H2O和bpV(HOpic)处理胚胎干细胞。比例尺， 100μm。
b.完全培养基中，分别用H2O和bpV(pic)处理胚胎干细胞。比例尺， 100μm。
图3显示SF1670促进多能性因子的表达。
a.Western blot分析多能性因子(Nanog、Klf4和Oct4)在DMSO和 SF1670处理组的表达。
b.qRT-PCR分析多能性因子(Esrrb、Zfp42、Fgf4、Nanog、Oct4、Rexo1、 Dppa3和Lefty2)的mRNA水平。
c.用anti-Nanog抗体对DMSO和SF1670处理的胚胎干细胞进行免疫荧光染色。比例尺，50μm。
图4显示SF1670可以替代SF1670来维持胚胎干细胞干性。
a.完全培养基中去除CHIR99021，分别用DMSO或SF1670处理胚胎干细胞。比例尺，100μm。
b.完全培养基中去除CHIR99021，碱性磷酸酶染色DMSO或SF1670处理的胚胎干细胞。比例尺，100μm。
c.完全培养基中去除CHIR99021，用anti-Nanog抗体对DMSO或SF1670 处理的胚胎干细胞进行免疫荧光染色。比例尺，50μm。
d.在培养的不同时间点去除CHIR99021，Q-PCR分析多能性因子，例如 Esrrb、Zfp42和FGF4在DMSO或SF1670处理的胚胎干细胞中的mRNA水平。
图5显示裸鼠体内崎胎瘤形成能力检测SF1670对胚胎干细胞干性的影响。
a.裸鼠的左右侧皮下组织分别被植入DMSO处理和SF1670处理的胚胎干细胞。
b.从裸鼠分离得到的崎胎瘤，它们分别起源于DMSO处理和SF1670处理的胚胎干细胞。
c.统计分析DMSO处理的和SF1670处理崎胎瘤重量。
d.DMSO处理和SF1670处理的崎胎瘤包含典型的外胚层、内胚层和中胚层组织。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实施例1实验方法和试剂
动物
所有小鼠处理均按照香港中文大学动物实验伦理委员会的要求进行。实验方案和操作获得香港中文大学动物实验伦理委员会的批准(编号 17-206-MIS)。
小鼠胚胎干细胞和培养
E14小鼠胚胎干细胞(ES-D3,ATCC,CRL-1934)的完全培养基包含DMEM/F12基础培养基(Life Technologies,10565)、15％fetal bovine serum (Hyclone,SH30071)、非必须氨基酸溶液(Life Technologies,11140)、β- 巯基乙醇(Life Technologies,31350)、1×103units/ml LIF(Millipore, ESG1106),1μM PD0325901(Sigma,PZ0162)和2.5μMCHIR99021(Sigma, SML1046)。小鼠胚胎干细胞每隔两天传代，以0.25％的胰酶消化胚胎干细胞，种于用明胶包被过的细胞培养板，每天更换培养基。
崎胎瘤形成能力和组织分析
用0.25％的胰酶消化胚胎干细胞，用含有50％matrigel的磷酸盐缓冲液(PBS)把细胞稀释至1×106细胞/ml的浓度，注射前，样品置于冰上，然后注射5×104个细胞于裸鼠的皮下组织。崎胎瘤形成过程中，为了减少个体间的差异，DMSO处理和SF1670处理的胚胎干细胞分别被植入到裸鼠的左右侧。三周后，分离畸胎瘤，用4％多聚甲醛(PFA)固定，并用苏木精和曙红(HE)染色组织切片。
胚胎干细胞克隆形成能力测试
胚胎干细胞以250细胞/cm2的浓度种于明胶包被的细胞培养板。培养至第四天，用碱性磷酸酶活性检测试剂盒(STEMGENT,00-0055)检测细胞克隆形成能力。首先吸走细胞培养基，用2ml PBST清洗细胞板两次，加1ml固定液并孵育2到5分钟，注意，不要过度固定，会影响碱性磷酸酶活性。吸走固定液，用2ml PBST清洗两次。吸走PBST，加1.5ml 新鲜的AP溶液，室温放置于黑暗中5到15分钟。吸走AP溶液，用PBS 清洗两次，最后用PBS浸没细胞克隆。
SF1670、bpV(HOpic)或bpV(pic)处理胚胎干细胞
在完全培养基的培养条件下，小鼠胚胎干细胞被种于明胶包被的六孔板的4个空，12小时之后，分别换成含有DMSO、0.5μM、1μM和2μM 浓度的SF1670(Sigma,SML0684)或bpV(HOpic)(Sigma,SML0884)或 bpV(pic)(Sigma,SML0885)的完全培养基，每隔一天更换新鲜培养基。另外，在缺失CHIR99021的完全培养基中，分别添加DMSO和SF1670或 bpV(HOpic)或bpV(pic)，培养胚胎干细胞，用于后期实验。
Western blot
收集细胞，用含有蛋白酶抑制剂混合物的预冷裂解缓冲液孵育30分钟。SDS-PAGE分离总蛋白(10μg)，并转移至PVDF膜(Bio-Rad)。PVDF 膜与一抗过夜孵育，并用ECL(HRP)(Millipore)显影蛋白质。以下抗体用于蛋白质印迹分析：anti-Nanog(1:1,000稀释，CellSignaling Technology，8822)，anti-Oct4(1:1,000稀释，Cell Signaling Technology，2840)，anti-Klf4(1:1,000稀释)，Cell Signaling Technology，4038)， anti-β-actin(1:2,000稀释，Immunoway，YM3028)。
免疫荧光染色
细胞培养3天后，去除培养基，用4％的PFA固定20分钟，PBS清洗细胞三次，用含有0.3％Triton-X 100的PBS孵育10分钟。去除用含有 0.3％Triton-X 100的PBS，用5％牛血清白蛋白封闭10分钟，用anti-Nanog 抗体(1：1,300稀释，Cell Signaling Technology，8822)低温过夜孵育。第二天，去除含有抗体的牛血清白蛋白缓冲液，PBS清洗三次，将样品与二抗(Life Technologies，A16036)在室温下孵育2小时，PBS清洗三次后，添加含抗荧光淬灭剂的DAPI封片剂(Life Technologies,P36931)。
实时定量PCR分析
用Trizol(Invitrogen)分离总RNA，并使用cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems)对500ng RNA进行逆转录，使用ΔΔCt方法分析mRNA表达。 Gapdh的表达被用于标准化，并对所有定量PCR反应进行重复。
统计分析
所有数据均以平均值±SEM表示。不同基因型的平均值之间差异的统计学显着性通过成对双尾分布Welch's t-检验测量。当p值小于0.05(*)、 0.01(**)或0.001(***)时，数据被认为是显著的。
实施例2SF1670维持胚胎干细胞干性状态
在完全培养基(包含DMEM/F12基础培养基、15％fetal bovine serum、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、1×103units/ml LIF,1μM PD0325901和2.5μM CHIR99021)中培养E14小鼠胚胎干细胞，同时加入不同浓度的PTEN抑制剂SF1670来共同培养小鼠胚胎干细胞，结果如图1所示。发明人意外地发现不同浓度的SF1670都能够显著地维持胚胎干细胞的干性(图1a)。小分子化合物SF1670处理的胚胎干细胞，“圆顶”状态胚胎干细胞克隆 (右图箭头所指)的比例显著增加，维持胚胎干细胞的原始态多能性 (naive pluripotency)。DMSO处理的胚胎干细胞显示了更高比例的“扁平状”状态胚胎干细胞克隆(左图箭头所指)(图1b和1c)。而且，结果也证明SF1670与CHIR99021共同用于培养胚胎干细胞，比单独采用CHIR99021能够更好地维持胚胎干细胞的干性(图1a)。
用其它PTEN抑制剂，如bpV(HOpic)或bpV(pic)对小鼠胚胎干细胞进行处理，结果发现对维持胚胎干细胞的干性的影响不明显(图2)。分别用bpV(HOpic)或bpV(pic)溶于水中，终浓度2μM，对照组用水处理胚胎干细胞。bpV(HOpic)(图2a)或bpV(pic)(图2b)处理的胚胎干细胞与对照组相比，“圆顶”状态的胚胎干细胞克隆比例没有显著增加。
实施例3 SF1670维持胚胎干细胞干性状态
基于SF1670对胚胎干细胞克隆形态的意外的显著影响，发明人对 SF1670对多能性因子表达的影响做进一步的研究和评估。实验结果发现 2μM SF1670处理的胚胎干细胞能够显著促进多能性因子的表达，例如 Nanog、Klf4和Oct4(图3a)。
同时，SF1670也促进一系列多能性因子，如Esrrb、Zfp42和Fgf4，以及Rex、Oct4和Nanog等的转录水平(图3b)。
免疫荧光实验也显示SF1670处理的胚胎干细胞表达更高水平的 Nanog(图3c)。
这些结果说明小分子化合物SF1670可以维持小鼠胚胎干细胞干性。
实施例4 SF1670可以替代GSK3的抑制剂CHIR99021来维持胚胎干细胞干性。
一些小分子化合物例如GSK3的抑制剂可以维持人类和小鼠胚胎干细胞的干性[5,7]，并且已经被应用在胚胎干细胞的培养中。PI3K/AKT信号通路在干细胞自我更新上发挥重要作用[10,11]。Pten参与调控PI3K/Akt 信号通路[12]。已有报道在输注的中性粒细胞中，SF1670可以通过增加细胞内PIP3水平来调节先天免疫应答反应[13]。发明人进一步实验，观察采用SF1670是否可通过影响PI3K/Akt通路来维持胚胎干细胞干性，以及与现有的胚胎干细胞培养基中采用的GSK3的抑制剂进行比较。
在胚胎干细胞的完全培养基(包含DMEM/F12基础培养基、15％fetal bovineserum、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、1×103units/ml LIF,1μM PD0325901和2.5μMCHIR99021)中去除GSK3的抑制剂CHIR99021后，加入SF1670用于胚胎干细胞的培养。实验结果显示，2μM浓度的SF1670 可以替代CHIR99021来维持胚胎干细胞的干性(图4a)。在缺失CHIR99021 的情况下，SF1670可以维持胚胎干细胞的原始态干性(图4b)。图4c 显示了Nanog在DMSO处理和SF1670处理的胚胎干细胞中的表达。
为了进一步验证SF1670在维持ESC干性的作用，在不同时间点去除 CHIR99021并检测相关多能性因子(Esrrb、Zfp42和FGF4)的转录水平。结果显示，相比于DMSO处理的胚胎干细胞，SF1670处理的ESC表达更高水平的干性基因(图4d)。
这些结果表明，小分子化合物SF1670能够取代胚胎干细胞培养体系中的Gsk3β抑制剂CHIR99021，并且能够在体外培养体系中更加有效地维持胚胎干细胞的干性。
实施例5小鼠体内崎胎瘤实验证明SF1670能够维持胚胎干细胞干性
对采用SF1670培养的胚胎干细胞做了小鼠体内崎胎瘤形成能力测试。实验发现，DMSO处理的和SF1670处理的胚胎干细胞都能够分化为中胚层、外胚层和内胚层组织(图5d)，即保持了多能性。同时，结果显示 SF1670处理的胚胎干细胞可以形成尺寸更大的崎胎瘤(图5a-5c)。
胚胎干细胞的分化趋势和干性维持是相互拮抗的，干性维持是保证干细胞多能性的基础。Serum/LIF和2i(MAPK和GSK3的抑制剂)被普遍用来维持胚胎干细胞的干性维持，以保证其多能性。本发明首次发现和证明了小分子化合物SF1670在维持胚胎干细胞干性的作用，其作为影响胚胎干细胞培养的新的细胞因子，既可以替代在现有胚胎干细胞培养体系中采用的GSK3抑制剂CHIR99021，用于维持胚胎干细胞的干性，也可以与GSK3抑制剂CHIR99021一起使用，发挥协同增效的作用，更有效地维持胚胎干细胞的干性。由此，申请人由此提供了新的和更有益的胚胎干细胞的细胞培养方法和细胞培养体系。
上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。
在本发明中，“约”表示±10％，优选为±5％，更优选为±2％，例如为±1％、±0.5％或±0.1％。
以下文献以参考形式全文引入。
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Claims (11)

1.体外培养胚胎干细胞的方法，所述方法包括使胚胎干细胞与SF1670在细胞培养液中接触，使得所述胚胎干细胞保持干性，其中所述细胞培养液中SF1670的工作浓度为0.1~5μM。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使得所述胚胎干细胞保持多能性。
3.根据权利要求2所述的方法，其中使得所述胚胎干细胞保持原始态多能性。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养液中SF1670的工作浓度为0.2~ 4μM。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述细胞培养液中SF1670的工作浓度为0.5~ 2μM。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞培养液含有GSK3抑制剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞培养液含有CHIR99021。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞培养液不含有GSK3抑制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞培养液不含有CHIR99021。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述胚胎干细胞为来自哺乳动物的胚胎干细胞。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述胚胎干细胞为来自啮齿动物或灵长类动物。
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